Cellular and Molecular Research
(Iranian Journal of Biology)
An investigation on some physiological and molecular characterization of TRR14 Re-transformed Arabidopsis plant under salt stress
Document Type : Research Paper
Authors
Golestan university
Abstract
TRR14 is a small protein which is located in chloroplast. This protein was first identified in screening of trehalose resistant (TRR14) Arabidopsis seedlings. The aim of present study was physiological and molecular investigation of TRR14 re-transformed (T17) seedlings under salt stress, compared to wild type Arabidopsis seedlings (WT). For this purpose, WT and T17 seeds were grown on MS medium complemented with 0, 75, 100 and 150 mM NaCl. The results showed that under salt stress, the germination rate and trehalase activity in T17 seedlings were higher than WT. Meanwhile the results showed that anthocyanin level in WT seedlings was higher than T17 under salt stress. The Na level was highly increased in WT seedlings under 75 mM NaCl treatment, compared to T17 seedlings. The K measurements revealed that the K level in T17 seedling was 3 times more than WT seedling when grown on MS medium. But K level was decreased under 75 mM NaCl treatment in both WT and T17 seedlings. On the other hand, by adding NaCl to medium culture, the shape and size of epidermal cells were changed in both WT and T17 seedlings. While stomata numbers increased in WT leaves under NaCl treatment, it remained unchanged in T17 seedlings. The gene expression pattern showed that trehalase and TRR14 expression were increased under salt stress.
Keywords
بررسی برخی ویژگیهای فیزیولوژیکی و مولکولی گیاهان تراریخت شده با ژن TRR14 در تیمار شوری
مهناز اقدسی* و نوشین مقدم
گرگان، دانشگاه گلستان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 17/10/93 تاریخ پذیرش: 3/9/94
چکیده
TRR14، پروتئین کوچکی است که در کلروپلاست جای دارد. این پروتئین نخستین بار در غربالگری گیاهچههای آرابیدوپسیس مقاوم به ترهالوز (Trehalose Resistant) شناخته شده است. هدف از این تحقیق، بررسی فیزیولوژیکی و مولکولی گیاهان تراریختشده با ژن TRR14 در مقایسه با گیاهچههای وحشی آرابیدوپسیس در تنش شوری است. بدین منظور، بذرهای گیاه وحشی آرابیدوپسیس و تراریخت شده با ژن TRR14 در محیط کشت MS حاوی غلظتهای مختلف نمک (0، 75، 100 و 150 میلی مولار ) کشت داده شدند. نتایج نشان داد که در تیمار شوری درصد جوانهزنی و فعالیت آنزیم ترهالاز در گیاهچههای تراریخت بالاتر از گیاهچه وحشی است. همچنین این نتایج نشان داد که با افزایش غلظت نمک میزان آنتوسیانین در گیاهچه وحشی به طور قابل توجهی در مقایسه با گیاهچه تراریخت افزایش یافت. نتایج حاضر نشان داد که در تیمار 75 میلیمولار نمک، غلظت سدیم در گیاهچه وحشی بهطور قابل ملاحظهای افزایش مییابد. سنجش پتاسیم نیز نشان داد که میزان آن در گیاهچه وحشی رشد یافته بر روی محیط MS ، تقریباً سه برابر گیاهچه تراریخت است. اما تیمار 75 میلیمولار نمک، سبب کاهش میزان پتاسیم در هر دو نوع گیاهچهها شد. همچنین با افزایش میزان نمک شکل و اندازه سلولهای اپیدرمی تغییر یافته و تعداد روزنه در واحد سطح در گیاهچههای وحشی افزایش یافت، در حالی که این فاکتور در گیاهچه تراریخت تغییری نشان نداد. بررسی الگوی بیان ژن نیز نشان داد که تیمار شوری، سبب افزایش بیان ژنهای ترهالاز و TRR14 شد.
