بررسی الگوهای بیان High temperature requirement A2 (HtrA2) در رده‌ها و بافت‌های سلولی مختلف و تولید آن در میزبان پروکاریوتی

سمیرا شاطریان¹، سعید نژاوند^1*، علی مطاع² و محمد پاژنگ¹

¹ ایران، تبریز، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

² ایران، تبریز، دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی تبریز، دانشکده پزشکی، گروه بیوشیمی و آزمایشگاه‌های بالینی

تاریخ دریافت: 28/07/1398          تاریخ پذیرش: 13/11/1398

چکیده

HtrA2 سرین پروتئاز میتوکندریایی است که تقریبا در همه بافت‌ها بیان می‌شود و تحت شرایط استرسی این پروتئاز به یک فاکتور پروآپوپتوزی تبدیل می‌شودو در القای آپوپتوز شرکت می‌کند. این پروتئین احتمالا دارای فعالیت چاپرونی نیز بوده و در تاخوردن مناسب پروتئین‌ها نقش دارد. باتوجه به اهمیت آنزیم HtrA2 در القای آپوپتوز و ارتباط آن با برخی بیماری‌ها، الگوی بیان پروتئین HtrA2در رده‌های سلولی طبیعی و برخی رده‌های بیماری بررسی شد. نتایج PCR نشان داد که ژن HtrA2 در سلول‌های طبیعی معده بیان می شود ولی در سلول‌های سرطانی معده بیان نمی شود. هم چنین در سلول‌های سرطانی ریه و سلول‌های آدنوکارسینومای کولون انسان (رده سلولی SW480) نیز بیان دیده شد. با توجه به بیان متفاوت ژن HtrA2 در رده های سلولی های طبیعی و بیماری، الگوی مشخصی که نشان دهنده ارتباط بیان این پروتئاز با بیماری باشد مشاهده نگردید. در مرحله بعد با توجه به اهمیت HtrA2، قطعه cDNA مربوط به آنزیم HtrA2درون حاملpET21a(+)  کلون و حاملنوترکیب به سلول‌های مستعد E.coli سویه TOP10 منتقل شدند. در نهایت بیان پروتئین توسط SDS-PAGE آنالیز شد. سپس پروتئین تولید شده توسط ستون نیکل-آگارز خالص‌سازی شد و فعالیت پروتئازی آن توسط سوبسترای کازئین و با روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد. نتایج نشان داد که آنزیم تولید شده فعال است و بنابراین HtrA2 تولید شده ساختار طبیعی داشته و می توان از آن در جهت تحقیقات بعدی استفاده نمود.

واژه های کلیدی: HtrA2، آپوپتوز، کازئین، SDS-PAGE،بیان، فعالیت پروتئازی

*‌ نویسنده مسئول، تلفن: 09127123560، پست الکترونیکی: saeed.najavand@gmail.com, S.najavand@azaruniv.ac.ir

