القای آپوپتوز رده سلولی کارسینومای مثانه 5637 در اثر تیمار با پودوفیلوتوکسین

ایمان صادقی¹، مهرداد بهمنش^1*، مظفر شریفی²، بهرام محمد سلطانی¹ و نجمه احمدیان چاشمی²

¹ تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک

² تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم گیاهی

تاریخ دریافت: 9/2/91                 تاریخ پذیرش: 3/5/91 

چکیده

قرنهاست که از شیمی درمانی برای درمان سرطان استفاده می شود. داروها و ترکیبات مختلفی در شیمی درمانی استفاده می شود که هر کدام برای نوع خاصی از سرطان استفاده می­شود. در این بین ترکیبات گیاهی از جمله لیگنانها، مدتهاست که در پزشکی و داروسازی مورد استفاده قرار می گیرند. پودوفیلوتوکسین یکی از اعضای خانواده لیگنانها بوده که عمدتاً از گونه های جنس  Podophyllum استخراج می شود. این ترکیب دارای خواص بیولوژیکی مختلفی از جمله خاصیت ضد ویروسی، ضد قارچی و ضد توموری است. از خاصیت ضد توموری آن در درمان تومورهایی مانند تومور Wilms و تومورهای دستگاه تناسلی استفاده می شود. همچنین نشان داده شده است که پودوفیلوتوکسین باعث القای آپوپتوز رده سلولی کارسینومای تخمدان (Hela) می شود. تاکنون گزارشی درباره تأثیر پودوفیلوتوکسین روی سلولهای رده کارسینومای مثانه و از جمله 5637  داده نشده است. در این مطالعه به بررسی تأثیر پودوفیلوتوکسین روی بقای سلولی و آپوپتوز سلولهای 5637 پرداخته شد و نشان داده شد که پودوفیلوتوکسین باعث القای آپوپتوز و مرگ این سلولها می­شود. به نظر می­رسد که پودوفیلوتوکسین می­تواند به عنوان ماده فعالی برای القای آپوپتوز سلولهای سرطانی استفاده شود.

واژه های کلیدی: پودوفیلوتوکسین، آپوپتوز، سلول 5637، سرطان

* نویسنده مسئول، تلفن: 82884451، پست الکترونیکی: Behmanesh@modares.ac.ir

مقدمه

شیمی درمانی (Chemotherapy) یکی از اصلی ترین روشهای درمان سرطان است. ترکیبات طبیعی و سنتزی مختلفی در شیمی درمانی استفاده می­شود (9)؛ در بین آنها ترکیبات گیاهی است که قرنهاست در پزشکی سنتی و در حال حاضر در شیمی درمانی مورد استفاده قرار گرفته و بیش از 25 درصد مواد دارویی تجویزی دارای پیش ساختارهای مشتق از ترکیبات گیاهی هستند (12).

گیاهان حاوی ترکیبات لیگنانی سالها توسط پزشکان چینی و ژاپنی در پزشکی استفاده شده، و این گیاهان به دلیل خواص بیولوژیکی متنوعی از جمله خاصیت ضد سرطانی ترکیبات لیگنانی خود به خوبی شناخته شده اند. لیگنانها خانواده ای از محصولات طبیعی حاصل از متابولیتهای ثانویه (Secondary metabolites) بوده، که از طریق مسیر بیوشیمیایی شیکیمیک (Shikimic pathway) به وجود می آیند (6).

