کشف مهارکننده علیه بتالاکتاماز CTX-M-9 باکتری E.coli با استفاده از مطالعات داکینگ مولکولی، MM/PBSA و دینامیک مولکولی

کامبیز داوری¹، جمیله نوروزی^1*، فرزانه حسینی¹، عباس اخوان سپهی¹ و ساکو میرزایی^2*

¹ ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، گروه میکروبیولوژی

² ایران، سنندج، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد سنندج، گروه بیوشیمی

تاریخ دریافت: 7/11/96                تاریخ پذیرش: 10/4/97

چکیده

امروزه، مقاومت آنتی بیوتیکی در باکتری ها به یک چالش عمده برای سلامت بشر تبدیل شده است ظهور مقاومت آنتی بیوتکی، منجر به ناکارآمدی آنتی بیوتیک ها ، عدم درمان مناسب بیماری های عفونی و افزایش هزینه های درمانی شده است. یکی از فراوانترین انواع مقاومتهای انتی بیوتیکی مقاومت به آنتی بیوتیکهای بتالاکتام بخصوص پنی سیلین و سفالوسپورین میباشد که در بیشتر موارد با یک مکانیسم آنزیم تغییر دهنده به نام بتالاکتاماز ایجاد می گردد. این آنزیم ها، حلقه بتا لاکتام آنتی بیوتیک های واجد این حلقه را هیدرولیز می کنند.  بتالاکتامازها، طبق طبقه بندی آمبلر که بر اساس تشابه توالی آمینو اسیدهای پروتئینی انجام می پذیرد، به چهار گروه A، B، C، و D تقسیم می شوند. در مطالعه حاضر، با استفاده از داکینگ مولکولی در فرآیند غربالگری مجازی، از میان 13842 ترکیب، قویترین مهار کننده ها بر علیه آنزیم  بتالاکتاماز CTX-M-9 انتخاب شد. ترکیبات با کمترین انرژی آزاد اتصال توسط مطالعات دینامیک مولکولی بررسی شدند. مطالعات مدلسازی ما مشخص کرد که ترکیب با کد بانک دارویی DB01753 دارای خصوصیت مهار کنندگی آنزیم بتالاکتاماز CTX-M-9 است. بعد از 50 نانوثانیه مطالعه دینامیک مولکولی، ترکیب  DB01753 با آمینو اسیدهای سرین 237، آسپارژین 104، گلوتامات 166، سرین 274 و تیروزین 105 تشکیل پیوند هیدروژنی داد. مطالعات MM/PBSA مشخص کرد که انرژی آزاد اتصال بین آنزیم بتالاکتاماز و DB01753 برابر 5/111- کیلوژول بر مول است. مطالعات ADME نشان داد که همه پارامترهای فارماکوکینتیکی در محدوده قابل قبول هستند.

واژه های کلیدی:  بتالاکتاماز، CTX-M-9، داکینگ مولکولی، دینامیک مولکولی    

* نویسنده مسئول، تلفن:  09183761833 ،  پست الکترونیکی: sako.biochem@gmail.com ، nowroozij@yahoo.com