مقدمه

هوموستازی عبارت از وضعیت ثابت و پایدار در سلول می‌باشد. برخی عوامل که بعضا هم قابل تشخیص نیستند، می‌توانند هوموستازی را به هم زده و موجب تغییر در ثبات و پایداری سلول گردند. برخی از تغییرات و صدمات سلولی قابل برگشت بوده و برخی دیگر موجب مرگ سلولی می‌گردند (12). مسیرهای سلولی شامل انیوکیز (Anoikis)، آپوپتوز (Apoptosis) (نیازمند انرژی) و نکروز (Necrosis) (بدون نیاز به انرژی) است که برای عملکرد مناسب سلول، حفظ هوموستازی بافت و تنظیم پاسخ‌های ایمنی نیاز می‌باشند (1). شکل اصلی مرگ برنامه ریزی شده سلول آپوپتوز است که در آن سلول دچار یک سری تغییرات مولکولی، بیوشیمیایی و ریخت شناختی (morphological) می‌شود (28). سلول‌ها شامل مخلوطی از پروتئین‌های پروآپوپتوزی و ضدآپوپتوزی هستند. زمانی که تعادل بین این پروتئین‌ها تغییر کند، سلول آماده ورود به آپوپتوز می‌شود. تحریک مولکول‌های پروآپوپتوزی و یا مهار فاکتورهای ضدآپوپتوزی بستگی به نوع سلول و محرک دارد. دو مسیر اصلی آپوپتوز، مسیر خارجی، مسیر وابسته به گیرنده‌های مرگ و مسیر داخلی، مسیر میتوکندریایی می‌باشد (29). در مسیر میتوکندریایی، تحریک روند آپوپتوز با آزاد شدن Second Mitochondria-derived Activator of Caspases and Direct IAP-Binding protein with Low PI (SMAC/DIABLO) و سرین پروتئاز high temperature requirement A2  (HtrA₂‌) از میتوکندری صورت می‌گیرد. نقش این فاکتورها خنثی کردن اعمال مهار کننده‌های آپوپتوز از قبیل X-Linked Inhibitor Of Apoptosis (XIAP)، CIAP1 و CIAP2 می‌باشد (27 و 28). HtrA‌ پروتئازها هم در یوکاریوت‌ها و هم در پروکاریوت‌ها حضور دارند. این پروتئازها اولین بار در باکتری‌ها به عنوان پروتئین پری‌پلاسمیک کشف شدند. مدل غشایی از این خانواده degradation of periplasmic proteins protease (Deg P‌) باکتریایی است که در باکتری اشرشیاکلیشناسایی شد و نشان داده شد که سرین پروتئازی القا شده با شوک حرارتی بوده و به همراه فعالیت چاپرونی برای بقای باکتری در دماهای بالاتر ضروری است (24).این پروتئاز، پروتئین‌های تانخورده، بدتاخورده یا غیرطبیعی را تجزیه کرده و می‌تواند به عنوان چاپرونی جهت حفاظت ساختار پروتئین عمل کند. در بسیاری از گونه‌های باکتریایی بیماری‌زا، فقدان عملکرد HtrA به کاهش بیماری‌زایی آن‌ها منجر می‌شود که به دلیل افزایش آسیب ‌پذیری باکتری‌ها نسبت به استرس یا کاهش در ترشح فاکتورهای بیماری‌زا می‌باشد. بنابراین پروتئاز HtrA باکتری‌های بیماری‌زا، هدف خوبی برای اهداف درمانی است. در انسان چهار همولوژی از پروتئاز HtrA شناسایی شده است و مشخص شده که در فیزیولوژی سلول نقش مهمی دارند و شامل HtrA₁، HtrA₂/omi، HtrA₃ و HtrA₄ می باشند (24 و 31). خانواده HtrA از طریق دمین PDZ انتهای کربوکسیل، از سایر سرین پروتئازها قابل تشخیص است. دمین انتهای آمین این خانواده متغیر است و می‌تواند شامل توالی‌های تنظیمی و نشانگر (signal) باشد. دمین پروتئازی از نوع کیموتریپسین می‌باشد (24). HtrA₂ بهترین عضو شناخته شده از خانوادهHtrA است که تحت شرایط فیزیولوژیک در حفظ هوموستازی میتوکندری شرکت می‌کند. در شرایط پاسخ به آسیب‌های سلولی ناشی از استرس، فعالیت حفاظتی آن به فعالیت پروآپوپتوزی تبدیل می‌شود. ژن HtrA₂ انسانی بر روی بازوی بلند کروموزم 2 (2p 13.1) واقع شده است (شکل1)(27). این ژن 8‌ اگزون دارد و پلی پپتیدی با 458 اسیدآمینه را کد می‌کند. جرم مولکولی HtrA₂50 کیلو دالتون است و توسط ریبوزوم‌های سیتوزولی بیان می‌شود (3، 19 و30).

‌‌‌

شکل 1- جایگاه قرارگیری ژن HtrA2  در کروموزم 2(27)

پروتئین HtrA₂ با طول کامل در انتهای آمین خود، یک توالی هدف دهی به میتوکندری Mitochondria Targeting Sequence  (MTS) را دارد که منجر به قرارگیری پروتئین در میتوکندری می‌شود. یک دمین درون غشایی intermembrane (TM) و یک موتیف Ala-Val-Pro-Ser (AVPS) متصل به پروتئین اتصالی IAP IAP Binding Protein (IBM) دارد. دمین کاتالیزی حفاظت شده سرین پروتئازی به صورت سرین 306 ، آسپارتات 228، هیستیدین 198 (His 198, Asp 228, Ser 306) می‌باشد که دمین پروتئولیتیک (PD) نام دارد (شکل 2) با حذف پروتئولیتیک ناحیه انتهای آمین، HtrA₂ به فرم بالغ تبدیل می‌شود (36).

فرم فعال kDa HtrA₂ 36 وزن مولکولی دارد. ساختار تریمر این پروتئین وزن مولکولی معادل kDa110 دارد که دارای ساختار هرمی شکل می‌باشد.(شکل 3) (23 و 36).

شکل 2- دمین های ساختاریدر پروتئاز HtrA2

شکل 3- ساختار دمین PDZ و موتیف تریمریزاسیون

HtrA2 پروتئینی هست که در هوموستازی میتوکندری و در نتیجه حفظ بقای سلول نقش دارد.  HtrA2 با مرگ برنامه‌ریزی شده سلول در ارتباط می‌باشد. توسط فعالیت کاسپازها در آپوپتوز و توسط مکانیسم ناشناخته غیر وابسته به کاسپاز در مرگ سلولی شرکت می‌کند. این پروتئین در انیوکیز و مرگ سلولی نکروز نیز دخیل است. این احتمال وجود دارد که این پروتئین دارای فعالیت چاپرونی نیز باشد و در تاخوردن پروتئین‌ها شرکت نماید. عدم عملکرد در مسیر مرگ سلولی منجر به حذف معیوب سلول‌های آسیب دیده شده و می‌تواند به عنوان منشا تغییرات نئوپلاستیک عمل کند (24)، به‌طوری که تغییر بیان HtrA2 در بسیاری از بیماری‌ها نظیر سرطان، آلزایمر، هانتینگتون، ارتریت دیده شده است. به دلیل نقش HtrA2 در القای آپوپتوز، این پروتئین می‌تواند به عنوان هدف دارویی برای درمان برخی بیماری‌ها و از بین بردن سلول‌های سرطانی مورد توجه قرار گیرد (18، 20، 22 و 31).‌ با توجه به اهمیت پروتئین HtrA2 در مسیر آپوپتوز و ارتباط داشتن آن با برخی از بیماری‌ها از جمله سرطان، مطالعه این پروتئین در سطوح مختلف امری ضروری به نظر می‌رسد. در این مطالعه پس از طراحی و تهیه پرایمرهای اختصاصی HtrA2، ابتدا واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بر روی انواع سلول‌ها و بافت‌های انسانی سالم و بیمار ، به‌منظور بررسی الگوی بیان این پروتئین صورت گرفت. در مرحله بعد، همسانه‌سازی و بیان ژن HtrA2 در میزبان اشرشیاکلی (E.coli) به منظور تخمین وزن مولکولی و تعیین فعالیت پروتئازی آن صورت پذیرفت. مطالعات مربوط به ساختار پروتئین و نیز مطالعات مربوط به خصوصیات چاپرونی احتمالی این پروتئین هم‌اکنون در حال انجام است.

