مقایسه کارآیی یک تابع انرژی دانش‌پایه و یک تابع نیروی دانش‌پایه در نمره‌دهی کمپلکسهای پروتئین- پروتئین

رحیم جعفری¹، مهدی میرزایی^2،4، مجید عرفانی مقدم³، مهدی صادقی^5*

¹ تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه نانوبیوتکنولوژی

² تهران، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، دانشکده پیراپزشکی

³تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوفیزیک

⁴ تهران، پژوهشگاه دانشهای بنیادی، پژوهشکده علوم کامپیوتر، گروه بیوانفورماتیک

⁵ تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

تاریخ دریافت: 19/6/91               تاریخ پذیرش: 21/12/91

چکیده

تابع نیروی دانش‌پایه نوعی از توابع نمره‌دهی می‌باشد که از آن در زمینه تشخیص فولد پروتئینها با موفقیت قابل توجهی استفاده شده است. در این مطالعه کارآیی نوعی تابع انرژی دانش‌پایه و تابع نیروی هم ارز آن در تشخیص کمپلکسهای درست پروتئین-پروتئین از کمپلکسهای نادرست، با یکدیگر مقایسه شده است. مقدار نیروی کل که از یک جزء کمپلکس (گیرنده/لیگاند) بر جزء دیگر وارد می‌شود به عنوان معیار پایداری کمپلکس، مورد استفاده قرار گرفت. چنین انتظار می‌رود که این نیرو در ساختار طبیعی کمترین مقدار را داشته باشد. جهت ارزیابی کارآیی هر روش، دو مجموعه مورد استفاده قرار گرفت که یکی از آنها با الگوریتم داکینگ جسم نرم و دیگری با الگوریتم داکینگ جسم سخت ایجاد شده بودند. نتایج حاصل از این مقایسه نشان می‌دهد نرخ موفقیت مدل انرژی در انتخاب ساختار‌های طبیعی و نزدیک به طبیعی بالاتر از روش نیرو می‌باشد. ظاهراً وابستگی مقدار نیرو به شکل ناحیه اتصال کمپلکسها باعث ایجاد خطاهایی در مدل نیرو شده که سبب نامناسب گردیدن آن در نمره‌دهی کمپلکسهای داک شده می‌شود.

واژه های کلیدی: انرژی دانش‌پایه، نیرو، تابع نمره‌دهی، داکینگ پروتئین-پروتئین

* نویسنده مسئول، تلفن:44787373، پست الکترونیکی:  sadeghi@nigeb.ac.ir

مقدمه

پروتئینها تقریباً در تمام فرآیند‌های زیستی نقش محوری دارند و در بسیاری از موارد، تنها در صورتی قادر به انجام عمل اختصاصی خود هستند که با برخی پروتئینهای دیگر برهمکنش داشته باشند. جهت بررسی دقیق برهمکنش پروتئینها در مقیاس اتمی، لازم است از ساختارهایی که با روشهای تجربی به دست آمده‌اند استفاده شود ولی متاسفانه ساختار کمپلکس بسیاری از پروتئینها تا کنون تعیین نگردیده، زیرا  طبیعت ناپایدار و گذرای برهمکنش پروتئینها سبب ایجاد اختلال در فرآیند ساخت کریستال از آنها می‌شود. از این رو با توجه به اهمیت موضوع، نیاز به ابزار‌های کمکی جهت مطالعه برهمکنش پروتئینها بدون استفاده از ساختار‌هایی که با روشهای تجربی به دست آمده‌اند، احساس می‌شود.

داکینگ، یک روش محاسباتی می‌باشد که در آن سعی می‌شود با استفاده از ساختار‌های اجزای سازنده (گیرنده و لیگاند)، شکل نهایی کمپلکس مورد نظر پیشگویی شود. الگوریتمهای داکینگ از دو بخش اصلی تشکیل شده‌اند که عبارتند از الگوریتمهای جستجو و توابع نمره‌دهی. الگوریتم جستجو باید بتواند حالتهای مختلف برهمکنش دو مولکول را در یک بازه زمانی قابل قبول به وجود آورد و از توابع نمره‌دهی جهت ارزیابی کیفیت ساختار‌های ایجاد شده به منظور تشخیص ساختار درست (طبیعی) یا "نزدیک به درست" از ساختار‌های غلط استفاده می‌شود. لازم به ذکر است، توابع نمره‌دهی هم در زمان جستجو و هم در زمان پس از آن مورد استفاده قرار می‌گیرند (10).

