Document Type : Research Paper
Authors
Assist. Prof. of plant breeding, Agroecology Department, College of Agriculture and Natural Resources of Darab, I.R. of Iran
Abstract
In order to investigate of cis-regulatory elements'role in the promoter region in the expression pattern of genes Catalase 2(CAT2) and Thioredoxin H5(TRX5) in Arabidopsis in response to different biotic and abiotic stresses,the promoter sequences of the genes, cis-regulatory elements in them, data relating to the expression of these genes in the different stresses were received using Phytozome, PlantCARE and the Bio-Array Resource for Plant Biology, respectively. Significant differences in the number of repetitions of each cis-regulatory element among promoters were determined by a variety of statistical methods available at bioinformatics IDEG6 tool. The results showed that eight cis-regulatory elements,including ARE,CAAT-box,ABRE,Unnamed-4,Box-W1,TGA-element,W box and TATA-box had significant and different occurrences between two promoters. It can be suggested that gene TRX5 unlike gene CAT2 is able to respond to biotic stress due to the presence of a greater number of specific regulatory elements in response to pathogen(Box-W1 and W box) and auxin(TGA-element). Also, a part of the expression pattern of these genes in response to abiotic stresses can be justified due to the presence of different number of repetitions of specific regulatory element in response to auxin(TGA-element) on the TRX5 gene promoter and anaerobic regulatory element(ARE) and abscisic acid regulatory element(ABRE) on the CAT2 gene promoter. Based on these results, TRX5 plays a role in response to biotic and abiotic stresses. Identification of these genes with functional response to biotic and abiotic stresses can be considered a huge progress in order to select candidate genes for genetic manipulation to enhance plants stress tolerance.
Keywords
بررسی مقایسهای پروموترهای ژنهای Catalase2و H5Thioredoxinدر آرابیدوپسیس به منظور تعیین نحوه کارکرد آنها در پاسخ به تنشهای زیستی و غیر زیستی
زهرا زینتی1* و روحاله شاملو دشت پاگردی2
1 داراب، دانشگاه شیراز، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، بخش اگرواکولوژی
2 شیراز، دانشگاه شیراز، دانشکده کشاورزی، بخش زراعت واصلاح نباتات
تاریخ دریافت: 19/7/94 تاریخ پذیرش: 27/4/95
چکیده
به منظور بررسی نقش عناصر تنظیمی سیس نواحی پروموتری بر الگوی بیان ژنهای Catalase 2(CAT2) و Thioredoxin H5 (TRX5) در گیاه آرابیدوپسیس در پاسخ به تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی، توالی پروموتری ژنهای مورد نظر، عناصر تنظیمی سیس موجود در آنها و دادههای مربوط به بیان این ژنها در تنشهای مختلف به ترتیب با استفاده از Phytozome، PlantCARE و The Bio-Array Resource for Plant Biology دریافت گردید. به منظور تعیین تفاوتهای معنیدار در تعداد تکرارهای هر کدام از عناصر تنظیمی سیس بین پروموترها از آزمونهای آماری مختلف موجود در ابزار بیوانفورماتیک IDEG6 استفاده شد. نتایج نشان داد که 8 عنصر تنظیمی شاملARE ، CAAT-box، ABRE، Unnamed__4، Box-W1، TGA-element، W box و TATA-box بین دو پروموتر دارای تعداد تکرار متفاوت و معنیداری بودند. به نظر میرسد وجود تعداد بیشتری از عناصراختصاصی تنظیمی پاسخ به پاتوژن ( Box-W1 و W box) و پاسخ به اکسین (TGA-element)، ژن TRX5را برخلاف ژن CAT2 قادر به پاسخ به تنش زیستی میکند. همچنین وجود تعداد تکرارهای متفاوتی از عنصر تنظیمی اختصاصی پاسخ به اکسین (TGA-element) در پروموتر ژن TRX5 و عناصر تنظیمی پاسخ بیهوازی (ARE) و پاسخ به آبسزیک اسید (ABRE) در پروموتر ژن CAT2 بخشی از الگوی بیان این دو ژن را در پاسخ به تنشهای غیر زیستی توجیه نمود. بر اساس این نتایج، TRX5هم در پاسخ به تنشهای زیستی و هم غیرزیستی نقش دارد. شناسایی این گونه ژنها با کارکرد پاسخ به تنشهای زیستی و غیر زیستی میتواند پیشرفت بزرگی در جهت انتخاب ژنهای کاندید مناسب جهت دستورزی ژنتیکی به منظور افزایش تحمل به تنشها درگیاهان به شمار رود.
