Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)

ITS-rDNA and molecular typing of Leishmania spp. in suspected patients with cutaneous leishmaniasis in Sistan and Balochestan province, Iran

Document Type : Research Paper

Authors

1 Dept. of Biology, Faculty of Sciences, University Campus, Graduate School, University of Zabol, Islamic Republic of Iran

2 Dept. of Biology, Faculty of Sciences, University of Zabol, Zabol, Iran

3 Dept. of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, Zahedan, Iran

Abstract

Leishmaniasis is a parasitic disease caused by Leishmania species. The early diagnosis is by clinical symptoms and direct observation of the parasites. Molecular methods are more sensitive than the direct microscopy. The identity of the species in Sistan-Baluchistan province has not been taken yet. ITS-rDNA was used to detect the species of Leishmania in patients in Sistan-Baluchistan province using molecular methods. This study was conducted during 2014-2015. 82 positive smear samples were collected for molecular studies. The parasites were inoculated in N.N.N culture (with RPMI-1640 medium and 10% fetal calf serum) for rapid proliferation. After DNA extraction, the PCR-RFLP was carried out to determine the Leishmania species. SPSS and Multalin software were used to analyze the results. 46 (56%) and 36 patients (44%) were diagnosed with Leishmania major and Tropica respectively. The dominant species in the city of Chabahar and Mirjaveh was Leishmania tropica and Leishmania major respectively. In the center region of the province, both leishmania major and tropica was diagnosed as responsible for the disease. PCR-RFLP has high sensitivity for the diagnosis of leishmaniasis and rapid species identification of the parasites.

Keywords

Main Subjects

تعیین هویت مولکولی انگل لیشمانیا با هدف قرار دادن ژن ITS-rDNAدر بیماران مشکوک به لیشمانیوز جلدی در استان سیستان وبلوچستان

احمد زارع زاده1، غلامرضا مطلب2*، هادی میر احمدی3،4 و علیرضا سلیمی خراشاد3،4

1 ایران، زابل، دانشگاه زابل، پردیس خودگردان، گروه زیست ‌شناسی

2ایران، زابل، دانشگاه زابل، گروه زیست ‌شناسی

3ایران، زاهدان، دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، مرکز تحقیقات بیماری های عفونی و گرمسیری

4ایران، زاهدان، دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، دانشکده پزشکی، گروه انگل شناسی و قارچ شناسی

تاریخ دریافت: 14/11/94              تاریخ پذیرش: 22/12/96

چکیده

لیشمانیوز یک بیماری انگلی ناشی ازگونه های لیشمانیا می باشد. تشخیص اولیه توسط علام بالینی و مشاهده مستقیم انگل است. حساسیت روشهای مولکولی نسبت به دید مستقیم توسط میکروسکوپ بیشتر است. تاکنون مطالعات جامع و کاملی در زمینه تعیین هویت گونه انگل در استان سیستان و بلوچستان صورت نگرفته است. در این پژوهش گونه های لیشمانیا با استفاده از روشهای مولکولی با هدف قرار دادن ژن ITS-rDNA در بیماران مراجعه کننده به مراکز درمانی استان  سیستان و بلوچستان صورت گرفت. این مطالعه در سال 1393 تا 1394 انجام گرفت. 82 نمونه لام مثبت جهت مطالعات مولکولی جمع آوری گردید. بخشی از نمونه های برداشت شده به محیط کشت N. N. N تلقیح و برای تکثیر سریع و ازدیاد به محیط کشت
RPMI-1640 همراه با 10 درصد سرم جنین گوساله انتقال داده شد. پس ازاستخراجDNA  با استفاده از تکنیک  RFLP PCR- تعیین گونه های لیشمانیا صورت گرفت. نرم افزارهای SPSS و multalin جهت آنالیز نتایج استفاده گردید. تعداد 46 بیمار (%56) آلوده به لیشمانیا ماژور و36 بیمار(%44)آلوده به لیشمانیا تروپیکا تشخیص داده شد. گونه غالب در شهرستان چابهار گونه لیشمانیا تروپیکا ودر شهرستان میرجاوه لیشمانیا ماژور بود. در مرکز استان هردو گونه لیشمانیا ماژور وتروپیکا مسؤل بیماری تشخیص داده شد. روش PCR-RFLP دارای حساسیت و اختصاصیت بالا بوده و برای تشخیص لیشمانیوزها و تعیین گونه سریع انگل های عامل بیماری مناسب می باشد.    

واژه های کلیدی: ژن  ITS-rDNA  ،  لیشمانیا ماژور، لیشمانیا تروپیکا، PCR-RFLP ، استان سیستان و بلوچستان

* نویسنده مسئول، تلفن:05431232180 ،  پست الکترونیکی: reza.motaleb@uoz.ac.ir

مقدمه

 