توابع نمره‌دهی را بر اساس ماهیت و نحوه ساخت، معمولاً در سه گروه مختلف طبقه‌بندی می‌کنند. در توابع نمره‌دهی فیزیکی، از روابط مربوط به مکانیک مولکولی جهت محاسبه انرژی ساختار‌ها استفاده می‌شود (4 و 13). توابع نمره‌دهی تجربی، ترکیبی خطی از انواع ویژگیهای مرتبط به انرژی مثل پیوند هیدروژنی، الکترواستاتیک، وان‌دروالس و غیره هستند که وزن یا ضرائب آنها متناسب با نوع کاربرد تنظیم می‌شود (5، 8، 11 و 18). دسته سوم، توابع دانش‌پایه هستند که در ساخت آنها از خصوصیات ساختاری و فیزیکو‌شیمیایی تعداد نسبتاً زیادی پروتئین با ساختار مشخص، استفاده می‌شود.

توابع پتانسیل آماری نوعی از توابع دانش‌پایه هستند که در آنها فراوانی خصوصیت‌های ذکر شده با استفاده از عکس رابطه بولتزمن به یک سری تابع انرژی موثر تبدیل می شوند (2، 3، 6، 12 و 21). در بسیاری از موارد، از خصوصیاتی مثل برهمکنش بین اتمها یا زنجیره‌های جانبی اسیدهای آمینه در ساخت این نوع توابع استفاده می‌شود و شکل کلی آن به صورت زیر است:

در این رابطه  انرژی بین اتمهای از نوع i و j با فاصله r از دو مولکول مختلف،  ثابت بولتزمن، T دمای محیط بر حسب کلوین،  و  احتمال جفت اتمهای i و j در فاصله r که به ترتیب در ساختار‌های واقعی و "وضعیت مرجع"  محاسبه شده‌اند. وضعیت مرجع یک وضعیت فرضی است که در آن برهمکنش اتمها بر حسب تصادف و نه بر حسب تمایل واقعی آنها به یکدیگر انجام می‌گیرد.

توابع نمره‌دهی آماری در ابتدا به منظور تشخیص فولد طبیعی در پروتئینهای تک زیرواحدی ابداع شدند و در طول سالها تلاشهای زیادی جهت بهبود آنها صورت گرفته است (19). یکی از تغییرات بنیادی در چنین توابعی، تبدیل آنها از فرم انرژی به فرم نیرو بوده که توسط میرزایی و همکاران صورت گرفته است (17). آنها نشان دادند، با ایجاد این تغییر و همچنین به کارگیری یک الگوریتم مناسب در مقایسه نیروهای وارد بر هر اتم در ساختار‌های مختلف، می‌توان قدرت تشخیص ساختار طبیعی را از ساختار‌های غیر‌طبیعی افزایش داد.

در بررسی حاضر سعی شده توانایی مدل انرژی و مدل نیرو در تشخیص کمپلکسهای طبیعی و نزدیک به طبیعی از کمپلکسهای غیر‌طبیعی با یکدیگر مقایسه شود. با فرض اینکه ساختار طبیعی در وضعیت تعادل قرار دارد، انتظار می رفت نیروهایی که دو مولکول بر یکدیگر وارد می‌کنند در کمترین حد ممکن یعنی نزدیک به صفر بوده و ساختار‌های نادرست  متناسب با میزان انحراف آنها از ساختار طبیعی نیروی بیشتری بر یکدیگر وارد کنند. بنابراین روش نمره‌دهی در این بررسی، محاسبه برآیند تمام نیروهای وارد بر اتمهای گیرنده/ لیگاند در ناحیه اتصال و مقایسه آنها با یکدیگر است.

