Identification of key genes as potential biomarkers involved in triple-negative breast cancer using RNA sequencing transcriptomic data analysis of breast cancer patients compared to healthy individuals

شناسایی ژن­های کلیدی دخیل در سرطان پستان سه گانه – منفی به عنوان نشانگر زیستی مستعد با استفاده از آنالیز داده‌های ترانسکریپتومی توالی یابیRNA  مبتلایان به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم

پگاه محبوب نیا¹، مصطفی رفیعی پور¹، رضا مهدیان² و فریناز به­فرجام^1*

¹ ایران، قزوین، دانشگاه دانش البرز، دانشکده علوم، گروه ژنتیک

² ایران، تهران، انستیتو پاستور ایران، گروه پزشکی مولکولی

تاریخ دریافت: 24/03/1401          تاریخ پذیرش: 16/09/1401

چکیده

سرطان پستان از نوع سه گانه – منفی نوعی سرطان شایع در جهان است که در بافت پستان رشد می­کند. این بیماری تبدیل به بزرگترین مشکل سلامتی انسان در سراسر جهان شده است. بنابراین شناسایی ژن­های کلیدی درگیر در این بیماری می­تواند در تشخیص، پیش­آگهی و درمان مفید باشد. هدف تحقیق حاضر شناسایی ژن­های با اختلاف بیان معنادار موثر بر سرطان پستان سه گانه – منفی است که با استفاده از آنالیز داده‌های ترانسکریپتومی توالی یابیRNA  مبتلایان به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم انجام گرفت. داده­های ترانسکریپتوم تعیین توالی شده با دستگاه Illumina مربوط به سه فرد مبتلا به سرطان پستان از نوع سه گانه- منفی و چهار فرد سالم از پایگاه داده  NCBI و SRA جمع­آوری شده و پس از کنترل کیفیت خوانش­ها با استفاده از نرم­افزار FastQC، همترازی توالی­ها با ژنوم مرجع با نرم­افزار STAR انجام شد. در نهایت، جهت بررسی بیان افتراقی ژن­ها، از نرم­افزارهای featureCounts و DESeq2 استفاده شد و ژن­های با اختلاف بیان معنادار به کمک نمودار Volcano نمایه گردید. در نهایت برای بررسی نقش ژن­ها در مسیر­های مولکولی، تجزیه و تحلیل هستی شناسی ژن انجام گرفت. در این تحقیق، 31 ژن دارای بیان افتراقی با سطح معنی داری p<0.05 شناسایی شد. در بین این 31 ژن، 11 ژن کاهش بیان و 20 ژن افزایش بیان نشان دادند. از جمله ژن­های شاخص این مجموعه ژنی، می­توان به ژن­های RNF223، ETV3L، CACNA1S، UPS34، NEURL3، CRYBG3 و FABP4 اشاره نمود. بررسی و مطالعات انجام شده در مورد این ژن­ها حاکی از نقش مهم آن­ها در مسیر­ها و فرآیندهای مولکولی درگیر در بیماریزایی افراد مبتلا به سرطان پستان از نوع سه گانه- منفی بود. بنابراین معرفی این نشانگر­های زیستی مهم در مکانیسم­های مولکولی حیاتی سلول­ها می­تواند برای اهداف تشخیصی، درمانی و پیشگیری بسیار با اهمیت و منحصر بفرد باشد.

واژه های کلیدی: سرطان پستان، بیان افتراقی ژن، ترانسکریپتوم و پایگاه داده NCBI

*نویسنده مسئول، پست الکترونیکی:Behfarjam.farinaz@gmail.com

مقدمه

سرطان پستان یکی از هتروژن­ترین انواع سرطان­ها و علت 9/22% از سرطان­ها در زنان و دومین سرطان شایع در کشورهای درحال توسعه است [22]. برطبق جدیدترین آماری که ارائه شده است، سالانه 21/33 زن از هر 100000 زن در ایران با میانگین سنی 84/49 سال به سرطان پستان مبتلا می­شوند که در این میان 2/14 نفر از هر 100000 نفر فوت می­کنند [22]. تخمین زده می­شود در سال 2030 در مجموع 4/26 میلیون مورد ابتلا به سرطان پستان در جهان وجود داشته­ باشد که 17 میلیون آن منجر به مرگ شود. در بین انواع مختلف سرطان پستان، نوع سه گانه – منفی (Triple Negative) دارای شیوع بالایی می­باشد که این نوع، به گونه­ای از بیماری سرطان پستان گفته می­شود که فاقد گیرنده استروژن (ER)، گیرنده پروژسترون (PR) وHER2/neu  باشد [15].

از آنجایی که بافت پستان اندامی حساس به استروژن است و در ایران مصرف داروهای ضدبارداری و سایر موارد دارویی شامل استروژن و یا پیش ساز آن در کنار عواملی همچون رژیم پرچرب و کم­ فیبر شانس ابتلا به سرطان پستان را افزایش می­دهد، تشخیص و درمان کارآمد دو مرحله­ی حیاتی بشمار می­آیند [11].