واژه های کلیدی: TRR14،، تنش شوری، جوانه زنی ، بیان ژن، ترهالاز
* نویسنده مسئول، تلفن: 09101062204 ، پست الکترونیکی: m.aghdasi@gu.ac.ir
مقدمه
شوری یکی از عوامل مهم محدودکننده در تولید محصولات کشاورزی و زراعی است. نزدیک به 800 میلیون هکتار از خشکیهای سطح کره زمین در شرایط شوری قرار دارند (22). تنش شوری روی گیاهان اثرات زیان باری را بر جای میگذارد. با شروع و توسعه تنش شوری در گیاه، همه فرآیندهای اصلی همانند فتوسنتز، ساخت پروتئینها، متابولیسم چربیها و تولید انرژی آسیب میبینند (9). گیاهان در طی تکامل مکانیسمهای محافظتی مختلفی برای غلبه بر شرایط ناخواسته محیطی به کار گرفتهاند. در پاسخ به تنشهای محیطی بسیاری از جنبههای فیزیولوژیک و متابولیسم گیاه در گیر شده و یک شبکه سیگنالینگ پیچیده برای سازگاری گیاهان با این شرایط پدید میآید (35). در پاسخ به شوری، ژنهای زیادی تنظیم میشوند که محصول آنها به طور مستقیم یا غیرمستقیم در این پدیده دخالت دارند. این ژنها در سنتز اسمولیتها، کانالهای یونی، گیرندهها، سیگنالینگ کلسیم و سایر سیگنالهای تنظیمی نقش دارند (17). بیشتر گیاهان اسمولیتهایی را در پاسخ به تنش خشکی و شوری سنتز و انباشته میکنند. برخی گیاهان با تولید اسمولیتهایی نظیر مانیتول، اونونیتول، ترهالوز، بتائین یا فروکتان بسیاری از تنشهای محیطی را تحمل میکنند (33).
ترهالوز دیساکاریدی است که از دو مولکول گلوکز با پیوند آلفا 1 و 1 ساخته شده است. این قند در طیف وسیعی از موجودات زنده اعم از باکتریها، قارچها، نماتودها، حشرات، سختپوستان و گیاهان وجود دارد و میتواند به عنوان منبع کربن و انرژی، مورد استفاده موجودات زنده قرار گیرد. پیش ماده این قند ترهالوز-6-فسفات (T6P) است که از اتصال گلوکز-6-فسفات و UDP- گلوکز و با دخالت ترهالوز-6-فسفات سینتاز (TPS) ساخته می شود. سپس T6P توسط آنزیم ترهالوز-6-فسفات فسفاتاز (TPP) دفسفریله شده و ترهالوز تولید می شود. در مسیر متابولیسم ترهالوز در گیاهان، این قند توسط آنزیم ترهالاز شکسته شده و به دو مولکول گلوکز تجزیه می شود (11). میزان قند ترهالوز در موجودات زنده بسیار اندک است و تا مدتها تصور بر آن بود که بسیاری از گیاهان فاقد این قند هستند (20). ترهالوز در زندگی گیاهان نقشهای متعدد مهمی را ایفا میکند؛ که از آن جمله میتوان تأثیر آن بر گلدهی، رشد گیاه، مصرف کربن، مقاومت به تنش و فتوسنتز را نام برد ( 24، 25، 28، 29، 31 و 32). اخیراً مشخص شده است که قند ترهالوز نقش مهمی در مقاومت به تنش در گیاهان دارد. تراریخت شدن گیاه تنباکو با ژن ترهالوز 6- فسفات سنتاز مخمر (ScTPS1) تحت پروموتور روبیسکو یا CaMV 35S promotor سبب افزایش مقاومت آن به تنش خشکی شده است . همچنین ثابت شده است که برگهای گیاهان تراریخت شده با این ژن از توازن آبی بهتری برخوردار هستند (13 و 14). از طرفی دیگر تراریخت شدن گیاهان با ژن ترهالوز 6- فسفات سنتاز سبب تولید گیاهان مقاوم به انواع تنشها مثل خشکی، سرما و شوری در تکلپهایها و در دو لپهایها شده است (13 و 20).
TRR14، پروتئین کوچکی به طول 139 اسید آمینه است که توسط ژن At4g10300 کد می شود. این پروتئین نخستین بار در غربالگری گیاهچههای Arabidopsis مقاوم به قند ترهالوز (Trehalose Resistance ) شناسایی شد و به همین جهت TRR14 نامیده شد. نقش پروتئین TRR14 در گیاه آرابیدوپسیس به درستی شناخته نشده است. اما نتایج حاصل از آنالیز ژنتیکی و بیان ژن نشان داد که بیان بالای ژن TRR14 در گیاه Arabidopsis سبب مقاومت این گیاه به غلظت قند ترهالوز می شود. این نتایج نشان داد که پروتئین TRR14 در سیگنالینگ قند ترهالوز در گیاهان نقش دارد (5). بررسیهای اولیه نشان داده که تراریختشدن گیاه Arabidopsis با ژن TRR14 سبب افزایش مقاومت این گیاهان به تنشهای شوری و خشکی شده است. در این تحقیق نشان داده شده که گیاهان تراریخت رشد یافته در محیط کشت حاوی 100 میلیمولار نمک، میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل، فعالیت آنزیم کاتالاز و پراکسیداز بالاتر از گیاهچه های وحشی بود (6). در حالی که گیاهچههای جهش یافته که فاقد بیان ژن TRR14 بودند در تنش شوری و خشکی حساستر بودهاند. به علاوه این نتایج به وضوح نشان میدهد که پروتئین TRR14 می تواند با اثر بر مکانیسمهای فیزیولوژیکی مهم گیاه نظیر تولید سیستم ریشه‌ای گسترده برای جذب آب و موادغذایی و میزان کلروفیل مناسب برای حفظ فتوسنتز در بقاء و افزایش ماندگاری گیاه در شرایط تنش نقش داشته باشد. (7). با توجه به آنکه بالا رفتن میزان قند ترهالوز در گیاهان سبب افزایش مقاومت به تنش می شود (13) و از طرفی چون پروتئین TRR14 در سیگنالینگ قند ترهالوز نقش دارد به نظر میرسد که TRR14 به نوعی در مقاوم نمودن گیاهان به تنش نقش داشته باشد. هدف از تحقیق حاضر، مقایسه برخی ویژگیهای فیزیولوژیکی و مولکولی گیاه آرابیدوپسیس تراریخت TRR14 در مقایسه با گیاه وحشی در تنش شوری است.