لیشمانیوز جلدی ( سالک) یک عفونت انگلی پوستی است که توسط گونه های مختلف تک یاخته لیشمانیا ایجاد می شود. این بیماری توسط 'گزش پشه خاکی به انسان انتقال پیدا می کند ودر میزبان انسانی لیشمانیا به صورت انگلهای اجباری درون سلولی، فاگوسیتهای تک هسته ای را آلوده می کند.  ابتلا به این بیماری با توجه  به نوع گونه انگل و واکنش سیستم ایمنی میزبان،  تظاهرات بالینی متفاوتی خواهد داشت این تظاهرات از عفونت تحت بالینی محدود شونده تا ضایعات منتشر و پیشرونده پوست،  غشاء مخاطی و سیستم رتیکلو آندوتلیال متغییر می باشد(4). این بیماری در تمام قاره های جهان به جز استرالیا و اقیانوس منجمد شمالی دیده شده است و در حال حاضر لیشمانیازیس در 88 کشور جهان در قاره‌های آسیا،  اروپا،  آفریقا و آمریکا دیده می‌شود که در میان این کشورها 72 کشور در حال توسعه و 13 کشور کمتر توسعه یافته وجود دارد. در سال 1390 شهر های شیراز، مشهد، اصفهان و استانهای گلستان، کرمان، خوزستان، ایلام، یزد، سیستان و بلوچستان، سمنان، قم، خراسان شمالی وبوشهر بیشترین موارد الودگی را داشته اند(2) . بالغ بر %80 موارد سالک کشور نوع روستایی میباشد(2).  بیماری لیشمانیوز جلدی در روستاهای پانزده استان ایران که بدلیل لیشمانیا میجرایجاد شده اند یکی از مشکلات جدی و رو به افزایش می باشد که به شکل بومی دیده می شود (11و14). در جنوب و جنوب شرق  مناطق فارس، سیستان  و بلوچستان، خوزستان و ایلام در جنوب غربی، در شمال شرق نواحی لطف آباد و ترکمن صحرا،  اصفهان و ابردژ ورامین و یزد در مرکز ایران از  مهمترین کانونهای بومی بیماری میباشند (13و15).  مشخصات گونه های مختلف جنس لیشمانیا به عوامل متعددی از قبیل توزیع جغرافیایی انگل، تظاهرات بالینی و اپیدمیولوژی بیماری، ناقل و مخزن حیوانی بستگی دارد(10و8). انگلهای لیشمانیا از نظر شکل ظاهری قابل تفکیک نیستند و تا پیش از توسعه روشهای جدید، شناسایی و تفکیک گونه های انگل بر علائم بالینی، اپیدمیولوژی بیماری، بررسی ناقلین، توانایی ایجاد بیماری در حیوانات آزمایشگاهی و رشد در محیط کشت، استوار بود که عمدتاً نیازمند صرف زمان و هزینه بالایی است(19).  در حال حاضر به کمک روشهای نوین زیست شناسی ملکولی مانند انواع پی سی آر پیشرفته و شناساگرهای ملکولی،  شناسایی گونه های متفاوت جنس لیشمانیا میسر گردیده است (22). ژنهایی مانند دی ان ای ریبوزومی (20)، منطقه ایجاد کننده مکان رونویسی داخلی(7)، ژن توبولین (13)، ژن گلیکوپروتئین 63 کیلودالتونی (21)، ریزماهواره های دی ان ای (15) و دی ان ای کینتوپلاستی (12و16)  برای شناسایی انگل لیشمانیا توسط محققین و پژوهشگران استفاده شده اند. حد فاصل مناطق کد کننده 5.8S و  18S،  قطعه ITS1  و حد فاصل مناطق 5.8S و 28S،  قطعه ITS2  قرار دارد. این مناطق بر خلاف مناطق کد کننده تنوع بین گونه ای بیشتری نشان می‍دهند و برای تفکیک گونه ها از آنها استفاده می شود. ساختار rDNA در یوکاریوت ها ساختمان ثابتی را نشان می دهد و کل ساختار آن از '5 به' 3 شامل ناحیه (Intergenic Spacers) IGS که جزء قطعات غیر رونویسی می باشد. پس از آن در انتهای  '5 External Transcribted Spaser 1) ETS1) و در انتهای ' 3
(External Transcribted Spaser2) ETS2 قرار دارد. همراه این قطعات در نواحی مختلف،  ژن های 18S rDNA, 5.8S rDNA  ناحیه Internal Transcribed Spacers1(ITS1) ،  ژن 5. 8S rDNA ناحیه Internal Transcribed Spacer 5) ITS2) و ژن 28SrDNA   قرار دارد. قطعات ژنی این دو ناحیه ( ITS1و(ITS2  در بین یوکاریوت ها محافظت شده می باشند و برای درک ارتباطات فیلوژنیک مفید ند(12). استان سیستان و بلوچستان  در جنوب شرق ایران واقع شده است و با کشورهای پاکستان (900 کیلومتر) و افغانستان (300 کیلومتر) مرز مشترک دارد. این استان با وسعتی حدود 785/181 کیلومتر مربع،  پهناورترین استان ایران می‌باشد (9). لذا این منطقه احتمالاً دارای اهمیت و نقش ویژه ای در ورود و صدور آلودگی به انگل لیشمانیا توسط افراد آلوده و ساکن در نواحی مرزی می باشد.  با این وجود گونه مسئول در این منطقه نامشخص است.  در حال حاضر با وجود بروزنسبتا بالای بیماری در استان و عدم انجام مطالعات مدون و دقیق در شهرهای استان هویت انگل در برخی کانون های اندمیک استان مشخص نشده است . در این تحقیق،  نمونه های انسانی از استان سیستان وبلوچستان جمع آوری،  هم به روش میکروسکوپی و هم مولکولی عامل بیماری،  مورد مطالعه قرار گرفت تا هویت انواع انگل لیشمانیا،  در این منطقه بطور قطعی تعیین و تأیید گردد.

