Document Type : Research Paper
Abstract
Bacteriophage lambda comprises critical advantages that have made it as an ideal gene delivery vehicle into the eukaryotic cells. These advantages reside in both the structure and biology of the lambda phage, for example, recent investigations have revealed common ancestry for the tailed phages and eukaryotic DNA viruses. Considering these features as well as the double-stranded nature of its genome, bacteriophage lambda might comprise a great advantage for phage-mediated gene delivery into eukaryotic cells. A phage lambda-derived gene nanocarrier bearing reporter gene GFP (λ-GFP) was constructed and utilized to transfect AGS cell line. λ-GFP particle-mediated gene delivery and expression as well as its internalization by AGS cell line was investigated.
Keywords
طراحی نانوحاملژنی فاژی و ارزیابی توانایی آن در انتقال و بیان ژن در رده سلولی انسانی
محمد خلجکندری، مجید صادقیزاده* و مهرداد بهمنش
تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک
تاریخ دریافت: 3/10/89 تاریخ پذیرش: 2/12/89
چکیده
وجود یک سری مزایای کلیدی در باکتریوفاژ لامبدا باعث شده است که این فاژ به عنوان یک حامل ژنی ایدهآل به سلولهای یوکاریوتی مطرح شود. این مزیتها هم در ساختار و هم در بیولوژی آن نهفته است ازجمله اینکه مطالعات اخیر داشتن اجداد مشترک با ویروسهای یوکاریوتی DNA دار را نشان دادهاند. با توجه به این واقعیات و نیز دورشتهای بودن ژنوم آن، فاژ لامبدا میتواند مزیت بزرگی در انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی داشته باشد. لذا با وارد کردن توالی یک ژن گزارشگر (GFP)، فاژ لامبدای نوترکیبی طراحی و برای انتقال ژن به سلولهای رده AGS مورد استفاده قرار گرفت. بیان ژن GFP در پی انتقال با ذرات λ-GFP و همین طور کارآیی ورود این ذرات به سلولهای رده AGS ارزیابی شد.
واژه های کلیدی: باکتریوفاژ لامبدا، λ-GFP، انتقال ژن با واسطه فاژ
* نویسنده مسئول، تلفن: 82884409 ، پست الکترونیکی: sadeghma@modares.ac.ir
مقدمه
حاملینی که در حال حاضر برای ژندرمانی به کار میروند در دو گروه اصلی حاملین ویروسی و حاملین غیر ویروسی قرار میگیرند. به طور کلی حاملین ویروسی کارآیی انتقال و بیان بالا حتی تا 100 درصد را دارند با اینحال آنها نه تنها کاملاً بیخطر و ایمن نیستند، بلکه تولید انبوه آنها هزینه بالایی میطلبد(15). این عوامل باعث شده است علیرغم قابلیتهای خوب آنها در انتقال و بیان ترانسژن، جستجو برای یافتن حاملین ژنی مناسب بیش از پیش ادامه یابد. از طرف دیگر حاملین غیر ویروسی نسبتاً بیخطر و ارزان میباشند، با اینحال کارآیی ورود و انتقال آنها به سلولهای هدف بسیار پایین است.( 2، 6، 17 و 18) فاژها مزایای زیادی دارند که باعث شده است به عنوان حاملین ژنی به سلولهای پستانداران مطرح و به عنوان جایگزینی برای حاملین ویروسی و حاملین غیر ویروسی در نظر گرفته شوند. به طور کلی این ذرات گرایشی برای ورود به سلولهای یوکاریوتی ندارند و لذا تا حد زیادی بیخطر هستند. پوشش پروتئینی آنها از تخریب ژن مورد انتقال در لحظه ورود به سلولهای هدف ممانعت میکند. این ویژگی در سامانههای غیر ویروسی کمرنگ میباشد و به همین علت DNA مورد انتقال آنها در معرض تخریب توسط آنزیمهای برشگرقرار میگیرد(15،16). از مزایای دیگر فاژها میتوان به مواردی از قبیل ارزانی تولید در حجم بالا، پایداری فیزیکی در محیطهای نامساعد، قابلیت تحمل و حمل توالیهای بزرگ، امکان هدفگیری با استفاده از فناوری فاژنمایی (phage display) (16) و نیز روشهای اتصال شیمیایی(12)، عدم ورود به ژنوم سلولهای میزبان و در نتیجه عدم خطر از کاراندازی ژنهای دیگر(15) اشاره کرد.