مواد و روشها
شرایط رشد و کشت گیاه: در این آزمایش از بذر گیاه Arabidopsis thaliana رقم کلمبیا صفر (Col-0) و گیاه تراریخت شده با ژنTRR14 (T17)استفاده شد (6). بذرها ابتدا به مدت 10 دقیقه در محلول 70 درصد اتانل و سپس10 دقیقه در محلول 20 درصد آب ژاول ضد عفونی شده و در آخرین مرحله 5 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شدند. سپس بذرها در محیط موراشیگ و اسکوگ) (MS حاوی غلظتهای مختلف 0، 75، 100، 150 میلیمولار کلرور سدیم کشت شدند(23). در هر پتری 40-50 بذر و هر تیمار با 5 تکرار انجام شد. به منظور استریفیکاسیون، بذرها به مدت 2-3 روز در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شده و بعد به اتاق کشت با دمای 2 ±24 درجه سانتی گراد تحت شرایط روز بلند (16 ساعت روشنایی/ 8 ساعت تاریکی) و شدت نور 150 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه انتقال داده شدند. بعد از 16 روز از کشت، سرعت جوانه زنی بذرها مورد بررسی قرار گرفت.
اندازهگیری شاخص روزنهای: جهت تعیین شاخص روزنهای، تعداد روزنه ها در واحد سطح برگ (یک سانتیمتر مربع) در زیر میکروسکوپ نوری معمولی و نورمارسکی (Jena, Germany) شمارش شد. سپس تعداد کل سلول اپیدرم، روزنه و تعداد کرکها در واحد سطح شمارش شده و با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:
اندازه گیری میزان آنتوسیانین: اندازهگیری آنتوسیانین به روش میتا و همکاران (1997) انجام شد(19). مقدار 02/0 گرم بافت تازه گیاه در ازت مایع خرد شده و سپس 4 میلی لیتر محلول 1 درصد اسید کلریدریک در متانول به آن افزوده و به مدت 24 ساعت در یخچال قرار داده شد. محلول حاصل به مدت 10 دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ شد. جذب نور در فاز رویی با استفاده از روش اسپکتروفتومتری در طول موجهای 530 و 757 نانومتر خوانده شد و با استفاده از فرمول زیر میزان نسبی آنتوسیانین تعیین شد:
A= A550- (0.25 A657)
A= میزان نسبی آنتوسیانین
A530و A657 به ترتیب جذب نور نمونه در طول موجهای 530 و 657 نانومتر است.
اندازهگیری فعالیت آنزیم ترهالاز: بر مبنای میزان گلوکز آزاد شده در واحد زمان با استفاده از روش اسپکتروفتومتری بر اساس تلفیقی از دو روش پرادو و همکاران (1998) و مولر و همکاران (2001) انجام شد (21 و26). به این منظور 05/0 گرم از بافت تازه گیاهی با 5 میلی لیتر بافر استخراج (شامل محلول 50 میلی مولار مورفولین اتان سولفونیک اسید (MES) با pH:6.8، محلول 1 میلی مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید ، محلول 1 درصد تریتون X100 و محلول 1 درصد پلی ونیل پیرولیدون) در هاون چینی سرد هموژن شد. پس از 2 ساعت قرارگرفتن در دمای صفر درجه سانتی گراد، سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه انجام شد. بهمنظور سنجش فعالیت آنزیم ترهالاز ، ابتدا 700 میکرولیتر از بافر50 میلیمولار MES به همراه 100 میکرولیتر از محلول 100 میلی مولار ترهالوز درون لوله آزمایش ریخته و به آن 200 میکرولیتر عصاره گیاهی اضافه شد. سپس جهت تعیین بهترین زمان برای سنجش میزان گلوکز آزاد شده در اثر فعالیت آنزیم ترهالاز نمونه ها در 4 بازه زمانی 0، 15، 35 و 45 دقیقه در دمای 35 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. در نهایت بازه زمانی 0 و 45 دقیقه انتخاب شد. به منظور توقف فعالیت آنزیم ترهالاز نمونه ها به مدت 5 دقیقه در بن ماری با دمای 100 درجه سانتی گراد قرار داده شد. در نهایت میزان فعالیت آنزیم ترهالاز بر اساس میکروگرم گلوکز آزاد شده بر گرم وزن تر گیاه در دقیقه محاسبه گردید.