واژه های کلیدی: CAT2، TRX5، آنالیز پروموتر، بیان ژن
* نویسنده مسئول، تلفن: 07136139940 ، پست الکترونیکی: zahrazinati@shirazu.ac.ir
مقدمه
در سیستمهای کشاورزی، تنشهای غیرزیستی و زیستی باعث تفاوت عملکرد برداشت شده نسبت به عملکرد بالقوه میشوند. شواهد زیادی وجود دارند که بیانگر تغییر بیان ژنهای گیاهی در اثر تنشهای مختلف هستند که احتمالاً به دلیل نقش آنها در مکانیسمهای تحمل میباشد. مطالعه گیاهان تراریخته این نظریه را که تغییر بیان ژنها میتواند منجر به افزایش تحمل شود، حمایت میکند (14، 20 و 32). تنظیم بیان ژن شامل یک شبکه مولکولی پیچیده میباشد. پروموترها نقش مهمی در تنظیم بیان ژن در مراحل مختلف رشدی و پاسخ به محیط دارند. رونویسی از ژنها در درجه اول توسط شناسایی عوامل رونویسی متصل شونده به DNA (TF= Transcription factors) و اتصالشان به توالی کوتاه خاصی (TFBS= Transcription factor binding site) یا عناصر تنظیمی سیس (CREs= Cis regulatory elements) در منطقه تنظیمی (پروموتر) کنترل میشود و سپس به فعال شدن یا سرکوبی رونویسی در پاسخ به تغییرات محیطی و در طی نمو منجر میگردد (27). بنابراین شناسایی عناصر تنظیمی سیس یکی از گامهای اساسی برای فهم شبکه تنظیمی رونویسی است که در نهایت اطلاعات لازم را برای ساخت مدلهای شبکههای تنظیمی فراهم میسازد (23). پروموتر منطقه بالادست مجاور شروع نقطه رونویسی (TSS= Transcription start site) میباشد. هر ژن دارای ترکیبی منحصر به فرد از عناصر تنظیمی در نواحی پروموتری خود میباشد که الگوی بیان زمانی و مکانی آن ژن را تعیین میکند. پیشرفتهای اخیر تکنولوژی ریزآرایه و در دسترس بودن تعداد زیادی از توالیهای ژنوم کامل، استفاده از روشهای محاسباتی را جهت یافتن عناصر تنظیمی و شفاف سازی شبکه تنظیمی امکان پذیر ساخته است (27). Thioredoxin H5 (TRX5) یکی از هشت عضو متعلق به خانواده Thioredoxinهای H سیتوزولی میباشد (22 و 25). در گیاهان Thioredoxin H در طول جوانه زنی و نمو اولیه گیاهچه (5، 18، 24 و 40) و احتمالاً جذب سولفات (26)، زخم، ریزش و پیری، برهمکنشهای ناسازگار با پاتوژن، تنش اکسیداتیو (21) شرکت دارد. وجود آنها در شیره آوندی برنج و طیف وسیعی از گونههای تک لپه و دولپه نشان میدهد که آنها میتوانند به عنوان پروتئینهای پیام رسان عمل کنند (17 و 33). Catalase 2 (CAT2) نیز یکی از سه ژن خانواده کاتالاز میباشد (11). کاتالاز جزئی از ماشین دفاعی آنتی اکسیدانی در گیاهان در مقابل صدمات تنش اکسیداتیو است. CAT2از کنترل کنندههای اصلی H2O2است که به هم ایستایی گونههای اکسیژن فعال کمک میکند (13). علاوه بر این، فعالیت کاتالاز در تنشهای سرما و خشکی افزایش مییابد (9). در این پژوهش به منظور شناسایی ارتباط عناصر تنظیمی سیس با الگوی بیان ژنهای رمز کننده CAT2و TRX5، از تلفیق آنالیز مقایسهای پروموترها و دادههای بیان ژن استفاده شد. این مطالعه اولین گزارش پیرامون بررسی مقایسهای پروموتر ژنهای رمز کننده CAT2 و TRX5میباشد.
مواد و روشها
آنالیز مقایسهای پروموترهای ژنهای CAT2 و TRX5:توالی پروموتر ژنهای CAT2 و TRX5 (شامل 1500 جفت باز بالادست نقطه آغاز رونویسی) از پایگاه اطلاعاتی www.phytozome.net دریافت شد. برای شناسایی نوع و تعداد عناصر تنظیمی توالیهای پروموتری، ازسایت http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html استفاده گردید. به منظور تعیین تفاوتهای معنیدار در تعداد تکرارهای هر کدام از عناصر تنظیمی سیس بین پروموترها، از آزمونهای آماری مختلف (Audic and Claverie، Fisher exact test، Chi-squared 2×2، Greller and Tobin، R of Stekel and Falciani و General Chi-squared) با در نظر گرفتن P-value≤0.05 و با به کارگیری ابزار IDEG6 (29) استفاده شد (34).