مواد و روشها

بیماران مراجعه کننده به مراکز بهداشتی ودرمانی استان سیستان و بلوچستان (ایرانشهر، چابهار، خاش، زابل، زاهدان، میرجاوه و نیکشهر) پس ازمعاینه توسط پزشک به آزمایشگاه معرفی و پس از تکمیل پرسشنامه اقدام به تهیه اسمیر مستقیم گردید. تعداد نمونه ها براساس اطلاعات آماری 82 نمونه در نظر گرفته شد. از هربیمار سه نمونه لام (گسترش) ازنقاط مختلف ضایعه جلدی تهیه شد.  گسترش تهیه شده بدون استفاده از شعله و در هوای اتاق خشک گردید. سپس متانول،  به مدت 30 تا 60 ثانیه (جهت فیکس کردن) روی لام ریخته و در مجاورت هوا خشک گردید. محلول گیمسا (1:10) با آب pH)  7.2)  رقیق٬ لام را روی پل رنگ آمیزی قرار داده و به مدت 15 دقیقه برروی آن محلول گیمسا ریخته شد. سپس لام را برای مدت کوتاهی در آب pH)  7.2) قرار داده و در مجاورت هوا خشک و آماده مطالعه گردید.  نمونه های جمع آوری شده زیر میکروسکوپ نوری با درشت نمایی هزار برابر از نظر وجود جسم لیشمن مورد بررسی قرار گرفته ومطابق با جدول شماره 1 درجه بندی گردید.

جدول1- درجه تشخیص میکروسکوپی بیماران مشکوک به لیشمانیوزجلدی مورد مطالعه (1) (605 نمونه لام)

تعداد انگل

تعدادفیلد میکروسکوپ

درجه مشاهده میکروسکوپی

0

1000

0

10-1

1000

1+

10-1

100

2+

10-1

10

3+

10-1

در هر فیلد

4+

100-10

در هر فیلد

5+

1000-100

در هر فیلد

6+

جهت تخلیص DNAاز کیت استخراجDNA  شرکت تکاپو زیست استفاده گردید که به روش ستونی استخراج صورت می گیرد برای جلو گیری از الودگی محتویات کیت به نمونه های مورد استخراج و یا  DNA از سر سمپلر های  فیلتر دار استفاده ودر هربار کشیدن محلولها سر سمپلر تعوض گردید. استخراج مطابق پروتکل کیت شرکت تکاپو زیست صورت گرفت. DNAی تخلیص شده را همراه با شناساگر bp 100 الکتروفورز و به صورت کیفی مقدار DNA مشخص گردید. برای این منظور 5 میکرولیتر از محلول DNA را بهمراه یک میکرولیتر بافر بارگیری بر روی ژل آگار 0.8 درصــدو10میکرو لیتردر  ژل نمونــه گذاری و الکتروفورز و در زیر نور ماوراء بنفش با استفاده از دستگاه UV-transiluminator مشاهده گردید.

انجام آزمایش  PCR : حجم کل واکنش PCR دراین مرحله 15میکرولیتر در نظر گرفته شد که مقدار وترتیب مواد شرکت کننده در واکنش  PCR1در جدول 2 آمده است.

جدول 2- مواد و مقدار مورد نیاز جهت ساخت cDNA

نام ماده

مقدار مورد استفاده

DNAالگو

3 میکرو لیتر

آب مقطر دوبار تقطیر بدون نوکلئار

3.5 میکرولیتر

Master Mix (Bioneer, Korea)

7.5 میکرولیتر

پرایمر IR(تکاپو زیست )

1 میکرولیتر

 

برای انتخاب بهترین دمای آنلینگ، PCR با 4دمای 56، 58، 60، 62سانتیگراد انجام شد که بهترین باندها دردمای 58درجه ساتیگراد برای هر دو گونه انگل حاصل گردید.  و پس از بهینه کردن PCR. برای تکثیر ژن از برنامه دمائی طبق جدول 3 استفاده  شد.

با توجه به اینکه محصول PCR مرحله اول باندهای مناسب  نداشتیم (چون استخراج از لامهای رنگ آمیزی شده کم انگل وپر انگل  بودند صورت گرفته بود)٬ به همین منظوراز روش (PCR2) Nested PCR استفاده گردید.

 

جدول 3- مراحل واکنش PCR1 و PCR2

مرحله واکنش

زمان

دما (درجه سانتی گراد)

واسرشت رشته الگو

5 دقیقه

94

واسرشت رشته ساخته شده

45 ثانیه

94

دمای اتصال پرایمر

45 ثانیه

58

فعالیت آنز یم DNA پلی مراز

60 ثانیه

72

برای اطمینان از ساخت کامل قطعات

5 دقیقه

72

مرحله 2 تا 4 (35 سیکل تکرار)

---

---

دمای 4درجه ساتیگراد

---

---

 

 

جهت Nested PCR٬از محصول PCR1، 2میکرولیتر برداشته و به میکروتیوب 0.2  منتقلو به آن 48 میکرولیترآب مقطر استریل اضافه وازآن بعنوان DNA الگودر (PCR2) NestedPCR استفاده نمودیم. حجم کل واکنش PCR دراین مرحله 20 میکرولیتر در نظر گرفته شد (3 میکرولیترDNA٬ 6 میکرولیترآب مقطر دوبار تقطیر بدون نوکلئار(DDW)، 10میکرولیترMasterMix و1میکرولیتر پرایمر (ITS. توالی پرایمرها در جدول   4 ارایه شده که از شرکت تکاپو زیست تهیه گردید.