نشانگرهای بافتی از اولین نشانگرهای زیستی مرتبط با سرطان پستان می­باشند، گیرنده­های هورمونی مانند گیرنده استروژن و گیرنده­ پروژسترون از جمله اولین نشانگرهایی هستند که در مراحل ابتدایی انواع سرطان پستان جهت پیش­آگهی و انتخاب روش درمانی مناسب بکار می­روند [21]. گیرنده فاکتور رشد اپیدرمال انسانی نوع 2 (HER2) نیز دیگر نشانگر پیش­آگهی سرطان پستان می­باشد که پاسخ آن تنها در صورتی قابل اتکا است که گره­های لنفاوی نیز درگیر سرطان شده باشند. نشانگر زیستی یوروکیناز پلاسمینوژن و کاتپسین دی نیز در جهت پیش­آگهی سرطان­های پستان با عدم درگیری گره­های لنفاوی کاربرد دارد [19] . در نهایت، می­توان از افزایش بیان P53 نیز به عنوان یک نشانگر زیستی برای پیش­آگهی سرطان پستان نام برد اما به دلیل عدم اختصاصیت این نشانگر و مشاهده­ی افزایش بیان P53 در بسیاری از انواع سرطان­ها به نظر می­رسد نمی­تواند نشانگر زیستی مفیدی واقع شود [14].

تاکنون حداقل هشت مجموعه­ی ژنی به عنوان نشانگرهای پیش آگهی پاتوژنز و درمان بیماری شناسایی شده است. در این میان، تغییرات بیانی 512 ژن دخیل در پاسخ به آسیب سلولی، تغییرات بیانی 97 ژن پیش­بینی کننده درجه بیماری و تغییرات بیانی 32 ژن بیانگر درگیری پاسخ به آسیب بواسطه P53 و تغییرات بیانی 186 ژن، پیش­بینی کننده تهاجمی/غیرتهاجمی بودن سرطان پستان می‍باشند [6]. بر اساس مواردی که ذکر شد و روش­های مختلفی که در راستای دستیابی به راهکار­های سریع­تر در تشخیص، درمان و پیش آگهی بیماری­های مختلف علی الخصوص سرطان پستان نوع سه گانه – منفی وجود دارد، امروزه تمرکز بسیاری از محققان بر روی روش­های نوین توالی یابی نسل بعدی است که در این بین روش توالی­یابی RNA (RNA sequencing) دارای اهمیت شایان ذکری می­باشد.

روش توالی­یابی RNA ، با استفاده از فناوری توالی­یابی نسل جدید، کمیت محتوای RNA یک نمونه زیستی را در یک بازه زمانی مشخص بررسی می­کند. بنابراین به نظر می­رسد با استفاده از این روش بتوان نشانگرهای دقیق­تری را جهت پیش­آگهی بیماری­ها عرضه کرد. پیشرفت‌های اخیر در توالی­یابی نسل بعد باعث شده که بازه پوشش توالی­یابی توکلئوتید­هایDNA  و همچنین مقدار نمونه ورودی برای توالی­یابی افزایش پیدا کند [11]. این پیشرفت‌ها توالی­یابی رونوشت‌های RNA سلول را تسهیل می‌کند و این امکان را فراهم می­کند که رونوشت‌های برش خورده ژن، تغییرات پس از رونویسی، همجوشی ژن­ها، جهش‌ها و پلی­مورفیسم تک نوکلئوتیدی و در نهایت تغییرات در بیان ژن را بررسی نماید [5]. توالی­یابی RNA فن آوری است که با بهره‌گیری از توانایی‌های «توالی­یابی نسل بعدی» برای بدست آوردن تصویری کلی از حضور و مقدار RNA از ژنوم در یک بازه­ی زمانی خاص استفاده می‌کند [5]. همچنین این روش دارای کاربردهایی همانند شناسایی تفاوت­های ژنتیکی، مسیرها و شبکه­های زیست مولکولی موثر در بیماریزایی افراد است [10]. از اینرو، با توجه به عدم وجود راهکار­هایی جهت تشخیص زود هنگام، اقدامات پیشگیرانه و روش­های درمانی مناسب بیماری سرطان پستان از نوع سه- گانه منفی و از طرفی به دلیل پیشرفت­های حاصله در زمینه روش­های نوین نسل بعدی توالی یابی، در این مطالعه داده­های مربوط به مطالعات ترانسکریپتوم بیماران مبتلا به سرطان پستان از نوع سه گانه منفی در مقایسه با افراد سالم با هدف شناسایی نشانگر­های زیستی احتمالی مورد مطالعه قرار گرفتند.