پودوفیلوتوکسین (podophyllutoxin) یکی از اعضای خانواده لیگنانهاست که یک ترکیب سمی غیر آلکالوئیدی بوده، و عمدتاً از گونه های Podophyllum  جداسازی می­شود (16 و 17). پودوفیلوتوکسین دارای خواص و فعالیتهای بیولوژیکی مختلفی است. در بین خواص فیزیولوژیکی و کاربردهای دارویی مشتقات پودوفیلوتوکسین، ویژگیهای ضد توموری و ضد ویروسی از جنبه فارماکولوژیکی از اهمیت زیادی برخوردار است (15). در حقیقت پودوفیلوتوکسین در زمینه های مختلف دارویی کاربرد داشته، و به عنوان ماده ضد ویروس در درمان condyloma acuminatum ناشی از ویروس HPV و دیگر زگیلهای مقاربتی مورد استفاده قرار می گیرد (5). شباهت قابل توجهی در وضعیت عملکرد لیگنانهای غیر آلکالوئیدی به عنوان مواد ضد ویروسی و ضد توموری وجود دارد. مکانیسم عملکرد ترکیبات شبه پودوفیلوتوکسین همانند کلشیسین (Colchicines) بوده، که با مهار تشکیل دوک میتوزی منجر به توقف تقسیم سلولی در مرحله متافاز می شود (7). اخیراً نشان داده شده است که مکانیسم فعالیت پودوفیلوتوکسین بر اساس مهار پلیمریزه شدن توبولین می باشد (8). برخلاف ترکیبات شبه پودوفیلوتوکسین، اتوپوزید (Etoposide) و تنیپوزید (Teniposide) که مشتقاتی از پودوفیلوتوکسین هستند، هیچکدام روی تجمع توبولین تأثیرگذار نیستند. ترکیبات شبه اتوپوزید به دلیل وجود شاخه قندی، مهار کننده میکروتوبولها نیستند و از طریق دیگری تقسیم سلولی را مهار می کنند. این ترکیبات، در اواخر مرحله  S یا اوایل مرحله G، چرخه سلولی را متوقف می کنند. مطالعات بیشتر نشان داده که اتوپوزید باعث شکست DNA می شود و یک آنزیم که توسط دارو القاء می­شود مسئول تخریب DNA است. هدف سلولی اتوپوزید آنزیم توپوایزومراز II (Topoisomerase II) بوده که برای تنظیم شکل و وضعیت DNA مورد نیاز است (10 و 11).

فعالیت بیولوژیکی پودوفیلوتوکسین به عنوان یک مهار کننده میتوزی کاربردهای دارویی دیگری از جمله استفاده به عنوان ماده ضد مالاریا و ضد قارچی دارد. همچنین پودوفیلوتوکسین در درمان بیماریهای پوستی و نقص سیستم ایمنی ناشی از عفونت ویروسی تأثیر دارد. به علاوه آنالوگهای وابسته به پودوفیلوتوکسین، فعالیت مهارکنندگی سیستم ایمنی داشته و برای استفاده در پیوند بافت مورد استفاده قرار می گیرند (3).

فعالیت ضد توموری ویژگی برجسته دیگری از پودوفیلوتوکسین است. پودوفیلوتوکسین در درمان تومورهای Wilms، انواع مختلف تومورهای دستگاه تناسلی (برای مثال carcinoma verrucosus) و سرطان ریه مؤثر بوده است. مطالعات مختلفی نیز در زمینه تأثیر پودوفیلوتوکسین و مشتقات آن روی رده های سلولی سرطانی صورت گرفته است (4). برای نمونه، Zhang و همکارانش گزارش دادند که مشتق قندی پودوفیلوتوکسین باعث القای آپوپتوز (Apoptosis) رده های سرطانی کارسینومای تخمدان (Hela) و آدنوکارسینومای ریه (A2) می شود (13).

در این مطالعه، به تأثیر پودوفیلوتوکسین بر روی بقای سلولی (Cell viability) و آپوپتوز رده سلولی سرطانی 5637 مشتق از کارسینومای مثانه پرداخته شد. در این پژوهش نشان داده شد که پودوفیلوتوکسین باعث افزایش مرگ و میر و آپوپتوز سلولهای سرطانی 5637 می شود.

مواد و روشها

پودوفیلوتوکسین (با وزن مولکولیg/mol 405/414 ) از شرکت Sigma خریداری شد. پنی سیلین، استرپتومایسین، تریپسین و محیط کشت RPMI 1640 از شرکت Gibco تهیه شد. کیت MTT assay، DMSO و Annexin-v- Flous از  شرکت Roche و رده سلولی سرطانی 5637  از بانک سلولی انستیتو پاستور خریداری شد.

