Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)

Study of biodegradation ability of some petroleum derivatives by native bacteria isolated from plants rhizosphere

Document Type : Research Paper

Author

Abstract

Some bacteria present a capability in bioremediation of oil derivatives. In this study the bacteria existing in the plant rhizospere of polluted soils were isolated and purified. These bacteria were then exposed to a combination of commonly used petroleum products with different concentration. The bacteria that capable of biodegrading these compounds, were selected and determined using taxonomical keys and biochemical tests. Their efficiencies in removing the petroleum derivatives were compared. Finally, bacteria with the highest capability for degradation of all oil products were introduced. According to our results, Alcaligenese utrupha, Pseudomonas alcaligenes and Pseudomonas aeroginosa were isolated from rhizosphere of the soils contaminated by kerosene and gasoil; Pseudomonas alcaligenes, Bacillus coagulans, and Bacillus circulans were isolated from soils contaminated by kerosene and engine oil; and Pseudomonas alcaligenes was isolated from soils contaminated by gasoil and engine oil. Pseudomonas alcaligenes was able to biodegrade the all types of the studied oil products. The bioremediation efficiencies of this bactrium were 72, 63 and 56% repectively.

Keywords

بررسی قابلیت تجزیه زیستی برخی از فراورده­های نفتی توسط باکتری­های بومی ریزوسفر گیاهان 

فریبا محسن زاده 

همدان، دانشگاه بوعلی سینا همدان، گروه زیست­شناسی

تاریخ دریافت: 10/3/93                تاریخ پذیرش: 16/5/93

چکیده

برخی از باکتری­ها قابلیت زیست­پالائی ترکیبات نفتی را دارند. در این تحقیق باکتری­های موجود در ریزوسفر گیاهان خاک­های آلوده با محصولات نفتی سازگار، جداسازی و خالص­سازی شد. سپس باکتری­های با توانایی تجزیه زیستی این ترکیبات انتخاب شدند و با استفاده از کلیدهای تاکسونومی و تست­های بیوشیمیایی شناسایی شدند؛ و توانایی آن­ها در حذف فراورده­های نفتی مقایسه گردید. در نهایت باکتری های با بالاترین توانایی تجزیه تمام فراورده­های نفتی مورد بررسی معرفی گردید. طبق نتایج ما از خاک­های آلوده به نفت سفید و گازوئیل، آلکالی­ژنز یوتروفا، سودوموناس آلکالی­ژنز و سودوموناس آئروژنزا، از خاک های آلوده به نفت سفید و روغن موتور، سودوموناس آلکالی­ژنز، باسیلوس سرئوس، باسیلوس کوآگولانس و از خاک های آلوده به روغن موتور و گازوئیل، سودوموناس آلکالی­ژنز جداسازی گردید. سودوموناس آلکالی­ژنز توانایی تجزیه­زیستی تمام انواع ترکیبات فراورده­های نفتی مورد بررسی را داشت. راندمان حذف­زیستی این ترکیبات توسط باکتری فوق در تیمارها به ترتیب 72،  63 و 56 درصد برآورد گردید.

واژه های کلیدی: آلودگی نفتی خاک، باکتری­های بومی، زیست­پالائی، سودوموناس آلکالی­ژنز

* نویسنده مسئول، تلفن: 09188131040 ، پست الکترونیکی: fmohsenzade@gmail.com 

مقدمه 

 

خاک اساس هستی، تولید و انبار مواد خام است و نقش مهمی را در زندگی انسان ایفا می­کند.  برنامه­ریزی برای داشتن خاکی سالم و تولیدکننده، لازمه بقای انسان است (7). فراورده­های نفتی، از مهمترین آلاینده­های آلی محیط زیست به ویژه خاک هستند (5)، ورود این ترکیبات به طبیعت، به سبب سمی بودن و ایجاد جهش و سرطان­زائی برای موجودات­زنده، از مهم­ترین نگرانی­های حامیان محیط­زیست است. این دسته از آلاینده­های آلی، پایداری زیادی در خاک دارند و انباشته شدن تدریجی آن­ها در خاک، موجب اختلال در کارکرد طبیعی خاک از جمله کاهش عملکرد محصولات کشاورزی و تغییر در ویژگی­های خاک می­گردد (9،33). نیاز به اصلاح محیط­های آلوده، سبب توسعه فن­آوری­های گوناگونی برای رفع آلودگی­های آلی از خاک شده­است (7). فن آوری­های فیزیکی و شیمیایی نظیر تصفیه حرارتی، تثبیت، سوزاندن و جامدسازی، جهت حذف آلودگی از مناطق با وسعت نسبتاً کم کاربرد­دارند و برای رفع آلودگی­های گسترده، صرفه اقتصادی ندارند؛ درنتیجه نیاز به  روش­های اقتصادی­تر پاک­سازی خاک­های آلوده کاملا محسوس است (7،9،27،32).

