جداسازی مخمرها از شالیزارهای برنج و بررسی کیفی آنزیمهای کاتابولیک برون ریز در دو مخمر از جنس Pseudozyma 

لیلا امینی، محمدرضا صعودی^* و شقایق نصر

تهران، دانشگاه الزهرا، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، آزمایشگاه ملی میکروبیولوژی صنعتی

تاریخ دریافت: 27/1/92               تاریخ پذیرش: 9/10/92 

چکیده

شالیزارهای برنج به دلیل ایجاد همزمان شرایط کم اکسیژن و هوازی و گوناگونی سوبسترا، زیستگاهها و مراتب اکولوژیک متنوع و متعددی را برای میکروارگانیسم های مولد آنزیم از جمله باکتریها، مخمرها و قارچهای ریسه دار فراهم می‌آورد. در این پژوهش، مجموعه ای از 46 جدایه مخمر، طی نمونه برداری از شالیزار و پس از غنی سازی و کشت در محیط YPG آگار حاوی آنتی بیوتیک جدا شدند. اغلب جدایه ها مولد آنزیمهای استراز و نوکلئاز بودند. دو جدایه SA006 و SA044 از نظر حضور آنزیمهای مختلف و همچنین برون ریز بودن برخی از آنها به  روش چاهک پلیت مورد بررسی قرار گرفتند. تولید آنزیمهای ترشحی آمیلاز، پروتئاز، نوکلئاز و لیپاز در یک یا هر دو سویه نشان داده شد ولی توانایی تولید آنزیمهای کراتیناز، سلولاز، فیتاز، زایلاناز،‌ کیتیناز و پکتیناز در هیچ یک از دو سویه دیده نشد. دو جدایه SA006 و SA044 به ترتیب به گونه های Pseudozyma antarctica و Pseudozyma aphidis تعلق داشتند.

واژه های کلیدی: آنزیمهای ترشحی، آنزیمهای کاتابولیک، بازیدیومایکوتا، سودوزیما، شالیزار، مخمر

* نویسنده مسئول، تلفن: (2733)88044051-021 پست الکترونیکی:  soudimr@gmail.com

مقدمه

مخمرها میکروارگانیسم های همه جایی هستند و بخشی از فلور میکروبی اغلب اکوسیستمهای طبیعی را تشکیل می دهند. این میکروارگانیسم ها در انواع محیطها مانند خاک، دریاچه های فقیر، تالاب ها، رودخانه ها و یخرودها یافت می شوند (9). مخمرها ساکنین طبیعی سطح گیاهان می باشند، با حیوانات در ارتباط هستند و در برخی زیستگاههای ساخته دست بشر مانند انواع غذاها نیز حضور دارند. خصوصیات فیزیکوشیمیایی محیط زیست مانند دما، pH، فشار هوا، میزان اشعه ماوراء بنفش، میزان شوری، فلور گیاهی و جانوری منطقه به عنوان عوامل اکولوژیکی داخلی و خارجی بر روی مخمرها تأثیر دارند و تنوع، فعالیت متابولیکی، ترشح انواع آنزیمها و رشد و بقای مخمر را تحت تأثیر قرار می دهند (4). وسیع ترین مطالعات انجام شده به گونه های مخمری مهم در صنعت تهیه شراب مربوط می شود در حالی که از نظر تولید آنزیم مطالعات کمتری بر روی مخمرهای دارای منشاء زیست محیطی انجام شده است (7 و 33). البته در سالهای اخیر مطالعات وسیعی بر روی مخمرهای جدا شده از محیطهای مختلف انجام شده است که هدف آن جداسازی سویه های مولد آنزیم بوده است. به طور کلی مخمرها به علت داشتن ویژگیهایی مانند نگهداری و کشت آسان، نیازهای محیطی و غذایی ساده تر نسبت به باکتریها (جز در موارد خاص)، رسیدن به تراکم بالای سلولی با هزینه کم و در محیط کشت ساده، قابلیت انجام فرآیندهای سلولی پس از ترجمه و فقدان اندوتوکسین و DNA ویروسی، اهمیت فراوانی در صنعت دارند (14 و 16). ایران دارای زیستگاههایی مانند دریاچه های شور، قلل مرتفع در نواحی کوهستانی، غارها، یخچالها و یخرودها، کویرها، شوره زارها، دریاچه های نمک و رادیواکتیو و خاکهای کشاورزی و رویشگاههای طبیعی گیاهان بومی منحصر به ایران است. بررسی تنوع و جمعیت میکروبی اکوسیستمهای بومی و اکوسیستمهای انسان - ساخت و به دنبال آن بررسی تواناییهای خاص میکروارگانیسم های این نواحی در حفظ ذخایر میکروبی و معرفی سویه های جدید بومی با تواناییهای خاص برای کاربرد در صنایع مختلف بسیار مفید است. در این میان شالیزارهای برنج به علت غنی بودن خاک زراعی و رطوبت بالای زمین، حضور انواع جانوران کوچک، گیاهان علفی، جلبکها و انواع میکروارگانیسم ها محیطی غنی و مغذی به شمار می‌رود و به همین علت در این پروژه اکوسیستم بومی شالیزار های برنج به منظور غربالگری جدایه های مخمر مولد آنزیمهای ترشحی مورد بررسی قرار گرفته است.