بررسی الگوی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 در پاسخ به تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی: سایت The Bio-Array Resource for Plant Biology (BAR) (http://bar.utoronto.ca) به منظور دریافت دادههای بیان ژنهای رمز کننده CAT2 (AT4G35090) و TRX5 (AT1G45145) در تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی مورد استفاده قرار گرفت. این سایت برای جستجو و اکتشاف در میان مجموعه دادههای بزرگ مقیاس ریزآرایه و پروژههای با بازدهی بالا در آرابیدوپسیس و گونههای دیگر استفاده میشود. به منظور تسهیل تفسیر و آنالیز دادههای بیان حاصل از آزمایشهای ریزآرایه و پروژههای با بازدهی بالا، نرمافزاری با نام electronic Fluorescent Pictograph (eFP) browserتوسط Winter و همکاران در سال 2007 ایجاد شده است که در سایت BAR قابل دسترس میباشد (41). موتور مرورگر Arabidopsis eFP دادههای بیان تقریباً 22000 ژن در آرابیدوپسیس که توسط کنسرسیوم AtGenExpress (کنسرسیوم بین المللی کشف ترانسکریپتوم آرابیدوپسیس) و آزمایشگاههای دیگر تولید شده است را ارائه میدهد. تقریباً بیشتر از 1000 مجموعه داده ریزآرایه در این نرمافزار بارگذاری شده است. در مرورگر Arabidopsis eFP پس از وارد کردن IDهای ژن مورد بررسی، انتخاب منبع دادهها از لیست پیش فرض و انتخاب روش تفسیری بیان ژن (مطلق، نسبی و مقایسهای)، مقادیر نرمال شده بیان ژن مورد نظر، بازیابی میشود. علاوه بر این، سایر جزئیات آزمایشها، از قبیل تعداد تکرارها، شرایط رشدی، نحوه اعمال تیمارها و نوع روش نرمال سازی دادهها در سایت BAR قابل دسترس میباشند (41). در مطالعه حاضر با انتخاب روشهای زیستی و غیر زیستی از لیست پیش فرض منبع دادهها و انتخاب روش تفسیری مطلق در مرورگر Arabidopsis eFP، دادههای بیان مطلق ژنهای CAT2 و TRX5 مربوط به بافت شاخساره و ریشه گیاه آرابیدوپسیس (اکوتیپ Clumbia-0) 18 روزه، در زمانهای 0، 5/0، 1، 3، 6، 12، 24 ساعت پس از اعمال تنشهای غیر زیستی (شوری، سرما، اسمزی، ژنوتوکسیک، خشکی، اکسیداتیو، اشعه ماوراء بنفش، زخم و گرما) و همچنین دادههای بیان مطلق ژنهای CAT2 و TRX5 در شاخساره گیاه آرابیدوپسیس 4 هفتهای، در زمانهای 2، 6 و 24 ساعت پس از اعمال تنشهای زیستی (باکتریهای غیر بیماریزای Pseudomonas Syringae، باکتریهای بیماریزای Pseudomonas Syringae و قارچ Phytophthora infestans) دریافت شدند. همبستگی بین الگوی بیان دو ژن CAT2 و TRX5 در تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی نیز با استفاده از نرمافزاز SAS تعیین شد. در نهایت، ارتباط بین الگوی بیان ژنها و نتایج حاصل از بخش آنالیز مقایسهای پروموترها بررسی گردید.
نتایج
بررسی توالی پروموتری ژنهای CAT2 و TRX5، 31 عنصر تنظیمی سیس را در هر ژن پیش بینی کرد. 19 عنصر تنظیمی بین دو پروموتر مشترک بود. 12 عنصر تنظیمی خاص CAT2و 12 عنصر تنظیمی نیز خاص TRX5بود. عمدهترین عنصر تنظیمی در نواحی پروموتری ژنهای CAT2 و TRX5، TATA-box و CAAT-box بودند که به ترتیب توالی شروع رونویسی (6) و توالی افزاینده (28) میباشند.
نتایج آزمونهای آماری نشان داد 8 عنصر تنظیمی یعنی ARE، CAAT-box، ABRE، Unnamed__4،
Box-W1، TGA-element، W box و TATA-box بین پروموترهای ژنهای CAT2 و TRX5دارای تعداد تکرار متفاوت و معنیداری بودند (جدول 1). از این تعداد، عنصر تنظیمی ARE خاص ژن CAT2، سه عنصر تنظیمی Box-W1، TGA-element و W box خاص ژن TRX5و چهار عنصر تنظیمی CAAT-box، Unnamed__4، ABRE و TATA-box بین دو پروموتر مشترک بودند.
الگوی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 در تنشهای مختلف زیستی و غیر زیستی در شکلهای 1، 2 و 3 ارائه شده است. همچنین ضرایب همبستگی بیان ژنهای CAT2 و TRX5تحت تنشهای مختلف غیر زیستی و زیستی در جدول 2 نشان داده شده است. همبستگی مثبت بیانگر روند تغییرات بیان نسبتاً مشابه و همبستگی منفی نشان دهنده روند تغییرات بیان متفاوت ژنهای CAT2 و TRX5تحت تنشهای مختلف غیر زیستی و زیستی میباشد. بین بیان دو ژن در تنش شوری و اشعه ماوراء بنفش (در بافت شاخساره) و تنش سرما (در بافت ریشه) همبستگی منفی معنیداری وجود داشت. به علاوه آنالیز همبستگی بیان ژنهای CAT2 و TRX5تحت تنشهای مختلف غیرزیستی و زیستی نشان داد که در اکثر تنشها همبستگی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 منفی میباشد، هرچند این همبستگی از لحاظ آماری معنیداری نبود. آنالیز مقایسهای پروموتر میتواند راهکار مناسبی برای توجیه بخشی از این روند تغییرات بیان متفاوت دو ژن CAT2 و TRX5در پاسخ به تنشهای زیستی
و غیرزیستی باشد.