به طور کلی ویروسها سامانههای زیستی پیچیدهای هستند که در آنها ژنوم درون یک ساختار نانو مقیاس (میانگین10-500 نانومتر) به نام کپسید قرار گرفته اند (3 و 11). فاژها ویروسهایی هستند که منحصراً باکتریها را آلوده میکنند. از جمله فاژهایی که برای انتفال ژن به سلولهای یوکاریوتی به کار رفتهاند میتوان به M13، T7، T4 و لامبدا اشاره کرد. بیشتر محققان M13 را برای انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی مورد استفاده قرار دادهاند در صورتیکه بعضی دیگر فاژ لامبدا را ترجیح میدهند(20). فاژ لامبدا یک ذره با ساختار نانومقیاس با ژنومی حدود 48 کیلوباز است. این فاژ یک کپسید بیستوجهی با قطر تقریبی 55 نانومتر دارد که ژنوم را احاطه کردهاست(13و20). گزارش شده است که فاژ لامبدا مزایایی نسبت به M13 دارد که میتوان به مواردی از قبیل اندازه و ویژگیهای فیزیکی ژنوم و نیز اندازه و ابعاد خود ذرات فاژ لامبدا اشاره کرد. ذرات فاژ لامبدا ابعادی مشابه با ویروسهای یوکاریوتی دارند، به گونهایکه مطالعات ساختاری اخیر نشان دادهاند باکتریوفاژهای دمدار و ویروسهای یوکاریوتی که ژنوم آنها DNA است دارای اجداد مشترک هستند(1). این ویژگیها میتواند بیان ژن مورد انتقال را در مقایسه با M13 که ژنومی کوچک و تکرشتهای دارد و لازم است پس از ورود به سلولها به حالت دورشتهای تبدیل شود، تسهیل کنند. رویهمرفته، این اطلاعات بیانگر آن هستند که فاژ لامبدا میتواند یک حامل ژنی کارآ به سلولهای یوکاریوت در مقایسه با فاژ M13 باشد(20،21).
در مطالعه حاضر توالی رمزکننده پروتئین سبز فلورسانس(GFP) تحت کنترل آغازگر رونویسی ویروس سیتومگال(CMV) در ژنوم فاژ لامبدا به منظور دستیابی به سازه پایهای از لامبدا که حاوی کاست بیانی GFP (λ-GFP) باشد، وارد شد. این سازه دارای قابلیت بیان GFP در سلولهای پستانداران میباشد و به عنوان چارچوب پایهای ارزشمندی است که میتواند با استفاده از اتصال مولکولهای هدفگیری مختلف با روشهای شیمیایی و فیزیکی موجود به سمت سلولهای مورد نظر هدفگیری و ارسال شود. میتوان با اتصال لیگاندهای هدفگیری مختلف به سطح ذرات فاژی λ-GFP نانوحاملژنی هدفمند به دست آورد. برای مثال هماکنون اتصال مولکول هدفگیری ترانسفرین به سطح این نانوزیست ذرات و استفاده از آنها برای بررسی کارآیی انتقال ژن GFP به سلولهای پستانداران تحت بررسی است. در این نوشتار طراحی و ساخت نانوحاملژنی فاژی(λ-GFP) و کارآیی آن در انتقال و بیان ژن GFP و نیز ورود این نانوحامل به سلولهای رده AGS انسانی مورد ارزیابی قرار میگیرد.