مواد و روشها

نمونه برداری: نمونه برداری در دو مرحله از برخی شالیزارهای مسیر شهرستانهای بابل، بابلسر، آمل و فریدونکنار انجام شد. نمونه ها از آب و خاک خزانه ها ی دستی جمع آوری شد و در فلاسک حاوی یخ در کمتر از 24 ساعت به آزمایشگاه منتقل شد.

کشت نمونه های آب: مقدار 100 میکرولیتر از نمونه آب بر روی محیط YPG آگار حاوی mg/l250 آنتی بیوتیک کلرامفنیکل کشت داده شد. پلیتها به مدت حداقل72 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری گردید.

کشت نمونه های خاک: معادل 10 گرم از نمونه های خاک در 90 میلی لیتر محلول رینگر سوسپانسیون شد و پس از گرماگذاری در دمای 30 درجه سانتی گراد، مقدار µl100 برداشته و بر روی محیط YPG آگار با غلظت mg/l250 کلرامفنیکل کشت داده شد (21). پلیتها به مدت حداقل72 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری گردید. به منظور غنی سازی بیشتر نمونه های خاک، 10 میلی لیتر از سوسپانسیون خاک تهیه شده در محلول رینگر به محیط YPG براث افزوده و پس از دو ساعت همزنی در دمای 30 درجه سانتی گراد ، به هر فلاسک، آنتی بیوتیک کلرامفنیکل با غلظت نهایی mg/l250 افزوده شد. فلاسکها 4 ساعت دیگر نیز در همان دما و دور اولیه همزنی شد. پس از این مدت، از هر فلاسک در نرمال سالین (محلول کلرید سدیم 9 گرم در لیتر) تا رقت ^3-10 تهیه شد و بر روی محیط YPG آگار دارای کلرامفنیکل کشت و به مدت 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت، پلیتها از نظر حضور مخمرها بررسی گردید.

نگهداری جدایه های مخمری: کشت خالص مخمرهای جدا شده در این پژوهش هر 30 روز به محیط غنی تازه (YPG آگار) انتقال داده شد. علاوه بر این، برای نگهداری طولانی مدت جدایه ها از محلول آبی گلیسرول 10 درصد (11 و 15) برای نگهداری در فریزر 70- درجه سانتی گراد و همچنین آب مقطر برای نگهداری در دمای 4 درجه سانتی گراد استفاده شد (28).