اندازه گیری میزان سدیم و پتاسیم: مقدار 50 میلیگرم از نمونههای خشک آسیاب شده به مدت 5/0 ساعت در دمای 300 درجه سانتی گراد و سپس 4 ساعت در دمای 550 درجه در کوره الکتریکی قرار گرفتند. پس از سرد شدن به هر کدام از ظروف حاوی خاکستر گیاهی، 1 میلیلیتر اسید کلریدریک 6 نرمال اضافه شد. سپس حجم محلول با آب مقطر به 50 میلیلیتر رسانده شد. برای اندازهگیری میزان سدیم و پتاسیم از دستگاه فلیم فلومتر استفاده شد. غلظت یونهای سدیم و پتاسیم در نمونههای گیاهی با استفاده از منحنی استاندارد و بر حسب میلیگرم در گرم وزن خشک بافت محاسبه شد.
استخراج RNA و RT-PCR: استخراج RNA از گیاهچههای آرابیدوپسیس طبق روشSambrok و Russell (2001) صورت گرفت (27).
واکنش RT-PCR با استفاده ازکیت Prime Script One Step RT-PCR (TAKARA BIO INC Japanese) انجام شد. این واکنش در حجم کلی25 میکرولیتر با محتوی 2 میکروگرم RNA، 1 واحد آنزیم Prime Script، 5/12 میکرولیتر بافر آنزیم Prime Script، 5/0 میکرولیتر از هر یک از پرایمرهای رفت و برگشت در دستگاه PCR با برنامه حرارتی واسرشته شدن در دمای 94 درجه به مدت 2 دقیقه برای چرخه اول و برای چرخه دوم به بعد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها در دمای 60 درجه به مدت 30 ثانیه و بسط در دمای 72 درجه به مدت 1 دقیقه درجه انجام شد. محصول PCR با استفاده از دستگاه الکتروفورز روی ژل آگارز 2 درصد جداسازی شد. در پایان ژلهای به دست آمده با اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی شدند.
طراحی پرایمر: پرایمرهای رفت و برگشت ژنهای مورد بررسی (TRE: gctgcaccacgaaccagtaga , ttcttcgttctccacgttgga)، (TRR14: attgtgagcaactgggatg and tagatggggacggtggag) و (Actin: gtagatggggacggtggag and aacttgatcgggatatggagtg)ّ به کمک نرم افزار Primer 3 طراحی و از شرکت امینسان تهیه گردیدند.
آنالیز آماری: کلیه آزمایشات با 4 تکرار در قالب طرح آزمایشی کاملاً تصادفی انجام شد و در تمام اندازهگیریها رسم نمودار با نرم افزار Excel و آنالیز دادهها با نرم افزار SAS و آزمون دانکن محاسبه شد.
نتایج
اثر تیمار شوری بر جوانهزنی: بررسی درصد جوانهزنی بذر گیاه وحشی (WT) و گیاهان تراریخت (T17) در محیط حاوی غلظتهای مختلف نمک نشان داد که جوانهزنی بذور گیاهچه های وحشی از روز دوم شروع شده و تا روز هشتم تقریباً 92 درصد بذرها جوانه زدند. اما در محیط حاوی 75 میلیمولار نمک جوانه زنی از روز دوم شروع شده و تا روز دهم تنها 60 درصد از بذرها جوانه زدند. در حالی که در غلظت 100 میلیمولار نمک تنها 20 درصد از بذرها جوانه زده و در غلظت150 میلیمولار نمک اصلاً بذرها قادر به جوانهزنی نبودند (شکل ا-الف ). بررسی درصد جوانهزنی بذور گیاهان تراریخت نیز نشان داد که جوانهزنی از روز دوم شروع شده و تا روز چهارم 98 درصد بذرها جوانه زدند. ازطرفی بررسی جوانهزنی بذرهای گیاهان تراریخت در محیط کشت حاوی 75 میلیمولار نمک، نشان داد که جوانهزنی از روز دوم شروع شده و تا روز چهارم 90 درصد از بذرها جوانه زدند. اما جوانه زنی این بذور در محیط حاوی 100 میلیمولار نمک از روز دوم شروع شده و تا روز دهم تنها 78 درصد بذرها جوانه زدند. با افزایش غلظت نمک تا 150 میلی مولارنیز تنها 15 درصد بذرها قابلیت جوانه زنی از خود نشان دادند (شکل 1-ب). همچنین این نتایج نشان داد که گیاهچههای وحشی در تنش 100 میلی مولار نمک ابتدا به رنگ سفید درآمده و پس از مدتی از بین رفتند؛ اما گیاهچههای تراریخت در همین محیط قادر به ادامه حیات بودند.