مقدمه

امروزه یکی از مشکلات جدی در زمینه حفظ سلامتی، مربوط به مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری های بیماریزا و مضر است (20 و 26). تعداد بی شماری از انسان ها در دنیا توسط آنتی بیوتیک ها درمان شده و نجات یافته اند. بنابراین، آنتی بیوتیکها  گزینه مهمی در درمان انواع بیماری های عفونی از جمله بیماریهای عفونی باکتریایی می باشند (12). پس ازمعرفی پنی  سیلین جی، تلاش برای ایجاد سنتز دیگر مشتقات آن شروع شد (12و 20). در مطالعات اخیر، تنها در ایالات متحده آمریکا، باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک باعث ایجاد حدود 2 میلیون عفونت و 23000 مرگ و میر در سال2014 شده اند. در سال 2014، سازمان بهداشت جهانی از مقاومت دارویی در برابر آنتی بیوتیکها به عنوان یک تهدید بزرگ جهانی نام برد. این سازمان با بررسی آمار مربوط به 114 کشور، از افزایش مقاومت دارویی در همه نقاط جهان خبر داد و اعلام کرد جهان وارد دوره "پسا آنتی بیوتیک" شده است. دوره ای که عفونت های ساده ای که برای سالیان طولانی قابل درمان بوده اند، کشنده شده اند (24). آنتی بیوتیک های بتا لاکتام گروهی بزرگ و گسترده ای از آنتی بیوتیک ها هستندکه حلقه بتا لاکتام در ساختار مولکولی آنها وجود دارد (16). فعالیت بتالاکتاماز در باکتریهای گرم مثبتی همچون باکتریهای استافیلوکوک اورئوس (Staphylococcus aureus) و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (Staphylococcus epidermidis)، باکتری های گرم منفی مانند هموفیلوس آنفلانزا (Haemophilus influenza)، نایسریا گونوره آ (Neisseria gonorrhoeae)، موراکسلا کاتارالیس (Moraxella catarrhalis)، اشیرشیا کولی (Escherichia coli) و گونه های پروتئوس (Proteus)، سراشیا (Serratia)، سودوموناس (Pseudomonas) و کلبسیلا (Klebsiella) و باکتری های بی هوازی چون گونه های باکتریوئیدس (Bacterioides) گزارش شده است (16). آنزیم های هیدرولاز و بتالاکتاماز شایعترین علل مقاومت باکتریها به آنتی بیوتیکهای بتالاکتام هستند. این آنزیم ها تقریبا تمام آنتی بیوتیک های بتالاکتام را از طریق هیدرولیز کردن پیوند آمید در حلقه بتا لاکتام غیر فعال می کنند (24). به طور روزافزون، دامنه سوبسترای بتالاکتامازها رو به گسترش می باشد، تاجاییکه اکنون، بتالاکتامازها یک خطر جدی برای سلامت جهانی هستند. بر اساس توالی اسید آمینه، بتالاکتامازها به چهار کلاس A، B، C و D تقسیم شده اند (1). در سال 1995، یک طبقه بندی جدید توسط بوش و جاکوبای معرفی شد که از پروفایل مهار کننده و سوبسترا آن استفاده کردند و تلاش نمودند طبقه بندی این آنزیم ها، با فنوتیپ آنها در جدایه های بالینی (clinical isolates) مرتبط باشند (7). کلاس A، بتالاکتامازهایی هستند که هم توسط کروموزوم و هم توسط پلاسمید باکتری کد می شوند و طیف وسیعی از آنزیم هایی چون TEM-1، SHV-1، CTX-M (ESBLs) و کرباپنم ها (مانند KPC-2) شامل می شوند (31). متالو بتالاکتامازها، که در کلاس B طبقه بندی می شوند، پنی‍سیلین ها، سفالوسپورین ها وکرباپنم ها را هیدرولیز می‍کنند. آنزیم های کلاس C، که اغلب توسط کروموزوم باکتری کد می شوند، به کلاولانیک اسید مقاوم هستند (15). بتالاکتامازهای کلاس D، به سرعت در حال گسترش بوده و طیف گسترده ای از سفالوسپورین هایی چون OXA-10 و کرباپنم هایی چون OXA-23 را هیدرولیز می کنند. این کلاس در باکتری های غیر تخمیری چون سودوموناس آیروجینوزا (Pseudomonas aeruginosa) و آسینتوباکتر باومانی (Acinetobacter baumannii) یافت شده است (10). کلاسهای A، C و D در جایگاه فعال خود دارای یک سرین نوکلئوفیل حفاظت شده هستند. این سه کلاس از یک مکانیسم یکسان برای هیدرولیز و شکستن آنتی بیوتیک های بتا لاکتام استفاده می کنند (10). تعداد بسیار زیادی از مهارکننده ها جهت غلبه بر مقاومت آنتی بیوتیکی ناشی از بتالاکتامازها طراحی و سنتز شده اند (3). در این شرایط، یک مهار کننده بتالاکتاماز به همراه آنتی بیوتیک مربوطه تجویز میگردد. کلاولانیک اسید، سولباکتام و تازوباکتام سه مهار کننده برگشت ناپذیر بوده که از طریق تشکیل کمپلکس غیرفعال آسیل-آنزیم، موجب خودکشی آنزیم می گردند (20). از سال 1995، یک سری جدید از باکتری های ESBL کلاس A بنام آنزیم های CTX-M در جهان پدیدار شد و اکنون به فراوانترین آنزیم های ESBL تبدیل گشته اند. آنزیم های CTX-M دارای شباهت توالی کمتر از 40 درصد با آنزیم های نوع  TEM و SHV می باشند وخود از بیش از 40 عضو تشکیل شده اند. این آنزیم ها دارای اثرات هیدرولیز کننده با طیف گسترده بوده و قادر به هیدرولیز پنی سیلین و سفالوسپورین های نسل 1 و 2 و 3 می باشند (6 و 8). مطالعات نشان داده است که اکثر آنزیم های بتالاکتاماز CTX-M که توسط اشیرشیا کلی بیان می شوند باعث ایجاد مقاومت بسیار بالایی به اکسی ایمینوسفالوسپورین‍ها (oxyimino-cephalosporins) (سفوتاکسیم (cefotaxime) و سفتریاکسون (ceftriaxone)) و سطوع متفاوتی از مقاومت به سفپیم (cefepime) و سفپیروم (cefpirome) می شوند (5، 6 و 25). امروزه تکنیک هایی چون غربالگری عملی، رزونانس مغناطیسی هسته، کریستالوگرافی اشعه ایکس، طیف سنجی جرمی، بیوانفورماتیک، ریاضیات، مدلسازی مولکولی و مکانیک مولکولی- مکانیک کوانتومی جهت طراحی و کشف مهارکننده های قوی و جدید مورد استفاده قرار می گیرند (4، 10 و 20). مطالعات نشان می دهد که هزینه فرآیند تولید یک داروی جدید حدود 6/2 میلیارد دلار است (22). بنابراین بیولوژی محاسباتی و مدلسازی مولکولی میتوانند به عنوان یک روش ارزشمند و موثر در طراحی و کشف دارو بکار گرفته شوند. غربالگری مجازی، یک تکنیک مبتنی بر جستجو و غربالگری ترکیبات مورد نظر از میان کتابخانه های عظیم ساختاری در محیط مجازی و کامپیوتری است. از آنجاییکه مقاومت در باکتری ها به شدت در حال گسترش است، ضرورت وجود یک مهار کننده جدید با ساختاری متفاوت با مهارکننده های بتالاکتاماز قدیمی مانند اسید کلاولانیک و موثر بر علیه آنزیم های مسئول این مقاومت احساس می گردد.  در این مطالعه، از غربالگری مجازی مبتنی بر داکینگ و دینامیک مولکولی جهت شناسایی مهارکننده قوی و موثر علیه CTX-M-9، یک بتالاکتاماز گروه  A، استفاده شد. همچنین، ارزیابی مربوط به جذب، توزیع، متابولیسم و ترشح این ترکیب به صورت محاسباتی انجام پذیرفت. در نهایت در این مطالعه، یک مهار کننده غیر بتالاکتام آنزیم بتالاکتاماز با قدرت اتصال بالا و عوارض جانبی پایین از طریق مطالعات محاسباتی معرفی و ارایه شد.