مواد و روشها

دریافت داده­ها از پایگاه داده NCBI : از آنجایی که پایگاه داده­ی NCBI یک سیستم یکپارچه بازیابی اطلاعات بوده و قادر به جستجوی همزمان در بانک­های مختلفی نظیر GeneBank، PubMed و سایر پایگاه­های داده­ی مشابه می­باشد، داده­های مورد نیاز جهت انجام این تحقیق نیز از پایگاه داده­ای  NCBIو SRA بدست آمد [5]. در تحقیق حاضر از داده­های ترانسکریپتوم تعیین توالی شده با دستگاه Illumina مربوط به سه فرد مبتلا به سرطان پستان از نوع سه گانه- منفی و چهار فرد سالم از پایگاه داده  NCBI و SRA استفاده شد (لینک دسترسی به داده­ها: https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP235648&o=acc_s%3Aa). جدول 1 به اطلاعات دموگرافیک این داده­ها اشاره می­کند.

جدول 1- اطلاعات دموگرافیک داده­های ترانسکریپتومی بدست آمده از پایگاه داده  NCBI و SRA

          * خوانش­های دو طرفه

کنترل کیفیت خوانش­ها: پس از گرفتن داده­ها از پایگاه داده NCBI و SRA، کنترل کیفیت آن­ها، به کمک نرم­افزار Fast QC در محیط لینوکس انجام شد (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) .نرم­افزار Fast QC علاوه بر فهرست تعداد خوانش­ها و رمزگذاری کیفیت آن­ها،  اطلاعات مربوط به کیفیت و محتوای بازها، طول خوانش و محتوای K-مر و همچنین حضور بازهای مبهم و مضاعف شدگی­ها را گزارش داده و مصورسازی می­کند.

همردیفی خوانش­ها با ژنوم مرجع: در مرحله­ی همردیف کردن خوانش­ها با ژنوم مرجع، داده­های تعیین کیفیت شده با ژنوم مرجع (GRCh38.p13 (GCA_000001405.28) http://ftp.ensembl.org/pub/release-106/fasta/homo_sapiens /dna/)  هم­ردیف شدند. در تحقیق حاضر جهت هم­ردیفی توالی­ها از نرم‍‍افزار STAR استفاده شد (https://github.com/alexdobin/STAR/archive ) STAR یک برنامه­ی هم‍ردیف­ساز حساس و سریع است که برای همردیفی خوانش­های توالی­یابی NGS در ژنوم‍های انسانی مورد استفاده قرار می­گیرد.

تبدیل فایل­های SAM به BAM : فایل­های SAM که معمولاً توسط هم­ردیف­سازها ایجاد می­شوند نیازمند پردازش­هایی نظیر تبدیل SAM/BAM، مرتب­سازی، نمایه‍سازی یا ادغام هستند. در تحقیق حاضر از نرم­افزار SAMtools و Picard استفاده شد. (https://sourceforge.net/ projects/samtools/) ابتدا فایل­های SAM به فایل­های BAM تبدیل شد. این کار با استفاده از مجموعه­ی Samtools از ابزارهای commandline صورت گرفت. از گزینه­ی n- مرتب­سازی Samtools استفاده شد تا از این طریق اطمینان حاصل شود که فایل SAM بر اساس مشخصه­ی خوانش مرتب ­گردد.

مرتب­سازی و نمایه­سازی کردن فایل­های BAM : جهت انجام این دو مرحله از نرم افزار Samtools در محیط لینوکس استفاده شد. هدف از مرتب­سازی دسترسی کارآمدتر به داده­ها در این فایل­ها می­باشد. فایل BAM مرتب شده دارای داده­هایی است که بر اساس کروموزوم­ها/ کانتیگ­ها و داربست­ها در ژنوم مرجع مرتب شده است.

بررسی و شمارش خوانش­های همردیف با ژن­ها: جهت بررسی و شمارش خوانش­های همردیف شده به ژن­ها از نرم­افزار FeatureCounts استفاده شد. (https://sourceforge.net/projects/subread/files/subread-2.0.3/)  داده ورودی به نرم­افزار FeatureCounts شامل یک یا چند فایل از خوانش­های همردیف شده با فرمت SAM یا BAM است. با استفاده از این نرم افزار تعداد خوانش­هایی که با هر ژن همردیف شده­اند، مشخص می­شود و از این­رو ویژگی خوانش­ها تعیین خواهد شد.

بررسی بیان افتراقی ژن­ها: آنالیز بیان افتراقی شامل شناسایی ژن­ها یا سایر انواع ترکیبات ژنومی مانند رونوشت­ها یا اگزون­ها است. در تحقیق حاضر جهت بررسی بیان افتراقی، از نرم­افزار DESeq2 در محیط R استفاده شد.

(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ DESeq2.html) که فایل ورودی این نرم­افزار در واقع همان فایل خروجی نرم­افزار FeatureCounts است که به صورت یک ماتریس می­باشد. این نرم­افزار خوانش­هایی که با هر بخش از یک ویژگی همپوشانی داشتند شمارش کرده و هر خوانشی را که با چندین ویژگی همپوشانی داشت، حذف می­نماید. در نتایج حاصل از این نرم افزار، ژن‍های دارای بیان افتراقی در افراد مبتلا به سرطان پستان از نوع سه گانه منفی در مقایسه با افراد سالم بدست می­آیند. پس از یافتن Ensembl Gene ID برای ژن­های دارای بیان افتراقی، در پایگاه داده BioDBnet  (https://biodbnet-abcc.ncifcrf.gov/ db/db2db.php) ،  Gene Symbolها به دست آمده، در نهایت با اعمال فیلتر p-value <0.05 و <-0.05 تا <+0.05 Log2 در محیط پایتون ژن­های دارای بیان افتراقی معنادار مشخص شدند.