جدول 1- نتایج مقایسه جفتی تعداد تکرارهای عناصر تنظیمی واقع در نواحی پروموتری ژنهای CAT2 و TRX5 با استفاده از آزمونهای آماری Audic and Claverie، Fisher exact test، Chi-squared 2X2، Greller and Tobin، R of Stekel and Falciani و General Chi-squared. مقادیر p-valueی هر آزمون برای هر عنصر تنظیمی آورده شده است.
Cis-acting elements |
کارکرد |
CAT2 |
TRX5 |
CAT2 (norm) |
TRX5 (norm) |
Audic and Claverie |
Fisher exact test |
Chi- squared 2×2 |
Greller and Tobin |
R of Stekel and Falciani |
General Chi-squared |
ABRE |
cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness |
10 |
1 |
657.9 |
88.5 |
0.0103 |
0.0269 |
0.0215 |
. |
0.0133 |
0.0215 |
ARE |
cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction |
4 |
0 |
263.2 |
0 |
0.0620 |
0.1384 |
0.0822 |
. |
0.0349 |
0.0822 |
CAAT-box |
common cis-acting element in promoter and enhancer regions |
30 |
14 |
1973.7 |
1238.9 |
0.0248 |
0.1337 |
0.1119 |
. |
0.1400 |
0.1119 |
TATA-box |
core promoter element around -30 of transcription start |
62 |
52 |
4078.9 |
4601.8 |
0.03498 |
0.4518 |
0.3952 |
0.1531 |
0.5201 |
0.3952 |
Unnamed__4 |
|
1 |
5 |
65.8 |
442.5 |
0.02783 |
0.0866 |
0.0414 |
. |
0.0396 |
0.0414 |
Box-W1 |
fungal elicitor responsive element |
0 |
3 |
0 |
265.5 |
0.0444 |
0.0763 |
0.0433 |
. |
0.0237 |
0.0433 |
TGA-element |
auxin-responsive element |
0 |
5 |
0 |
442.5 |
0.0080 |
0.0133 |
0.0088 |
. |
0.0035 |
0.0088 |
W box |
pathogen-induced activity |
0 |
3 |
0 |
265.5 |
0.0444 |
0.0763 |
0.0433 |
. |
0.0237 |
0.0433 |
جدول 2- همبستگی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 تحت تنشهای مختلف غیر زیستی و زیستی
قارچPhytophthora infestants |
باکتریبیماریزایPseudomonas syringae |
باکتریغیربیماریزایPseudomonas syringae |
گرما |
زخم |
اشعه ماوراء بنفش |
اکسیداتیو |
ژنوتوکسیک |
خشکی |
اسمزی |
سرما |
شوری |
|
669/0- |
046/0- |
977/0 |
415/0 |
022/0- |
*790/0- |
654/0 |
222/0 |
735/0- |
599/0- |
450/0- |
**871/0- |
شاخساره |
|
|
|
600/0 |
077/0 |
352/0- |
267/0 |
325/0- |
164/0 |
675/0 |
**966/0- |
100/0 |
ریشه |
علامت * نشان دهنده معنیداری درسطح 5% و علامت ** نشان دهنده معنیداری درسطح 1% میباشد.
|
شکل 1- الگوی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 در تنشهای الف) باکتری غیر بیماریزای Pseudomonas syringae، ب) باکتری بیماریزای Pseudomonas syringae، ج) قارچ Phytophthora infestants در بافت شاخساره
|
شکل 2- میزان بیان مطلق ژنهای CAT2 و TRX5 در شرایط نرمال و تنشهای غیر زیستی (شوری، سرما، اسمزی، خشکی، ژنوتوکسیک، اکسیداتیو، اشعه ماوراء بنفش، زخم و گرما) در بافت شاخساره (الف) و بافت ریشه (ب)
|
شکل 3- میزان بیان نسبی ژنهای CAT2 و TRX5 در شرایط نرمال و تنشهای غیر زیستی (شوری، سرما، اسمزی، خشکی، ژنوتوکسیک، اکسیداتیو، اشعه ماوراء بنفش، زخم و گرما) در بافت شاخساره (الف) و بافت ریشه (ب)
بحث
بررسی الگوی بیان ژنهای CAT2 و TRX5 در پاسخ به تنشهای زیستی: بر اساس نتایج حاصل از آنالیز پروموتر، عنصر تنظیمی W box به طور اختصاصی در نواحی پروموتری ژن TRX5وجود داشت. این عنصر تنظیمی جایگاه اتصال عامل رونویسی WRKY و برای فعالیت ژن در برابر عامل بیماریزا ضروری میباشد (15). در پژوهشی که توسط Laloi و همکاران (2004) انجام شد در گیاهان با بیان بالایWRKY6 ، بیان ژن TRX5 افزایش یافت. آنها گزارش کردند کهWRKY6 در تنظیم بیان TRX5درگیر است (21).موتیف Box-W1 نیز که بطور اختصاصی در نواحی پروموتری ژن TRX5وجود داشت، عنصر تنظیمی پاسخ به حمله پاتوژن میباشد (30). تعداد عناصر تنظیمی W box و Box-W1 در ناحیه پروموتری ژن TRX5به طور معنیداری بیشتر از تعداد آن در ناحیه پروموتری ژن CAT2بود. از سوی دیگر، آنالیز بیان ژن نشان داد که در شرایط تنش پاتوژن نسبت به شرایط کنترل، بیان ژن TRX5به میزان قابل توجهی افزایش مییابد در حالی که بیان ژن CAT2 کاهش مییابد (شکل 1). بنابراین تعداد بیشتر عناصر تنظیمی W box و Box-W1 در ناحیه پروموتری ژن TRX5میتواند دلیلی بر افزایش بیشتر بیان این ژن در شرایط تنش پاتوژن نسبت به شرایط کنترل باشد.