 

 

جدول4- مشخصات پرایمر 1 (16) و 2

پرایمر

توالی

Forward : IR1

5'-GCTGTAGGTGAACCTGCAGCAGCTGGATCATT-3'

Reverse : IR2

5'-GCGGGTAGTCCTGCCAAACACTCAGGTCTG-3'

Forward : ITS1F

5'-GCAGCTGGATCATTTTCC-3'

Reverse : ITS2R

5'-ATATGCAGAAGAGAGGAGGC-3'

 

 

 

برای تأیید تکثیر ژنوم و اندازه قطعه تکثیر شده از الکتروفورز روی ژل آگارز استفاده شد به این ترتیب که 3 میکرولیتر از محصول PCR1 و3 میکرولیتر از محصولNested PCR  را به صورت جداگانه  (1میکرولیتر لدر درچاهک اول و5 میکرولیترمحصول  PCR1و 5 میکرولیتر از محصول(PCR2)  به ژل 2درصد اضافه گردید وجریان الکتروفورز با ولتاژ90 به مدت 40 دقیقه برقرار واز محصول عکس برداری به عمل آمد.

RFLP(Restriction Fragments Length Polymorphism)

با تکثیر ناحیه  ITSباند حاصل 480bp برای تمام گونه های انگل یکسان می باشد و افتراق گونه های انگل غیر ممکن می باشد به همین دلیل برای تعیین گونه انگل به محصول  PCRآنزیم محدود کننده معرفی شده توسط Dweik را اضافه نمودیم، این آنزیم توالیITS1 را در قسمت GG↓CC برش می دهد می کندودر انگل لیشمانیا با توجه به تعداد نقاط  برش محل های مختلفی قطع خواهند شد به همین منظور آنزیم BSUR1 مناسب تشخیص داده شد که پس از الکتروفورز، محصول به صورت باندهای جداگانه برروی ژل قابل رویت بود ومی توانستیم گونه های انگل را از روی این قطعات وطول باندها از یکدیگر متمایز نماییم و با مشاهده پلی مورفیسم ایجادشده دراثر هضم آنزیمی که برای هرگونه اختصاصی است توانستیم به نوع انگل پی ببریم. 15میکرولیترحجم نهایی واکنش در این مرحله می‍باشدکه مواد زیر باهم در میکرو تیوب  0.2 به شرح ذیل ترکیب شدند: 10میکرولیترمحصولPCR2، 1 میکرولیتر بافر 2 مخصوص آنزیم، 1میکرو لیتر آنزیم محدود کننده و 7 میکرولیتر آب مقطر 2بار تقطیربدون نوکلئار به میکرو تیوبهای 0.2 منتقل و درب میکرو تیوبها جهت جلوگیری از تبخیرمواد واکنش با پارافیلم مسدود گردید و میکرو تیوبها به مدت 8 ساعت در 37در جه اینکوبه گردید.

تجزیه و تحلیل اطلاعات: کلیه ی محصولات PCR که در آن ژن ITS-rDNA تکثیر پیدا کرده و دارای باند قوی و نسبتاً خوبی بودند بطور مستقیم و بدون کلون کردن تعیین توالی شدند. نرم افزار SequencherTm4.1.1software (Gene Codes Corporation) برای توالی DNA نمونه های مثبت مطابقت کردن نوکلئوتیدها با نوکلئوتید کروماتوگرافی هر نمونه مورد استفاده قرار گرفت. برای آنالیزهای فیلوژنتیکی نیز از نرم افزار Phylogenetic analysis using parsimony ((PAUP بهره گرفته شد. آزمون کای اسکویر با درجه اطمینان 95 درصد بوسیله نرم افزار SPSS 16 (SPSS Inc., USA) برای مقایسه میانگینها استفاده گردید.

نتایج

در بررسی های میکروسکوپی از لام های رنگ آمیزی شده با گیمسا از 605  لام تهیه شده 312 نمونه مثبت شد که علت مشاهده نشدن آماستیگوت در بقیه لامها می تواند مشابه بودن ظاهر کلینکی زخم با سایر ضایعات پوستی، آلودگی میکروبی و قارچی زخم ها، کم بودن تعداد انگل در اسمیرهای تهیه شده وتکنیک ضعیف نمونه برداری از ضایعات باشد. در نهایت  82 لام مثبت جهت مطالعات مولکولی انتخاب گردید. ژن تکثیر شده ITS-rDNA با اندازه 480 جفت باز وقتی که تحت تاثیر آنزیم BsuR1 قرار می گیرد، در گونه لیشمانیا ماژور به دو قطعه 140 و 340 جفت باز، در لیشمانیا تروپیکا به چهار قطعه 25، 38، 57 و 360 جفت باز برش داده می شود که نتایج آن در شکل 1 و جدول 5 مشاهده می شود.

 

 

شکل 1- نتایج الکتروفورز محصولات PCR روی ژل نتیجه الکتروفورز ژن تکثیر یافته ITS-rDNA  بر روی ژل آگارز 2 درصد در گونه های

 مشخص شده لیشمانیا از استان سیستان و بلوچستان که تحت اثر آنزیم BsuR1 قرارگرفته است. –Ve1: کنترل منفی (با آنزیم بدون محصول); Ve2:

کنترل منفی (با محصول بدون آنزیم); +Ve: کنترل مثبت.