مواد و روشها

آماده سازی ساختارها و غربالگری مجازی: ساختار سه بعدی آنزیم بتالاکتاماز CTX-M-9 از پایگاه داده پروتئین با کد 1YLY گرفته شد (8). با استفاده از نرم افزار AUTODOCK TOOLS مولکولهای آب حذف شدند. هیدروژنها به ساختار اضافه شده، بار Gasteiger–Marsili برای ساختار منظور گشته (14) و اتمهای هیدروژن غیرقطبی حذف شدند. قبل از انجام داکینگ، جهت از بین بردن ممانعت فضایی احتمالی ساختار، با استفاده از نرم افزار گرومکس نسخه 5.1 (29)، و الگوریتم steepest descent  ساختار آنزیم از لحاظ انرژی کمینه شد. برای انجام داکینگ مولکولی و غربالگری مجازی، ابتدا از مولکول trifluoromethyl-3H-benzoimidazole-4-carboxylic acid [3-(1Hte-trazol-5-yl)-phenyl]-amide)  (ترکیب 19) به عنوان الگو استفاده شد. ترکیب 19، یک مهار کننده آنزیم بتالاکتاماز CTX-M-9 بوده و دارای ثابت مهار تجربی 89 نانومولار است (23). در مرحله بعد، از پایگاه داده زینک (17)، ترکیبات با 50 درصد شباهت با ترکیب 19 انتخاب و دانلود شدند (5125 ترکیب). این ترکیب یک مهار کننده قوی بتالاکتاماز بوده و دارای ثابت مهار 89 نانومولار است (23). ساختار ترکیب 19 در شکل 1 نشان داده است. علاوه بر این پایگاه داده، از یک کتابخانه بانک دارویی دیگر شامل داروهای تصویب شده و ترکیبات تحت آزمایش (8717 ترکیب)، از پایگاه داده دارو جهت انجام غربالگری مجازی استفاده شد (32). مجموع ترکیبات استفاده شده که در داکینگ مولکولی مورد مطالعه و بررسی قرار گرفت 13842 مولکول بود. جهت آماده سازی همه این ترکیبات، هیدروژنها اضافه شده و بار آنها با استفاده از روش Gasteiger–Marsili محاسبه شد. سپس ساختارهای سه بعدی این ترکیبات برای مطالعات بعدی ذخیره شد.  