مواد و روشها

تکثیر قطعه ژنی HtrA2 از منابع سلولی مختلف: طبق مطالعات انجام شده، منابع زیادی به نقش این پروتئین در بیماری‌های عصبی، هانتیگتون، آلزایمر و سرطان‌ها پرداخته‌اند (18 و 20). از طرفی،  به دلیل اینکه منابع کمتری به نقش این پروتئین در سرطانی‌هایی مثل سرطان ریه و معده پرداخته‌اند و همچنین به دلیل در دسترس بودن و سهولت تهیه سلول‌های سرطانی معده و ریه باعث شد به عنوان نمونه‌هایی برای تحقیق و بررسی نقش و عملکرد این پروتئین انتخاب شوند. در این مطالعه،بافت های طبیعی و سرطانی معده و ریه و سلولهای آدنوکارسینومای کولون انسان (رده سلولی SW480) که قبلا توسط آزمایشگاه‌های بالینی گروه بیوشیمی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی تبریزتهیه (از هر بافت تعداد 5 نمونه) و مورد تایید نیز بودند آماده وcDNA مربوط به این سلول‌ها با استفاده از کیت استخراج RNA و سنتز cDNA شرکت bioneer، تهیه گردید. برای تکثیر قطعه ژنی HtrA2، دو جفت آغازگر رفت و برگشت مختص قطعه ژنی توسط نرم افزار generunner طراحی شد (جدول 1) و واکنش زنجیره ای پلیمراز Polymerase chain reaction (PCR) با یک برنامه دمایی تنظیم شده و دمای اتصال^°C60 انجام گردید. از هر دو جفت آغازگر برای انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز بر روی cDNA‌ های سنتز شده از منابع سلولی مختلف استفاده گردید.

همسانه سازی قطعه ژنی  HtrA2در ناقل بیانیpET21a(+): ناقل (vector) Pmd-HtrA2 حاوی قطعه ژنی HtrA2 از شرکت سینوبیولوژیکال (Sino Biological) تهیه گردید. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از جفت آغازگر مختص همسانه‌سازی با برنامه دمایی ذکر شده بر روی حاملPmd-HtrA2 به عنوان الگو انجام پذیرفت. توالی و مشخصات جفت آغازگر اختصاصی قطعه ژنی و جفت آغازگر اختصاصی همسانه‌سازی همراه با اندازه محصول PCR در جدول (1) آمده است.

جدول 1- توالی و مشخصات مربوط به آغازگرهای اختصاصی قطعه ژنی و آغازگرهای مختص همسانه‌سازی(جایگاه برش آنزیم ها در جدول مشخص شده است)

بعد از تکثیر قطعه ژنی کد کننده آنزیم HtrA2، قطعه مورد نظر توسط آنزیم‌های برشگر NdeI و XhoIتهیه شده از شرکت سیناکلون، به مدت 25 دقیقه در دمای^°C37  برش یافت. در این مطالعه از حامل بیانی pET21a(+) برای همسانه‌سازی قطعه ژنی HtrA2استفاده گردید. pET21a(+) نیز با شرایط ذکر شده توسط دو آنزیم NdeI و XhoI در معرض هضم قرار گرفت. پس از تخلیص قطعه ژنی و ناقل هضم شده توسط کیت استخراج از ژل(شرکت (Bionner، واکنش الحاق (Ligation) توسط آنزیمT4 DNA Ligase صورت گرفت و واکنش الحاق به مدت 16 ساعت در دمای ^°C4 انجام پذیرفت. سپس محصول واکنش الحاق با استفاده از روش شوک حرارتی به سلول‌های مستعد (competent cells) باکتری E.‌coli سوشTOP10 منتقل گردید. باکترهای ترانسفرم شده به پلیت LB حاوی آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین منتقل و به مدت 16 ساعت در^°C37 قرار گرفت. برای تایید حضور ناقل‌های نوترکیب در کلونی‌های تکثیر یافته، ابتدا تعدادی از کلونی‌ها انتخاب شده و بر روی آن‌ها ژل کراکینگ انجام پذیرفت.در ژل کراکینگ، بافر کراکینگ(NaOH, SDS, EDTA) بافر تخریب کننده است که دیواره سلولی باکتری را لیز کرده و محتویات داخل سلول از جمله DNA ژنومی و پلاسمید از سلول آزاد می‌شوند. با الکتروفورز کردن این عصاره سلولی می‌توان با توجه به اندازه باندهای ظاهر شده بر روی ژل آگارز، پلاسمیدهایی که احتمالا دارای قطعه ژنی هستند را مشاهده نمود (17). از کلونی‌های تایید شده توسط ژل کراکینگ برای انجام واکنش کلونی PCR استفاده گردید.در نهایت از کلونی‌های تایید شده در مرحله کلونی  PCRاستخراج پلاسمید صورت گرفت و حامل‌های نوترکیب توسط آغازگرهای پروموتر T7 تعیین توالی شدند (شرکت Bionner).