شکل 1- درصد جوانهزنی الف(گیاهچههای وحشی(WT) و ب( گیاهان تراریخت شده با ژن TRR14(T17) بر روی محیط کشت MS حاوی غلظتهای مختلف NaCl در طی یک دوره 16 روزه.
انداره گیری میزان آنتوسیانین: در گیاهچههای وحشی و تراریخت در غلظتهای مختلف نمک، نشان داد که در محیط فاقد نمک بین این دو نوع گیاه تفاوتی از نظر میزان آنتوسیانین وجود ندارد. اما در غلظت 75 میلیمولار نمک، میزان آنتوسیانین در گیاهچههای وحشی بیش از پنج برابر افزایش نشان داد. گیاهچههای تراریخت نیز با تیمار شوری افزایش دو برابری در میزان آنتوسیانین خود نشان دادند. میزان آنتوسیانین در گیاهچههای وحشی و تراریخت رشدیافته در محیط حاوی 100 میلی مولار نمک تفاوت معنیداری را با گیاهچههای رشد یافته در محیط کشت حاوی 75 میلی مولار نمک نشان نداد (شکل-2).
شکل 2- اثر تیمار غلظتهای مختلف NaCl بر میزان آنتوسیانین در گیاهچههای وحشی (WT) و تراریخت شده با ژن TRR17(T17)پس از 16 روز. داده ها، حاصل میانگین چهار تکرار است.
اندازه گیری سدیم، پتاسیم و نسبت پتاسیم به سدیم: نتایج حاصل نشان داد که در محیط فاقد نمک، میزان سدیم در گیاهچههای وحشی و تراریخت با یکدیگر برابر است. با تیمار شوری میزان سدیم در گیاهچههای وحشی به طور معنی داری افزایش یافت؛ اما میزان سدیم در گیاهچههای تراریخت به طور معنیداری کمتر از گیاهچههای وحشی است. میزان سدیم در گیاهچه های وحشی و تراریخت رشد یافته در محیط حاوی 100 میلی مولار نمک تفاوت معنیداری را با یکدیگر نشان ندادند (شکل 3-الف)
اندازهگیری میزان پتاسیم نیز نشان داد که در محیط فاقد نمک، میزان پتاسیم در گیاهچههای وحشی سه برابر بیشتر از گیاهچههای تراریخت رشد یافته در همین محیط است. با تیمار شوری میزان پتاسیم در گیاهچههای وحشی و تراریخت کاهش یافت. از طرفی دیگر میزان پتاسیم در گیاهچههای وحشی رشد یافته در محیط حاوی 100 میلی مولار کاهش چشمگیری را نشان داده در حالی که در همین محیط میزان پتاسیم در گیاهچههای تراریخت افزایش 12 برابری را نشان داد (شکل 3-ب).
بررسی نسبت پتاسیم به سدیم نیز نشان داد که در محیط فاقد نمک و محیط حاوی 75 میلیمولار نمک، این نسبت در گیاهچههای وحشی بالاتر از گیاهچههای تراریخت است؛ اما با افزایش میزان نمک تا 100 میلی مولار، این نسبت در گیاهچههای تراریخت بالاتر از گیاهچههای وحشی بوده است (شکل 3-ج).
شکل 3- اثر تیمار غلظتهای مختلف NaCl بر میزان الف) سدیم، ب) پتاسیم و ج) نسبت پتاسیم به سدیم (K/Na) در گیاهچههای وحشی (WT) و تراریخت شده با ژن TRR14(T17)پس از 16 روز. داده ها، حاصل میانگین چهار تکرار می باشد.
