Cellular and Molecular Research
(Iranian Journal of Biology)
Identification and introducing of an Iranian Pantoea agglomerans strain AKH25 by 16S rRNA sequence and investigation of it,s capacity to malononitrile degradation
Document Type : Research Paper
Author
Abstract
Malononitrile, CH2(CN)2 is an aliphatic dinitrile, which uses in the production of herbicides, anti-cancer drugs and dyes. In the present study, malononitrile hydrolyzing bacteria screened from sewage with using MM1 media containing 1 % malononitrile. This strain was identified with biochemical and molecular methods. At first, malononitrile hydrolyzing activity of this strain determined with colorimetric method. The isolate AKH25, with high enzyme activity was selected and 16S rRNA gene was amplified and sequenced by PCR method and designed primers. Comparison of 16S rRNA gene of AKH25 (KM229757) with the other deposited 16S rRNA genes in NCBI showed that this strain is Pantoea agglomerans from Enterobacteriaceae family. In another study, the bacterial growth curve and ammonia liberated in the presence of different malononitrile concentration was considered. Results showed that, the highest malononitrile decomposition value was detected as releasing of 1.48 and 3.33 mM ammonia from 2.0 and 5.0 mM malononitrile, after 21 h of incubation during the stationary phase, respectively. According to this research, the Iranian Pantoea agglomerans strain AKH25 can be used as a suitable candidate for removing malononitrile from contaminated environments.
Keywords
Main Subjects
شناسایی و معرفی سویه ایرانی پانتوآ آگلومرانس AKH25 با استفاده از توالی16S rRNA و بررسی قدرت تجزیه کنندگی مالونونیتریل آن
نرجس رمضانیپور، ارسطو بدویی دلفارد*، زهرا کرمی، عبدالحمید نمکی شوشتری
کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 18/12/93 تاریخ پذیرش: 11/3/94
چکیده
مالونونیتریل CH2(CN)2، یک ترکیب دینیتریلی با ساختار خطی است که در تولید علفکشها، داروهای ضد سرطان و رنگها، مورد استفاده قرار میگیرد. در مطالعه حاضر، باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل با استفاده از محیط کشت MM1 (mineral salts medium) حاوی 1 درصد مالونونیتریل از نمونه فاضلاب جمع آوری شده و به دو روش بیوشیمیایی و مولکولی شناسایی شدند. برای این منظور ابتدا میزان هیدرولیز مالونونیتریل توسط سویههای جدا شده با روش رنگ سنجی تعیین شد. سویهای که دارای بیشترین قدرت هیدرولیز کنندگی بود، انتخاب گردید و با استفاده از روشPCR و پرایمرهای طراحی شده، ژن 16S rRNA آن تکثیر و تعیین توالی گردید. مقایسه توالی به دست آمده KM229757)) با سایر توالیهای ثبت شده در بانک ژنی نشان داد سویه جداسازی شده (AKH25)مربوط به پانتوآ آگلومرانس از خانواده انتروباکتریاسه است. در مطالعه دیگر، منحنی رشد و میزان آمونیاک آزاد شده در حضور غلظتهای مختلف مالونونیتریل رسم گردید. نتایج نشان داد این سویه، دارای بالاترین فعالیت تجزیه مالونونیتریل به میزان 48/1 و 33/3 میلیمولار آمونیاک تولیدی در حضور غلظتهای 2 و 5 میلیمولار مالونونیتریل در 21 ساعت پس از انکوباسیون در فاز سکون منحنی رشد بود. بر اساس این تحقیق، سویه ایرانی پانتوآ آگلومرانسAKH25 میتواند کاندید مناسبی برای حذف مالونونیتریل از محیطهای آلوده مورد استفاده قرار گیرد.