بیان و تخلیص آنزیم HtrA2: در این مرحله، پس از انتقال باکتری‌های ترانسفورم (Transformed bacteria) شده به سلول‌های مستعد BL21(DE3) و ظاهر شدن کلونی‌ها در پلیت LB حاوی آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین، بر روی تعدادی از کلونی‌ها کشت اولیه انجام پذیرفت. برای بررسی تولید پروتئین نوترکیب، نمونه‌ها با دو القاگر لاکتوز (mM 4) و IPTG(mM 1) القا شدند و در فواصل زمانی 3، 6 و 21 ساعت و دمای ^°C25 و ^°C30 و ^°C33 ، بیان پروتئین HtrA2 مورد بررسی قرار گرفت. بعد از سانتریفیوژ به رسوبات حاصل هم حجم آن‌ها، بافر لیز اضافه گردید. پس از اضافه شدن بافر لیز، می­توان پروتئین­های محلول درون سلولی باکتری را از رسوب باکتریایی با عمل سونیکاسیون جدا نمود. سونیکاسیون در فواصل زمانی20 ثانیه به تعداد 5 بار، روی یخ صورت گرفت.نمونه‌های حاصل از سونیکاسیون، سانتریفیوژ و محلول رویی حاوی پروتئین HtrA2 جداسازی گردید. با توجه به وجود دنباله‌ی هیستیدینی در پروتئین بیان شده از ستون تمایلی نیکل آگارز برای تخلیص پروتئین بیان شده استفاده شد و نمونه‌های خالص شده در این مرحله از طریق SDS-PAGE و سنجش فعالیت آنزیم در مجاورت با سوبسترا آنالیز شدند(10 و 21).

تعیین فعالیت آنزیم: در این مرحله، سنجش فعالیت آنزیمی از نمونه تخلیص شده صورت گرفت به این صورت که 2/0 گرم سوبسترای کازئین در  ml20 بافر تریس حل شد و pH محلول بر روی 5/7 تنظیم گردید. به نمونه اصلی400میکرولیتر از سوبسترا و 100 میکرولیتر از نمونه ریخته شد و به مدت 60 دقیقه در انکوباتور 40 درجه قرار گرفتند. در این آزمایش کنترل منفی شامل 400 میکرولیتر سوبسترا بود. بعد از 60 دقیقه نمونه‌ها از انکوباتور خارج و به نمونه اصلی 500 میکرولیتر بافر TCA به عنوان مهار کننده فعالیت آنزیم و به کنترل منفی 500 میکرولیتر مهار کننده به همراه 100 میکرولیتر آنزیم اضافه گردید. در ادامه همه نمونه‌ها به مدت 15دقیقه به دمای C°20- درجه منتقل شدند، سپس نمونه‌ها به مدت 5 دقیقه با دور 12000 سانتریفیوژ شدند و بعد از اتمام سانتریفیوژ، جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 280 نانومتر گرفته شد. بعد از خوانش جذب در طول موج 280 نانومتر، جهت تبدیل جذب به مولاریته از منحنی استاندارد تیروزین استفاده شد و در نهایتفعالیت آنزیم HtrA2 محاسبه گردید (شکل 10).

نتایج

نتایج حاصل از تکثیر قطعه ژنی HtrA2 مربوط به بافت ها و رده‌های سلولی مختلف: نتایج واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مربوط به قطعه ژنی HtrA2 که توسط هر دو جفت آغازگر طراحی شده برای ژن انجام شده است در شکل (4) نشان داده شده است. حضور قطعه 975 جفت بازی و 1377 جفت بازی نشان دهنده حضور و بیان ژن HtrA2 در رده یا بافت سلولی مربوطه می‌باشد (در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز از cDNA رده یا بافت سلولی مربوطه به عنوان الگو استفاده شده است).

همان‌طور که در شکل 4 مشاهده می‌شود، ژن HtrA2 در سلول‌های طبیعی معده بیان شده ولی در سلول‌های سرطانی معده بیان نشده است. همچنین وجود قطعه 1377 جفت بازی در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مربوط به سلول‌های سرطانی ریه نیز علتی بر بیان این ژن در سلول‌های سرطانی ریه می‌باشد. در رده‌ سلولی SW480 نیز حضور قطعه 975 جفت بازی نشان دهنده بیان این ژن در سلول های آدنوکارسینومای کولون انسان می باشد.