کشت  سلول:  رده  سلولی  سرطانی  کارسینومای  مثانه

5637  در محیط کشت RPMI 1640 حاوی 10 درصد سرم (FBS) (Fetal bovine serum) کشت داده شده، و در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد co₂ انکوبه شدند. برای جلوگیری از آلوده شدن به محیط کشت U/ml 100 آمپی سیلین 100 µg/ ml و استرپتومایسین اضافه شد.

بررسی مورفولوژی: بعد از تیمار سلولهای سرطانی 5637 با پودوفیلوتوکسین با غلظت µg/ml10 به مدت 24 ساعت، تغییرات مورفولوژیکی زیر میکروسکوپ نوری Olympus بررسی و عکس برداری انجام شد( شکل 1).

بررسی سمیت سلولی: یکی از روشهای سنجش میزان سمیّت یک ترکیب شیمیایی یا هر ماده دیگر روی سلول، آزمون MTT است. معرف MTT (3و4و5- دای متیل تیازول -2)-2 و 5- دی فنیل تترازولیوم بروماید(3-(4,5-Dimethylthiazol - 2 - yl) - 2 , 5 - diphenyltetrazolium bromide)) که یک نمک تترازولیوم (Tetrazole) زرد رنگ است، جذب میتوکندری سلولهای فعال از نظر متابولیک شده و در اثر فعالیت آنزیمهای دهیدروژناز، تولید بلور فورمازان (Formazan) بنفش رنگ می کند که در حلال مناسب حل شده و میزان رنگ تولید شده با اسپکتروفتومتری اندازه گیری می شود (14). به طور معمول ابتدا سلولها در پلیت 96 خانه در محیط کشت RPMI 1640، حاوی 10 درصد سرم کشت داده شدند، و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد CO₂ انکوبه شدند. . برای تعیین LD50 غلظتهای متفاوت از ماده پودو فیلو توکسین در محیط کشت سلولی برای مدت 24 ساعت با  رنگ آمیزی تریپان بلو و تست MTT  انجام شد. این غلظت معادل µg/ml15 محیط کشت تعیین و برای ادامه  بقیه مراحل از غلظت µg/ml10 که زیر غلظت کشنده بود برای انجام مراحل بعدی  استفاده شد. سپس پودوفیلوتوکسین محلول در اتانول مطلق با غلظت µg/ml10 به چاهکها به صورت دو تکرار اضافه شد و انکوباسیون به مدت 24، 48 و 72 ساعت دیگر ادامه یافت. برای ارزیابی میزان سمیت ،10میکرولیتر از محلول رنگ MTT (طبق پروتوکل شرکتRoche  ) به هر چاهک اضافه کرده و به مدت 4ساعت انکوباسیون ادامه پیدا کرد. مایع رویی را حذف کرده، و 100میکرولیتر DMSO به هر چاهک اضافه شد. بعد از پیپتاژ، جذب در طول موج 490 نانومتر با استفاده از Eliza reader  خوانده شد.

سنجش آپوپتوز: یکی از روشهای موجود برای بررسی آپوپتوز، آنالیز و مطالعه مولکولهای PS موجود در سطح خارجی غشاء به هنگام فرآیند آپوپتوز است. مولکول Annexin-V یک پروتئین متصل شونده به فسفولیپیدها در حضور یون کلسیم می‌باشد. این ماده دارای تمایل بالایی برای مولکول PS می‌باشد. بنابراین، برای تشخیص سلولهای در حال آپوپتوز در یک جمعیت سلولی بسیار مناسب است. کیت Annexin-V-Fluos Staining kit هم دارای ماده AnnexinV و هم دارای رنگ PI می‌باشد که امکان تشخیص و تمیز دادن سلولهای در حال آپوپتوز را از سلولهای نکروزی میسر می‌سازد (1). به منظور شمارش سلولهای آپوپتوزی از کیت تشخیصی Annexin-V- Flous استفاده شد. ابتدا سلولها در پلیت 6 خانه در محیط RPMI 1640، حاوی 10درصد سرم کشت داده شده و به مدت 24ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد CO₂ انکوبه شدند. سپس پودوفیلوتوکسین با غلظت µg/ml10 (برای اینکه مرگ سلولی کنترل شده و معنی دار باشد، غلظت کمتر از غلظت کشنده 50 درصد یا LD₅₀ استفاده شد) به چاهکها به صورت دو تکرار اضافه شد و انکوباسیون به مدت  48 ساعت ادامه یافت. سلولها را بعد از تیمار جمع آوری و دوبار با PBS شستشو داده شد. سپس،PI  و Annexin-v به سوسپانسیون سلولی موجود در بافر اتصال شونده اضافه گردید. سلولها در تاریکی به مدت 15 دقیقه در 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند و با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری آنالیز شدند.