مواد و روشها

مجموعه آموزش: جهت آموزش از مجموعه‌ای که توسط Huang و Zou ساخته شده بود استفاده گردید (6). این مجموعه دارای 850 کمپلکس پروتئین-پروتئین می‌باشد که تفکیک‌پذیری ساختاری آنها حداکثر 5/2 آنگستروم است. زیرواحدهای هر کمپلکس حداقل 10 اسید آمینه داشته و حداقل 30 برهمکنش اسید آمینه-اسید آمینه در ناحیه برهمکنش آنها وجود دارد. توالی هر جفت مولکول گیرنده-گیرنده یا لیگاند-لیگاند از دو کمپلکس مختلف، حداکثر 70 درصد یکسان هستند.

مجموعه‌های تست: معمولا به منظور ارزیابی دقت توابع نمره‌دهی از مجموعه‌هایی به نام "مجموعه دکوی" (Decoy set) استفاده می‌شود. این مجموعه‌ها شامل چندین پروتئین تست هستند که به ازای هر یک از آنها تعداد زیادی ساختار غلط یا دکوی و تعداد بسیار کمی ساختار "نزدیک به درست" وجود دارد و توابع نمره‌دهی باید بتوانند این ساختار‌ها را از ساختار‌های غلط تشخیص دهند. در این مطالعه از دو مجموعه دکوی استفاده گردید که با روشهای داکینگ جسم سخت و داکینگ جسم نرم تولید شده‌اند. در داکینگ جسم سخت،  پیکربندی اجزای سازنده کمپلکس در طول فرآیند داکینگ ثابت باقی می‌ماند ولی در داکینگ جسم نرم سعی می‌شود علاوه بر تغییر موقعیت دو مولکول نسبت به یکدیگر، تغییرات پیکربندی ناشی از برهمکنش آنها نیز شبیه‌سازی شود.

مجموعه داکینگ جسم نرم (soft body docking): مجموعه دکوی مورد استفاده با استفاده از نرم افزار RosettaDock تولید شده است. این مجموعه شامل 54 کمپلکس می‌باشد که به ازای هر یک از آنها حدود 1000 ساختار وجود دارد (5)

مجموعه داکینگ جسم سخت (rigid body docking): مجموعه‌های تست (Benchmark) شماره 2 و 3 ساخته شده توسط Weng و همکاران (7 و 16) شامل 124 کمپلکس می‌باشد. مولکول‌های گیرنده و لیگاند در این مجموعه هر دو به صورت جداگانه تعیین ساختار شده‌اند. این کمپلکسها بر اساس مشکل بودن داکینگ به سه گروه تقسیم می‌شوند: آسان، متوسط و سخت. اجرای داکینگ جسم سخت به وسیله zdock بر روی کمپلکسهایی که جزء گروه سخت هستند نمی‌تواند ساختار نزدیک به طبیعی تولید ‌کند. از آنجایی که تعداد دکویهای 124 کمپلکس نسبتاً زیاد است، برای افزایش سرعت محاسبه انرژی و نیرو، یک مجموعه کوچکتر ساخته شد که اعضای آن به صورت کاملاً تصادفی انتخاب شده بودند. از این زیر مجموعه، کمپلکسهایی که جزء گروه سخت بودند و همچنین آنهایی که توالی‌شان بیشتر از 65 درصد با توالی پروتئینهای مجموعه آموزش یکسان بودند، حذف گردیدند. در نتیجه با اعمال فیلتر های ذکر شده در نهایت 46 کمپلکس باقی ماند.

در مرحله بعد با استفاده از نرم افزار zdock-3.0.1 (15)، عمل داکینگ جسم سخت بر روی هر یک از 46 جفت انجام گرفته و به ازای هر یک از آنها تعداد 3600 کمپلکس تولید شد. در بین ساختار‌های مربوط به 42 کمپلکس‌ تست، حداقل یک ساختار نزدیک به طبیعی وجود داشت. 4 مورد دیگر که فاقد ساختار نزدیک به طبیعی بودند از مجموعه حذف شدند. معیار به کار رفته در تعریف ساختار‌های نزدیک به طبیعی در بخش نتایج توضیح داده شده است. 