بررسی کیفی حضور آنزیمها در دو جدایه مخمری SA006 و SA044: بدین منظور از کشت تازه مخمرهای ذکر شده بر روی محیطهای جامد واجد سوبسترای آنزیمی به صورت نقطه ای کشت داده شد. آنزیمهای بررسی شده به شرح زیر است:

آنزیم پروتئاز: از محیط جامد واجد شیر بدون چربی (Skim milk) برای بررسی تولید آنزیم پروتئاز استفاده شد (5). پلیتها به مدت 2 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. مشاهده هاله شفاف در اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم پروتئاز است.

آنزیم آمیلاز: از محیط جامد واجد نشاسته برای بررسی تولید آنزیم آمیلاز  استفاده شد (19). پلیتها به مدت 2 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت سطح پلیت با معرف لوگل پوشانده شد. مشاهده هاله شفاف در زمینه بنفش رنگ پلیت نشان دهنده وجود آنزیم آمیلاز است.

آنزیم استراز: از محیط جامد واجد تویین 80 (Tween 80)برای بررسی تولید آنزیم استراز استفاده شد (8). پلیتها به مدت 2 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت مشاهده رسوب در اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم استراز است.

آنزیم لاکاز: الف- با استفاده از سوبسترای تانیک اسید: از محیط جامد واجد تانیک اسید برای بررسی تولید آنزیم لاکاز استفاده شد (24). پلیتها به مدت 2 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت مشاهده هاله قهوه ای رنگ در زیر و اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم لاکاز است.

ب- با استفاده از سوبسترای گوایکول: از محیط جامد واجد گوایکول برای بررسی تولید آنزیم لاکاز استفاده شد (24). پلیتها به مدت 2 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت، مشاهده رنگ قرمز تا قهوه ای در اطراف و زیر کلنی نشان دهنده حضور آنزیم لاکاز است.

با استفاده از سوبسترای رنگی کریستال ویوله: از محیط جامد واجد کریستال ویوله برای بررسی تولید آنزیم لاکاز استفاده شد (1). پلیتها به مدت 2 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت، مشاهده هاله شفاف در اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم لاکاز و تجزیه رنگ است.

آنزیم فیتاز: از محیط جامد واجد سدیم فیتات برای بررسی تولید آنزیم فیتاز استفاده شد (19). پلیتها به مدت 2 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت، از رنگ آمیزی افتراقی با محلول آبی 2 درصد (w/v) کلرید کبالت، محلول آبی مولیبدات آمونیوم 25/6 درصد (w/v) و محلول آبی وانادات آمونیوم 42/0 درصد (w/v) استفاده شد (2). مشاهده هاله شفاف در اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم فیتاز است.

آنزیم لیپاز: از محیط واجد سوبسترای چربی کره برای بررسی تولید آنزیم لیپاز استفاده شد (استاندارد شماره 4779 مؤسسه استاندارد و تحقیقات صنعتی ایران). پلیتها به مدت 3 تا 5 روز در 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت مشاهده رنگ آبی و یا فیروزه ای کلنی نشان دهنده حضور آنزیم لیپاز است.

آنزیم کراتیناز: از محیط واجد سوبسترای کراتین برای بررسی تولید آنزیم کراتیناز استفاده شد (17). پلیتها به مدت 6 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت مشاهده هاله شفاف در اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم کراتیناز است.

آنزیم DNase: از محیط دارای DNA برای بررسی تولید آنزیم نوکلئاز استفاده شد (20). پلیتها به مدت 3 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت سطح پلیت با محلول 1 نرمال هیدروکلریک اسید به مدت 20 دقیقه پوشانده شد. پس از 20 دقیقه، مشاهده هاله شفاف در زمینه کدر پلیت نشان دهنده حضور آنزیم DNase است.

آنزیم سلولاز: از محیط واجد سوبسترای کربوکسی متیل سلولز برای بررسی تولید آنزیم سلولاز استفاده شد (8). پلیتها به مدت 3 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت سطح پلیت با معرف قرمز کنگو به مدت 10 دقیقه پوشانده و پس از آن توسط 1 مولار کلرید سدیم شسته شد (36). مشاهده هاله شفاف در اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم سلولاز است.