اثر تیمار شوری بر تعداد روزنههای سطح برگ: بررسی وضعیت سلولهای اپیدرم برگ گیاهچههای وحشی و تراریخت شده که در محیط فاقد نمک رشد یافتهاند، نشان داد شکل سلولها مشابه یکدیگر است. سلولهای اپیدرمی در گیاه وحشی و تراریخت شکل مشخصی نداشته و حاشیه سینوسی دارند (شکل 4- الف). بررسیهای انجام شده نشان داد که بین تیمار صفر و 75 میلیمولار نمک، تفاوت معنیداری در شکل و وضعیت سلولهای اپیدرم و روزنه گیاهچه وحشی و تراریخت وجود ندارد؛ اما در گیاهچههای وحشی رشد یافته در محیط حاوی 100 میلیمولار نمک، شکل سلولهای اپیدرم تغییر یافته و حاشیه سلولها صاف شدهاند. از طرفی دیگر در این شرایط اندازه سلولها نیز کوچک شده است. همچنین روزنهها نیز از نظر اندازه کوچکتر شده اما تعداد روزنهها در واحد سطح افزایش یافته است (شکل 4-ب). تعداد روزنهها در واحد سطح اپیدرم گیاهچههای وحشی رشدیافته بر روی محیط MS، برابر با 3/1±9 است؛ در حالی که در تیمار 100 میلیمولار نمک تعداد روزنه به 1/2± 20 افزایش یافته است. در مقابل در گیاهچههای تراریخت رشدیافته در محیط فاقد نمک تعداد روزنه در واحد سطح 3/1±11 میباشد که تفاوت معنیداری را با تعدادروزنهها در واحد سطح گیاهچههای وحشی نشان نمیدهد. همچنین این نتایج نشان داد که در گیاهچههای T17 رشد یافته در محیط حاوی 100 میلیمولار نمک، اندازه سلولها ثابت باقی مانده اما جدارههای سلولی اندکی تغییر یافته و صاف شدهاند (شکل 4– ج). در این گیاهچهها با تیمار نمک، تعداد روزنهها در واحد سطح اندکی کاهش نشان داد (2/1±8). نگاهی به دادههای جدول 1 نشان میدهد که شاخص روزنهای در دو گیاهچه وحشی و تراریخت رشد یافته بر محیط MS تقریباً مشابه است. اما با تیمار نمک، این فاکتور در گیاهچههای وحشی افزایش چشمگیری یافته در حالی که در گیاهچههای ترایخت شاخص روزنهای اندکی کاهش یافته است (جدول 1).
جدول 1- شاخص روزنهای در گیاهچههای وحشی (WT) و تراریخت شده با ژن TRR17(T17) پس از 16 روز رشد بر روی محیط MS و یا محیط MS حاوی 100 میلی مولار نمک. داده ها، حاصل میانگین 4 تکرار است.
|
MS+NaCl |
MS |
Plant |
|
31/0 |
23/0 |
WT |
|
19/0 |
22/0 |
T17 |
شکل 4- اپیدرم و روزنه برگیاهچههای وحشی آرابیدوپسیس (WT) وتراریختشده با ژن TRR14(T17)الف) تصویر میکروسکوپ نوری معمولی از اپیدرم گیاهچههای وحشی بر روی محیط MS با بزرگنمایی 40، ب)تصویر میکروسکوپ نورمارسکی از اپیدرم گیاهچههای وحشی بر روی محیط MS حاوی غلظت 100 میلیمولار نمک با بزرگنمایی 10 و ج) تصویر میکروسکوپ نورمارسکی از اپیدرم گیاهچههای T17 بر روی محیط MS حاوی غلظت 100 میلیمولار نمک با بزرگنمایی 10.
بررسی فعالیت آنزیم ترهالاز: بررسی میزان فعالیت آنزیم ترهالاز در گیاهچههای وحشی و تراریخت، نشان داد که در محیط فاقد نمک، فعالیت این آنزیم در گیاهچههای تراریخت به طور معنیداری بالاتر از گیاهچههای وحشی است. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت نمک در محیط کشت فعالیت این آنزیم در گیاهچههای وحشی به طور معنیداری افزایش مییابد. اما فعالیت آنزیم ترهالاز در گیاهچههای تراریخت با تیمار شوری تغییر معنیداری را نشان نداد (شکل- 5).
بررسی الگوی بیان ژن ترهالاز: بررسی وضعیت الگوی بیان ژن گیاهچههای رشدیافته در محیط MS، نشان داد که بیان ژن ترهالاز (TRE) در گیاهچههای تراریخت بالاتر از گیاهچههای وحشی است؛ اما با تیمار نمک بیان این ژن در گیاهچههای وحشی به طور چشمگیری افزایش می یابد. همچنین در گیاهچههای تراریخت نیز تغییر اندکی درالگوی بیان ژن ترهالاز مشاهده می شود (شکل 6- الف).
شکل 5- اثر تیمارغلظتهای مختلف NaCl بر فعالیت آنزیم ترهالاز در گیاهچههای وحشی(WT) و تراریخت شده با ژن TRR14(T17) پس از 16 روز. داده ها، حاصل میانگین 4 تکرار می باشد.