شکل 4- نتیجه PCR از قطعه HtrA2/omi الف) چاهک اول بلانک، چاهک دوم محصولPCRاز cDNA بافت سرطانی معده، چاهک سوم محصول PCR مربوط به cDNA  بافت طبیعی معده (اندازه قطعه حدود  975 جفت باز می‌باشد) وچاهک چهارم اندازه نمای DNA، ب) چاهک اولاندازه نمای DNA چاهک دوم محصول PCR از بافت سرطانی ریه (1377جفت باز) می‌باشد، چاهک سوم بلانک، ج) چاهک اول اندازه نمای DNA ، چاهک دوم PCR با cDNA مربوط به رده سلولی SW480 (975 جفت باز)،چاهک سوم بلانک

نتایج مربوط به همسانه‌سازی قطعه ژنی HtrA2 در ناقل بیانی pET21a(+): در مرحله همسانه‌سازی، پس از تکثیر قطعه HtrA2 توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با آغازگرهای مختص همسانه‌سازی،یک قطعه 975 جفت بازی مشاهده گردید. به منظور حذف قطعات و مواد و آنزیم‌های اضافی، خالص سازی محصول PCR انجام پذیرفت (شکل 5 الف).

شکل 5- الف) خالص سازی محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز مربوط به قطعه ژنی HtrA2/omi(چاهک اول محصول خالص شدهواکنش زنجیره‌ای پلیمراز مربوط به قطعه ژنی HtrA2/omi (975جفت باز)، چاهک دوم اندازه نمای DNA). ب) نتیجه استخراج حاملPET21a(+) و قطعه ژنی HtrA2/omiاز ژل (چاهک اول باند مربوط به قطعه ژنی HtrA2/omi برش خورده توسط هر دوآنزیم برشگر  (حدود 1000جفت باز)، چاهک دوم باند مربوط به حاملPET21a(+)  برش خورده توسط هر دو آنزیم برشگر (حدود 5500جفت باز)، چاهک سوم اندازه نمای DNA)

پس از هضم آنزیمی قطعه ژنی و حامل توسط آنزیم‌های برشگر NdeI و XhoI ، محصولات بر روی ژل آگارز %1 بارگذاری شدند و به منظور خالص سازی قطعه ژنی و حامل جهت بستن واکنش الحاق، محصولات هضم از ژل آگارز استخراج گردیدند. نتایج استخراج قطعه ژنیHtrA2 و حاملpET21a(+) هضم شده توسط آنزیم‌های برشگر از ژل آگارز در شکل 5 ب نشان داده شده است.

بعد از انجام واکنش الحاق، محصول واکنش الحاق به سلول‌های مستعد اشرشیاکلی سویه Top10 انتقال یافته و پس از 16 ساعت انکوباسیون در دمای^°C37 کلونی‌ها در پلیت نمایان شدند.پس از مشاهده کلونی‌ها، برای تائید نو­ترکیب بودن کلونی­ها و اطمینان از قرار گرفتن صحیح قطعه ژنی HtrA2درون حاملpET21a(+)، از کلونی‌های حاصل ژل کراکینگ به عمل آمد.بعد از انجام الکتروفورز در ژل کراکینگ ، یک باند سفید رنگی در نزدیکی چاهک‌ها دیده می شود که مربوط به پروتئین‌های چسبیده به DNA هستند که این پروتئین‌های چسبیده به DNA مانع از حرکت DNA در ژل می‌شود. باند دوم مربوط به ژنوم باکتری می‌باشد. باند سوم مربوط به حامل می‌باشد که احتمالا حامل نوترکیب مد نظر ما در این ناحیه قرار گیرد و بخش سفید رنگ در انتهای ژل مربوط به RNAها می‌باشند )17). شکل 6 نتایج مربوط به ژل کراکینگ تعدادی از کلونی‌های مرحله قبل را که به طور تصادفی انتخاب شده بودند را نشان می‌دهد.همان طور که در شکل 6 نشان داده شده است باند مربوط به حامل‌های حاصل از تخریب کلونی‌های ترادیسی شده در چاهک‌های 2،4 و 8 نسبت به باند حاملpET21a(+) بدون قطعه ژنی (چاهک 1) در موقعیت بالاتری قرار گرفته اند و احتمالا نشان دهنده حضور قطعه ژنی‌HtrA2 در حامل‌های مربوطه می باشند.

شکل 6- نتیجه مربوط به ژل کراکینگ تعدادی از کلونی‌های ترانسفرم شده (چاهک 1باند مربوط به حاملpET21a(+) بدون قطعه ژنی، چاهک­های 2 تا9باند مربوط به حامل‌های حاصل ازتخریب کلونی­های ترانسفورم شده).

پس از ژل کراکینگ، کلونی­هایی که احتمال داده می‌شد دارای حامل نوترکیب باشند انتخاب و جهت تایید کامل­تر، کلونی PCR بر روی آن­ها انجام گرفت. شکل 7 نتیجه کلونی PCR از تعدادی از کلونی‌های ترانسفرم شده با حامل نوترکیب را نشان می‌دهد.