هستی شناسی ژن و و غنی سازی مسیر ژن­های با بیان متفاوت: برای انعکاس عملکردهای ژن، آنالیز­های هستی شناسی ژن انجام گرفت. (ToppFun)ToppGene  (https://toppgene.cchmc.org/enrichment.jsp) یک پایگاه داده آنلاین است که مجموعه­ای جامع از منابع را برای حاشیه نویسی عملکردی ارائه می­دهد تا اهمیت بیولوژیکی فهرست گسترده­ای از ژن­ها را تشخیص دهد [4]. آنالیزهای غنی‌سازی عملکردی ژن­های با بیان افتراقی، از جمله آنالیز­های هستی شناسی ژن و تحلیل غنی‌سازی مسیر­های درگیر آن­ها، در تحقیق حاضر، با استفاده از ToppGene با معیار cut-off p<0.05 و تعداد غنی‌سازی ژن بیشتر از 2 انجام شد.

نتایج

نتایج کنترل کیفیت داده­ها: در تحقیق حاضر  داده­های ترانسکریپتومی 7 نمونه انسانی شامل 3 نمونه سرطانی و 4 نمونه سالم مورد بررسی قرار گرفت که نتایج حاصل از کنترل کیفیت داده­های مربوطه، در شکل 1 (فایل پیوست شکل های 1-6) نشان داده شده است.

نتایج مربوط به همردیفی خوانش­ها با ژنوم مرجع: نتایج مربوط به همردیفی خوانش­ها با ژنوم مرجع که با استفاده از نرم­افزار STAR انجام گردید در جدول 2 قابل مشاهده است، درصد Mapping ، عمق خوانش و طول خوانش­های حاصله برای هر کدام از داده­ها حاکی از همردیفی مناسب آن­ها می­باشد.

شکل 1- نمودار­های مربوط به کنترل کیفیت خوانش­ها در نمونه shC-1. الف) وجود و یا عدم وجود آداپتور؛ ب) مضاعف شدگی؛ ج) توالی­های با پیچیدگی پایین؛ د) بازهای مبهم؛ ه) کیفیت خوانش؛ و) درصد بازهای فراخوانده شده؛ ز) تعداد خوانش­ها در مقابل درصد GC؛ ح) تعداد کل خوانش­ها در مقابل متوسط نمره کیفیت و ط) توزیع طول خوانش‍ها.

جدول 2- نتایج Mapping با استفاده از نرم­افزار STAR

                      * درصد خوانش های هم ردیف شده با ژنوم مرجع

                      ** تعداد خوانش های کوتاهی که در یک منطقه ژنومی خاص روی یکدیگر همپوشانی دارند.

نتایج حاصل از آنالیز بیان افتراقی: فایل­های BAM، پس از مرتب­سازی، با استفاده از نرم­افزار FeatureCount ارزیابی شدند. بعد از مرتب­سازی نتایج اولین مرحله از تجزیه و تحلیل  داده­ها در نرم افزار FeatureCount، این نتایج با استفاده از نرم افزار DESeq2 جهت شناسایی ژن­های دارای بیان افتراقی، آنالیز شدند.

در مجموع نتایج حاصل از آنالیز بیان افتراقی ژن، 9201 ژن با بیان متفاوت را نشان داد که به کمک پایگاه داده BioDBnet ، Gene Symbol آنها یافت شد. برای نمایش بیان افتراقی ژن­ها از نمودار Volcano استفاده شد (شکل 2). در این نمودار برای نمایش ژن­های با بیان متفاوت از سه طیف رنگی استفاده شد. نقاط سبز رنگ نمایانگر ژن­های با افزایش بیان معنادار با اعمال فیلتر p-value <0.05 و Log2 > 0.01 ، نقاط قرمز رنگ، ژن‍های با کاهش بیان معنادار با اعمال فیلتر p-value <0.05 و Log2 > -0.01 است. در نهایت، نقاط آبی رنگ مربوط به ژن­هایی با p-value نامناسب می­باشند ( p-value >0.05 ). به عبارتی دیگر، ژن­هایی که در این طیف رنگی قرار گرفته­اند (رنگ آبی) به طور معنادار دچار افزایش یا کاهش بیان نشده­اند.