مواد و روشها
مواد: در این پژوهش از ناقل لامبدا ZAP-CMV شرکت استراتاژن (Stratagene, USA) برای ساخت سازه نوترکیب استفاده شد. این ناقل حاوی توالی فاژمیدی pCMV-Script EX میباشد که با دارا بودن توالی آغازگر رونویسی ویروس سیتومگال (CMV) امکان رونویسی و بیان ژن کلون شده را در سلولهای پستانداران مهیا میکند. همچنین برای تکثیر ذرات فاژی نوترکیب از باکتری XL1-Blue MRF' استفاده شد. این سویه ־RecA و حاوی اپیزوم F' است که تولید پیلی را رمزدهی میکند. با توجه به اینکه ناقل فاژمیدی pCMV-Script EX به ژنوتیپ supF نیازی ندارد، لذا با کارآیی بالایی در سویه XL1-Blue MRF' تکثیر مییابد. پلاسمید pEGFP-N1 محصول شرکت Clontech آمریکا به عنوان الگو در واکنش PCR برای تکثیر توالی ژن GFP استفاده شد. آنزیمهای برشگر XhoI و EcoRI از شرکت Fermentas لیتوانی تهیه شدند. بقیه مواد همراه با شرکت سازنده آنها در قسمت روشها و در مرحله مورد استفاده در این پژوهش ذکر شدهاند.
طراحی و ساخت سازه λ-GFP : برای رسیدن به سازه λ-GFPاز ناقل فاژی لامبدای ZAP-CMV محصول شرکت استراتاژن استفاده شد. بدین منظور توالی ژن EGFP با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی با توالی رفت؛ 5'-GTAGAATTCCGCCACCATGGTGAGCA -3' و برگشت؛ 5'-GACCTCGAGTTACTTGTACAGTTCGTCCATGC-3' که دارای جایگاههای شناسایی و برش با آنزیمهای EcoRI در پرایمر رفت و XhoI در پرایمر برگشت (توالی خط کشیده شده) میباشند و نیز پلاسمید pEGFP-N1 به عنوان الگو توسط PCR تکثیر شد. برای اجتناب از خطای احتمالی تکثیر، از پلیمراز LA Taq شرکت تاکارا که دارای خاصیت تصحیح اشتباهات است استفاده شد. شرایط انجام PCR عبارت است از: واسرشتسازی اولیه در دمای 94 درجه به مدت 3 دقیقه، تکرار 30 چرخه با واسرشتسازی در دمای 94 درجه به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمرها در 57 درجه به مدت 30 ثانیه و تکثیر در دمای 72 درجه به مدت 45 ثانیه و بالاخره گسترش نهایی در دمای 72 درجه به مدت 5 دقیقه. محصولات PCR پس از هضم با آنزیمهای EcoRI و XhoI، به وسیله کیت استخراج از ژل Gene JETTM Gel Extraction kit شرکت Fermentas از ژل خالصسازی شدند. این قطعات سپس به محل مناسب خود در ناقل فاژ لامبدا ZAP-CMV سابکلون شدند.
اتصال قطعات حاصل از PCR با ناقل لامبدا ZAP-CMV : نسبتهای مولی یکسان از قطعات حاصل از PCR و ناقل لامبدا ZAP-CMV با 2 واحد آنزیم T4 DNA لیگاز ، 10 mM rATP و بافر در حجم نهایی 5 میکرولیتر با هم مخلوط و به مدت 16 ساعت در یخچال 4 درجه سانتی گراد انکوبه شد. واکنش اتصال در نهایت منجر به تشکیل سازه λ-GFP میگردد که در آن توالی GFP تحت کنترل آغازگر CMV قرار دارد و بنابراین قابلیت رونویسی و بیان در سلولهای پستانداران را خواهد داشت.