شکل 6- اثر تیمارغلظتهای مختلف NaCl بر الگوی بیان ژن الف) ترهالاز و ب) TRR14 در گیاهچههای وحشی (WT) و تراریخت شده با ژن TRR14(T17) پس از 16 روز.
بررسی الگوی بیان ژن : TRR14: نتایج حاصل از بررسی بیان ژن در دو گروه گیاهچههای وحشی و تراریخت شده با همین ژن، نشان داد که در گیاهچههای تراریخت میزان بیان این ژن بالاتر از گیاهچههای وحشی است؛ که این امر تأییدی بر تراریخت شدن این گیاه است. بررسی الگوی بیان ژن TRR14، نشان داد که بیان این ژن در گیاهچههای وحشی تیمار شده با غلظتهای مختلف نمک نسبت به گیاهچههای وحشی رشد یافته در محیط فاقد نمک افزایش اندکی نشان میدهد؛ اما در گیاهچه های رشد یافته در محیط حاوی 100 میلی مولار نمک میزان بیان این ژن نسبت به گیاهچههای رشد یافته در محیط کشت فاقد نمک، افزایش بیشتری نشان میدهد. در گیاهچههای تراریخت نیز بیان ژن TRR14، درغلظتهای مختلف نمک افزایش یافته است (شکل 6- ب).
بحث
TRR14 پروتئین ناشناخته کوچکی به طول 139 اسیدآمینه است. آنالیز فیلوژنی آشکار کرد که TRR14 یک عضو کوچک و منشعب از خانواده ژنی درآرابیدوپسیس است. پروتئین TRR14 در کلروپلاست جای داشته و در تمام بافتها بیان می شود (6). این پروتئین دارای 6 همولوگ در گیاه آرابیدوبسیس است و پارالوگهای این پروتئین در برنج و یونجه نیز شناسایی شده است (15 و 18). این پروتیین دارای دومین کیوپین منفرد با ساختار سوم است (10) گزارشها نشان داده که پروتئینهای با ساختار کیوپین مانند ژرمین و پروتئین های مشابه ژرمین در پاسخ به تنشها نقش دارند (8 و 10).
نتایج تحقیقات حاضر نشان داد که تراریختشدن گیاه Arabidopsis thaliana با ژن TRR14، سبب افزایش درصد جوانهزنی و میزان ماندگاری گیاهچهها در تنش شوری می شود. همانگونه که پیش از این نیز نشان داده شد؛ تنش شوری سبب کاهش جوانهزنی و میزان ماندگاری در این گیاه می شود (16). اثر شوری بر جوانهزنی تعدادی از گیاهان زراعی نظیر گندم و بادام زمینی مورد بررسی قرار گرفته است. این نتایج نشان میدهد که با افزایش شوری درصد جوانه زنی کاهش مییابد (1 و 4). پیش از این نیز بررسیهای انجام شده بر روی گیاهان فاقد ژن TRR14 نشان داده که این گیاهان قادر به جوانه زنی در محیط کشت حاوی نمک نبوده و در مقایسه با گیاهان وحشی حساسیت بیشتری به نمک دارند (6). نتایج حاضر نشان داده که تراریخت شدن گیاهان با ژن TRR14 می تواند سبب افزایش میزان جوانه زنی در محیط حاوی نمک شود.
تنش شوری سبب افزایش جذب سدیم توسط گیاه می شود (12) که نتیجه آن افزایش میزان سدیم در دو بخش هوایی و ریشه گیاه است. از طرفی شوری سبب کاهش میزان پتاسیم بخش هوایی و ریشه می شود (3). نتایج حاضر نیز نشان داده که تنش شوری سبب افزایش میزان سدیم در گیاهچههای وحشی و تراریخت شده است؛ اما میزان جذب سدیم در گیاهچههای وحشی به مراتب بالاتر از گیاهچه تراریخت بوده است. نکته مهم و قابل توجه در ارتباط با گیاهچههای تراریخت آن است که میزان پتاسیم داخلی این گیاهچهها در شریط عاری از تنش، 3 برابر کمتر از گیاهچه وحشی است. اما با تیمار 75 میلیمولار نمک، میزان پتاسیم در هر دو نوع گیاهچه کاهش یافته است. علاوه بر این، گیاهچههای تراریخت در تیمار 100 میلیمولار نمک توانستهاند نسبت پتاسیم به سدیم را در خود بالا نگه دارند. بررسیها نیز نشان داده که چنانچه گیاه بتواند در تنش شوری توانایی جذب پتاسیم را نسبت به سدیم) K+/Na+ ( بالا نگه دارد قادر به مقاومت به تنش شوری خواهد بود (34).