بررسی الگوی بیان ژنهای CAT2وTRX5 در پاسخ به تنشهای غیرزیستی: یکی دیگر از عناصری که به طور اختصاصی در نواحی پروموتری ژن CAT2 وجود داشت و بین پروموترهای دو ژن تفاوت معنیداری نشان داد ARE (عنصر پاسخ بیهوازی) با توالی TGGTTT بود. مطالعات پیشین نشان دادند که یک پروتئین از خانواده MYB (عامل رونویسی AtMYB2) به عنصر تنظیمی ARE با توالی TGGTTT متصل میشود (7 و 16). برهمکنش بین عامل رونویسی AtMYB2 و توالی TGGTTT نشان داد که توالی TGGTTT نقش مهمی در نواحی پروموتری ژنهای پاسخ دهنده به تنش ایفاء میکند (7). خانواده MYB بزرگترین خانواده عوامل رونویسی در آرابیدوپسیس میباشند که در فرآیندهای سلولی مختلف شرکت دارند (10 و 43). MYB2 به عنوان عامل رونویسی هورمونهای آبسزیک اسید (ABA) و اتیلن (ET) در شرایط تنش عمل میکند (8 و 43) و همچنین بیان تعدادی از ژنهای پاسخ دهنده به شوری و خشکی را مدیریت میکند (3، 7 و 10). به نظر میرسد AREها در شبکههای تنظیمی طیف گستردهای از تنشهای غیر زیستی از جمله تنشهای بیهوازی، خشکی و شوری با میانجیگری هورمونهای ABA و ET دخیل باشند (31).
به علاوه، در نواحی پروموتری ژنهای TRX5و CAT2 به ترتیب 1 و 10 عنصر پاسخ دهنده به ABA (ABRE) وجود داشت. Skriver و همکاران (1991) گزارش دادند که وجود چند نسخه از ABRE در یک پروموتر، امکان پاسخ به ABA را به آن پروموتر میدهد در حالی که وجود تنها یک نسخه از ABRE در پروموتر، منجر به عدم پاسخ پروموتر به ABA میشود (36). در پژوهشی که توسط رهنما و وکیلیان (1392) انجام شد فعالیت القایی پروموتر Rd29A پس از همسانهسازی از گیاه آرابیدوپسیس در گیاه توتون مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصل از این پژوهش، ABA، تنش شوری و تنش خشکی باعث القای پروموتر Rd29A گردید. آنها پیشنهاد کردند که با توجه به حضور عنصر ABRE در پروموتر Rd29Aاحتمالاً تنش شوری و خشکی با استفاده از سیگنال ABA در القای پروموتر عمل میکنند (2). حضور تعداد زیاد ABRE در نواحی پروموتری CAT2نشان میدهد که مسیر سیگنالینگ ABA در تنظیم بیان این ژن نقش دارد و لذا سطح ABA در پاسخ به تنشهای غیر زیستی مانند خشکی و شوری افزایش مییابد (42). در پژوهشی که توسط جعفریه یزدی و همکاران (2007) انجام شد، عملکرد گیاهان کلزای تحت تنش خشکی زمانی که غلظت پایین آبسزیک اسید اعمال شد در مقایسه با گیاهان کلزای تحت تنش خشکی افزایش یافت (1).
بررسی دادههای بیان ژن نشان داد که میزان بیان ژن CAT2 در شاخساره تحت شرایط نرمال و تنشهای مختلف غیر زیستی بیشتر از ژن TRX5بود در حالی که در ریشه عکس آن صادق بود. به عبارتی میزان بیان ژن TRX5در ریشه تحت شرایط نرمال و تنشهای مختلف غیر زیستی بیشتر از ژن CAT2بود (شکل 2). CAT2به عنوان کاتالاز القاء شونده توسط نور شناخته شده است و بیان آن یک تناوب شبانه روزی با حداکثر بیان در صبح زود را نشان میدهد (44 و 45). همچنین ناکارآیی CAT2، مقاومت به نور زیاد را در گیاهان آرابیدوپسیس کاهش می دهد (38). Du و همکاران (2008) گزارش کردند که CAT2 عمدتاً در بافتهای فتوسنتزی از جمله برگها بیان میشود و میزان بیان آن بالاتر از CAT1 و CAT3 میباشد. به علاوه فعالیت آن در تنشهای سرما، خشکی و اکسیداتیو افزایش مییابد (9). بررسی عناصر تنظیمی نواحی پروموتری نشان داد که عناصر تنظیمی پاسخ به نور با توالیهای متفاوت در CAT2و TRX5 به ترتیب 18و 12 عدد میباشد. از آنجا که بافت شاخساره در معرض روشنایی و بافت ریشه درون خاک در معرض تاریکی قرار دارد، احتمالاً میتوان میزان بیان بالاتر ژن CAT2 نسبت به ژن TRX5در بافت شاخساره و کمتر بودن میزان آن در بافت ریشه را به این عنصر تنظیمی نسبت داد.