بستهبندی برونسلولی سازه λ-GFP : 5/2 میکرولیتر از محصول واکنش اتصال که حاوی تقریباً یک میکروگرم سازه λ-GFP است به یک ویال حاوی عصاره بستهبندی (پروتئینهای بستهبندی کننده فاژ لامبدا) اضافه و پس از مخلوط کردن آرام محتویات به مدت 2 ساعت در دمای اتاق قرار داده شد تا سازه حاصل درون پروتئینهای پوشش فاژ بستهبندی و ذرات فاژی تشکیل شوند. پس از 2 ساعت 500 میکرولیتر بافر SM (5.8g NaCl, 2.0g MgSO4 . 7H20, 50.0 ml of 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of 2% (w/v) gelatin, dH2O up to 1 lit ) به آن افزوده شد تا واکنش متوقف شود. سپس 20 میکرولیتر به آن کلروفرم اضافه و پس ورتکس آرام محتویات ویال در g 1000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی حاوی ذرات فاژی است که برای تعیین تیتر آماده هستند.
تکثیر و تیتراسیون ذرات فاژی بستهبندی شده: رقتهای 1:10 و 1:1 از محصول بستهبندی شده در بافر SM تهیه و با 200 میکرولیتر باکتری اشرشیاکلی سویه XL1-Blue MRF' با OD600 = 0.5 رقیق شد و در دو ویال جداگانه در محلول 10 mM MgSO4 مخلوط شدند. مخلوط فاژ-باکتری به مدت 15 دقیقه در 37 درجه بدون تکان انکوبه شد تا فاژها به باکتریها متصل شوند. سپس محتویات آنها با ml 3 آگار NZY رویی مذاب اما خنک شده تا دمای 48 درجه مخلوط و بلافاصله روی پلیتهایNZY آگار از پیش گرم شده پخش گردید. پلیتها پس از 10 دقیقه به صورت وارونه در انکوباتور 37 درجه قرار داده شد و تا ظاهر شدن پلاکها (8-12ساعت) انکوبه شدند.
تایید وجود توالی GFP در سازه λ-GFP : برای تأیید کلون شدن GFP در ناقل لامبدا ZAP-CMV و دستیابی به سازه λ-GFP از روش Plaque-PCR استفاده شد. بدین منظور مخلوط PCR حاوی تمام اجزا به جز DNA الگو آماده و در حجم کل 25 میکرولیتر در ویالهای PCR توزیع شد. در این واکنش به جای DNA الگو نوک تیپهای استریل آغشته به پلاکهای ظاهر شده در سطح پلیت با مخلوطهای PCR تماس و پیپتاژ شد تا ذرات فاژی موجود در پلاک در مخلوط حل شود. تکثیر توالی GFP با استفاده از پرایمرهای GFP انجام شد. شرایط انجام PCR مشابه با شرایط قبل بود، به جز اینکه مرحله واسرشتسازی اولیه 7 دقیقه در 94 درجه به منظور اطمینان از متلاشی شدن ذرات فاژی انجام گرفت. محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز و پس رنگ آمیزی با اتیدیمبرومید باندهای حاصل مشاهده شدند.
آلوده کردن سلولهای رده AGS انسانی با نانوحاملژنی فاژی : سلولهای رده AGS به تعداد 105×2 سلول در هر چاهک پلیت ششخانه در محیط RPMI همراه با 10 درصد سرم وμg/ml 10 آنتیبیوتیک کشت داده شد و 24 ساعت در دمای 37 درجه و شرایط 5% CO2 انکوبه شد. سلولها با ضریب عفونت یا MOI (MOI; Multiplicity of Infection) برابر با 106 از ذرات فاژی λ-GFP به مدت 12 ساعت تیمار و پس از تعویض محیط با محیط تازه تا 36 ساعت دیگر انکوبه شدند. به عنوان کنترل مثبت DNA استخراج و تخلیص شده از ذرات فاژی λ-GFP، توسط لیپوفکتامین 2000 شرکت Invitrogene به سلولهای AGS ترانسفکت شد. در نهایت سلولها برای مشاهده بیان GFP توسط میکروسکوپ معکوس فلورسانس بررسی شدند.