شکل 1- ساختار ترکیب 19.

داکینگ مولکولی ترکیبات: داکینگ مولکولی ترکیبات بر علیه جایگاه فعال بتالاکتاماز با استفاده از نرم افزار Autodock vina انجام پذیرفت (28). ساختار کریستالی مورد استفاده در این مطالعه دارای یک مهار کننده بود و آمینواسیدهای اطراف آن به عنوان جایگاه اتصال در جعبه داکینگ در نظر گرفته شد (8 و 10). در این مطالعات داکینگ، تمام پارامترهای نرم افزار، به عنوان پیش فرض در نظر گرفته شد. در هر بار انجام داکینگ، ساختار با کمترین انرژی داکینگ برای انجام مطالعات دینامیک مولکولی مورد استفاده قرار گرفت.

دینامیک مولکولی: دینامیک مولکولی برای چهار سیستم مستقل شامل بتالاکتاماز آزاد، کمپلکس بتالاکتاماز: ترکیب 19، کمپلکس بتالاکتاماز: ZINC33264777 و کمپلکس بتالاکتاماز: DB01753انجام پذیرفت. دو کمپلکس حاوی DB01753 و ZINC33264777بر اساس انرژی آزاد اتصال حاصل از داکینگ مولکولی برای مطالعه دینامیک مولکولی انتخاب شدند. از کمپلکس بتالاکتاماز: ترکیب 19 به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.  تمام مطالعات دینامیک مولکولی با استفاده از نرم افزار گرومکس نسخه 5.1 (29) و از میدان نیروی AMBER 99SB استفاده شد. pKa ریشه های آمینواسیدی بتالاکتاماز توسط سرور PROPKA 2.0 محاسبه گشت تا آمینواسیدهای یونیزه شونده در حالت یونیزاسیون صحیح خود تعریف شوند (2). بار جزئی و فایل های توپولوژی ترکیباتی که جهت انجام غربالگری مورد استفاده قرار گرفتند با استفاده از نرم افزار ACPYPE موجود در مجموعه ANTECHAMBER   تولید شدند (30). هر سیستم در یک مکعب با آب مدل TIP3P حل شده (18) و با استفاده از مقادیر مناسب سدیم و کلر خنثی گشت. بهینه کردن ساختارها در دینامیک مولکولی، با استفاده از الگوریتم های steepest descent  و conjugate gradient  انجام پذیرفت. محدوده محاسباتی برهم کنشهای وان دروالس و الکترواستاتیک به ترتیب 4/1 و 9/0 در نظر گرفته شد. جهت محاسبه برهم کنشهای الکترواستاتیک از PME استفاده شد (9). برای تعادل دمای از Berendsen  و برای تعادل فشار از Parrinello-Rahman barostat استفاده گشت (10و 20). در تمام اجراهای دینامیک مولکولی در این مطالعه، از دمای 300 درجه کلوین و فشار 1 اتمسفر استفاده شد و سیستم ها در این دما و فشار به تعادل رسیدند. هر سیستم در این مطالعه به مدت 50 نانوثانیه مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت. در مدت زمان 50 نانوثانیه، تغییرات کنفورماسیونی زنجیره جانبی ریشه های آمینواسیدی به خوبی قابل ارزیابی است. خروجی اجراهای دینامیک مولکولی با نرم افزار VMD آنالیز شده و نمودارهای آن با استفاده از اکسل رسم شد.    

محاسبه انرژی آزاد اتصال از روش MM/PBSA : پس از انجام دینامیک مولکولی، انرژی آزاد اتصال از طریق محاسبه فریم های 10 نانوثانیه آخر با استفاده از نرم افزار MM/PBSA محاسبه شد. این نرم افزار، یک نرم افزار رایگان برای کاربردهای آکادمیک بوده و برای محاسبه انرژی آزاد بین دو گروه تعریف شده مورد استفاده قرارمی گیرد. اخیرا از الگوریتم MM/PBSA به عنوان تابع امتیاز دهی در طراحی محاسباتی دارو استفاده شده است. انرژی آزاد اتصال در این روش از فرمول زیر محاسبه می شود:

G_binding = G_complex – (G_protein + G_ligand)

که در اینجا G_complex، انرژی آزاد کل کمپلکس پروتئین- مهارکنندهاست و  G_proteinو G_ligandبه ترتیب انرژی آزاد کل پروتئین و مهار کننده آزاد در حلال است(19).