آنالیز آماری: برای بررسی نتایج به دست آمده از روشهای آنالیز آماری ANOVA و t-test استفاده شد و سطح معنی داری 95 درصد در نظر گرفته شد.

نتایج

تغییرات مورفولوژیکی: تغییرات مورفولوژی سلولهای 5637 با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شد. همان طور که در شکل 1 دیده می شود، سلولها پس از تیمار با پودوفیلوتوکسین، دچار تغییراتی از جمله چروکیدگی، گرد شدن و برآمدن غشاء شدند. این تغییرات مورفولوژی نشان می دهد که ممکن است پودوفیلوتوکسین باعث القای فرآیند آپوپتوز در سلولهای 5637 شود.

شکل1. مورفولوژی سلولهای 5637 بعد از تیمار با پودوفیلوتوکسین. (A) سلولهای تیمار نشده. (B) سلولهای تیمار شده با پودوفیلوتوکسین (تصاویر با استفاده از میکروسکوپ نوری و با بزرگنمایی 20× گرفته شده است).

بررسی سمیت سلولی: برای بررسی تأثیر پودوفیلوتوکسین روی سلولهای 5637، از روش MTT assay استفاده شد. ابتدا غلظت کشنده 50 درصد سلولها یا LD50 برای پودوفیلوتوکسین به دست آمد و برای اینکه مرگ سلولی به صورت کنترل شده و معنی دار باشد، از غلظت کمتر از LD50 یعنی µg/ml10 استفاده شد (غلظت LD50 به دست آمده µg/ml 15 بود). شکل 2 نشان دهنده تأثیر پودوفیلوتوکسین (غلظت µg/ml10( روی رده سلولی 5637 در سه بازه زمانی 24، 48 و 72 ساعت است. برای کنترل از کشت سلول هم زمانی استفاده شد که هیچ تیماری روی آن صورت نگرفته بود.

شکل 2- درصد بقای سلولهای 5637 تیمار شده با پودوفیلوتوکسین (غلظت µg/ml10) به مدت 24، 48 و 72 ساعت. نتایج به صورت میانگینی از دو آزمایش مستقل نشان داده شده است. ترکیب پودوفیلو توکسین در 24 ساعت اول تیمار باعث مرگ حدود 30 درصد از سلولها می شود. در حالی که میزان این اثر گذاری در زمان 72 ساعت بیش از 60 درصد می باشد.

نتایج این تحقیق حاکی از آن است که پودوفیلوتوکسین باعث کاهش بقای سلولی در هر سه بازه زمانی شده است. که این نشان دهنده بقای سلولی وابسته به زمان است. البته در بازه زمانی 72 ساعت کاهش بقای سلولی نسبت به دو زمان دیگر شدیدتربوده و از نظر آماری معنی دار بود.

بررسی آپوپتوز: آپوپتوز به وسیله رنگ آمیزی سلولها با استفاده از کیت AnnexinV-Flous و با استفاده از فلوسایتومتری تعیین شد. آپوپتوز اولیه به وسیله رنگ آمیزی مثبت برای Annexin-V-FITC و آپوپتوز ثانویه به وسیله رنگ آمیزی مثبت هم برای Annexin-V و هم برای PI مشخص شد.