 

جدول5- قطعات حاصل از عمکرد آندونکلئازی آنزیم  BSUR1بر روی محصول ژن DNA  ITS

Size of fragments(bp)

Digestion position in 5'end

Number of fragment

Leishmania species

140,340

140

2

Leishmania major

25,38,57,360

41,65,122

4

Leishmania  tropica

 

 

 

در این تحقیق از82 نمونه اینکه با هدف قرار دادن ژن ITS به وسیله ی پرایمرهای TSF1 و ITS2R و تکنیک  RFLP بررسی گردید. از 82 نمونه آنالیز شده 58 مورد مربوط به جنس مذکر و 24 مورد مربوط به جنس مونث می باشد.

جدول 6 -  توزیع فراوانی موارد مثبت لیشمانیایی در نمونه های جدا شده از زخم بیماران

گونه

تعداد

درصد

لیشمانیا  ماژور

46

56.1

لیشمانیا تروپیکا

36

43.9

مجموع

82

100

 

افراد دارای زخم در محدوده سنی 1تا بالای 60 سال بودندوبیشترین گروه سنی مبتلایان به سالک گروه های سنی 10-1 سال با ٪25.6 وگروه سنی 20-11 سال با %30.4 وگروه سنی 30-21 با % 19.5ابتلا را شامل می‍شوند و افراد گروه سنی 41 تا بالای 60 سال کمترین مبتلایان به بیماری می باشند.بیشترین مواردتعداد ضایعات مربوط به یک زخم بود (56 درصد) که بر اساس آزمون  x2ارتباط معنی داری بین تعداد زخم وگونه عامل بیماری وجود ندارد. دست وپا بیشترین فراوانی زخم را داشتند و کمترین مواردتعداد ضایعه در تنه مشاهده گردید (جدول 7) که بر اساس آزمون  x2  ارتباط معنی داری بین تعداد زخم وگونه عامل بیماری وجود ندارد.

از تعداد 82 بیمارمبتلا به سالک جلدی تعداد 49 مورد ساکن شهرو تعداد 33  مورد ساکن روستاها بودند که بر اساس آزمون x2  ارتباط معنی داری بین تعداد زخم و گونه

عامل بیماری وجود ندارد (جدول 8).

 

جدول 7 - پراکندگی زخمها بر حسب محل ضایعه ((p>0.05

محل ضایعه

تعداد

درصد

سرو صورت

62

19.9

دست

165

52.9

پا

75

24

تنه

10

3.2

مجموع

312

100

 

جدول 8 - پراکنش جغرافیایی

 

منطقه جغرافیایی

 

تعداد

 

لیشمانیا ماژور

 

لیشمانیا تروپیکا

 

درصد

ایرانشهر

1

1

0

1.3

چابهار

12

0

12

12.5

خاش

6

4

2

6.3

زابل

5

3

2

7.5

زاهدان

37

19

18

46.3

میرجاوه

19

17

2

22.5

نیکشهر

2

2

0

2.5

جمع

82

44

36

100

 

شکل ٬2 مقایسه توالی هاپلوتایپ های مشترک ژن ITS لیشمانیا تروپیکا و ماژور را با هاپلوتایپ های ثبت شده در  GenBankو لیشمانیا ماژور و تروپیکا جدا شده از مبتلایان در شمال، جنوب و مرکز استان که با نرم افزار آنلاین multalin تهیه و مقایسه شده اند را نشان می دهد. آنالیز سکانس ها، 3 تفاوت نوکلئوتیدی در جایگاه های 11، 283، 420 را مشخص نمود.  

 

70                  

                                ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

gi|1027901346|gb|KU949582.1| L  ---------- ---------- ----TATACA CTACGGGGAG GCTTATTCTA TATATATATA GTATAGGCTT 

Leishmania major isolate Zahed  ---------- ---------- ---ATATACA ACTCGGGGAG GCTTATTCTA TATATATATA GTATAGGCTT 

Leishmania major isolate Zahed  CCGATGATTA CACCCCAAAA AACATATACA ACTCGGGGAG GCTTATTCTA TATATATATA GTATAGGCTT 

Leishmania major isolate Zahed  ---------- ---------- ---------- --------AG GCTNATTCTA TATATATATA GTATAGGCTT 

 

                                         80         90        100        110        120        130        140             

                                ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

gi|1027901346|gb|KU949582.1| L  TTCCCACATA CACAGCAAAC TTTTATACTC GAAATTTGCA GTAAAAAAGG CCGATCGACG TTGTAGAACG 

Leishmania major isolate Zahed  TTCCCACATA CACAGCAAAC TTTTATACTC AAAGTTTGCA GTAAAAAAGG CCGATCGACG TTGTAGAACG 

Leishmania major isolate Zahed  TTCCCACATA CACAGCAAAC TTTTATACTC AAAATTTGCA GTAAAAAAGG CCGATCGACG TTGTAGAACG 

Leishmania major isolate Zahed  TTCCCACATA CACAGCAAAC TTTTATACTC AAAATTTGCA GTAAAAAAGG CCGATCGACG TTGTAGAACG 

 