پیش بینی ADME ترکیبات مورد مطالعه: خواص ADME شامل جذب، توزیع، متابولیسم و ترشح کاندیدهای دارویی نقش مهمی در تصویب این ترکیبات در فاز کارآزمایی بالینی دارد. بنابراین، این خواص توسط نرم افزار Qikprop در مجموعه شرودینگر، برای ترکیبات مورد مطالعه در دینامیک مولکولی محاسبه شد(27). تقریبا حدود 40 درصد کاندیداهای دارو به دلیل خصوصیت ADME ضعیف در مرحله کارآزمایی بالینی رد می شوند. رد شدن دارو در این مرحله، زیان بسیار زیادی را به شرکت های داروسازی و صنعت دارویی کشورها تحمیل می نماید. Qikprop قادر است در زمان کوتاهی و با ضریب خطای پایین، بسیاری از خصوصیات فیزیکوشیمیایی و شیمیایی مولکولهای کاندیدای دارو را پیش بینی کند.

نتایج و بحث

یکی از مشکلات بشریت در عرصه بهداشت و سلامت، مسئله مقاومت باکتری ها به آنتی بیوتیکها است. این امر موجب مرگ تعداد زیادی از افراد در این کره خاکی میگردد. در سالهای اخیر، مدلسازی مولکولی و بیولوژی محاسباتی جزء مهمی از روند مطالعات مربوط به طراحی و کشف دارو شده است. غربالگری مجازی یک روش محاسباتی برای شناسایی ترکیبات رهبر در یک کتابخانه بزرگ و متنوع از  ترکیبات شیمیایی است. این روش محاسباتی ارزشمند برای کشف ترکیبات رهبر سریع تر و مقرون به صرفه تر از روش های غربالگری تجربی است. غربالگری مجازی به عنوان " ارزیابی اتوماتیک کتابخانه های بسیار بزرگ از ترکیبات " با استفاده از برنامه های کامپیوتری تعریف شده است. در این مطالعه، غربالگری مجازی با استفاده از داکینگ مولکولی در مورد 13842 ساختار مولکولی بر علیه جایگاه فعال بتالاکتاماز
CTX-M-9 انجام پذیرفت. در مرجله بعد، مطالعات دینامیک مولکولی در مورد 4 سیستم در دو حالت آنزیم آزاد و آنزیم متصل به مهار کننده انجام گرفت.

آنالیز داده های داکینگ مولکولی: نتایج مربوط به قویترین مهارکننده های حاصل از داکینگ مولکولی بر اساس مقدار انرژی آزاد اتصال در جدول 1 نشان داده شده است. ترکیب با کد DB01753 از پایگاه داده دارو دارای کمترین مقدار انرژی آزاد بود (62/16- کیلوکاری بر مول). در جایگاههای بعدی، ترکیبات مربوط به پایگاه داده زینک با کدهای ZINC33264777، ZINC25981582 و ZINC40297472 می باشند. همچنین، انرژی آزاد اتصال برای ترکیب الگو (ترکیب 19) نیز محاسبه شد که مقدار آن 98/11- کیلوکالری بر مول بود. ترکیبات نشان داده شده در این جدول، دارای انرژی آزاد اتصال کمتری نسبت به ترکیب شماره 19 بودند. الگوی برهم کنش ترکیب DB01753 با جایگاه فعال آنزیم بتالاکتاماز CTX-M-9 در شکل 2 نشان داده شده است. بر اساس این شکل، 10 پیوند هیدروژنی بین ترکیب DB01753 و ریشه آمینواسیدهای Ala 272، Ser 274، Ser 130، Asn 132، Ser 237، Asn 104، Asp 240 و Arg 276 تشکیل شده است. مطالعات بر پایه آنالیز ساختار کریستالی نشان داده است که ریشه آمینواسید Asp 240 نقش مهمی در برهم کنش قطبی با مهارکننده های سنتز شده آنزیم بتالاکتاماز CTX-M-9 دارد (23). همچنین ریشه آمینواسیدهای
Tyr 105، Pro 167 و Ala 272 با این مهار کننده برهم کنش هیدروفوب می دهند.