آنزیم زایلاناز: از محیط واجد سوبسترای زایلان برای بررسی تولید آنزیم زایلاناز  استفاده شد (32). پلیتها به مدت 7 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت سطح پلیت با معرف قرمز کنگو به مدت 10 دقیقه پوشانده و پس از آن توسط 1 مولار  کلرید سدیم شسته شد (36). مشاهده هاله شفاف در اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم زایلاناز است.

آنزیم کیتیناز: از محیط واجد سوبسترای کیتین بررسی تولید آنزیم کیتیناز استفاده شد (8). پلیتها به مدت 3 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت مشاهده هاله شفاف در اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم کیتیناز است.

آنزیم لسیتیناز: از محیط واجد سوبسترای زرده تخم مرغ برای بررسی تولید آنزیم لیپاز استفاده شد (30). پلیتها به مدت 7 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت مشاهده هاله رسوب سفید رنگ در اطراف کلنی نشان دهنده حضور آنزیم لسیتیناز است.

آنزیم پکتیناز: از محیط واجد سوبسترای پکتین برای بررسی تولید آنزیم پکتیناز استفاده شد (29). پلیتها به مدت 5 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت به هر پلیت محلول آبی معرف قرمز روتنیوم 05/0 درصد (w/v) به مدت یک ساعت اضافه شد. سپس برای 30 دقیقه با آب مقطر رنگ بری انجام گرفت. محیط‌ کشت دارای ‌هاله شفاف (تجزیه پکتین) بیانگر تولید پکتیناز و محیط دارای حلقه قرمز رنگ نشانه تولید پکتین استراز در عدم وجود پکتیناز است (10 و27).

شناسایی دو جدایه دارای بیشترین تنوع آنزیمی: الف- شناسایی بیوشیمیایی: آزمونهای دی آزونیوم آبی، هیدرولیز اوره، تخمیر قندها، بررسی تولید ریسه، جذب منابع کربن، جذب منابع نیتروژن، مقاومت به سیکلوهگزیمید 01/0 و 1/0 درصد، تولید نشاسته خارج سلولی، تولید اسید از گلوکز، تحمل استیک اسید 1 درصد، رشد در حضور غلظتهای 1، 3، 5، 10 و 15 درصد کلرید سدیم، رشد در غلظت 50 و 60 درصد گلوکز، رشد در دماهای 15، 20، 30، 35 و 37 درجه سانتی گراد و رشد در pH های اولیه 2،‌4، 6، 8، 10، 12 و 14 برای شناسایی بیوشیمیایی دو جدایه برتر SA006 و SA044 بر اساس Kurtzman and Fell 1998 و Barnett et al. 2000 انجام شد (3 و 25).

ب- شناسایی مولکولی: استخراج DNA دو جدایه برتر SA006 و SA044 توسط روش فنل کلروفرم انجام شد (38). تکثیر انتهای 5’ زیرواحد بزرگ ریبوزومی بر اساس روش Kurtzman and Robnett 1997 با استفاده از دو پرایمر NL1 و NL4 صورت گرفت. قطعات تکثیر شده توسط الکتروفورز بر روی ژل آگارز 2 درصد (w/v) در غلظت 5/0 درصد از بافر X)5TBE( و رنگ‌آمیزی‌ اتیدیوم برماید مرئی شد. bp plusDNA Ladder 50 به عنوان نشانگر وزن مولکولی مورد استفاده قرار گرفت.

ج- بررسی میکروسکوپی و ماکروسکوپی: برای بررسی ماکروسکوپی کلنی مخمرهای SA006 و SA044 و تعیین ویژگیهای کلنی، از کشت تازه مخمر بر روی محیط YPG آگار به صورت تک کلنی کشت داده شد و پس از 3 روز گرماگذاری در دمای 30 درجه سانتی گراد، ظاهر کلنی از نظر برجستگی، قوام، رنگ و حاشیه توسط استریومیکروسکوپ بررسی شد (3).