تعریف انواع اتم (Atom types): با وجود آنکه نوع اتمهای سازنده پروتئینها مشخص و محدود می‌باشند، به دلیل نوع اتصالات و محیط پیرامونی اتمها، تنوع آنها به لحاظ خصوصیات فیزیکوشیمیایی زیاد است. بر این اساس تعداد "انواع اتمی" در 20 اسید آمینه طبیعی 167 نوع می‌باشد. مسلماً در ساخت توابع، هر اندازه اتمهای مورد استفاده متنوع‌تر باشند، تابع نهایی بهتر خواهد بود. اما تفکیک اتمها به انواع مختلف سبب می‌شود فراوانی آنها در ساختار‌های مجموعه آموزش بسیار کمتر از حدی بشود که بتوان از آنها در ساخت تابع پتانسیل استفاده کرد زیرا اساس این نوع توابع، مشاهده آماری می‌باشد. در چنین شرایطی لازم است با دسته‌بندی اتمهای دارای خصوصیات فیزیکوشیمیایی مشابه در انواع اتمی کمتر، تا اندازه ای از بروز چنین مشکلی شود. در این مطالعه 167 نوع اتم در 16 گروه قرار داده شد (جدول 1) که دو به دو مجموعاً 136 "جفت تیپ اتمی"  را تشکیل می‌دهند.

جدول 1- لیست 16 تیپ اتمی متعلق به 20 اسید آمینه استاندارد که در ساخت توابع انرژی استفاده شده‌اند.

محاسبه توابع انرژی: در ساخت توابع انرژی با کاربرد داکینگ، معمولاً از اطلاعات موجود در ناحیه اتصال کمپلکسها استفاده می‌شود. دو اسید آمینه از دو زیرواحد مختلف، متعلق به ناحیه اتصال خواهند بود اگر فاصله حداقل یک جفت از اتمهای سنگین آنها (اتمهایی به جز هیدروژن) 5/4 آنگستروم و یا کمتر باشد.

در ابتدا فراوانی جفت اتمهای ناحیه اتصال در محدوده‌های مشخصی از فاصله‌ها (مثلا 1-25/1 آنگستروم، 25/1-5/1 آنگستروم و ...) حساب می‌شود. در مطالعه حاضر از 34 "محدوده فاصله"، هر یک با پهنای 25/0 آنگستروم استفاده گردید و از جفت اتمهایی که فاصله آنها بیش از 5/8 آنگستروم بود صرف نظر شد.

انرژی بین جفت اتمهایی از نوع i وj  در فاصله r، که یکی از آنها متعلق به  گیرنده و دیگری متعلق به لیگاند باشد، از رابطه زیر محاسبه گردید که بر گرفته از کار Sippl می‌باشد (20).

 وزنی است که به هر مشاهده داده می‌شود و مقدار آن 02/0 انتخاب گردید.

در این رابطه،  تعداد کل جفت اتمهای ij است.

  تعداد جفت اتمهای ij در فاصله r می‌باشد (فراوانی مطلق)

 فراوانی نسبی جفت اتمهای ij در فاصله r است که برابر است با:

   فراوانی نسبی همه جفت اتمها در فاصله r است که برابر می‌باشد با:

°K 293 T = و در نتیجه مقدار RT، برابر است با kcal/mol 582/0

انرژی کل یک کمپلکس، مجموع انرژی جفت اتمهای گیرنده-لیگاند در ناحیه اتصال است.

محاسبه توابع نیرو: نیرو در حقیقت تغییرات انرژی به ازای تغییرات فاصله است (  ). برای محاسبه مقدار نیرو در نقطه مورد نظر از روش مشتق عددی استفاده شد.

در این رابطه  مقدار نیرو برای "محدوده فاصله" شماره i،  و  به ترتیب مقدار انرژی در محدوده‌های بعدی و قبلی و  و  به ترتیب فاصله تا مرکز محدوده‌های بعدی و قبلی هستند.

محاسبه نیروی وارد بر اتمها: برای محاسبه نیرویی که از اتم گیرنده  با مختصات به اتم لیگاند   با مختصات  وارد می‌شود، در ابتدا لازم است بردار یکّه   به   حساب شود.