آنالیز داده های دینامیک مولکولی: انحراف جذر میانگین مربعات یا RMSD یکی از پارامترهای معمول در مطالعات دینامیک مولکولی است که جهت اطمینان از به تعادل رسیدن سیستم طی شبیه سازی اندازه گیری میشود. مقادیر بالای RMSD نشان دهنده انعطاف پذیری بالای پروتئین طی زمان شبیه سازی است. شکل 3 مقادیر RMSD چهار سیستم شامل شامل بتالاکتاماز آزاد، کمپلکس بتالاکتاماز: ترکیب 19، کمپلکس بتالاکتاماز: ZINC33264777 و کمپلکس بتالاکتاماز: DB01753را طی 50 نانوثانیه از شبیه سازی نشان می دهد. بر اساس این شکل، RMSD پروتیئن آزاد در 5400 پیکوثانیه برابر 1/1 آنگستروم بود. سپس در 26000 پیکوثانیه به 3/1 آنگستروم افزایش پیدا کرد. پس از به تعادل رسیدن و تغییرات و نوسات جزئی، در نهایت در 47000 پیکوثانیه به 7/1 آنگستروم افزایش پیدا کرد. چندین تغیر ناگهانی RMSD در مورد بتالاکتاماز آزاد مشاهده شد که می تواند مربوط به خصوصیت انعطاف پذیری بالای این  آنزیم ها  در  حالت  آزاد  و  در  محلول

باشد. این آنزیم ها دارای طیف وسیعی از سوبستراها بوده و این تغییرات زیاد کنفورماسیونی و انعطاف پذیری بالا جهت اتصال به این سوبستراها صورت میگیرد (10و 20). میانگین مقادیر RMSD آنزیم آزاد برابر 1.1 آنگستروم بود. این مقدار برای کمپلکس بتالاکتاماز: ترکیب 19 برابر 2/1 آنگستروم بود. بنابراین با اتصال ترکیب 19 به جایگاه فعال بتالاکتاماز، افزایش جزئی تحرک اسکلت اصلی آنزیم طی شبیه سازی دینامیک القا شده است. در هر صورت اتصال ترکیب ZINC33264777 به بتالاکتاماز، موجب کاهش مقادیر RMSD شد (9/0 آنگستروم). بر اساس شکل 3، بتالاکتاماز متصل به ZINC33264777 پس از 5000 پیکوثانیه به تعادل رسید. مهار کننده  DB01753پس از اتصال به آنزیم، موجب افزایش میانگین RMSD به 2/1 آنگستروم  شد.

جدول 1- ساختار دوبعدی و انرژی آزاد اتصال بهترین ترکیبات حاصل از داکینگ مولکولی توسط نرم افزار  Autodock vina. برای مقایسه، انرژی داکینگ ترکیب شماره 19 نیز محاسبه شده است.

شکل 2- الگوی برهم کنش ترکیب DB01753 با جایگاه فعال آنزیم بتالاکتاماز CTX-M-9

شکل 3- مقادیر RMSD چهار سیستم شامل شامل بتالاکتاماز آزاد، کمپلکس بتالاکتاماز: ترکیب 19، کمپلکس بتالاکتاماز: ZINC33264777 و کمپلکس بتالاکتاماز: DB01753 طی 50 نانوثانیه از شبیه سازی دینامیک مولکولی.