                                        150        160        170        180        190        200        210           

                                ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

gi|1027901346|gb|KU949582.1| L  CACCGCCTAT ACACAAAAGC AAAAATGTCC GTTTATACAA AAAAATAGAC GGCGTTTCGG TTTTTGGCGG 

Leishmania major isolate Zahed  CACCGCCTAT ACACAAAAGC AAAAATGTCC GTTTATACAA AAAAATAGAC GGCGTTTCGG TTTTTGGCGG 

Leishmania major isolate Zahed  CACCGCCTAT ACACAAAAGC AAAAATGTCC GTTTATACAA AAAAATAGAC GGCGTTTCGG TTTTTGGCGG 

Leishmania major isolate Zahed  CACCGCCTAT ACACAAAAGC AAAAATGTCC GTTTATACAA AAAGATAGAC GGCGTTTCGG TTTTTGGCGG 

 

                                        220        230        240        250        260        270        280           

                                ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

gi|1027901346|gb|KU949582.1| L  GAGGGANANA NAGGGGGGTG CGTGCGCGTG GATAACGGCT CACATAACGT GTCGCGATGG ATGACTTGGC 

Leishmania major isolate Zahed  GAGGGAGAGA GAGGGGGGTG CGTGCGCGTG GATAACGGCT CACATAACGT GTCGCGATGG ATGACTTGGC 

Leishmania major isolate Zahed  GAGGGAGAGA GAGGGGGGTG CGTGCGCGTG GATAACGGCT CACATAACGT GTCGCGATGG ATGACTTGGC 

Leishmania major isolate Zahed  GAGGGAGAGA GAGGGGGGTG CGTGCGCGTG GATAACGGCT CACATAACGT GTCGCGATGG ATGACTTGGC 

 

                                        290        300        310        320        330        340        350           

                                ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

gi|1027901346|gb|KU949582.1| L  TTCCTATTTC GTTGAAGAAC GCAGTAAAGT GCGATAAGTG GTATCAATTG CAGAATCATT CAATTACCGA 

Leishmania major isolate Zahed  TTCCTATTTC GTTGAAGAAC GCANNAAAGN GCGATAAGTG GTATCAATTG CAGAATCATT CAATTACCNA 

Leishmania major isolate Zahed  TTCCTATTTC GTTGAAGAAC GCAGTAAAGT GCGATAAGTG GTATCAATTG CAGAATCATT CAATTACCGA 

Leishmania major isolate Zahed  TTCCTATTTC GTTGAAGAAC GCAGTAAAGT GCGATAAGTG GTATCAATTG CAGAATCATT CAATTACCGA 

 

                                        360        370        380        390        400        410        420           

                                ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|

gi|1027901346|gb|KU949582.1| L  ATCTTTGAAC GCAAACGGCG CATGGGANAA GCTCTATTGN GTCATCCCCG TGCATGCCAT ATTCTCAGTG 

Leishmania major isolate Zahed  ATCTTTGAAC GCAAACGGCG CATGGGAGAA GCTCTATTGT GTCATCCCCG TGCATGCCAT ATTCTCAGTG 

Leishmania major isolate Zahed  ATCTTTGAAC GCAAACGGCG CATGGGAGAA GCTCTATTGT GTCATCCCCG TGCATGCCAT ATTCTCAGTG 

Leishmania major isolate Zahed  ATCTTTGAAC GCAAACGGCG CATGGGAGAA GCTCTATTGT GTCATCCCCG TGCATGCCAT ATTCTCAGTG 

 

                                        430        440        450        460       

                                ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ..

gi|1027901346|gb|KU949582.1| L  TCGAACAAAA AACAACACGC C--------- ---------- --

Leishmania major isolate Zahed  TCGAACAAAA AACAACACGC CGCCTCCTCT CTTCTGCATA TA

Leishmania major isolate Zahed  TCGAACAAAA AACAACACGC CGCCTCCTCT CTTCTGCATA TA

Leishmania major isolate Zahed  TCGAACAAAA AACAACACGC CGCCTCCTCT CTTCTGCATA TA

 

شکل2-  نتایج سکوئنسینگ

 