بردار نیرو بین اتمهای i و j  و در فاصله   dبرابر خواهد بود با:

که در آن  مقدار عددی نیرو در فاصله d می‌باشد که قبلاً از طریق مشتق عددی محاسبه شده بود. نیروی کل ( ) که از سمت اتمهای گیرنده بر اتمهای لیگاند وارد می‌شود جمع برداری تمام نیروهای حاصل از جفت اتمهای گیرنده-لیگاند است. بدیهی است، نیروی کل گیرنده بر لیگاند دقیقاً برابر ولی برخلاف جهت نیرویی است که از لیگاند بر گیرنده وارد می‌شود. بنابراین محاسبه یکی از آنها کافی است.  

در نهایت برای مقایسه کمپلکسها با یکدیگر لازم است اندازه بردار نیروی کل که همان نمره هر ساختار می‌باشد حساب گردد:

،  و  مؤلفه‌های بردار F هستند.

نتایج 

پس از نمره‌دهی با روش مربوطه و سپس مرتب کردن ساختارها بر اساس نمره‌شان، انتظار می‌رود ساختار‌های با کیفیت بهتر در رتبه های بالاتر قرار گیرند. اگر در مورد یک پروتئین تست، حداقل یک ساختار با کیفیت مورد نظر در چند‌تای اول (مثلا در 10 تای اول) مشاهده شود در این صورت روش مورد نظر در مورد آن موفق بوده است. درصد مواردی که در آنها موفق به یافتن حداقل یک ساختار مطلوب که حداکثر دارای رتبه مورد نظر باشد، نشان دهنده میزان توانایی روش مورد مطالعه به ازای آن رتبه خاص (top n) می‌باشد. به عنوان مثال اگر 50 عدد پروتئین تست وجود داشته باشد که هر یک دارای چندین کمپلکس باشند و مثلاً اگر در 5 مورد از آنها بتوان حداقل یک کمپلکس با ساختار مناسب در بین مثلاً 3 ساختاری که بیشترین نمره را دارند یافت، در این صورت درصد موفقیت به ازای top3 معادل 10 درصد خواهد بود. به این ترتیب با تغییر top n و محاسبه مجدد درصد موفقیت، می‌توان منحنی "نرخ موفقیت" را به دست آورد.

یافتن ساختار طبیعی: از آنجا که محاسبه ساختاری، دقیقاً شبیه به آنچه که با روشهای تجربی تعیین می‌شود، عملاً از طریق داکینگ غیر ممکن است، معمولاً هدف مورد جستجو نه ساختار طبیعی بلکه ساختار‌های نزدیک به طبیعی هستند. اگر ساختار طبیعی در بین ساختار‌های دیگر موجود باشد، در این صورت یافتن آن بسته به نوع مجموعه، در بسیاری از موارد نسبتاً راحت است. با این وجود از آنجایی که هدف از انجام این پژوهش مقایسه روشها می‌باشد، نتیجه چنین آزمونی جهت قضاوت نهایی مفید خواهد بود.

مجموعه‌های مورد استفاده در ابتدا فاقد ساختار‌های کمپلکس طبیعی (تعیین شده با روش تجربی) بودند به همین دلیل فایل pdb آنها به صورت دستی اضافه شد. بعد از نمره‌دهی با دو روش انرژی و نیرو، "نرخ موفقیت" برای هر کدام از مجموعه‌ها محاسبه گردید (شکل 1). در مجموعه‌ای که با استفاده از داکینگ جسم سخت ساخته شده، هر دو روش توانسته‌اند ساختار‌های طبیعی را تا حد زیادی از ساختار‌های غیر‌طبیعی جدا کنند، به طوری که درصد موفقیت در top 10 برای هر دو بیش از 75 درصد است. اما در مجموع، دقت روش انرژی بهتر از روش نیرو است زیرا درصد موفقیت انرژی برای رتبه اول (top 1) بالاتر بوده و همچنین زودتر به درصد موفقیت 100 می رسد.