 زیست­پالائی و گیاه­پالایی یک فن­آوری نسبتاً نوین پالایش خاک­های آلوده است که در آن از موجودات­زنده و گیاهان جهت حذف یا کاهش غلظت آلاینده­های معدنی، رادیواکتیو و آلی به­ویژه ترکیبات­نفتی از محیط­زیست استفاده­می­شود (26،40). زیست­پالائی خاک­های آلوده به مواد­نفتی از جدیدترین روش­های مطرح در زمینه پاک­سازی خاک­ها از مواد­نفتی است و همچنین ابزاری مهم جهت کاهش آلودگی­های محیط­زیست می­باشد (10،30،49). پژوهش­های متعددی در دست­است که نشان­می­دهد، سویه­های مختلف باکتریایی نه­تنها نسبت به آلودگی­های نفتی مقاوم­هستند، بلکه برخی از آن­ها قادرند از این ترکیبات به عنوان منبع کربن و ماده غذایی استفاده کنند؛ بنابراین وجود آلاینده­های نفتی نه تنها مانع رشد باکتری­ها نمی­شود بلکه موجب رشد بیشتر و سریعتر برخی گونه­ها نیز می گردد (7،45).

در پژوهشی، کاریمورا و همکاران موفق به جداسازی سویه اسفینگوموناس الوده آ از خاک های آلوده شدند که قادر بود از کربازول و سایر ترکیبات نفتی استفاده کند. نتایج آن­ها نشان­داد که با افزایش میزان رشد باکتری، میزان تجزیه مواد نفتی افزایش می یابد (25). پژوهشگران دیگر نیز با تحقیقاتی که در خصوص جداسازی و شناسایی باکتری­های تجزیه کننده بنزین از خاک­های آلوده پمپ­های بنزین انجام­دادند، موفق به جداسازی گونه­های سودوموناس رودوکوکوس و فلاووباکتریوم گردیدند (29). در مطالعه­ای دیگر با عنوان مصرف هیدروکربن­های­نفتی به کمک باکتری­های بومی، نتایج قابل توجهی به­دست­آمده­است. عمده باکتری­های جداسازی و شناسایی­شده را باسیلوس مگاتریوم، سودوموناس پوتیدا، باسیلوس برئیس، انتروباکتر آئروژنز و باسیلوس پونی­لیس تشکیل می دادند (37). همچنین در تحقیق دیگری که توسط اوکوه و همکاران (35) انجام گرفت، توان گونه بورخولدریا اسپسیا آر کیو در تجزیه زیستی نفت خام سنگین مورد بررسی قرار گرفت. این باکتری از نفت خام به عنوان تنها منبع­کربن استفاده­نمود و در مدت 15 روز جمعیت باکتری از 105 به 108cfu  افزایش یافت (35).

با توجه به اینکه معمولا خاک­ها به ترکیبی از فراورده­های نفتی آغشته می­گردند و تاکنون هیچ تحقیقی بر روی فلور میکربی که قادر به حذف همزمان ترکیبات مختلف نفتی باشد صورت نگرفته­است، لزوم انجام این بررسی احساس می­شود. بنابراین پژوهش حاضر با هدف یافتن باکتری­های ریزوسفری دارای قابلیت بالا در تجزیه­زیستی طیف وسیعی از فراورده­های نفتی در خاک­های­آلوده شهر همدان، صورت گرفت.

مواد و روشها

آماده سازی نمونه­ها: نمونه­هایی از خاک همراه (اطراف) ریشه گیاهان رویش یافته در خاک­های آلوده شهر همدان، از نقاط مختلف شهر، جمع­آوری و در پاکت­های یک بار­مصرف جهت انجام آزمایشات­میکروبی به آزمایشگاه منتقل­گردید. نمونه­های خاک پس از جداسازی مواد­زائد، از صافی با قطر منافذ 2 میلی­متری عبور داده­شدند. سپس نمونه­ها کاملا با هم مخلوط و یک نمونه یکنواخت تهیه گردید.

سازگار کردن باکتری­های ریزوسفری با فراورده­های نفتی: جهت سازگار­کردن باکتری­های موجود در نمونه­خاک مورد بررسی، و غالب شدن سوش­های دارای قابلیت تجزیه­زیستی ترکیبات نفتی موجود در آن، نمونه همگن­شده به فراورده­های نفتی مختلف ( نفت سفید، گازوئیل، روغن موتور) به صورت دو به دو ( نفت و گازوئیل، نفت و روغن موتور و گازوئیل و روغن موتور) در غلظت 1 درصد (با نسبت مساوی) آغشته شدند. نمونه­ها در دمای آزمایشگاه به مدت یک­ماه نگهداری شدند. برای حفظ رطوبت مورد نیاز باکتری­ها،  نمونه­ها به صورت روزانه با آب مقطر اسپری گردیدند.

کشت و جداسازی باکتری­های خاک: بعد از گذشت یک­ماه رقت­های متوالی از ۱-۱۰ تا 9-۱۰ نمونه­های خاک در محیط­کشت مغذی حاوی آگار غنی­شده با ۵٪ عصاره مخمر به روش آمیخته کشت داده­شد و به مدت یک هفته در دمای آزمایشگاه نگهداری گردیدند. سپس انواع پرگنه­های رشد کرده جداسازی و به روش کشت خطی خالص­سازی و هر سویه باکتریایی با یک کد مشخص شد.