بررسی ورود نانوحاملژنی فاژی به سلولهای AGS : سلولهای رده AGS به تعداد 105×2 سلول در هر چاهک پلیت ششخانه در محیط RPMI همراه با 10 درصد سرم وμg/ml10 آنتیبیوتیک کشت و بهمدت 24 ساعت در دمای 37 درجه و شرایط 5% CO2 انکوبه شدند. ذرات فاژی λ-GFP در دو MOI 105 و 106 به چاهکها اضافه و 12 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. سپس محیط کشت تعویض و چاهکها با PBS (Phosphate Buffered Saline) شستشو داده شدند. ذرات فاژی چسبیده به سلولها توسط شستشو با بافر گلیسین (50 mM Glycine pH 2.8, 500mM Nacl) آزاد و از محیط حذف شدند. سلولها پس از تیمار با تریپسین از چاهکها جمع آوری و DNA تام آنها توسط کیت Gene JET™ Genomic DNA Purification Kit ساخت شرکت Fermentas استخراج شد. DNA حاصل به عنوان الگو در واکنش زنجیرهای پلیمراز جهت تکثیر و آشکارسازی توالی GFPبا استفاده از پرایمرهای اختصاصی مورد استفاده قرار گرفت. واکنش PCR مانند قبل انجام شد. محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز و آشکارسازی شدند.
نتایج
ساخت سازه λ-GFP : توالی ژن GFP با روش PCR تکثیر و پس از هضم و تخلیص تحت کنترل آغازگر رونویسی CMV در توالی ناقل لامبدای ZAP-CMV کلون شد. سازه به دست آمده برای تولید ذرات فاژی نوترکیب λ-GFP به روش بستهبندی برونسلولی (In vitro packaging) بستهبندی شد. آلوده کردن سلولهای باکتری XL1-Blue MRF' توسط محصول بستهبندی نشان داد که ذرات فاژی λ-GFP تولید شده است. تشکیل پلاکهای متعدد (شکل1) در سطح کشت چمنی باکتری XL1-Blue MRF' نشان دهنده دستیابی به ذرات فاژی نوترکیب است.
وجود توالی GFP در سازه λ-GFP و نانوحامل فاژی: وجود توالی GFP در سازه λ-GFP با روش Plaque-PCR و استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن GFP مورد بررسی قرار گرفت. محصولات حاصل از PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شد. وجود باند 700 جفت بازی نشان دهنده وجود توالی GFP در سازه میباشد (شکل2).
آلوده کردن سلولهای رده AGS انسانی با نانوحاملژنی فاژی : سلولهای رده AGS انسانی پس از کشت در پلیتهای ششخانه توسط ذرات λ-GFP با ضریب عفونت 106 به مدت 12 ساعت تیمار شدند. سلولها پس از تعویض محیط، 36 ساعت دیگر نیز انکوبه و در نهایت با میکروسکوپ فلورسانس معکوس برای بررسی بیان GFP مشاهده شدند (شکل3). شمارش سلولهای بیان کننده GFP نشان داد که در حدود 0.02% از سلولها در اثر تیمار با ذرات فاژی GFP مثبت هستند. این آزمایش همچنین تأیید کرد که سازه حاصل فعال بوده و فرآیند ساخت سازه با موفقیت انجام شده است.
شکل1- تیتراسیون محصول بستهبندی. پلاکهای ظاهر شده در کشت چمنی باکتری XL1-Blue MRF' در اثر آلوده سازی با رقت A) 10: 1 و B) 1:1 از محصول بستهبندی
شکل2- الکتروفورز محصولات حاصل از فرآیند Plaque-PCR. در این واکنش از 50 نانوگرم DNA پلاسمیدی pEGFP-N1 به عنوان کنترل مثبت (P.C) و از نمونه بدون DNA الگو به عنوان کنترل منفی (N.C) استفاده شد. ستون M نمایانگر نردبان اندازه مولکولی و ستونهای P3, P2, P1 سه پلاک مختلف مورد استفاده در PCR هستند.