در مجموعه دوم که با روش داکینگ جسم نرم ساخته شده، نرخ موفقیت هر دو روش در مقایسه با مجموعه قبل کاهش زیادی می‌یابد. در این مجموعه نیز روش انرژی بهتر از نیرو عمل می‌کند. همانطور که در شکل ملاحظه می‌شود روش نیرو در هیچ یک از top n ها قادر به یافتن ساختار طبیعی نیست.

شکل 1) نرخ موفقیت در یافتن ساختار طبیعی. A ) مجموعه تولید شده با روش داکینگ جسم سخت. B ) مجموعه تولید شده با روش داکینگ جسم نرم (منحنی نیرو با محور افقی نمودار مماس شده و به سختی دیده می‌شود).

یافتن ساختار نزدیک به طبیعی: تعریف ساختار نزدیک به طبیعی بر اساس شاخصهای مختلفی انجام می‌گیرد که یکی از آنها اصطلاحاً "کیفیت ساختار" است. بر اساس معیار های CAPRI، کیفیت ساختار تلفیقی از سه پارامتر  ،  و   می‌باشد (9 و 14) .    عبارت است از تعداد تماسهای اسیدآمینه-اسیدآمینه طبیعی در ساختار پیشگویی شده، تقسیم بر تعداد تماسهای اسیدآمینه-اسیدآمینه در ساختار طبیعی (ساختار کریستاله). اسید آمینه‌های گیرنده و لیگاندی که در فاصله کمتر از 5 آنگستروم باشند، در تماس با هم فرض می شوند.    عبارت است از rmsd بین لیگاند در ساختار پیشگویی شده و لیگاند در حالت طبیعی، بعد از آنکه گیرنده‌های آنها با استفاده از اتمهای زنجیره اصلی (ستون فقرات پروتئین) به طور بهینه بر روی یکدیگر قرار گیرند. برای محاسبه  ، ابتدا اسیدهای آمینه موجود در محل اتصال کمپلکس طبیعی را مشخص کرده و سپس rmsd بین این اسیدهای آمینه و معادل آنها در کمپلکس پیشگویی شده را بعد از انطباق آنها با استفاده از اتمهای زنجیره اصلی حساب می‌کنند. لازم به ذکر است که در این مورد برای تعیین ناحیه اتصال در ساختار طبیعی از cut off معادل 10 آنگستروم استفاده می‌شود. در نهایت کیفیت کمپلکسها با توجه به مقادیر این سه ویژگی بیان می‌گردد (جدول 2).

جدول2- کیفیت ساختار‌های پیش بینی شده بر اساس ترکیب سه پارامتر  ، و  (9 و 14)

نتایج ارائه شده در این قسمت بر مبنای توانایی روشها در یافتن ساختارهایی است که بر اساس جدول فوق، کیفیت آنها در حد "قابل قبول" و یا بهتر باشد. در این آزمون ساختار‌های طبیعی از مجموعه‌های تست خارج شدند زیرا بر اساس معیار ذکر شده کیفیت آنها "بالا" است که نباید با ساختار‌های نزدیک به طبیعی که چنین کیفیتی دارند مخلوط شوند.

همانطور که در شکل 2 مشاهده می‌شود، در مجموعه ساخته شده با روش داکینگ جسم سخت، به ازای top n های ابتدایی، توانایی روش نیرو کمی بیشتر از روش انرژی می‌باشد، اما این مقدار به قدری ناچیز است که بر اساس آن نمی‌توان قضاوت قابل اطمینانی داشت. در مجموع، قدرت تمایز روش انرژی در این مجموعه نیز بهتر از روش نیرو است.

در مجموعه دوم که با روش داکینگ جسم نرم ساخته شده، توانایی روش نیرو در یافتن ساختار‌های نزدیک به طبیعی بهتر از ساختار طبیعی می‌باشد که دلیل آن بیشتر بودن تعداد آنها است. با این حال در این مجموعه نیز مجدداً روش انرژی عملکرد بهتری نسبت به روش نیرو دارد.

شکل 2- نرخ موفقیت در یافتن ساختار نزدیک به طبیعی. A ) مجموعه تولید شده با روش داکینگ جسم سخت. B ) مجموعه تولید شده با روش داکینگ جسم نرم