بررسی حذف­زیستی فراورده­های نفتی: سترون  سازی فراورده­های نفتی: برای اینکه در نمونه­های تیمار­­شده با فراورده­های ­نفتی فقط عملکرد باکتری تلقیح­شده بررسی­گردد، بایستی فراورده­های نفتی مصرفی ابتدا سترون­شوند. از­آن­جا که حرارت، احتمالا موجب تبخیر یا تغییر ماهیت بخشی از مواد تشکیل­دهنده فراورده­های نفتی می­گردد، عمل سترون­سازی با استفاده از فیلتراسیون با کمک صافی­های نیتروسلولزی سترون با قطر منافذ 45/0 میکرون صورت گرفت (21).

آماده­سازی باکتری­ها جهت تلقیح: ابتدا به منظور بالابردن و یکسان­سازی جمعیت سوش­های باکتریائی جدا­شده در مرحله قبل، یک پرگنه از هر سوش در محیط نوترینت براث کشت داده شد و بعد از رسیدن به کدورتی معادل 1/0- 08/0، رسوبی از هر سوش باکتریائی تهیه شد(18).

تهیه تیمارها جهت بررسی قابلیت حذف فراورده­های نفتی باکتری­های جدا شده:  رسوب حاصل از هر سوش باکتری تهیه شده، به محیط کشت حاوی نمک های ضروری رشد باکتری ها (جدول 1)، و ترکیبی از فراورده­های نفتی رایج با نسبت های مساوی (نفت و گازوئیل، نفت و روغن موتور، گازوئیل و روغن موتور و نهایتا گازوئیل، روغن موتور و نفت) با غلظت 5/0، 1، 5 درصد، تلقیح گردید. لوله­های فاقد باکتری به عنوان شاهد تهیه­گردید (51). سپس نمونه­های فوق به مدت یک ماه در دمای 25 درجه­سانتیگراد در محیط آزمایشگاه بر روی شیکر، نگهداری­شدند (24). جهت کنترل آلودگی ثانویه تیمارها، هر هفته یک قطره از نمونه مجددا بر روی محیط کشت آگار مغذی کشت داده شد و پرگنه  باکتریها با باکتری اولیه مقایسه گردید.

 

جدول 1- ترکیب نمک­های موجود در محیط کشت نمکی حداقل

ماده 

کلرید آمونیوم

سولفات آهن

سولفات منیزیم

فسفات سدیم

کلرید کلسیم

کلرید پتاسیم

کلرید سدیم

غلظت درمحیط کشت

(گرم بر لیتر) 

2

1

2

2

1/0

8/0

8/0


بررسی میزان رشد باکتری­ها: میزان رشد توده میکروبی نمونه­های تیمار شده از طریق بررسی کدورت نمونه­ها ارزیابی گردید. جهت این منظور میزان جذب نوری نمونه­ها بعد از مدت یک ماه توسط دستگاه اسپکتوفتومتری در طول موج 600  نانومتر اندازه­گیری و مقدار آن با محیط شاهد مقایسه گردید (18،23،24،25).

شناسایی باکتری­های دارای پتانسیل حذففراورده­های نفتی: باکتریهایی که در محیط فوق قادر به ایجاد کدورت بودند، از طریق تست های بیوشیمیائی اختصاصی (اکسیداز، لوان، سیترات، تحرک، متیل­رد، لیسیتیناز، هیدرولیز اوره، لیپاز، اندول، احیای نیترات و ...)، بررسی و شناسائی گردیدند (26).

بررسی راندمان حذف فراورده­های نفتی: برای اندازه­گیری غلظت باقیمانده فراورده­های نفتی در گروههای تیماری٬ بعد از اتمام دوره آزمایش، ترکیبات نفتی باقیمانده با دی کلرومتان استخراج، و میزان جذب نوری آن در طول موج 420 نانومتر قرائت گردید (51). از آنجایی که کاهش بخشی از محصولات نفتی به دلیل فرار بودن آنها است، مقایسه غلظت ترکیبات نفتی با نمونه­های شاهد فاقد باکتری صورت گرفت (6). سپس غلظت­های باقیمانده با غلظت اولیه مقایسه و به صورت درصد حذف ترکیبات نفتی محاسبه گردید (15).

آنالیز آماری: مقایسه مقادیر حاصل از سنجش کدورت نمونه­ها جهت اندازه گیری قابلیت حذف­زیستی باکتری­های جدا­شده و راندمان حذف فراورده­های نفتی توسط آن­ها، با استفاده از نرم­افزار SPSS ورژن 19 از طریق آزمون آماری آنالیز واریانس چند جانبه در سطح احتمال 05/0 انجام گرفت.