بررسی میزان log2 fold Change و p-value (p-value <0.05 و <-0.05 تا <+0.05 Log2) به عنوان دو معیار اصلی در تفکیک ژن‍های با بیان متفاوت نشان داد که از میان 9201 ژن، 31 ژن سطح بیان متفاوت­تری را بر اساس دامنه­ای که تعیین شد، داشته­اند. قابل ذکر است که با تغییر این دامنه که در برخی مقالات هم اشاره شده است، می­توان ژن­های با تفاوت بیان بیشتری را شناسایی کرد. در این تحقیق، از دامنه­ی سختگیرانه­ای برای این آنالیز استفاده شد (<-0.05 تا <+0.05 Log2) و نتیجه حاصل به صورت نمودار ستونی نمایش داده شد (شکل 3). از این 31 ژن، 11 ژن کاهش بیان معنادار نشان دادند که با رنگ قرمز و 20 ژن هم افزایش بیان معنادار نشان دادند که با رنگ آبی در نمودار نمایش داده شدند.

شکل 2-  نمایش بیان افتراقی ژن­ها با استفاده از نمودار Volcano. در این نمودار بیان افتراقی ژن­ها با استفاده از دو پارامتر p-value و Log2 نمایش داده شد.

شکل 3- شناسایی 31  ژن با بیان متفاوت با اعمال دو فیلتر log2 fold Change و p-value . 11 ژن به رنگ قرمز دچار کاهش بیان معنادار  و 20 ژن به رنگ آبی دچار افزایش بیان معنادار . * نمایانگر 10 ژن با تفاوت بیان متفاوت­تری نسبت به سایر ژن­ها

در بین این 31 ژن، با اعمال فیلتر سختگیرانه­ای، 10 ژن تفاوت بیان متفاوت­تری نسبت به سایر ژن­ها داشتند. به طوری که پنج ژن RP11-762L8.6، lnc-RHBDD1-3، LINC00624، SGPP2 و AP000866.2 بیشترین میزان بیان یا به عبارتی بالاترین سطح بیان معناداری و پنج ژن CACNA1S، CXCL5، CCL20، NEURL3 و DEFB4A کمترین میزان بیان یا به عبارتی پایین­ترین سطح بیان معناداری را نشان دادند (شکل 3).

نتایج مربوط به تجزیه و تحلیل های هستی شناسی ژن: تجزیه و تحلیل هستی شناسی برای 31 ژن تمایز یافته برتر مشخص کرد که ژن های تمایز یافته به طور قابل توجهی در فرآیندهای بیولوژیکی و مکانیسم­های مولکولی موثر در سرطان پستان از جمله فرآیند­های مرتبط با پاسخ سلولی، رشد و تکثیر سلولی، آپوپتوز، فرآیند­های متابولیسمی، فرآیند­های مرتبط با چرخه سلولی، تولیدمثل و پاسخ­های ایمنی درگیر هستند (جدول 3).

بحث و نتیجه­گیری

سرطان پستان از نوع منفی - سه گانه نوع پیشرونده­ای از این بیماری است که امروزه فاقد نشانگر­های زیستی موثر و اهداف درمانی مورد نیاز برای مطالعات تشخیصی و درمانی می­باشد. سرطان پستان از نوع منفی سه گانه، مسئول تقریبا 15 درصد تمامی سرطان­های پستان تهاجمی است. امروزه به دلیل عدم شناخت کافی در مورد مکانیسم­های مولکولی و عملکردی و اهداف درمانی، شیمی درمانی عمده­ترین روش برای درمان این نوع از سرطان است. بنابراین، نیاز جدی به شناسایی نشانگر­های درمانی و تشخیصی می­باشد [1،2،13]. روش­های نوینی همانند ریزآرایه و تکنیک­های توالی یابی عمیق، تغییرات مولکولی گسترده­ای را در این بیماری ایجاد نموده و منجر به پیشرفت قابل توجهی در کار­های بالینی شده­ است. در سال­های اخیر، توالی یابی RNA به عنوان یک فن آوری جدید برای تجزیه و تحلیل ترانسکریپتوم با توان بالا مطرح شده است. بسیاری از مطالعات، ترانسکریپت­های دارای بیان افتراقی را شناسایی نموده و به عنوان نشانگر­های زیستی مستعد در طبقه بندی زیرگروه­های سرطان معرفی نموده­اند که می­تواند برای شناسایی و درمان این بیماری تهاجمی و پیشرونده بسیار مفید و ارزشمند باشد [26]. در این مطالعه، یک تجزیه و تحلیل افتراقی جامعی بر روی داده­های ترانسکریپتوم افراد مبتلا به سرطان پستان از نوع سه گانه - منفی در مقایسه با افراد سالم انجام گرفت. نتایج حاصل از مطالعه 7 داده شامل 3 فرد مبتلا به سرطان پستان و 4 فرد سالم، در نهایت منجر به شناسایی 31 ژن دارای بیان افتراقی با سطح معنی داری p<0.05 شد. در بین این 31 ژن، 11 ژن کاهش بیان و 20 ژن افزایش بیان نشان دادند. ارزیابی­های بیشتر این ژن­ها حاکی از نقش مهم و کلیدی آن­ها در مکانیسم­های مولکولی درگیر در بیماریزایی سرطان پستان بود.