بررسی بیان نسبی ژنهای CAT2 و TRX5در بافت شاخساره و ریشه نیز نشان داد که بیان ژن CAT2 تحت تنشهای مختلف غیر زیستی تفاوت معنیداری با شرایط کنترل ندارد. بیان ژن TRX5 در بافت شاخساره تحت تنشهای مختلف غیر زیستی به میزان قابل توجهی افزایش یافت ولی در بافت ریشه تحت تنشهای مختلف تغییر بیان محسوسی وجود نداشت (شکل 3). Taji و همکاران (2004) نشان دادند که تحت تنش mM250 نمک NaCl، تعداد ژنهای کمتری در خویشاوند وحشی متحمل آرابیدوپسیس (Thellungiella halophila) در مقایسه با آرابیدپسیس القا شد. این مطلب میتواند تأکیدی بر این نکته باشد که تحمل به تنش در Thellungiella halophile ممکن است ناشی از بیان بالای دائمی چندین ژن درگیر در تحمل به شوری باشد در حالی که این ژنها در آرابیدوپسیس القاء شونده هستند (37). همچنین از یک سو با توجه به پژوهشی که توسط Du و همکاران (2008) انجام شد که در آن فعالیت CAT2در تنشهای سرما، خشکی و اکسیداتیو در گیاهان آرابیدوپسیس افزایش یافت و از سوی دیگر با توجه با عدم تغییر بیان این ژن در سطح رونویسی در تنشهای مختلف، به نظر میرسد فعالیت این ژن وابسته به تنظیم در سطح پس از رونویسی باشد (9).
TRX5به دلیل دارا بودن چندین عنصر TGA-element (عنصر پاسخ به اکسین) در نواحی پروموتری، جزء ژنهای پاسخ دهنده به اکسین میباشد. این عنصر تنظیمی نیز به طور اختصاصی در نواحی پروموتری ژن TRX5وجود داشت. Wang و همکاران (2001) نشان دادند که هورمون اکسین در پاسخ به تنشهای غیر زیستی در آرابیدوپسیس دخیل است (39). همچنین در پژوهشی که توسط Ghanashiam و Jain (2009) انجام شد تعداد زیادی ژن پاسخ دهنده به اکسین علاوه بر تنشهای غیر زیستی به تنش زیستی نیز پاسخ دادند. نتایج آزمایشات حاکی از آن بود که اکسین یکی از اجزای مهم درگیر در پاسخهای دفاعی از طریق تنظیم بیان بسیاری از ژنها میباشد و تداخلی بین مسیرهای انتقال پیام تنشهای زیستی و غیرزیستی ایجاد میکند (12). Bari وJones نیز شواهدی برای درگیری مسیر انتقال پیام اکسین در پاسخهای دفاعی ارائه دادند (4). از آنجا که تعداد این عنصر تنظیمی در نواحی پروموتری ژن TRX5و CAT2 به ترتیب 5 و 0 بود و نیز بیان ژن TRX5 در بافت شاخساره تحت تنشهای مختلف غیر زیستی به میزان قابل توجهی افزایش یافت و با توجه اینکه تغییر بیان ژن CAT2تحت تنشهای مختلف غیر زیستی محسوس نبود شاید بتوان القای TRX5 در تنشهای غیرزیستی را به حضور این عنصر تنظیمی در نواحی پروموتری آن نسبت داد.
عنصر تنظیمی دیگر با اختلاف معنیدار بین نواحی پروموتری دو ژن، Unnamed__4 با توالی CTCC بود. تعداد این عنصر تنظیمی در نواحی پروموتری ژن TRX5و CAT2 به ترتیب 5 و 1 بود. کارکرد این عنصر تنظیمی کاملاً شناخته شده نیست. لذا این احتمال وجود دارد که ممکن است یکی از دلایل القای بیان TRX5 تحت تنشهای مختلف ناشی از عنصر تنظیمی CTCC باشد. به عبارتی این عنصر تنظیمی در پاسخ به تنشهای غیرزیستی نقش داشته باشد. این فرضیه برای اثبات نیاز به آنالیز پروموتری ژنهای بیشتری دارد. تا کنون مطالعات زیادی پیرامون کارکرد دقیق این عنصر تنظیمی انجام نشده است. با این حال، در پژوهشی که توسط Shumin و همکاران (2015) انجام شد، با توجه به حضور این عنصر در چند ژن تنظیمی لایه مغذی دانه گرده از جمله DYT1، AMS، AtMYB103 پیشنهاد شد که این عنصر تنظیمی احتمالاً به طور گستردهای در تنظیم بیان ژنی خاص بساک نقش دارد. آنها بیان کردند موتیف Unnamed__4 با توالی CTCC یک عنصر تنظیمی بالقوه میباشد که یک سر نخ جدید برای بررسی ارتباط بین DYT1 و ژنهای بالادست آن فراهم میکند (35). در پژوهش دیگری که توسط Ku و همکاران (2011) انجام شد، تغییر توالی CCCC به توالی CTCC در ناحیه 5'-UTR ژن TAC1 (ژن کنترل کننده زاویه برگ) در ذرت منجر به افزایش بیان این ژن و تغییر زاویه برگ گردید (19).