شکل 7- نتیجه الکتروفورز کلونی PCR، (چاهک اول و پنجم PCRاز کلونی ترانسفورم شده با ناقلpET21a(+)بدون قطعه ژنی، چاهک دوم تا چهارم مربوط به کلونی PCR از کلونی­های ترادیسی شده با حامل‌های نو­ترکیب، چاهک ششم اندازه نمای DNA)

همان‌طور که در شکل مشاهده می‌شود وجود باندهای 975 جفت بازی نشان‌دهنده حضور قطعه ژنی HtrA2 در کلونی‌های ترانسفرم شده می‌باشد.

بیان و تخلیص HtrA2/omi: در مرحله بیان، حامل‌های نوترکیب تایید شده در مرحله همسانه‌سازی به سلول‌های مستعد BL21 منتقل شدند و پس از غربالگری، کلونی‌های حاوی حامل نوترکیب برای بیان آماده شدند. برای بررسی بیان پروتئین نو­ترکیب، القا توسط غلظت 4 میلی مولار لاکتوز و 1 میلی مولار IPTG در زمان‌های مختلف و در دماهای ^°C25 ،^°C30 و ^°C33صورت گرفت. دمای ^°C30 و 6 ساعت انکوباسیون پس از القا با لاکتوز 4 میلی مولار و IPTG 1 میلی‌مولار به عنوان شرایط بهینه در نظر گرفته شدند. شکل 8 نتایج مربوط به بیان HtrA2در شرایط مختلف را در ژل الکتروفورز نشان می‌دهد.

شکل 8- ژل  SDS-PAGEبیان پروتئین HtrA2 با القا کننده‌های لاکتوز و  IPTG( چاهک اول نمونه القا شده با لاکتوزبعد از 6 ساعت (باند 36 کیلودالتونی با پیکان مشخص شده است) ، چاهک دوم نمونه بدون القا بعد از 6 ساعت، چاهک سوم نمونه القا شده با IPTG بعد از 6 ساعت، چاهک چهارماندازه نمای پروتئین)

نتایج حاصل از SDS-PAGEحضور پروتئین 36 کیلو دالتونی در نمونه‌های القا شده را نشان می‌دهد. بهترین سطح بیان مربوط به نمونه‌های القا شده با غلظت 1 میلی مولار IPTG و 4 میلی مولار لاکتوز، به مدت 6 ساعت در دمای ^°C30 می‌باشد (شکل 9). دلیل استفاده از دو نوع القاگر این بود که چونپروتئین HtrA2 در حضور القاگر لاکتوز بیان ضعیفی را از خود نشان داد، لذا  برای بهتر شدن بیان از القاگر IPTGنیز استفاده شد. بنابراین کسب نتایج بهتر نیاز به بهینه سازی کدون برای سیستم پروکایوتی می‌باشد.

در ادامه کار پروتئین‌های بیان شده، توسط ستون نیکل آگارز خالص سازی شدند و سپس توسط SDS-PAGE آنالیز شدند. شکل 9 نتایج مربوط به خالص سازی پروتئین HtrA2 با وزن مولکولی 36 کیلودالتون توسط ستون نیکل آگارز را نشان می‌دهد.

شکل 9- نتیجه ژل SDS-PAGE مربوط به پروتئین HtrA2 تخلیص شده(چاهک اول پروتئین القا شده بالاکتوز بعد از 6 ساعت (باند 36 کیلودالتونی با پیکان مشخص شده است)، چاهک دوم اندازه نمای پروتئین، چاهک سوم پروتئین القا شده با IPTG بعد از 6 ساعت و چاهک چهارم نمونه‌ تخلیص شده توسط ستون).

تعیین فعالیت آنزیم HtrA2: برای تعیین فعالیت پروتئازی HtrA2 از سوبسترای کازئین استفاده گردید. جذب نمونه­ی موردنظر در طول موج 280 نانومتر اندازه‌گیری شد.  جهت تبدیل مقدار جذب نمونه‌ها در طول موج 280 نانومتر به مولاریته، منحنی استاندارد تیروزین رسم گردید (شکل10).

در این مرحله در ابتدا اختلاف جذب نمونه­ اصلی القا شده با لاکتوز و نمونه کنترل در واحد زمان (به ازای دقیقه) به­دست آمد که برابر با 5/0 بوده و سپس با استفاده از معادله خط نمودار استاندارد تیروزین، فعالیت آنزیم 397/0 میکرومول در دقیقه محاسبه گردید.

شکل 10- منحنی استاندارد تیروزین

همچنین اختلاف جذب نمونه اصلی القا شده با IPTG و نمونه کنترل در واحد زمان (به ازای دقیقه) برابر با 43/0 بوده و فعالیت آنزیم برابر با 334/0 میکرومول در دقیقه محاسبه گردید (شکل 11).

شکل 11- تعیین فعالیت آنزیمی HtrA2 (در نمونه القا شده با لاکتوز میزان فعالیت آنزیم معادل 397/0 میکرومول در دقیقه و در نمونه القا شده با IPTG میزان فعالیت آنزیم معادل 334/0 میکرومول در دقیقه محاسبه گردید)

بررسی فعالیت آنزیم هم در دمای ^°C25 و هم در دمای ^°C40 انجام گرفت. به طوری که آنزیم در دمای 40 درجه فعالیت بیشتری از خود نشان داد (نتایج نشان داده نشده است).