جدول 3- گزیده­ای از  تجزیه و تحلیل هستی شناسی برای 31 ژن تمایز یافته برتر حاصل از آنالیز بیان افتراقی

در مطالعه اخیر، ژن USP34 در افراد مبتلا به سرطان پستان از نوع سه گانه - منفی در مقایسه با افراد سالم افزایش 5 برابری نشان داد. بررسی و مطالعات انجام شده حاکی از این است که این ژن پپتیداز اختصاصی یوبی کوئیتین 34 است که بر روی کروموزوم 2 قرار گرفته است. یوبی کوئیتین یک پروتئین 76 اسیدآمینه­ای است که با اتصال به یکسری از پروتئین­های هدف و تجزیه آن­ها نقش مهمی در تنظیم فرآیند­های سلولی دارد. حال یوبی کوئیتین پروتئاز­ها می­توانند در حذف این عامل از پروتئین­های هدف نقش داشته باشند. خانواده ژنی پروتئاز­های اختصاصی یوبی کوئیتین، یکی از کلاس­های مهمی از پروتئاز­ها در انسان هستند. پروتئاز اختصاصی یوبی کوئیتین UPS34 می­تواند نوع خاصی از آنزیم جدا کننده یوبی کوئیتین را رمزگذاری کند [12]. مطالعات زیادی به نقش حیاتی پپتیداز‌های اختصاصی یوبی کوئیتین در پیشرفت سرطان اشاره نموده‌اند [24]. همچنین، بر اساس مطالعات قبلی چندین مسیر مهم مرتبط با سرطان توسط اعضای مختلف UPS تنظیم می­شوند که از جمله آن­ها می­توان به مسیر­های JAKs-STATs ، مسیر NF-kB ، مسیر TGFB و مسیر Wnt اشاره نمود. مطالعات حاکی از نقش مهم UPS34 در مسیر پیام رسانی Wnt است [24]. از این رو می توان ژن UPS34 را به عنوان نشانگر زیستی احتمالی مهم در سرطان پستان معرفی نمود و با طراحی مهارکننده­های موثر علیه آن از پیشرفت سرطان جلوگیری نمود. ژن دیگری که در مطالعه کنونی به عنوان یک نشانگر زیستی احتمالی شناسایی گردید، ژن CRYBG3 بود. این ژن به صورت معنی داری در افراد مبتلا به سرطان پستان در مقایسه با افراد کنترل افزایش معناداری نشان داد. تجزیه و تحلیل­های هستی شناسی ژن و بررسی منابع حاکی از نقش مهم و تعیین کننده این ژن در مکانیسم­های مولکولی درگیر در بیماریزایی افراد مبتلا به سرطان پستان بود که تاییدی بر یافته­های این مطالعه بود. نقش مهم ژن CRYBG3 به این صورت است که این ژن می­تواند با یک آنزیم مهم فرآیند گلیکولیز به نام لاکتات دهیدروژناز برهمکنش داشته باشد. مطالعات انجام شده توسط چن و همکاران در سال 2018، افزایش بیان هماهنگ این دو ژن را در افراد مبتلا به سرطان ریه گزارش نمودند [3]. ژن CRYBG3 به عنوان تنظیم کننده گلیکولیز است و افزایش بیان آن باعث جذب گلوکز و تولید لاکتات می­شود و این در حالی است که ناک داوون آن نتایج معکوسی را نشان داده و باعث مهار تکثیر سلولی می­گردد. بنابراین می­توان گفت که ژن CRYBG3 می‍تواند به عنوان یک نشانگر زیستی احتمالی مهم در تشخیص و پیش آگهی افراد مبتلا به سرطان بوده و هدف گیری آن می­تواند گامی در جهت درمان این بیماری پیچیده باشد [23].