تلفیق نتایج آنالیز مقایسهای پروموتر و نتایج الگوی بیان ژنها، ارتباط قوی و آشکاری را بین بیان ژنها و عناصر تنظیمی سیس شناسایی شده نشان داد. با بررسی عناصر تنظیمی موجود در نواحی پروموتری مشخص گردید که ژن TRX5با دارا بودن عناصر اختصاصی تنظیمی پاسخ به پاتوژن ( Box-W1و W box) و پاسخ به اکسین (TGA-element) در پاسخ به تنش زیستی نقش مؤثری ایفا میکند. همچنین ژن TRX5 با دارا بودن عنصر تنظیمی اختصاصی پاسخ به اکسین (TGA-element) و ژن CAT2 با دارا بودن عناصر تنظیمی پاسخ بیهوازی (ARE) و پاسخ به آبسزیک اسید (ABRE) در تنشهای غیر زیستی نقش دارند.
در کل TRX5هم در پاسخ به تنشهای زیستی و هم غیرزیستی نقش دارد. شناسایی این گونه ژنها با کارکردهای مقاومت در تنشهای زیستی و غیر زیستی پیشرفت بزرگی در زمینه انتقال ژن به شمار میرود. به علاوه شناسایی عناصر تنظیمی میتواند افق جدیدی را در درک مکانیسم پاسخ به تنشها و ارتباط ژنهای مورد نظر با ژنهای بالادست باز نماید.
3. Abe H., Urao T., Ito T., Seki M., Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. 2003. Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15: 63-78.
4. Bari R. and Jones J.D.G. 2009. Role of plant hormones in plant defence responses. Plant Molecular Biology, 69:473-88.
5. Besse I., Wong J.H., Kobrehel K. and Buchanan B.B. 1996. Thiocalsin: a thioredoxin-linked, substrate-specific protease dependent on calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93: 3169–3175.
6. Burley S.K. and Roeder R.G. 1996. Biochemistry and structural biology of transcription factor IID (TFIID), Annual Review of Biochemistry, 65: 769–799.
7. Dolferus R., Klok E.J., Ismond K., Delessert C., Wilson S., Good A., Peacock J. and Dennis L. 2001. Molecular basis of the anaerobic response in plants. International Union of Biochemistry and Molecular Biology life, 51: 79-82.
8. Du H., Zhang L., Liu L., Tang X.F., Yang W.J. and Wu Y.M. 2009. Biochemical and molecular characterization of plant MYB transcription factor family. Biochemistry (Moscow), 74: 1-11.
9. Du Y.Y., Wang P.C., Chen J. and Song C.P. 2008. Comprehensive functional analysis of the catalase gene family in Arabidopsis thaliana. Journal of Integrative Plant Biology, 50:1318-1326.
10. Dubos C., Stracke R., Grotewold E., Weisshaar B., Martin C. and Lepiniec L. 2010. MYB transcription factors in Arabidopsis. Trends in Plant Science, 15: 573-581.
11. Frugoli J.A., Zhong H., Nuccio M.L., McCourt P., McPeek M.A., Thomas T.L. and McClung C.R. 1996. Catalase is encoded by a multigene family in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Physiology, 112: 327–336.
12. Ghanashyam C. and Jain M. 2009. Role of auxin-responsive genes in biotic stress responses. Plant Signaling and Behavior, 4: 846-848.
13. Gill S.S. and Tuteja N. 2010. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48: 909–930.
16. Hoeren F.U., Dolferus R., Wu Y., Peacock W.J. and Dennis E.S. 1998. Evidence for a role for AtMYB2 in the induction of the Arabidopsis alcohol dehydrogenase gene (ADH1) by low oxygen. Genetics, 149: 479-490.
17. Ishiwatari Y., Honda C., Kawashima I., Nakamura S., Hirano H., Mori S, Fujiwara T., Hayashi H. and Chino M. 1995. Thioredoxin h is one of the major proteins in rice phloem sap. Planta, 195: 456–463.
18. Kobrehel K., Wong J.H., Balogh A., Kiss F., Yee B.C. and Buchanan B.B. 1992. Specific reduction of wheat storage proteins by thioredoxin h. Plant Physiology, 99: 919–924.
19. Ku L., Wei X., Zhang S., Zhang J., Guo S. and Chen Y. 2011. Cloning and characterization of a putative TAC1 ortholog associated with leaf angle in maize (Zea mays L.). PLoS ONE, 6: e20621.