بحث

مسیرهای مختلفی که مرگ برنامه‌ریزی شده سلول را تنظیم می‌کنند به عنوان اهداف درمانی در انکولوژی به منظور افزایش حساسیت به عوامل شیمی درمانی و یا غلبه بر مساله مقاومت، کانون توجه تحقیقات بوده‌اند. دو مسیر اصلی تنظیم‌کننده مرگ‌سلولی برنامه‌ریزی شده شامل گیرنده‌های مرگ (مسیر خارجی) و مسیر سیگنال آپوپتوزی میتوکندریایی (مسیر داخلی) می‌باشد. این مسیرها با تعدادی از پروتئین‌های پروآپوپتوزی و آنتی‌آپوپتوزی تنظیم می‌شوند. تنظیم‌کننده‌های آپوپتوز به عنوان هدف درمانی جدید مطرح هستند (4). هدف قرار دادن آپوپتوز یک روش جدید برای کشف داروی سرطان است (7). HtrA2 پروتئینی هست که در هوموستازی میتوکندری و در نتیجه حفظ بقای سلول نقش دارد (31).  HtrA2در سلول‌های انسانی از طریق فعالیت پروتئازی خود قادر به القای آپوپتوز در مسیر غیر وابسته به کاسپاز و در مسیر وابسته به کاسپاز از طریق توانایی مهار میان‌کنش کاسپاز-‌IAP می‌باشد (33،34و 35). بنابراین  HtrA2می‌تواند به عنوان کاندید دارویی آپوپتوز مطرح باشد (16). همچنین آنالیز و بررسی وضعیت بیان پروتئین HtrA2/omi به عنوان تنظیم کننده آپوپتوز، برای درک میزان پیشرفت سرطان در بافت‌های سرطانی نیاز است (4). بنابراین با توجه به اهمیت HtrA2/omi به عنوان یک آنزیم تنظیم‌کننده و القاگر آپوپتوز و فعالیت ضد توموری آن، در ابتدا بیان این پروتئین در سلول‌های مختلف انسانی بررسی شد و سپسcDNA مربوط به HtrA2/omi در حامل بیانی مناسب کلون و بیان گردید و پس از بهینه کردن بیان پروتئین، خالص­سازی آنزیم انجام گرفت و در نهایت فعالیت پروتئازی آن با استفاده از سوبسترای کازئین بررسی شد.

بر حسب مطالعات انجام گرفته مشخص شده است بیان  HtrA2/omiدر تومورها بر حسب نوع تومور متغییر است. برای مثال در آدنوکارسینومای ریه (lung adenocarcinoma) بیان بالایی از HtrA2/omi دیده شده است (2). در کارسینومای سلول‌های سر و گردن (squamous cell carcinoma of the head and neck) در مقایسه با سلول های طبیعی همان بافت بیان HtrA2/omi بیشتر می باشد (8). در لوکمیای لنفوسیتی مزمن (chronic lymphocytic leukemia) در مقایسه با سلول‌های B طبیعی بیان HtrA2/omi کمتر می باشد (9). همچنین بیان HtrA2/omi در تومور wilm^,s در مقایسه با کلیه طبیعی بیشتر می‌باشد (5). در سرطان تخمدان این پروتئین بیان پایینی دارد (11). در سرطان پستان نیز با افزایش پیشرفت تومور، بیان HtrA2/omi کاهش می یابد (25 و 26). در سرطان پروستات متاستاتیک نیز در مقایسه با سرطان ابتدایی پروستات، پروستات طبیعی یا هیپرتروفی خوش خیم پروستات، بیان HtrA2/omi کمتر می‌باشد (6). در تومور سلول‌های جنسی مردانه (germ cell tumor) در مقایسه با بیضه‌های سالم HtrA2/omi بیان پایین‌تری دارد (14).در یک آزمایش صورت گرفته بر روی کارسینومای معده پیشرفته، با استفاده از رویکرد ریز آرایه بافتی (tissue microarray)، میزان بیان پروتئین HtrA2/omi بر روی 60 بیمار بررسی شد و مشخص شد که در 43 بیمار از 60 بیمار مبتلا به کارسینومای معده (Gastric carcinoma)، بیان HtrA2/omi به خوبی صورت می‌گیرد در حالی که در موکوس طبیعی معده بیان پروتئین HtrA2/omi وجود ندارد و یا بیان خیلی ضعیفی دارد (15). در رده سلولی کارسینومای هپاتوسلولار (Hepatocellular carcinoma) نیز، پروتئین Htr A2/omi بیان خیلی بالایی دارد و آپوپتوز سلول‌های کارسینومای هپاتوسلولار را القا می‌کند (32).