شکل3- انتقال ژن با نانوحاملژنی فاژی. سلولهای رده AGS انسانی توسط نانوحامل فاژی با ضریب عفونت 106 تیمار شده و پس از 48 ساعت سلولها به وسیله میکروسکوپ فلورسانس معکوس بررسی شدند. A) سلولهای تیمار شده با نانوحامل فاژی B) سلولهای آلوده شده با 500 نانوگرم DNA استخراج شده از ذرات فاژی λ-GFP با کمک لیپوفکتامین 2000 C) کنترل منفی
شکل4- بررسی ورود نانوحاملژنی فاژی به سلولهای AGS. سلولهای AGS پس از 12 ساعت تیمار با ذرات فاژی λ-GFP در ضریب عفونتهای 105 (ستون1) و 106(ستون2) با PBS شستشو و ذرات فاژی چسبیده به سطح سلولها با بافر گلیسین جدا شده و حذف شدند. DNA تام از سلولها استخراج و به عنوان الگو در PCR جهت تکثیر توالی GFP با پرایمرهای اختصاصی به کار رفت. همچنین از10 نانوگرم DNA استخراج شده از ذرات فاژی به عنوان کنترل مثبت PCR و جهت مقایسه استفاده شد(ستون3).
ورود نانوحاملژنی فاژی به سلولهای AGS : توانایی ورود ذرات نانوحامل فاژی به سلولهای AGS با تیمار سلولها توسط دو MOI متفاوت از ذرات فاژی و متعاقب آن استخراج DNA از سلولهای تیمار شده و آشکارسازی وجود DNA ترانسژن در سلولها با استفاده از PCR بررسی شد. نتایج حاصل از PCR نمونههای DNA استخراج شده از سلولهای تیمار شده با ذرات فاژی λ-GFP در شکل4 نشان داده شده است. این نتایج نشان داد که ورود ذرات فاژی به سلولها وابسته به دُز میباشد.
بحث
اخیراً باکتریوفاژها – به ویژه فاژ لامبدا- به علت مزایایی که دارند به عنوان حاملی بالقوه مناسب برای انتقال ژنها به سلولهای پستاندار مورد توجه قرار گرفتهاند. استفاده از باکتریوفاژ نه تنها در مطالعات انتقال ژن با اهداف ژندرمانی(5، 7، 8 و 15) بلکه با اهداف دیگری از قبیل واکسینه کردن(4 و 14) به صورت روزافزون در حال افزایش است. با توجه به این واقعیتها و برای دستیابی به یک حامل پایهای مبتنی بر فاژ لامبدا که شایستگی لازم را برای مطالعات انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی را داشته باشد، ابتدا توالی ژن GFP در ناقلی از فاژ لامبدا به نام λZAP-CMV تحت کنترل آغازگر CMV وارد شد تا سازه λ-GFP به دست آید. بستهبندی برونسلولی سازه حاصل توسط عصاره بستهبندی منجر به تولید ذرات فاژی حاوی توالی ژن گزارشگر GFP شد. برای تأیید تولید ذرات فاژی λ-GFP، سلولهای باکتری XL1-Blue MRF' توسط محصول بستهبندی آلوده شدند و تشکیل پلاکهای متعدد (شکل1) در سطح کشت چمنی باکتریایی، به وجود آمدن ذرات فاژی λ-GFP را نشان داد. همچنین برای تایید حضور توالی GFP در ذرات فاژی حاصل تعدادی از پلاکهای فاژی ظاهر شده در سطح کشت چمنی به وسیله Plaque-PCR بررسی شدند. نتایج حاصل از Plaque-PCR (شکل2) نشان دهنده کلون شدن توالی GFP در ناقل فاژی میباشد و بدین ترتیب حاکی از دستیابی به نانوحاملژنی λ-GFPاست. در ادامه برای بررسی توانایی نانوحامل حاصل در انتقال و بیان ژن GFP، سلولهای AGS توسط این ذرات تیمار و بیان GFP در سلولها با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس معکوس ارزیابی شدند. شمارش سلولهای بیان کننده GFP نشان داد که علیرغم استفاده از تعداد بالایی (1011×2 ذره) از ذرات