نتایج

جداسازی و شناسائی باکتری­های تجزیه­کننده فراورده­های نفتی: خاک­های اطراف ریشه جمع­ آوری شده از مناطق آلوده به فراورده­های نفتی که از بخش­های مختلف شهر همدان جمع­آوری شده بودند، با ترکیبی از محصولات نفتی مورد مطالعه آغشته شدند و پس از سازگار کردن فلور باکتریائی آن با این محصولات، باکتری­هایی که قادر به رشد در حضور کمپلکس موجود در آن بودند، جداسازی گردید و با غلظت های مختلفی از این فراورده­های ترکیبی (نفت و گازئیل، نفت و روغن موتور، و نهایتا روغن موتور و گازوئیل) (5/0، 1 و 5 درصد)  به مدت یک ماه تماس داده­شد. باکتری­هائی که قادر به استفاده همزمان از این محصولات بودند در محیط­کشت ایجاد کدورت نمودند. نتایج حاصله نشان داد که در مجموع ۳ سوش باکتریایی در حضور نفت سفید و گازوییل رشد نمودند. در حضور گازوییل و روغن موتور یک سوش باکتریایی و در حضور نفت سفید و روغن موتور٬ ۳ سوش باکتریایی رشد نموده­اند که جداسازی و شناسایی شدند. باکتری سودوموناس الکالیژنز تنها باکتری بود که در هر سه گروه تیماری مشاهده گردید و بنابر این قادر به رشد در حضور هر سه فراورده نفتی مورد آزمایش می­باشد. خصوصیات باکتری­های جداسازی­شده در جدول 3 آورده­شده­است.

 

جدول2-  باکتری­های مصرف کننده ترکیبات نفتی موجود در فراورده­های مختلف نفتی 

باکتری­های رشد­کرده در نمونه­های تیمار شده با نفت سفید و گازوئیل

سودوموناسآلکالی­ژنز

(Pseudomonas alchaligenes)

سودوموناس آئروژنز(Pseudomonas aerogenosa)

آلکالی­ژنز یوتروفا (Alcaligenese utrupha)

باکتری­های رشد­کرده در نمونه­های تیمار شده با گازوئیل وروغن موتور

سودوموناس آلکالی ژنز

باکتری­های رشد­کرده  در نمونه­های تیمار شده با نفت سفید و روغن موتور

سودوموناس آلکالی ژنز

باسیلوس کوآگولانس(Bacillus coagulans)

باسیلوس سیرکولانس (Bacillus circulans)

 

جدول 3- مهمترین ویژگی­های ریخت شناسی باکتری­های شناسائی­شده

جدایه

خصوصیات مرفولوژیکی

 

سودوموناس آلکالی­ژنز

 

گرم منفی، میله­ای متحرک، به شدت هوازی، پرگنه­های بژ روشن، موکوسی، دارای هاله در اطراف، برآمدگی جزئی در مرکز و قابلیت چسبندگی به محیطکشت.

آلکالی­ژنز یوتروفا

 

گرم منفی، میله­ای متحرک، به شدت هوازی، اکسیداز مثبت، کاتالاز مثبت ، اوره­آز مثبت، پرگنه­های ریز، بژ رنگ با حاشیه منظم و قابلیت چسبندگی به محیط­کشت.

 

سودوموناس آئروژنزا

 

گرم منفی، لاکتوز منفی، اکسیداز مثبت، توانایی رشد در دمای ۴۲ درجه سانتیگراد و ویژگی فلوئورسانس در برابر نور فرابنفش .

باسیلوس کوآگولانس

گرم مثبت، میله­ای متحرک، هوازی، ایجاد اندوسپور، مقاوم به عوامل فیزیکی و شیمیایی ، در فاز رشد گرم منفی ، کاتالاز مثبت، نیترات منفی، رشد اسپور­ها در محیط اسیدی.

باسیلوس سیرکولانس

 

 

گرم مثبت، میله­ای، دارای اسپور­های بزرگ، کاتالاز مثبت، متحرک، تخمیر­کننده گلوکز، دارای پرگنه نیمه شفاف با اندازه متغیر و متحرک، دارای مرز باریک بین پرگنه­های اصلی و میکرو پرگنه­ها.

 


اثر غلظت فراورده­های نفتی: بعد از تماس یک ماهه هر یک از سه باکتری ایجاد­کننده کدورت با نفت سفید٬ روغن موتور و گازوئیل (سودوموناس آلکالیژنز، آلکالی ژنز یوتروفا و سودوموناس آئروژنزا) در غلظت­های 5/0، 1 و 5 درصد ترکیب این فراورده­ها به صورت دو به دو به نسبت مساوی (طبق گروه­های تیماری)، حذف زیستی الاینده ها بررسی گردید. نتایج نشان داد افزایش غلظت از 5/0 درصد تا 5 درصد  باعث کاهش معنی­داری در راندمان حذف زیستی آلاینده­ها توسط هر سوش باکتریائی گردید (05/0≥ p). شیب کاهش راندمان با افزایش غلظت از 5/0 تا 1 درصد کمتر از میزان آن از غلظت 1 تا 5 درصد بود اما به طور کلی بیشترین میزان حذف در غلظت 1 تا 5 درصد آلاینده اتفاق افتاد. به طور متوسط بیشترین راندمان حذف آلاینده­ها در غلظت 5/0 درصد و کمترین آن در غلظت 5 درصد فراورده­های نفتی مشاهده گردید (نمودارهای 1 ، 2 و 3).

اثر سوش باکتریائی: نتایج نشان داد، کلیه باکتری­ها در غلظت­های مورد آزمون فراورده­های نفتی، توانستند ترکیبات نفتی را از محیط­کشت حذف کنند، اما در بین باکتری­های مورد بررسی سودوموناس آلکالی­ژنز بیشترین راندمان حذف را در کلیه غلظت­ها و فراورده­های مورد آزمون از خود نشان­داد. تفاوت راندمان حذف آلاینده­های باکتری مذکور با سایر باکتری­ها معنی­دار بود (01/0≥ p) (راندمان حذف­زیستی این ترکیبات توسط باکتری فوق در تیمارها به ترتیب 72،  63 و 56 درصد برآورد گردید.) (نمودارهای 1 ، 2 و 3).