21. Laloi C., Mestres-Ortega D., Marco Y., Meyer Y. and Reichheld J.P. 2004. The Arabidopsis cytosolic thioredoxin h5 gene induction by oxidative stress and its W-Box-mediated response to pathogen elicitor. Plant Physiology, 134:1006-16.
22. Laloi C., Rayapuram N., Chartier Y., Grienenberger J.M., Bonnard G. and Meyer Y. 2001. Identification and characterization of a mitochondrial thioredoxin system in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 98: 14144–14149.
23. Lee T.I., Rinaldi N.J., Robert F., Odom D.T., Bar-Joseph Z., Gerber G.K., Hannett N.M., Harbison C.T., Thompson C.M., Simon I., Zeitlinger J., Jennings E.G., Murray H.L., Gordon D.B. Ren B., Wyrick J.J., Tagne J.B., Volkert T.L., Fraenkel E., Gifford D.K. and Young R.A. 2002. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science, 298: 799-804.
24. Marx C., Wong J.H. and Buchanan B.B. 2003. Thioredoxin and germinating barley: targets and protein redox changes. Planta, 216: 454–460.
29. Romualdi C., Bortolzuzz S., Dalessi F. and Danieli G.A. 2003. IDEG6: a web tool for detection of differentially expressed genes in multiple tag sampling expriments. Physiological Genomics, 12: 159-162.
30. Rushton P.J., Reinstadler A., Lipka V., Lippok B. and Somssich I.E. 2002. Synthetic plant promoters containing defined regulatory elements provide novel insights into pathogen- and wound-induced signaling. Plant Cell, 14:749–762.
31. Sadeghnezhad E., Askari H., Soltani S. and Honarvar F. 2014. Identification and distribution of anaerobic responsive elements (AREs) in genes functional categorization of Arabidopsis thaliana. Journal of Applied Biotechnology Reports, 4: 135-141.
33. Schobert C., Baker L., Szederkenyi J., Grossmann P., Komor E., Hayashi H., Chino M. and Lucas W.J. 1998. Identification of immunologically related proteins in sieve-tube exudate collected from monocotyledonous and dicotyledonous plants. Planta, 206: 245-252.
34. Shamloo-Dashtpagerdi R., Razi H., Aliakbari M., Lindlöf A., Ebrahimi M. and Ebrahimie E. 2015. A novel pairwise comparison method for in silico discovery of statistically significant cis-regulatory elements in eukaryotic promoter regions: Application to Arabidopsis. Journal of Theoretical Biology, 364: 364–376.
36. Skriver K., Olsen F.L., Rogers J.C. and Mundy J. 1991. cis-acting DNA elements responsive to gibberellin and its antagonist abscisic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88: 7266-7270.
37. Taji T., Seki M., Satou M., Sakurai T., Kobayashi M., Ishiyama K., Narusaka Y., Narusaka M., Zhu J.K. and Shinozaki K. 2004. Comparative genomics in salt tolerance between Arabidopsis and Arabidopsis-related halophyte salt cress using Arabidopsis microarray. Plant Physiology, 135: 1697–1709.
38. Vanderauwera S., Zimmermann P., Rombauts S., Vandenabeele S., Langebartels C., Gruissem W., Inzé D. and Van Breusegem F. 2005. Genome-wide analysis of hydrogen peroxide-regulated gene expression in Arabidopsis reveals a high light-induced transcriptional cluster involved in anthocyanin biosynthesis. Plant Physiology, 139: 806–821.
40. Wong J.H., Kim Y.B., Ren P.H., Cai N., Cho M.J., Hedden P., Lemaux P.G. and Buchanan B.B. 2002. Transgenic barley grain overexpressing thioredoxin shows evidence that the starchy endosperm communicates with the embryo and the aleurone. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99: 16325–16330.
41. Winter D., Vinegar B., Nahal H., Ammar R., Wilson G.V. and Provart N.J. 2007. An‘‘electronic fluorescent pictograph’’ browser for exploring and analyzing large-scale biological data sets. PLoS ONE, 8:e718.
43. Yanhui C., Xiaoyuan Y., Kun H., Meihua L., Jigang L., Zhaofeng G., Zhiqiang L., Yunfei Z., Xiaoxiao W., Xiaoming Q., Yunping S., Li Z., Xiaohui D., Jingchu L., Xing-Wang D., Zhangliang C., Hongya G. and Li-Jia Q. 2006. The MYB transcription factor superfamily of Arabidopsis: expression analysis and phylogenetic comparison with the rice MYB family. Plant Molecular Biology, 60: 107-124.
44. Zhong H. and McClung C. 1996. The circadian clock gates expression of two Arabidopsis catalase genes to distinct and opposite circadian phases. Molecular and General Genetics, 251: 196–203.
45. Zhong H.H., Young J.C., Pease E.A., Hangarter R.P. and McClung C.R. 1994. Interactions between light and the circadian clock in the regulation of CAT2 expression in Arabidopsis. Plant Physiology, 104: 889–898.