بحث

نتیجه تحقیق، حاکی از موجود بودن هر دو فرم لیشمانیوز جلدی آنتروپوژنیک و زئونوتیک در استان سیستان و  بلوچستان می باشد که از دلایل آن میتوان به ورود اتباع بیگانه غیرمجاز به کشور اشاره نمود. با توجه به این که این بیماری توسط پشه خاکی از فرد مبتلا به سالک منتقل می‍شود حضور  این افراد که بدون هیچ گونه کنترل بهداشتی وارد کشور می شوند در انتشار این بیماری مؤثر است به طوری که حدود 19 درصد موارد مبتلا در سال های اخیردر منطقه مورد مطالعه را اتباع بیگانه تشکیل می‍دهند. همچنین در شرح حال این بیماران سابقه سفر به کانوتهای آلوده کرمان ویزد وبندر عباس وجود داد. در تحقیق حاضر،  با توجه به همخوانی نتایج
DNA   sequencing با PCR-RFLP و نیز ایجاد الگوی باندی مربوط به لیشمانیا در مورد تمام نمونه ها،  به نظر میرسد که  PCRانجام شده،  اختصاصی عمل کرده و احتمال پاسخ مثبت کاذب در آن ناچیز است. در مطالعه ی به عمل آمده توسط فولادی و همکاران که در منطقه مرزی میرجاوه به عمل آمده است لیشمانیا ماژور به عنوان عامل 100در صد بیماری گزارش گردیده است. نتایج حاصل از این تحقیق وجود لیشمانیا ترو پیکا در این منطقه را نیز اثبات می نماید(3). درمطالعه ثقفی پوروهمکاران در بخش مرکزی استان قم بااستفاده ازتکنیک PCR-RFLP٬ نمونه های انسانی ویک نمونه ازجونده گونه مریونس لیبیکوس برای تعیین هویت انگل لیشمانیا موردآزمایش قرارگرفته و مشخص شدکه انگل موجود در لامهای انسانی و جونده، لیشمانیا ماژور بوده است (23). در مطالعه واعظ نیا و همکاران در مشهد،  34درصد نمونه ها لیشمانیا ماژور بود که تقریباً مشابه نمونه های انسانی و حیوانی کانون بومی بیماری لیشمانیوز جلدی در بخش مرکزی قم می باشد. در ضمن 66 درصد نمونه ها لیشمانیا تروپیکا بودند (24). در مطالعه دیگری در خصوص تعیین هویت انگل لیشمانیا با استفاده از تکنیک PCR-RFLP در لام های رنگ آمیزی شده مربوط به بیماران و جوندگان مخزن لیشمانیوز جلدی در شهرستان دامغان، از 25 نمونه انسانی و 8 نمونه جونده رومبومیس اپیموس مورد آزمایش، مشخص شد که انگل موجود در لام های انسانی وجوندگان، لیشمانیا ماژور (عامل لیشمانیوز جلدی روستایی) می باشد (25). علت ناهمخوانی نتایج مطالعه مدکور با تحقیق حاضر می تواند وسعت منطقه جغرافیای مورد مطالعه و وجود کانونهای متعدد در نقاط مختلف استان  و همجواری با کشورهای پاکستان و افغانستان و تردد بومیان باشد. نتیجه تحقیق حاضر، حاکی از موجود بودن هر دو فرم لیشمانیوز جلدی آنتروپونوتیک و زئونوتیک در استان سیستان و بلوچستان می باشد که از دلایل آن میتوان به ورود اتباع بیگانه غیرمجاز به کشور اشاره نمود. با توجه به این که این بیماری توسط پشه خاکی از فرد مبتلا به سالک منتقل می شود٬ حضور این افراد که بدون هیچ گونه کنترل بهداشتی وارد کشور می شوند٬ در انتشار این بیماری مؤثر است به طوری که حدود 19 درصد موارد مبتلا در سال های اخیردر منطقه مورد مطالعه  را اتباع بیگانه تشکیل می دهند همچنین در شرح حال این بیماران سابقه سفر به کانوتهای آلوده کرمان ویزد وبندر عباس وجود دارد. شناسایی و تعیین هویت انگل لیشمانیا با استفاده از روش مولکولی PCR-RFLP  در لام های رنگ آمیزی شده باگیمسا در نمونه های انسانی،  روش مناسب و به صرفه ای است. مزایای این روش این است که بدون انجام تعیین توالی ژن ها،  تشخیص گونه های انگل لیشمانیای مولد بیماری امکان پذیر خواهد بود. بنابراین این تکنیک PCR-RFLP در کنار سایر روش ها مثل تزریق انگل به حیوان آزمایشگاهی، کشت انگل و تست های سرولوژی روش مفیدی خواهد بود. ضمن این که تکنیک حساسیت و ویژگی بالا بوده و می‍تواند در طی 24 ساعت علاوه بر تشخیص لیشمانیوز،  نوع گونه انگل را تعیین هویت نمود.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از دانشگاه زابل و دانشگاه علوم پزشکی زاهدان و نیز آقای مهندس حمید ملک رییسی تشکر و قدردانی می شود.  

1-  بقایی، ا، سیدان جاسبی، ا، آخوندی، م، میرزایی، ه، دهنام٬ ا.1391. تشخیص میکروسکوپی و تعیین هویت مولکولی انگل لیشمانیا با هدف قرار دادن ژن ITS-rDNA در بیماران مشکوک به لیشمانیوز جلدی در استان فارس. مجله دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی شهید صدوقی یزد . جلد  20 . شماره  4 .ص 473-464.
2-  شیرزادی، م. 1391. راهنمای مراقبت لیشمانیوز جلدی(سالک) در ایران. وزارت بهداشت درمان وآموزش پزشکی معاونت بهداشت مرکز مدیریت بیماریهای واگیر.
3-فولادی ب، شریفی ا، ابراهیم زاده، ع، هاشمی شهری، س، مرادقلی، ح، سرابندی نو، ا، فضایلی، ا.1386 .مقایسه روش PCR مستقیم با روشهای میکروسکوپی و کشت in vitro برای تشخیص لیشمانیوز جلدی.  جلد 9. شماره 3 . ص 181-189.
 