 

 

 

نمودار1- (درصد) حذف فراورده­های نفت سفید و گازوئیل توسط باکتری­ها در غلظت­های مختلف آلاینده­ها (در مدت زمان تماس یک­ماهه)

 

بعد از سودوموناس آلکالی­ژنز، در تیمارهای حاوی ترکیب نفت  سفید و گازوئیل، باکتری های آلکالی­ژنز یوتروفا و سودوموناس آئروژنزا، در تیمارهای حاوی ترکیب نفت سفید و روغن موتور، باکتری­های  باسیلوس کوآگولانس و باسیلوس سیرکولانس از نظر راندمان حذف­زیستی در جایگاه­های بعدی قرار گرفتند. در ترکیب روغن موتور و گازوئیل فقط باکتری سودوموناس آلکالی­ژنز قادر به تجزیه­زیستی بود (نمودار 3).

 

 

 

نمودار2- (درصد) حذف نفت سفید و روغن موتور توسط باکتری­ها در غلظت­های مختلف (در مدت زمان تماس یک­ماهه)

 

نمودار3- (درصد) حذف آلاینده­ها توسط باکتری Pseudomonas alcaligenesدر غلظت­های مختلف آلاینده­ها (در مدت زمان تماس یک­ماهه) 


بحث ونتیجه گیری

با مطالعه و دقت بر همه روش­های رفع آلودگی­های نفتی در محیط­زیست و اشاره به اینکه سایر روش­های حذف مثل سوزاندن و دفن­کردن در زمین، علاوه بر هزینه­بر بودن، در دراز مدت اثرات زیست­محیطی نامطلوبی را به­جا می­گذارند، می­توان تکنولوژی "زیست­پالایی" را به عنوان یکی از بهترین و عملی ترین روش­های رفع آلودگی­های نفتی در اکوسیستم­های آبی و خشکی مطرح کرد."زیست­پالایی" یک روش قابل انعطاف، مناسب از نظر اقتصادی، پراهمیت و تکنیکی برای بهبود نواحی آلوده نفتی می باشد (13).

نتایج این پژوهش نشان­داد که در فلور باکتریائی خاک­های آلوده به ترکیبات نفتی، باکتری­های با قابلیت سازگار­شدن با ترکیبات نفتی وجود­دارد و این بدین معنی است که آلودگی به ترکیبات نفتی مانع رشد همه باکتری­های خاک در محیط­های آلوده نیست (42). نتایج حاصله از پژوهش جاری، با نتایج بدست­آمده توسط پژوهشگران متعدد پیشین همسو است (۳7،۳8،46).

در این پژوهش از روش تلقیح باکتری بومی جداسازی­شده از خود محیط آلوده و بکارگیری آن در زمینه سالم­سازی زیستی آلاینده هیدروکربنی در خاک استفاده شده­است. پژوهشگران کارائی این روش را در حذف­زیستی آلاینده­ها به اثبات رسانیده­اند (11) و علت این امر را سوخت­وساز و سازگاری ژنتیکی جمعیت میکروبی در محیط­زیست خودشان می­دانند (3،4،16).

 طبق نتایج این پژوهش گونه­های مختلف جنس باسیلوس قادر به تجزیه فراورده­های هیدروکربنی بودند. در یک پژوهش با مقایسه میان 5 سویه جدا­شده از خاک، تنها سویه باسیلوس قادر به مصرف بالای ترکیبات نفتی بود و توانایی این گروه در زیست­پالایی ترکیبات­نفتی به اثبات رسید (۳۹). در نتیجه بررسی­های به­عمل­آمده از این پژوهش و تایید آن توسط سایر محققین گونه­های باسیلوس به دلیل داشتن روکش درون سلولی از اسپور جزو گونه­های با مقاومت بالا در برابر غلظت­های بالای آلودگی­های هیدروکربنی به شمار می­آیند (3۹).

 تاثیر مثبت جنس سودوموناس در زیست­پالایش فراورده­های نفتی که از نتایج تحقیق حاضر است با نتیجه بوسرت و بارتا (12) هماهنگی دارد .همچنین محققان دیگر، طی پژوهش های خود تاثیر مثبت حضور باکتری سودوموناس را در زدودن آلاینده­های آلی گزارش کرده­اند (28،۴1). وکت و همکاران (50) تاثیر مثبت باسیلوسها را در تجزیه آلاینده­های آلی نشان­دادند. داس و ماخرجی (17) بکارگیری دو گونه باکتری باسیلوس و سودوموناس را برای کاهش مجموع هیدروکربن­های ­نفتی در نمونه خاکی از منطقه شمال شرقی هند بررسی نمودند. نتایج پژوهش آن­ها حاکی از توانایی هر دو باکتری در کاهش مجموع هیدروکربن­های نفتی بود.