یکی از نشانههای تنش بر روی گیاهان تجمع آنتوسیانین میباشد (30). نتایج حاضر نیز نشان داد که گیاهچه های تراریخت نسبت به گیاهچههای وحشی در تنش شوری میزان آنتوسیانین کمتری انباشته کردهاند که تأییدی بر مقاومت نسبی گیاهان تراریخت نسبت به تنش شوری است. گزارشهای پیشین نیز نشان داد که در تیمار شوری میزان فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان در گیاهان تراریخت بالاتر از گیاهچههای وحشی بوده که نشان دهنده فعال شدن سیستمهای آنتی اکسیدان جهت مقابله با تنش شوری بوده است (7).
از جمله اثرات تنش بر گیاهان، تغییر تعداد و اندازه سلولهای اپیدرمی و روزنه است (2). در نتایج حاضر، گیاهچههای تراریخت استراتژی کاهش تعداد روزنه در واحد سطح را به کار بستهاند تا در این شرایط از به هدر رفتن آب جلوگیری کنند. وان هوت و همکارن در سال 2013 نشان دادهاند که در گیاهان تراریخت آرابیدوپسیس مقاوم به خشکی، تعداد روزنههای برگ در واحد سطح گیاه در شرایط تنش کمترشده که نتیجه آن کاهش کمتر آب گیاه و مقاومت بهتر گیاهچههای تراریخت در تنش خشکی بوده است (32).
بررسی الگوی بیان ژن نیز نشان داده که بیان ژن ترهالاز در گیاهچههای تراریخت بالاتر از گیاهچه وحشی است؛ که این امر باید در بررسیهای آتی مورد بحث بیشتری قرار گیرد تا رابطه بین بیش بیانی TRR14 و ترهالاز مشخص شود. پیش از این نیز نشان داده شده که TRR14 در سیگنالینگ قند ترهالوز نقش دارد و ممکن است افزایش بیان ترهالاز در گیاهان تراریخت همین امر باشد. تیمار شوری سبب افزایش بیان ژن ترهالاز در گیاهچه وحشی شده است که به موازات آن افزایش معنیدار در فعالیت آنزیم ترهالاز نیز دیده می شود. در مقابل تغییر اندکی در میزان بیان ژن ترهالاز در گیاه تراریخت دیده شده است. اندازهگیری فعالیت آنزیم ترهالاز نیز نشان داده که تنش شوری تغییر معنیداری را در فعالیت این آنزیم در گیاهان تراریخت ایجاد نکرد. نتایج تحقیقات وان هوت و همکاران در سال 2013 نشان داد که تراریختشدن گیاه Arabidopsis thaliana با ژن ترهالاز سبب افزایش مقاومت گیاهچهها به تنش خشکی می شود. اگرچه باید در نظر داشت که در گزارش وانهوت و همکاران فعالیت آنزیم ترهالاز در گیاهچه های تراریخت 100 برابر بالاتر از گیاهچههای وحشی بود (32). در حالی که در تحقیق حاضر میزان افزایش فعالیت این آنزیم چندان بالا نبوده است. بنابراین به نظر نمیرسد که در این تحقیق علت مقاومت گیاهان تراریخت به تنش شوری ناشی از افزایش فعالیت آنزیم ترهالاز باشد.
بررسی الگوی بیان TRR14 نیز نشان داده که شوری سبب افزایش بیان این ژن می شود و همین امر نشاندهنده نقش این ژن در مقاومت به شوری در گیاه Arabidopsisاست. پیش از این نیز بررسیهای انجام شده بر روی گیاهان جهش یافته در ژن TRR14 نشان داده که این گیاهان در مقایسه با گیاهان وحشی آرابیدوپسیس نسبت به تنش شوری حساسیت بیشتری دارند (6). این نتایج نشان می دهد که تراریخت شدن گیاهان با ژن TRR14 می تواند سبب افزایش مقاومت آنها به تنش شوری شود.
در مجموع به نظر میرسد که گیاه Arabidopsis تراریخت شده با ژن TRR14 با کاهش تعداد روزنه در واحد سطح توانسته با شوری مقابله نماید. با توجه به آنکه در گیاه تراریخت میزان پتاسیم سه برابر کمتر از گیاه وحشی می باشد، بنابراین کارهای بیشتری در این زمینه به ویژه بر روی کانالهای پتاسیم و یا بیان ژنهای مرتبط لازم است صورت گیرد تا نقش واقعی ژن TRR14 در مقاومت به تنش روشن شود.
', './data/cell/coversheet/221478435298.jpg'))
Volume 29, Issue 2 - Serial Number 2
September 2016Pages 141-152
- Receive Date: 07 January 2015
- Revise Date: 18 August 2015
- Accept Date: 24 November 2015