این الگوی تغییرات RMSD شبیه به رفتار کمپلکس بتالاکتاماز: ترکیب 19 بود. جذر میانگین مربعات نوسانات یا RMSF، میزان تحرک و انعطاف پذیری ریشه های آمینواسیدها را طی زمان شبیه سازی نشان میدهد. مقادیر بالای RMSF، میزان انعطاف پذیری بالای ریشه های آمینواسیدها را نشان می دهد. مقادیر RMSF طی 50 نانوثانیه زمان شبیه سازی برای هر چهار سیستم در شکل 4 نشان داده شده است. مقدار RMSF آمینواسید Ser 70 در آنزیم آزاد برابر 1/1 آنگستروم است. این باقی مانده آمینواسیدی به آلکوکساید تبدیل شده و مسئول حمله نوکلئوفیلی به کربن کربونیل حلقه بتا لاکتام است. متعاقبا، حدواسط آسیل آنزیم در جایگاه فعال آنزیم تولید میشود (11). شکل 4 نشان میدهد که در حضور ترکیب 19، RMSF ریشه Ser 70 به 48/0 آنگستروم کاهش می یابد. این مقدار در حضور ZINC33264777 و DB01753 به ترتیب 46/0 و 57/0 آنگستروم است. یکی از دلیل کاهش RMSF این آمینواسید می تواند برهمکنش با مهارکننده ها طی زمان شبیه سازی می باشد. دلیل دیگر می تواند به دلیل القای تغییرات کنفورماسیونی سرین 70 در حضور مهار کننده ها و برهمکنش غیرکووالان این ریشه آمینواسیدی با ریشه های دیگر باشد.   علاوه بر آمینواسید Ser 70، ریشه آمینواسیدهای Lys 73، Ser 130 و Glu 166 در شکستن پیوند آمیدی حلقه بتا لاکتام نقش دارند. اتصال ترکیب شماره 19 و ZINC33264777 به جایگاه فعال آنزیم، موجب کاهش مقادیر RMSF مربوط به Ser 130 و Glu 166 می گردد (13). Ser 130 بین هلیکس شماره 6 و 7 قرار گرفته و تشکیل لوپ حفاظت شده SDN می دهد (20). همچنین گزارش شده است که این آمینواسید نقش بسیار مهمی در مقاومت آنتی بیوتیکی باکتری ها دارد (21). بنابراین با کاهش تحرک این آمینواسیدها می توان احتمال داد که این مهارکننده ها با آمینواسیدهای ذکر شده برهم کنش داده اند. شکل 5، نحوه برهم کنش ترکیب DB01753 را پس از 50 نانوثانیه شبیه سازی دینامیک مولکولی نشان می دهد. بر اساس این شکل، بین ریشه آمینواسیدهای Ser 274، Asn 104، Glu 166، Ser 237 و Tyr 105 با DB01753 پیوند هیدروژنی تشکیل می شود. همچنین، Tyr 105 با پورین مولکولDB01753 برهم کنش از نوع پای پای استاکینگ می دهد. شکل 6، تعداد پیوندهای هیدروژنی بین مهارکننده ها و آنزیم بتالاکتاماز را در سه کمپلکس بتالاکتاماز: ZINC33264777، بتالاکتاماز: DB01753و بتالاکتاماز: ترکیب 19 نشان می دهد. میانگین تشکیل پیوند هیدروژنی بین مهار کننده و آنزیم طی زمان شبیه سازی برای ترکیب 19 و ZINC33264777، به ترتیب 13/5 و 48/1 بود. میانگین تعداد پیوندهای هیدروژنی برای ترکیب DB01753 برابر 53/5 بود که بیشتر از دو ترکیب دیگر می باشد. بر اساس شکل 6، بعد از گذشت 40000 پیکوثانیه، تعداد پیوندهای تشکیل شده بین ترکیب 19 و آنزیم کاهش یافت. این در حالی بود که پس از گذشت 37000 پیکوثانیه، تعداد پیوندهای هیدروژنی بین ترکیب DB01753 افزایش ناگهانی داشت و تا پایان زمان شبیه سازی، این افزایش، پایدار ماند. بنابراین، میتوان استنباط نمود که پایداری ترکیب DB01753 نسبت به ترکیبات ZINC33264777  و 19 در جایگاه فعال آنزیم بیشتر است. پایداری بیشتر این کمپلکس میتواند منجر به کاهش ثابت مهار ترکیب DB01753 گردد. برای بررسی پایداری پیوند هیدروژنی طی زمان شبیه سازی، فاصله بین اتمهای درگیر در پیوند هیدروژنی بین ترکیب DB01753 و آنزیم محاسبه شد (شکل 7). فاصله بین 4 اتم از ریشه های آمینو اسیدی  Glu 166 (اتم OE1)، Arg 276 (اتمهایHH21 و HH12) و Tyr 105 (اتم HH) جایگاه فعال با اتمهای H231، O29، O38 و O45 از مولکول DB01753 در 15000 پیکوثانیه آخر شبیه سازی دینامیک مولکولی، به زیر 3 آنگستروم کاهش یافت. این داده ها نشان میدهد که با گذشت زمان، پیوندهای هیدروژنی پایدار بین ترکیب DB01753 و آنزیم بتالاکتاماز تشکیل شده که خود موجب پایداری کمپلکس آنزیم: DB01753 می شود.

محاسبه انرژی آزاد اتصال مهارکننده ها با روش MM/PBSA : انرژی آزاد اتصال بین مهارکننده ها و جایگاه فعال آنزیم بتالاکتاماز در 10 فریم آخر شبیه سازی دینامیک مولکولی برای هر کدام از سسیتم ها محاسبه شد (جدول 2).