نتایج ما نشان­داد که باکتری­های سازگار با ترکیبات­نفتی متنوع هستند و جنس­های مختلفی همچون سودوموناس، باسیلوس، آلکالی­ژنز را شامل می شوند. محققان قبلی نیز جنس­های مختلفی از باکتری­ها را در خاک­های آلوده به ترکیبات نفتی یافته­اند(1،14،37،51). طبق نتایج ما دو جنس سودوموناس و باسیلوس در بین سوش­های بومی باکتریائی تجزیه­کننده نفت وجود دارند. این دو جنس توسط برخی محققان پیشین نیز گزارش گردیده است(1،6،37،42،50).

نتایج ما نشان­داد، که راندمان حذف نفت سفید در مورد کلیه باکتری­های بررسی­شده، در غلظت­های نسبتا کم فراورده­های نفتی(5/0درصد) بیشتر از سایر غلظت­هااست. این نتایج با نتایج حاصل از رشد بیشتر باکتری ­ها در این غلظت هم­خوانی دارد(نمودار 1و 2). بنابراین علت این امر را می توان در بیشتر بودن تراکم باکتری­ها در این غلظت نسبت داد. تفاوت در میزان تحمل آلودگی نفتی باکتری­های جداسازی شده از خاک­های آلوده به ترکیبات نفتی توسط پژوهشگران متعدد گزارش شده­است (25،31).

طبق نتایج ما گونه باکتریائی سودوموناس آلکالی­ژنز با قابلیت تجزیه فراورده­های نفتی از خاک­های آلوده به ترکیبات نفتی مختلف جداسازی شده است. با توجه به اینکه توان رشد و قابلیت تجزیه ­باکتری­ها به شرایط محیطی و آب و هوایی بستگی­دارد(4) می توان نتیجه­گیری کرد که این باکتری در شرایط آب و هوایی سردسیر هم بهترین باکتری تجریه کننده ترکیبات نفتی است. نتایج ما با یافته­های برخی پژوهشگران که تجزیه ترکیبات نفتی توسط سویه سودوموناس آلکالی­ژنز جدا شده از خاک­های مناطق غیر سردسیر را تائید کرده بودند، همسوئی دارد(17،25،۴1،51).

نتایج آنالیز آماری نشان داد که فاکتور غلظت، سویه باکتری و اثر تعاملی آن­ها در تمامی سطوح، معنی­دار است و کلیه باکتری­ها در غلظت­های مورد آزمون فراورده­های نفتی، توانستند آن را از محیط­کشت حذف کنند، اما در بین باکتری­های مورد بررسی سودوموناس آلکالی­ژنز بیشترین راندمان حذف را در کلیه غلظت­های مورد آزمون فراورده­های نفتی از خود نشان داد. راندمان حذف­زیستی این ترکیبات توسط باکتری فوق در تیمار نفت سفید و گازوئیل بیشترین مقدار را داشت. علت این امر قابلیت تجزیه بیشتر ترکیبات موجود در این دو فراورده نفتی می­تواند باشد (22،36،48)، بعد از سودوموناس آلکالی­ژنز، باکتری آلکالی­ژنز یوتروفا و باسیلوس کوآگولانس و سپس بقیه باکتری­ها به ترتیب بیشترین راندمان حذف را داشتند.

در نهایت در بین کل باکتری­های مورد آزمون، باکتری سودوموناس آلکالی­ژنز با دارا بودن رشد بیشتر و راندمان بالاتر، بیشترین راندمان حذف آلاینده را در کل غلظت­های ترکیبات نفتی مورد آزمون، از خود نشان داد. بنابراین، این باکتری بعنوان شاخص تجزیه کننده فراورده­های  نفتی از خاک­های آلوده، معرفی گردید. با وجود تنوع باکتریائی بیشتر خاک­های آلوده به نفت سفید و گازوئیل، نسبت به روغن موتور، باکتری سودوموناس آلکالی­ژنز به عنوان یک سوش باکتریائی همزیست با ریشه گیاهان و موثر در حذف انواع ترکیبات نفتی معرفی شد.