4- Dowlati,Y., 1996. Cutaneous leishmaniasis: Clinical aspect. Clinics in Dermatology, 14(5):425-431.
5- Dowlati, Y., Firooz, A., 1997. Leishmaniasis (letter).Journal of the American Academy of Dermatology, 37(1):139-40.
6- De Bruijn, M.H., Barker, D.C., 1992. Diagnosis of New World Leishmaniasis: specific detection of species of the Leishmania braziliensis complex by amplification of kinetoplast DNA.Acta Tropica, 52(1): 45-58.
7- Eisenberger, C.L., Jaffe, C.L., 1999. Leishmania: identification of Old World species using a permissively primed intergenic polymorphic polymerase chain reaction. Experimental Parasitology, 91(1): 70-77.
8- Harris, D.J, Crandall, K.A., 2000. Intragenomic Variation within ITS1 and ITS2 of Freshwater Crayfishes (Decapoda: Cambaridae): Implications for Phylogenetic and Microsatellite Studies.  Molecular Biology and Evolution, 17(2), 284-291.
9- Hassan Abadi, D., Gholam Rezaei, Y., Najafi, A., Alifarja, S., 2018. Investigating and analyzing the system of divisions in Iran with emphasis on scientific and geographical variables. Geography, 29(1), 277-298.
10- Lainson, R., Shaw, J.J., 1987. Evolution, classification and geographical distribution. In: Peters W, Killick-Kendrick R,editors. The Leishmaniasis in biology and medicine. Orlando: Academic Press, 120-8.
11-Moin-Vaziri, V., Depaquit, J., Yaghoobi-Ershadi, M.R., Oshaghi, M.A., Derakhshandeh-Peykar, P., Ferté, H., 2007. Intraspecific variation within Phlebotomus sergenti Parrot (1917) (Diptera: Psychodidae) based on mtDNA sequences in Islamic Republic of Iran. Acta Tropica,102(1): 29-37.
 12- Marfurt, J., Niederwieser, I., Makia, N.D., Beck, P., Felger, I., 2003. Diagnostic genotyping of old and new world Leishmania species by PCR-RFLP. Parasitology,46(2): 115-24.
13- Mohebali, M., Javadian, E., Yaghoobi-Ershadi, M.R., Akhavan, A.A., Hajjaran, H., Abaei, M.R., 2004. Characterization of Leishmania infection in rodents from endemic areas of the Islamic Republic of Iran. Eastern Mediterranean Health Journal,10(4-5): 591-9.
14 - Nadim, A., Tahvildar-Bidruni, G.h., Farshian, M., Heydari, M., Abadi, A.A., 1973. Differentiation of Leishmania tropica major from Leishmania tropica minor by inoculation to laboratory animals. Iranian Journal of Public Health, 2(2):115-18.
15- Nadim, A., Seyedi-Rashti, M.A., 1971. A brief review of the epidemiology of various types of leishmaniasis in Iran. Acta Medica Iranica,14(2): 99-106.
16- Parvizi, P., Mauricio, I., Aransay, A. M., Miles, M. A. , Ready, P. D., 2005.  Firstdetection of Leishmania major in peridomestic Iranian sandflies: comparison ofnested PCR of nuclear ITS ribosomal DNA and semi-nested PCR of minicirckinetoplast DNA.  Acta Tropica 93, PP:75-83
17- Pearson, R.D., De Queiroz Sousa, A., Jeronimo, S.M.B.,2001. Leishmania species: visceral (Kala-Azar), cutaneous andmucosal leishmaniasis. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, editors. Principles and practice of infectiousdiseases. New York: Churchill Livingstone, 283-45.
18- Russell, R., Iribar, M.P., Lambson, B., Brewster, S., Blackwell, J.M., Dye, C., 1999. Intra and inter-specific microsatellite variation in the Leishmania subgenus Viannia. Molecular and Biochemical Parasitology, 103(1): 71-7.
19- Sidney, N.K., Shoshana, F., Arieh, I., 1999. Epidemiology of cutaneous leishmaniasis. Clinics in Dermatology, 17(3):257-60.
20- Van Eys, G.J., Schoone, G.J., Kroon, N.C., Ebeling, S.B.,1992. Sequence analysis of small subunit ribosomal RNA genes and its use for detection and identification of Leishmania parasites. Molecular and Biochemical Parasitology,51(1): 133-42.
21-Victoir K, Banuls AL, Arevalo J, Llanos-Cuentas A, Hamers R, Noel S, et al. The gp63 gene locus, a target for genetic characterization of Leishmania belonging to subgenus Viannia. Parasitology 1998; 117(1): 1-13.
22- Wislon, S.M., 1995. DNA-based methods in the detection of Leishmania parasite: field applications and practicalities.Annals of Tropical Medicine & Parasitology,89(1):95-100.
23- Saghafipour, A., Rassi, Y., Abai, M.R., Oshaghi, M.A., Yaghoobi, Arshadi, M.R., Mohebali, M., et al.  2012. Identification of Leishmania species in patients and reservoir rodents using PCR–RFLP in the central county of Qom province in 2010. Arak University of Medical Sciences Journal; 15(6): 1-10.
24- Vaeznia, H., Dalimi, A., Sadraei, J., Pirstani, M. 2009. Determination of Leishmania species causing cutaneous leishmaniasis in Mashhad by PCRRFLP method.  Archives of  Razi; 64(1):39-44.
25- Mohammadi Azni S, Rasi Y, Oshaghi M A, Yaghoubi Ershadi M, Mohebali M, Abaie M, et al . 2011. Diagnosis and Characterization of Leishmania Species in Patients and Rodents Giemsa-Stained Slides by PCR-RFLP in Damghan District, Iran. Avicenna Journal of Clinical Medicine; 17 (4):5-9.
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 32, Issue 1
April 2019
Pages 54-64
  • Receive Date: 25 May 2018
  • Accept Date: 01 July 2018