در این روش، اطلاعات دقیقتری در مورد انرژی آزاد اتصال، نسبت به روشهای داکینگ مولکولی حاصل میگردد. مقدار انرژی آزاد اتصال بین مهار کننده و آنزیم رابطه عکس با میزان تمایل مهارکننده برای اتصال به آنزیم دارد. کمترین مقدار انرژی آزاد اتصال، مربوط به ترکیب DB01753 با انرژی آزاد اتصال برابر 5/111- کیلوژول بر مول بود. انرژی آزاد الکتروستاتیک این ترکیب برابر 8/550- کیلوژول بر مول است. مقدار انرژی حلال پوشی برای ترکیب 19، ZINC33264777 و DB01753 به ترتیب 4/266، 1/103و 6/596 بود. بر اساس داده های جدول 2، انرژی مساحت سطح در معرض حلال هر سه مهار کننده تقریبا شبیه به هم بود.

شکل 4- مقادیر RMSF چهار سیستم شامل شامل بتالاکتاماز آزاد، کمپلکس بتالاکتاماز: ترکیب 19، کمپلکس بتالاکتاماز: ZINC33264777 و کمپلکس بتالاکتاماز: DB01753 طی 50 نانوثانیه زمان شبیه سازی دینامیک مولکولی.

شکل 5- نحوه برهم کنش ترکیب DB01753 با جایگاه فعال بتالاکتاماز پس از 50 نانوثانیه شبیه سازی دینامیک مولکولی.

شکل 6- تعداد پیوند هیدروژنی بین مهارکننده های ترکیب 19، ZINC33264777 و DB01753 با بتالاکتاماز طی 50 نانوثانیه زمان شبیه سازی دینامیک مولکولی.

شکل 7- فاصله های محاسبه شده بین 4 اتم از ریشه های آمینو اسیدی  Glu 166 (اتم OE1)، Arg 276 (اتمهایHH21 و HH12) و Tyr 105 (اتم HH) جایگاه فعال با اتمهای H231، O29، O38 و O45 از مولکول DB01753 طی 50 نانوثانیه شبیه سازی دینامیک مولکولی.

همچنین داده ها نشان دادند که مولکول DB01753 تمایل بیشتری به اتصال به آنزیم بتالاکتاماز داشته و با قدرت بیشتری آنرا می تواند مهار کند. در هر صورت، برای کاهش انرژی آزاد اتصال این مولکول، و تولید ترکیبی با انرژی آزاد اتصال کمتر، می توان با تغییرات کووالان بروی ساختار آن، انرژی حلال پوشی آنرا کاهش داد بطوریکه ترکیب با انرژی کمتری در آب حل شود. کاهش گروههای هیدروفوب در مولکول، در این مورد می تواند کمک کننده باشد.

پیش بینی ADMET مهار کننده ها: در مورد ترکیب 19، ZINC33264777 و DB01753 با استفاده از نرم افزار شرودینگر، برخی خواص فارماکو-کینتیکی پیش بینی شد (جدول 3). پارامترهای محاسبه شده شامل ضریب توزیع آب/ اکتانل، نفوذپذیری سلول Caco-2، ضریب توزیع خونی/ مغزی، درصد جذب دهانی و فعالیت علیه سیستم عصبی مرکزی بود (10). پارامترهای فارماکو-کینتیکی تمامی سه ترکیب در دامنه قابل قبولی بوده و می توانند جهت استفاده در انسان به کار گمارده شوند (جدول 3).

نتیجه گیری

برای سالیان متمادی، کشف دارو با استفاده از روش آزمون و خطا در مورد کتابخانه های مولکولی بزرگ انجام می‍پذیرفت.    

جدول 2- محاسبه انرژی آزاد اتصال بین مهار کننده ها و آنزیم بتالاکتاماز CTX-M-9 با استفاده از روش MM/PBSA

جدول 3- محاسبه ADME مهار کننده های مورد استفاده در این مطالعه

^a Predicted octanol/water partition coefficient (reasonable value from -2.0 to 6.5).

^b Predicted apparent Caco-2 cell permeability in nm/s (<25 poor, >500 great).

^c Predicted brain/blood partition coefficient (reasonable value from -3.0 to 1.2).

^d Human Oral Absorption in GI (±20%) (<25% is poor).

^e Predicted central nervous system activity on a –2 (inactive) to +2 (active) scale.