برای بررسی شکل میکروسکوپی نیز از جدایه های SA006 و SA044 بر روی محیط YPG آگار، کشت بر روی لام تهیه شد و به مدت 3 روز در دمای 30 درجه سانتی گراد گرماگذاری شد. پس از این مدت، لاملها توسط رنگ آمیزی لاکتوفنل بلو از نظر شکل سلولها، نحوه جوانه زنی و تولید ریسه بررسی شد.

بررسی ترشحی بودن آنزیمهای دو جدایه برتر با استفاده از روش چاهک پلیت: برای بررسی خارج سلولی بودن آنزیمهای پروتئاز، استراز، DNase، لیپاز و آمیلاز دو جدایه برتر از روش چاهک پلیت استفاده شد (13).

نتایج

دو جدایه SA006 و SA044 به ترتیب از شالیزارهای روستاهای رضاکلا و زرگرمحله در محدوده طول و عرض جغرافیایی 052°38.130'- 052°35.567' و 36°31.213'- 36°36.716' و به ترتیب از نمونه های آب خزانه و خاک شالیزار جدا شدند. برای جداسازی جدایه SA006 از روش کشت مستقیم نمونه بر روی محیط YPG آگار حاوی mg/l250 کلرامفنیکل استفاده شد و جداسازی جدایه SA044 از طریق غنی سازی نمونه خاک در محیط YPG براث و سپس کشت بر روی محیط YPG آگار حاوی mg/l250 کلرامفنیکل انجام شد.

نتایج بررسی حضور آنزیمهای مورد بررسی و ترشحی بودن برخی از آنزیمهای موجود با استفاده از روش چاهک پلیت، در جدول 1 ذکر شده است. همان طور که مشاهده می شود جدایه SA006 نسبت به جدایه SA044 تنوع آنزیمی بیشتری دارد. آنزیمهای پروتئاز و نوکلئاز دو جدایه و آنزیمهای لیپاز و آمیلاز جدایه SA006 ترشحی است. اغلب مخمرهای مورد بررسی مولد آنزیمهای استراز و نوکلئاز بودند.

جدول 1- نتایج بررسی حضور آنزیمها و خارج سلولی بودن آنها در دو جدایه SA006 و SA044

*از کل 46 سویه غربال شده                        s: آنزیمهای برون ریز                                 nd: بررسی نشده است

پس از تکثیر قطعه D1/D2 از S rDNA26 زیر واحد بزرگ ریبوزوم در واکنش (polymerase chain reaction)PCR با استفاده از پرایمر پیش رو NL-1 و پرایمر پس رو  NL-4 قطعه‌ای به طول حدود 600 جفت باز از DNA جدایه های SA006 و SA044 به دست آمد. توالیهای به دست آمده پس از ویرایش توسط نرم افزار Bioedit، برای مقایسه با توالیهای DNA ریبوزومی سایر مخمرها در بانک ژنتیکی NCBI و CBS،BLASTN  شدند. برای همردیف سازی چندتایی (Multiple sequence alignment) این توالیها، نرم افزار Clustal W و برای ترسیم درخت فیلوژنتیکی نرم افزار MEGA 5 مورد استفاده قرار گرفت. درخت فیلوژنی حاصل در شکل 1 نشان داده شده است.

نتایج بررسی فیلوژنی تشابه 100 درصد توالی جدایه SA006 را به گونه شاخص Pseudozyma antarctica تأیید می کند. توالی جدایه SA044 به دو گونه شاخص Pseudozyma rugulosa و Pseudozyma aphidis 100 درصد شباهت دارد. جدایه های برترSA006 Pseudozyma antarctica وSA044 Pseudozyma aphidis به ترتیب با شماره دسترسی mb-nlim201036 و mb-nlim201034 در بانک میکروبی آزمایشگاه ملی میکروبیولوژی صنعتی و با شماره دسترسی IBRC30003 و IBRC30002 در بانک میکروبی مرکز ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران ثبت شدند.