فاژی برای آلوده کردن سلولهای AGS کارآیی انتقال و بیان به کمک نانوحاملژنی حاصل پایین و در حدود 0.02% میباشد (شکل3). این نتیجه دلیل دیگری برای بیخطر بودن و عدم گرایش ذرات فاژی به ورود به سلولهای یوکاریوتی می باشد. با اینحال این بررسیها نشان داد که سازه طراحی شده فعال میباشد و قابلیت انتقال و بیان ژن به سلولهای یوکاریوتی را دارد. این یافتهها با گزارشهای قبلی توسط گروههای مختلف مطابقت دارد. Poul و Marks (16) در مطالعه خود علیرغم استفاده از تعداد بسیار بالایی (cfu/ml 1013×4) از ذرات فاژی M13 دارای توالی GFP با بررسی میکروسکوپی تعداد سلولهای بیان کننده GFP را به قدر کافی ندیدند، با اینحال آنها تعداد سلولهای GFP مثبت را با بررسی FACS (Fluorescence activated cell sorting) حدود 0.04% گزارش کردند. آنها وقتی که از ذرات فاژی نمایش دهنده آنتیبادی تک زنجیرهای anti-ErbB2 در سطح پروتئین PIII استفاده کردند کارآیی انتقال و بیان را حدود 2 درصد گزارش کردند. مطالعات دیگر نشان دهنده کارآیی بسیار پایین انتقال و بیان ژن با فاژهای طبیعی بوده است، در صورتیکه این گروهها با نمایش مولکولهای هدفگیری در سطح ذرات فاژی توانستند کارآیی انتقال و بیان ژن را به مقدار زیادی افزایش دهند(5، 7، 8، 9، 10، 20 و 21).
بررسی ورود نانوحامل به سلولهای AGS با استفاده از MOI های مختلف نشان داد که ورود ذرات به سلولها وابسته به دُز میباشد (شکل4). مقایسه ساده باندهای حاصل از تکثیر 10 نانوگرم DNA استخراج شده از ذرات فاژی که معادل با مقدار DNA موجود در108×2 ذره از آن فاژ است(16) با باندهای حاصل از DNA تام سلولهای تیمارشده با نانوحامل حاکی از ورود تعداد بالایی از ذرات به سلولها در مقایسه با تعداد سلولهای GFP مثبت مشاهده شده با بررسی میکروسکوپی است. با اینحال باید توجه داشت که سلولهای GFP مثبت مشاهده شده با میکروسکوپ ناشی از تعداد اندک کپیهای ژنوم ترانسژن است که توانستهاند از سدهای مختلف داخل سلول عبور و به هسته وارد شوند. انتقال و بیان ژن با واسطه فاژ میتواند به وسیله یک یا چند رخداد پس از ورود به داخل سلول از قبیل تخریب فاژ برای آزاد شدن DNA، فرار از اندوزوم، انتقال به هسته و رونویسی محدود شود(19). برای افزایش کارآیی انتقال و بیان ژن با کمک فاژ میتوان از دو راهبرد استفاده کرد: راهبرد اول استفاده از مولکولهای هدفگیری مسیرهای داخل سلولی از قبیل اتصال پپتیدهای دارای نشانه انتقال به هسته یا فرار از اندوزوم و دوم راهبردهایی که هدف آنها رخدادهای خارج سلولی از قبیل افزایش احتمال برهمکنش بین فاژ و سلول است. افزایش برهمکنشهای سلول و فاژ هم با روش فاژنمایی(phage display) (5،7،9،10،15،20،21) و هم با روشهای مختلف اتصال شیمیایی لیگاند هدفگیری به سطح ذرات فاژی طبیعی قابل حصول است (12). گفتنی است که راهکار دوم به عنوان یک روش نوین توسط گروه پژوهشی تحقیق حاضر برای اتصال ترانسفرین به عنوان مولکول هدفگیری به سطح ذرات فاژی λ-GFP در حال اجراست.
تشکر و قدردانی
هزینه اجرای این پژوهش توسط معاونت پژوهشی دانشگاه تربیت مدرس و همینطور بخشی از آن توسط ستاد توسعه فناوری نانو تأمین شده است.