یکی از ژن­هایی که در این مطالعه دچار کاهش بیان شد، ژن FABP4 بود. کاهش 5 برابری این ژن با سطح معنی داری p<0.05 در افراد مبتلا به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم مشاهده شد. پروتئین متصل شونده به اسید چرب آدیپوسیت (FABP4) به وفور در ماکروفاژ­ها و سلول­های آدیپوسیت وجود دارد. با توجه به فراوانی این پروتئین در این دسته از سلول­ها، نظر بر این است که FABP4 در متابولیسم لیپید نقش دارد. طبق مطالعات انجام شده توسط ژانک و همکاران (2018)، نقش پروتئین FABP4 در بسیاری از سرطان­ها از جمله سرطان ریه، سرطان پستان، سرطان تخمدان و سرطان پروستات گزارش شده است. این پروتئین می­تواند به لیگاند­های لیپیدی هیدروفوب متصل گردد و در تنظیم متابولیسم گلوکز و لیپید نقش داشته باشد. همچنین نقش مهمی در پیام رسانی درون سلولی ایفا می­کند [25]. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل­های هستی شناسی ژن و یکسری از مطالعات حاکی از تاثیر تعیین کننده این پروتئین بر روی فرآیند تکثیر سلولی و آپوپتوز می­باشد. علاوه براین، گزارش شده که هر گونه کاهش بیان در این پروتئین کاملا مرتبط با سایز توموری هست که مورد مطالعه قرار گرفته است و افزایش بیان آن با القای ژن خارجی منجر به مهار تکثیر و مهاجرت سلول­های توموری شده است [25]. با توجه به اینکه تشخیص و شناسایی بیماری سرطان یکی از معظلات امروزه پزشکان و متخصصان می­باشد، شناسایی ژن مهم و کلیدی FABP4 می­تواند بسیار ارزشمند باشد. یکی دیگر از نشانگر­های کلیدی و مهم گزارش شده در این مطالعه، ژن RNF223 بود. نتیجه حاصله برای این ژن کاهش بیان معنی دار آن در افراد مبتلا به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم بود. ژن RNF223 بر روی کروموزوم 1 واقع شده است و پروتئین حاصل از آن با داشتن یک دومین انگشت حلقه نقشی کلیدی در مسیر یوبی کویتینه شدن دارد. بسیاری از پروتئین­های دارای این دومین، می­توانند به اهداف مولکولی خود متصل گردند و عملکرد آن­ها را تنظیم کنند. از جمله اهداف این پروتئین­ها می­توان به مولکول­های DNA، RNA، پروتئین و یا ساختار­های لیپیدی اشاره نمود. زوآ و همکاران (2019) در مطالعه­ای که با هدف بهبود تشخیص در بیماری سارکوما انجام دادند، به نقش مهم و تعیین کننده ژن­های FGF23، TLX2، TIFAB، RNF223، HIST1H3A و AADACL4 پی بردند. آنالیز­های عملکردی با کیفیت بالایی که این محققین انجام دادند، در نهایت منجر به معرفی این 6 ژن شد که دارای نقش حیاتی در فرآیندهای بیولوژیکی مرتبط با سرطان بوده و در بهبود تشخیص این بیماری پیچیده می­توانند بسیار کمک کننده باشند [21]. با توجه به نقش مهم این پروتئین در فرآیند مهم یوبی کوتئینه کردن پروتئین­های هدف، کاهش بیان آن می­تواند منجر به بهم ریختن تنظیم مسیر­های مولکولی مختلف درگیر در داخل بدن شود و اثرات جبران ناپذیری داشته باشد. از این رو شناسایی چگونگی عملکرد این پروتئین و تشخیص زودهنگام آن می­تواند در امر تشخیص و پیش آگهی مفید باشد.