در این تحقیق برای بررسی بیان ژن HtrA2/omi در سلول‌های طبیعی و سرطانی، cDNA مربوط به HtrA2/omi از منابع مختلف سلولی تهیه شده و بعد از انجام عمل PCR مشخص شد تعدادی از این سلول‌ها دارای بیان ژن HtrA2/omi بوده ولی در بعضی دیگر یا بیانی وجود ندارد و یا بیان قابل تشخیص نیست. در cDNA تهیه شده از بافت سرطانی معده برخلاف مطالعات قبلی ژن HtrA2/omi بیان نشده بود و هیچ باندی به دنبال انجام PCR مشاهده نشد در حالی که در cDNA تهیه شده از بافت سرطانی ریه بعد از انجام PCR باند مربوط به تکثیر HtrA2/omi قابل مشاهده بود. پس از اینکه بیان پروتئین HtrA2 در چندین بافت و رده مورد بررسی و مطالعه قرار گرفت. برای درک عملکرد و خصوصیات احتمالی این پروتئین که بیان های متفاوتی از آن در چندین بافت مورد مطالعه مشاهده گردید به منظور مطالعات بیشتر و لزوم تولید پروتئین، cDNA این پروتئین در ناقل مناسب  کلون شد و پروتئین نوترکیب بیان گردید. در این تحقیق طی کلون سازی به دلیل بیان ژن مورد نظر در میزبان پروکاریوتی، نیاز به وجود توالی سیگنال پپتید جهت قرارگیری در میتوکندری نبود در نتیجه‌ در استراتژی کلونینیگ از آغازگرهای مختص کلونینگ که فقطقطعه مربوط به فرم بالغ پروتئین HtrA2/omi را همانندسازی می کردند استفاده گردید. در نتیجه استفاده از این آغازگرها قطعات ژنی با 975 جفت باز تولید شدند. بعد از مشاهده باند مورد نظر، کلونینگ قطعه ژنی در حاملpET21a(+) صورت گرفت، نتایج حاصل از ژل کراکینگ و کلونی PCR، موید کلون شدن قطعه ژنی درون حامل بودند، همچنین برای اطمینان بیشتر حامل حاوی قطعه کلون شده برای تعیین توالی به شرکت bioneer فرستاده شد. در انتهای کربوکسیل آغازگرهای مختص کلونینگ توالی His-Tag طراحی شد. موتیف His-Tag قادر به تسهیل در جداسازی و تخلیص پروتئین مورد نظر از طریق ستون کروماتوگرافی نیکل-آگارز می‌شود و در واقع پروتئین از طریق این موتیف با گروه‌های نیکل ستون کروماتوگرافی میان‌کنش برقرار می‌کند. دلیل قرار نگرفتن توالی His-Tag در N-ترمینال آغازگرها این بود که در ناحیه آمین، دمین‌های عملکردی جای گرفته‌اند و به هنگام تولید پروتئین بالغ برش دقیقا از کنار دمین درون غشایی صورت می‌گیرد در حالی که در انتهایکربوکسیل بعد از دمین PDZ، دمین های عملکردی مهمی وجود ندارند. در مرحله بیان ژن HtrA2/omi درون حامل بیانی BL21(DE3) از زمان­ها و دماهای مختلف و القاکننده­های IPTG و لاکتوز برای بررسی بیان استفاده گردید. برای بیان پروتئین HtrA2، دمای ^°C30  و 6 ساعت انکوباسیون پس از القا با لاکتوز 4 میلی مولار و IPTG 1 میلی‌مولار به عنوان شرایط بهینه برای بیان پروتئین انتخاب شد. پروتئین‌ HtrA2/omi به همراه توالی مربوط به His-Tag وزن مولکولی معادل 36 کیلودالتون داشت که بر روی ژل SDS-PAGE در محدوده بین 30-41 کیلودالتون قرار گرفت.فعالیت آنزیم HtrA2/omi توسط سوبسترای کازئین نیز در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفت. در اثر فعالیت آنزیم HtrA2/omi بر روی سوبسترا، کازئین شکسته شده و تیروزین به همراه قطعات پپتیدی دیگر تولید می‌شوند. با تهیه رقت‌های مختلف از تیروزین و رسم نمودار استاندارد تیروزین، می‌توان جذب نوری نمونه‌های حاصل از پروتئولیز را به مولاریته تبدیل کرد. فرایند پروتئولیز در pH 7 تا 10 پایدار بوده و کازئین سوبسترایی زود هضم و قابل دسترس می‌باشد. به همین دلیل از کازئین به عنوان سوبسترای آنزیم HtrA2/omi استفاده شد. فعالیت آنزیم در دمای ^°C25 کاهش قابل توجهی نسبت به دمای ^°C40 از خود نشان داد. قرارگیری موقتی HtrA2 در معرض دماهای بالا نیز مشابه چاپرون باکتریایی خود (deg P) که پروتئاز تجزیه کننده پروتئین‌ها در فضای پری پلاسمیک باکتری می‌باشد، فعالیت پروتئازی HtrA2/omi را افزایش می‌دهد (13). با توجه به این که پروتئاز HtrA2/omi احتمالا دارای فعالیت چاپرونی بوده و نیز آنزیمی است که تحت شرایط استرسی فعالیت بیشتری دارد، بنابراین فعالیت بیشتر در دمای 40 درجه نسبت به دمای 25 درجه پیش بینی می شد. آزمایش‌های دقیق‌تر بر روی فعالیت آنزیمی و فعالیت چاپرونی پروتئین در حال انجام است تا بتوان این پروتئین را به عنوان تارگتی مفید و سودمند در درمان برخی بیماری‌ها از جمله سرطان معرفی نمود.