سلولهای 5637 با پودوفیلوتوکسین (µg/ml10) به مدت 48 ساعت قبل از آنالیز توسط فلوسایتومتری تیمار شدند. سلولهای بدون هیچ تیماری به عنوان کنترل در نظر گرفته شدند. همان طور که در شکل 3 دیده می شود، سلولهای کنترل بدون هیچ تیمار، 39/0 درصد آپوپتوز اولیه، و 06/0 درصد آپوپتوز ثانویه نشان داده، در صورتی که سلولهای 5637 تیمار شده با پودوفیلوتوکسین، 94/28 درصد آپوپتوز اولیه و 05/31 درصد آپوپتوز ثانویه نشان دادند. این نشان می دهد که تیمار سلولهای 5637 با پودوفیلوتوکسین باعث القای آپوپتوز شده است.

شکل3- آنالیزفلوسایتومتری آپوپتوز سلولهای 5637 با استفاده از Annexin-V-Flous.(A) آپوپتوز القاء شده سلولهای 5637 ناشی از تیمار با پودوفیلوتوکسین. (B) سلولهای 5637 بدون تیمار.

بحث و نتیجه گیری

سرطان و ابتلای به آن یکی از معضلات مهم  فعلی برای جامعه بشری محسوب می شود (2). متأسفانه در طی سالهای اخیر روند رو به رشدی در دنیا و ایران مشاهده می شود. یافتن اثرات درمانی ترکیبات طبیعی که بتوان از آنها به عنوان دارو برای از بین بردن سلولهای سرطانی استفاده کرد، یکی از اولویتهای کلیدی است. ترکیبات طبیعی نسبت به ترکیبات شیمیایی از مزیتهای زیادی همچون اثرات جانبی کمتر  برخوردار است.

پودوفیلوتوکسین یکی از اعضای خانواده لیگنانها بوده، که خواص بیولوژیکی متعددی از جمله خاصیت ضد ویروسی و ضد توموری دارد (15). ترکیبات ضد سرطانی مهمی مانند اتوپوزید از این ترکیب ساخته می­شود (4). تأثیر پودوفیلوتوکسین تاکنون روی چند رده سلول سرطانی بررسی شده اما کاری روی سلولهای رده سرطانی 5637 مشتق شده از مثانه انجام نشده است. در این مطالعه به آنالیز تیمار سلولهای 5637 با پودوفیلوتوکسین و تأثیر آن روی آپوپتوز و بقای این سلولها پرداخته شد. آنالیز بقای سلولی نشان داد که پودوفیلوتوکسین باعث کاهش بقای سلولهای 5637 می شود. همچنین مطالعه آنالیز آپوپتوز با استفاده از فلوسایتومتری نشان داد که پودوفیلوتوکسین به صورت معنی داری باعث القای آپوپتوز سلولهای سرطانی 5637 می شود. نکته جالب در نتایج این تحقیق تأثیر وابسته به زمان ترکیب پودوفیلوتوکسین می باشد. بر اساس نتایج به دست آمده از سمیت سلولی در طی 24 ساعت اول تیمار، حدود 30 درصد از سلولها از بین می­روند که می­تواند بیانگر تأثیر ماده روی غشای پلاسمایی سلولها باشد. در حالی که در زمان 72 ساعت میزان تأثیر گذاری ماده به بیش از 60 درصد می رسد. به علاوه، آنالیز نتایج آپوپتوز نیز نشان دهنده تأثیر شدیدتر پودوفیلوتوکسین در زمانهای طولانی تر است. همچنین دیده می­شود که میزان آپوپتوز ثانویه بیشتر از آپوپتوز اولیه است، که این نشان دهنده تأثیر پودوفیلوتوکسین روی DNA و شکست آن و همچنین تغییرات غشایی زیاد سلول می باشد. این می تواند بدین مفهوم باشد که ترکیب پودوفیلوتوکسین علاوه بر تأثیر روی غشاء، باعث مختل شدن روند حیات سلول می­شود . به نظر می­رسد که این ترکیب دارای منشاء گیاهی بوده و از جمله ترکیبات طبیعی محسوب می­گردد، دارای توانایی مناسبی برای استفاده بر ضد سلولهای سرطانی باشد.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله تشکر و قدردانی از صندوق حمایت از پژوهشگران کشور و معاونت پژوهشی دانشگاه تربیت مدرس که بودجه و امکانات لازم برای انجام این تحقیق را فراهم کردند به عمل می آید.