ژن دیگری که در نتایج حاصل از این مطالعه به عنوان نشانگر زیستی احتمالی معرفی شد، ژن ETV3L بود. این ژن در تجزیه و تحلیل­های انجام شده کاهش بیان معنی داری (5 برابری) نشان داد. بررسی­های انجام شده در بانک­های اطلاعاتی، حاکی از وجود این ژن در موقعیت 1q23.1 با 20790 جفت باز بود که از نظر عملکردی نقش مهمی در بسیاری از فرآیند­های درون سلولی داشت. فاکتور­های نسخه برداری ETS ، بیان ژن­های درگیر در تکوین طبیعی سلولی ، تکثیر، تمایز، رگ زایی و آپوپتوز را تنظیم می­کنند. این دسته از فاکتور­ها دارای 28 عضو هستند که ژن ETV3L به عنوان یکی از اعضای مهم این ابرخانواده ژنی می­باشد. عدم تنظیم این فاکتور­های نسخه برداری، تکثیر سلولی در انواع مختلف سرطان­ها را تسهیل می­کند و چندین عضو آن­ها با فعال کردن نسخه برداری ژن­های خاصی در تهاجم و متاستاز نقش دارند. 28 عضو شناسایی شده از این خانواده ژنی تا به امروز دارای یک توالی اسیدآمینه­ای حفاظت شده به نام دومین ETS هستند که تقریبا دارای 85 اسید آمینه بوده و یک دومین متصل شونده به DNA در انتهای کربوکسیلی ایجاد می­کنند که برای شناسایی توالی هدف GGAA/T (جایگاه متصل شونده به ETS) ضروری می­باشد. فاکتور­های نسخه برداری ETS از جمله ETV3L با اتصال به نواحی متصل شونده به DNA، می­توانند در فرآیند­های دیگری مثل تکوین سلول­های بنیادی، تکثیر سلولی، تمایز، رشد سلولی، ترانسفورماسیون، رگ زایی و آپوپتوز نقش داشته باشند. این فاکتور­ها پروتئین­های افکتوری پایین دستی مسیر­های مولکولی مهم درون سلولی از جمله مسیر­های RAS/ RAF/ ERK هستند که مسیر­هایی مهم در فرآیند­های فوق می‍باشند. به گونه­ای که ارتباط سطح بیان ژن­های ETS با پیشرفت تومور در بسیاری از نئوپلازیایی انسانی شامل لوکمیا، تیروئید، پانکراس، کبد، پروستات، کلون، ریه و سرطان پستان مشاهده شده است که هر گونه تغییر بیان در آن­ها می­تواند باعث تغییر در ژن‍های هدف پاسخ دهنده شود. [7]. NEURL3 ، از دیگر ژن­های شاخص معرفی شده در این مطالعه است. این ژن کاهش بیان 6 برابری در افراد مبتلا به سرطان در مقایسه با افراد کنترل نشان داد. مطالعات حاکی از نقش مهم پروتئین حاصل از این ژن در تکوین غدد پستانی و به تبع سرطان پستان بود. خانواده ژنی نوروگلین، لیگاند­های شامل EGF را رمزگردانی می­کنند که قادرند با اتصال به پذیرنده­های تیروزین کینازی در شبکه­های پیام رسانی مهم در مسیر تکوین غدد پستانی و سرطان پستان بسیار مهم و تاثیرگذار باشند [16]. نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل­های هستی شناسی ژن و مطالعات مختلف حاکی از نقش مهم پروتئین NEURL3 در مراحل مختلف ریخت زایی و اختصاصی شدن سلول­های پستانی در مراحل جنینی هست. مطالعات اخیر نشان داده­اند که هر گونه تغییر در میزان تولید این پروتئین مهم می­تواند نقش بسیار تعیین کننده­ای در شکل گیری این سلول­های مهم در بافت پستانی داشته باشد. مطالعات لی و همکاران (2017) و گاتناتی و همکاران (2020) موید این نتایج و اطلاعات است [16,9]. نشانگر زیستی احتمالی مهم دیگری که در مطالعه کنونی گزارش شد، ژن CACNA1S بود [20]. نتایج حاصله کاهش معنی دار این ژن در افراد مبتلا به سرطان پستان در مقایسه با افراد سالم را نشان داد. مطالعه صورت گرفته توسط فان و همکاران در سال 2017 به اهمیت این ژن اشاره نموده و آن را به عنوان یکی از اهداف جدیدی برای درمان سرطان معرفی کردند [17]. ژن CACNA1S یکی از اعضای مجموعه ژنی کانال­های کلسیمی وابسته به ولتاژ می­باشد که این کانال­ها دارای نقش­های تایید شده­ای در فرآیند­های سلولی مثل میتوژنز، تکثیر سلولی، تمایز، آپوپتوز و متاستاز هستند [18]. در گزارشی ارتباط بین این دسته ژنی و کاهش در تکثیر و افزایش آپوپتوز در سرطان پروستات مطرح شده است که به دلیل کاهش بیان این ژن­­ها و هدف گیری آن­ها گامی مهم در جهت درمان بیماری سرطان برداشته شده است. بیان ترانسکریپت­های کانال­های یونی به عنوان نشانگر­های زیستی ­ مستعدی در انواع مختلف سرطان مثل سرطان پروستات و سرطان پستان مطرح شده است. بنابراین مطالعه نقش­های عملکردی این کانال­های یونی در مراحل تکوین سرطان ممکن است اهداف ارزشمندی برای تشخیص تومور مشخص نماید که نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل­های هستی شناسی ژن نیز به این امر اشاره داشت. به دلیل نقش مهم کلسیم و کانال­های یونی وابسته به این یون در فرآیند­های درون سلولی و مکانیسم­های مولکولی تعیین کننده سلولی، معرفی این ژن مهم می­تواند ارزش بالینی خیلی بالایی داشته باشد [18].

در این مطالعه، تجزیه و تحلیل­های انجام شده بر روی داده­های ترانسکریپتوم افراد مبتلا به سرطان پستان از نوع سه گانه - منفی در مقایسه با افراد سالم نتایج ارزشمندی را نشان داد. نتیجه این مطالعات، شناسایی 31 ژن دارای بیان افتراقی با سطح معنی داری p<0.05 بود. در بین این 31 ژن، 11 ژن کاهش بیان و 20 ژن افزایش بیان نشان دادند. از جمله ژن­های شاخص این مجموعه ژنی یافت شده می­توان به ژن­های RNF223، ETV3L، CACNA1S، UPS34، NEURL3، CRYBG3 و FABP4 و سایر ژن­های مهمی مثل CCL20، CXCL5، CEP295 و FLG2 اشاره نمود. بررسی و مطالعات انجام شده در مورد این ژن­ها حاکی از نقش مهم آن­ها در مسیر­ها و فرآیند­های مولکولی درگیر در بیماریزایی افراد مبتلا به سرطان پستان بود. از جمله فرآیند­هایی که این ژن­ها دخیل هستند، می­توان فرآیند­های تکثیر سلولی، تنظیم متابولیسم گلوکز و لیپید، آپوپتوز، پیام رسانی درون سلولی، تمایز، تکوین، تنظیم کانال­های وابسته به یون­ها، ترانسفورماسیون، رگ زایی و اتصالات سلولی را نام برد. بنابراین معرفی این نشانگر­های زیستی مهم در مکانیسم­های مولکولی حیاتی سلول­ها می­تواند برای اهداف تشخیصی، درمانی و پیشگیری بسیار با اهمیت و منحصر بفرد باشد که البته نیازمند مطالعات گسترده­تر برای تایید نتایج کنونی است.

تضاد منافع

نویسندگان اعلام می­کنند که هیچ تضاد منافعی ندارند.