  1. آموزگار، م.، اخوان سپهی، ع.، اخوان سپهی، ف.، (1388)، جداسازی و شناسایی باکتری­های هالوتولرانت تجزیه­کننده از خاک چاه­های نفت قم، فصلنامه دانش میکروب­شناسی، 1 (3): 5-10.
  2. براتی، ب.، (1384)، دستور کار آزمایشگاه میکروب­شناسی، انتشارات دانشگاه تهران.
  3. راهب، ج.، یخچالی، ب.، (1380). بررسی ژنتیکی چند سویه باکتری بومی قادر به گوگردزدائی ترکیبات نفتی. مجله زیست شناسی ایران، 11 (3): 1-11.
  4. راهب، ج.، کفایتی، م. الف.، بردانیا، ح.، (1391)، گوگردزدائی زیستی ترکیبات آلی گوگرددار سوخت­های فسیلی. مجله زیست شناسی ایران، (2): ۲۰۵-۲۱۰.
  5. طلایی، الف.، طلایی، م.، جعفرزاده حقیقی فر، ن.، (1388)، بهینه­سازی بیولوژیکی فاضلاب­های حاوی گازوئیل شناور بر روی سطح آب به روش تاگوچی، مجله آب و فاضلاب اصفهان، 88 (3): 57.
  6. ناصری، س.، مصداقی­نیا، ع.، عمرانی، ق.، رضایی، س.، ندافی، ک.، یونسیان، م.، اربابی، م.، (1384)، حذف هیدروکربن­های آروماتیک چند حلقه­ای PAHs از خاک­های آلوده به ترکیبات نفتی توسط کنسرسیوم میکروبی، گزارش نهایی طرح تحقیقاتی، دانشگاه علوم پزشکی تهران.
  7. یوسفی کبریا، د.، خدادادی، الف.، کنجی دوست، ح.، بادکوبی، الف.، آموزگار، م.، (1388)، جداسازی باکتری بومی از خاک آلوده پالایشگاه نفت تهران با توانایی حذف گازوئیل، هشتمین کنگره بین المللی مهندسی عمران، دانشگاه شیراز، شیراز.
    1. Abiola, A., Olenyk, M., (1998), Effects of organic amendment and surfactants on bioremediation of hydrocarbon contaminated soil by composting, The 8th Annual National Composting Conference of The Composting Council of Canada, Ottawa, Ontario; 4-6.
    2. Alexander, M., (1995), How toxic are toxic chemicals in soil, Environmental Science and Technology, 29: 2713-2717.
    3.  Autry, A.R., (1991),  Ellis GM. Environmental progress, 11: 318.
    4.  Bento, F.M., Camargo, F.A.O., Okeke, B., (2003), Bioremediation of soil contaminated by diesel oil, Braz. J. of Microbiol , 34: 65-68.
    5.  Boossert, I.D., Bartha, R., (1984), The fate of petroleum in soil ecosystems In: Atlas RM (ed). Petroleum Microbiology, Mac Millan Publishing Co; New York, 435-474.
    6.  Brown, J.L., Syslo, J., Lin, Y.H., Getty, S., Vemuri, R., Nadeau, R.,( 1998),  On-site treatment of contaminated soils: An approach to bioremediation of weathered petroleum compounds, J. of Soil Contamination, 7: 773-800.
    7.  Bundy, J.G., Paton, G.I., Campbell, C.D., (2002), Microbial communities in different soils types do not converge after diesel contamination, J. Appl. Microbiol, 92: 276-288.
    8.  Delille, D., Bassères,  A., (1998), Dessommes  AA. Effectiveness of bioremediation for oil-polluted Antarctic seawater, Polar Biol, 19: 237-241.
    9.  Devinny, J., Chang, S.H., (2000), Bioaugmentation for soil bioremediation In: Wise, D.L.;Trantolo, D.J.(eds.) Marcel Dekker, Inc., New York, 465-488.
    10.   Das, K., Mukherjee, A.K., (2006), Crude petroleum-oil biodegradation efficiency of Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a petroleum-oil contaminated soil from north-east India, Bioresource Technology, 98: 1339-1345.
    11.  Ferguson, S.H., Franzmann, P.D., Revill, A.T., Snape, I., Rayner, J.L., (2003), The effects of nitrogen and water on mineralization of hydrocarbons in diesel-contaminated terrestrial Antarctic soils, Cold Regions Science and Technology, 37:197-212
    12.  Fredrickson, J. Balkwill, D., (1998), Sampling and enumeration techniques, Geesey G & Sayler.          
    13.  Gibson, D.T., Subramanian, V., (1984), Microbial degradation of aromatic hydrocarbons. In: Gibson, D.T. (Ed.), Microbial Degradation of Organic Compounds, Marcel Dekkar, New York, 181-252.
    14.  Heitkamp, M.A., Franklin, W,, Cerniglia, C.E., (1988), Microbial metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons: Isolation and characterization of a pyrene-degrading bacterium, Appl Environ Microbiol, 54: 2549-2555.
    15.  James, G.S., (2012), Karuna KA. Bioremediation of Petroleum and Petroleum Products, Wiley.
    16.  Ijah, U.J.J., Antai, S.P., (2003), Removal of Nigerian light crude oil in soil over a 12-month period, International Bio deterioration & Biodegradation, 51: 93-99.
    17.  Khan, J.A., Rizvi, S.H.A., (2011), Isolation and characterization of microorganism contaminated sites, Adv In Applied Sci Res, 2(3): 455-460. 
    18.  Kirimura,  K., Nakagawa,  H., Tsuji, K., Kazuya, M., Kurane, R., Usami, S.H., (1999), Selective and continuous degradation of carbazole contained in petroleum oil by resting cells of Sphingomonas sp., CDH-Biosci Biotechnol Biochem, 63(9): 1563-1568. 
    19.  Leahy, J.G., Colwell, R.R., (1990), Microbial degradation of hydrocarbons in the environment, Microbial, 54: 305-315.
    20.  Lee, K., Brand, J.M., Gibson, D.T., (1995), Stereo specific sulfoxidation by toluene and naphthalene dioxygenases, BiochemBiophys Res Commun, 212: 9-15.
    21.  Lee, K., Gibson, D.T., (1996), Toluene and ethylbenzene oxidation by purified naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp., Appl Environ Microbio, 62: 3101-3106.