شکل1- درخت فیلوژنتیکی رابطه بین دوجدایهSA006  و  SA044با دیگر سویه‌های‌ Pseudozyma. Spp بر اساس ترادف D1/D2 با استفاده از نرم افزار MEGA5 با روش Neighbour-joining برای 641 باز را نشان می‌دهد. میزان Bootstrap (1000 replication) به صورت درصد در گره هر شاخه آورده شده است. نشانه ▲ جدایه SA006 را نشان می دهد که بیشترین قرابت را با گونه Pseudozyma antarctica دارد و نشانه ■ جدایه SA044 را با بیشترین قرابت به Pseudozyma aphidis و Pseudozyma rugulosa مشخص می کند.

آزمون بیوشیمیایی جذب منابع مختلف کربن جدایه های برتر SA006 و SA044 در جدول 2 مشخص شده و تستهای بیوشیمیایی فراتر در جدول 3 ارائه شده است. هر جدایه با گونه شاخص خود (که درصد تشابه ژنتیکی بیشتری با آن دارد) مقایسه شده است. جدایه SA006 از نظر ژنتیکی شباهت بسیار نزدیکی با گونه Pseudozyma antarctica (3) دارد و جدایه SA044 نیز به گونه های Pseudozyma aphidis و Pseudozyma rugulosa (3) بسیار شبیه است. جدایه های SA006 و SA044 جز در برخی موارد جذب منابع کربن و رشد در حضور گلوکز 50 درصد و 60 درصد به گونه های شاخص خود شباهت نزدیکی دارند.

جدول2- توانایی جذب منابع کربن در دو جدایه SA006، SA044 و مقایسه با گونه های شاخص آنها

d: مثبت تاخیری پس از 7 روز گرماگذاری

v: متغیر

جدول 3- نتایج آزمونهای بیوشیمیایی فراتر در دو جدایه SA006،SA044 و مقایسه با گونه های شاخص آنها

n: نتیجه مشخص نیست و بررسی نشده است

به منظور بررسی ریخت شناسی، پس از کشت دو جدایه بر روی محیط YPG آگار و گرماگذاری آن، کلنی جدایه های SA006 و SA044 (شکل 2و 3) از نظر برجستگی، قوام، رنگ، حاشیه و قطر کلنی توسط استریومیکروسکوپ بررسی شد. کلنیهای جدایه SA006، چرمی، صورتی رنگ، محدب و دارای کناره های نامنظم و قطر آن mm5/2 بود. کلنیهای جدایه SA044، غشایی، کرم تا زرد رنگ، برآمده و دارای کناره های نامنظم و قطر آن mm5/2 بود.

برای بررسی شکل میکروسکوپی نیز از جدایه های SA006 و SA044 بر روی محیط YPG آگار، کشت بر روی لام تهیه شد و پس از گرماگذاری، لاملها توسط رنگ آمیزی لاکتوفنل بلو بررسی شد. SA044 دارای سلولهای درشت و پلی مورفیک از بیضی کوتاه تا میله ای، دارای ذخیره دانه های چربی و مولد ریسه حقیقی و کاذب است. جوانه زنی به صورت قطبی انجام می شود و سلولها فاقد تولید مثل جنسی هستند. SA006 دارای سلولهای میله ای با ذخیره دانه های چربی و ریسه حقیقی و کاذب است و در اغلب موارد بلاستوکنیدی تشکیل می دهد. جوانه زنی به صورت یک قطبی انجام می شود و سلولها فاقد تولید مثل جنسی هستند. تصاویر میکروسکوپی دو جدایه SA006 و SA044 در شکل 4 نشان داده شده است.