    22.  LU,  S., (2006), Isolation and characterization of gasoline degrading bacteria from gas station leaking-contaminated soils, J. of Environmental Sciences, 18: 969-972.
    23.  Margesin, R., Zimmerbauer, A., Schinner, F., (2000), Monitoring of bioremediation by soil biological activities, Chemosphere, 40: 339-346.
    24.  Mittal, A., Singh, P., (2009), Isolation of hydrocarbon degrading Bacteria from soils contaminated with crude oil spills, Indian J. of  Exp Biology, 47: 760-765.
    25.  Mohsenzadeh, F., Nasseri, S., Mesdaghinia, A., Nabizadeh, R., Zafari, D., Chehregani, A., (2009), Phytoremediation of petroleum contaminated soils: Pre screening for suitable plants and rhizospheral fungi, Toxicological & Environmental Chemistry, 91(8): 1443-1453.
    26.  Namkoong, W., Hwang, E.Y., Park,  J.S., Choi, J.Y., (2002), Bioremediation of Diesel-Contaminated Soil With Composting, Environmental Pollution, 23-31.
    27.  Ojo, A.O., (2006), Petroleum hydrocarbon utilization by native bacterial population from a  wastewater canal Southwest Nigeria African, J. of Biotechnoi, 5(4): 333-337.
    28.  Okoh, A.I., Ajisebutu, S., Babaloa, G., Trejo-hernandez, M.R., (2001),  potential of Burkholderia cepacia RQ in the biodegradation of heavy crude oil, Int Microbiol, 4: 83-87.
    29.  Orji, F.A., Iblene, A.A., Dike, E.N., (2012), Laboratory scale bioremediation of petroleum hydrocarbon – polluted mangrove swamps in the Niger Delta using cow dung, Malaysian J.l of Microbiology, 8: 219-228.
    30.  Parag, A., Vaishampaya, P.P., Kanekar, P., Dhakephalkar, k., (2007), Isolation and Characterization of Arthrobacter sp. strain MCM B-436 an atrazine-degrading bacterium،from rhizospher, International Biodeterioration & Biodegradation, 273-278.
    31.  Richard, J.Y., Vogel, T.M., (1999), Characterization of a soil bacterial consortium capable of degrading diesel fuel, International Bio deterioration & Biodegradation, 93-100.
    32.  Schaefer, M., Seren, O., Juliane, F., (2005), Effects of Lumbricus terrestris, Allolobo phorachlorotica and Eisenia fetida on microbial community                dynamics  in oil-contaminated soil. Soil Biology&Biochemistry, 37: 2065
    33.  Semple, K.T., Reid, B.J., Fermor, T.R., (2001), Impact of composting strategies on the treatment of soils contaminated with organic pollutants, Environ Pollut, 112: 269-283.
    34.  Shields, M.S., Montgomery, S.O., Cuskey, S.M., Chapman,  P.J., Priichard, P.H., (1991), Mutants of Pseudomonas cepacia G4 defective in catabolism of aromatic compounds and trichloroethylene, Appl Environ Microbiol, 57: 1935-1941.
    35.  Sorkhoh, N.A., Ibrahim, A.S., Ghannouin, M.A., (1993), High temperature hydrocarbon degradation by Bacillus strarothermophilus from oil polluted Kuwait desert, Applied Microbiology and Biotechnology, 39: 123-126.
    36.  Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, (1998), 19th ed, American Public Health Assosiation / American Works Assosiation /Water.
    37.  Stirling, L.A., Watkinson. R.J., (1997), Microbial metabolism of ali-cyclic hydrocarbons: isolation and properties of a cyclohexane-degrading bacterium, Journal of General Microbiology, 99: 119-125.
    38.  Talaie, A.R., (2008), Parametric study of petroleum compounds biodegradation using microorganisms, M.Sc. Thesis of Environmental Engineering, Scince and Research -University Branch-Ahvaz.
    39.  Thapa, B.A., Kumar, K.C., Ghimire, A., (2012), Areview on bioremediation of petroleum hydrocarbon contamiants in soil, Kathmandu University Journal of Science, Engineering and Technology, 8: 164-170.
    40.  Udeani, T.K.C., Obroh, A.A., Azubike, N., (2009), Isolation of bacteria  from mechanic  workshops soil environment contaminated with used engine oil. African  J. of Biotechnology,  8: 6301-6303.
    41.  Usman, D.H., Ibrahim, A.M., Abdullahi, S.,  (2012), Potencials of bacterial isolates in bioremediation of petroleum refinary wastewater, J. of aplied hytotechnology in Environmetal Sanitation, 1: 131-138.
    42.  Vogel  TM. Bioaugmentation as a soil bioremediation approach. Current Opinion in Biotechnology 1996; 7: 311-316.
    43.  Wackett, L.P., Brusseau, G.A., Householder, S.R., Hanson, R.S.A., (1989), Survey of microbial oxygenases: trichloroethylene degradation by propane-oxidizing bacteria, Appl Environ Microbiol, 55: 2960-2964.
    44.  Xu, R., Obbard, J.P., (2003), Effect of nutrient amendments on indigenous hydrocarbon biodegradation in oil-contaminated beach sediments, J. of Environmental Quality, 32 (4): 1234-1243.

 

Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 30, Issue 1
April 2017
Pages 66-76
  • Receive Date: 31 May 2014
  • Revise Date: 18 June 2014
  • Accept Date: 07 August 2014