واژه های کلیدی: جداسازی، مالونونیتریل، پانتوآ آگلومرانس، دی نیتریل
* نویسنده مسئول، تلفن: 03433222032، پست الکترونیکی: badoei@uk.ac.ir
مقدمه
توسعه روز افزون کارخانهها و صنایع شیمیایی متعدد، باعث تولید و مصرف ترکیبات شیمیایی مختلف شده است که پیامد آن تهدید جهانی برای محیط زیست میباشد(4). نیتریلها و مشتقات آنها با ساختار کلی R-C≡N به طور وسیعی در تولید انواع حلالها، پلاستیکها، حشره کشها، علفکشها، رنگها، مواد دارویی، پلیمرها و ... استفاده می شوند (8 و 26). علاوه بر فاضلاب خانگی، شهری و پساب کشاوزی از جمله صنایعی که خروجی فاضلاب آنها محتوی ترکیبات نیتریل است میتوان به صنایع دستکاری فلزات، استخراج معادن و ... اشاره کرد(6). مالونونیتریل CH2(CN)2، یک ترکیب دینیتریلی با ساختار خطی است که علاوه بر استفاده گسترده در تولید علفکشها، داروهای ضدسرطان و رنگها، به صورت ویژه و انبوه در تولید گاز اشکآور 2-کلرو بنزیلیدین مالونونیتریل (2-Chlorobenzylidene Malononitrile) مورد استفاده قرار میگیرد(12). برخی از عوارض این گاز اشکآور شامل سرگیجه، درد قفسه سینه، سردرد شدید، دو بینی و تاری دید، خستگی، تهوع، استفراغ، استفراغ خونی، دردهای شکمی و افزایش ترشحات دهان، بینی، چشم و سیستم تنفسی و دردهای شدید عضلانی ذکر شده است(5،10). این گاز در زمان 8 سال دفاع مقدس کشور ایران، از جمله سلاحهای شیمیایی-جنگی کشور عراق بود که برای اولین بار در عملیات رمضان نقش بازدارندگی به خود گرفت و نیروهای ایران را از دستیابی به اهداف عملیاتی بازداشت(15). در پی این واقعه، روزنامه لس آنجلس تایمز چاپ امریکا نوشت: در تابستان سال 1982 میلادی (1361 ه. ش.)، هنگامی که نیروهای ایرانی به نزدیکی سربازان عراقی رسیدند، دشمن از عامل سی اس که به عنوان گاز اشک آور شناخته میشود، استفاده کرد (15). این ماده با تأثیر بر DNA سلول میتواند سبب عوارض دیررس و تغییرات کارسینوژنیک و سرطانزایی در انسان شده و همچنین به دلیل نیمهعمر طولانی با شسته شدن توسط آب باران و سرازیر شدن به مزارع که از آبهای سطحی استفاده میکنند، سبب بروز عوارض زیست محیطی گردد(15). به طوری که، مالونونیتریل و مشتقات آن پس از رهاسازی در محیط زیست اثرات مضری مانند کاهش رشد موجودات زنده، کاهش مقاومت در برابر بیماریها، مرگ و میر موجودات، افزایش جهشهای ژنتیکی و سرطان را ایجاد میکنند(14). این ترکیبات در بدن انسان بلافاصله در اثر متابولسم کبدی به ماده سمی سیانید تبدیل شده و منجر به ایجاد مسائل جدی در بحث سلامت فردی میشوند(27). از جمله راهکارها برای حذف یا تبدیل ترکیبات نیتریل به ترکیبات اسیدی یا آمیدی بیخطر میتوان به هیدرولیز شیمیایی و آنزیمی اشاره نمود. پیوند نیتریل در ترکیبات نیتریلدار بسیار پایدار میباشد، این امر سبب میشود تا هیدرولیز شیمیایی آنها نیازمند شرایط سخت اسیدی (6 مولار اسیدکلردریک) یا بازی (2 مولار سدیم هیدروکسید) و دمای واکنشی بالا باشد(23). علاوه بر آن تولید محصولات جانبی مانند اسید سیانیدریک سمی و مقادیر بالای نمک و ... میتواند مشکلات فراوانی به وجود آورد(23). با توجه به این معایب، تجزیه به روش میکروبی-آنزیمی با داشتن مزایایی مانند امکان کنترل فیزیولوژیکی و فیزیکوشیمیایی، تنوع آنزیمی و مقادیر بالای تولید آنزیم میتواند راهی مؤثر و کارآ برای حذف یا تبدیل نیتریلهایی با سمیت بالا از محیطزیست میباشد(1). در این راستا، جداسازی و غربالگری آنزیمهای جدید با خصوصیات مؤثر و بهینه از میکروارگانیسمها به عنوان اولین مرحله در مسیر تحقیق و توسعه محصولات آنزیمی بررسی شده و باکتریهای متنوعی جداسازی و بررسی شدند(2). تاکنون گزارشات محدودی از جداسازی و فعالیت باکتریهای هیدرولیز کننده دینیتریلهای آلیفاتیک به ویژه مالونونیتریل منتشر شده است که میتوان به جداسازی Pyrococcus abyssi (25) و Bacillus RAPc8 (27) با سوبسترای مالونونیتریل، فعالیت 17 درصدی هیدرولیز مالونونیتریل سویه Burkholderia cenocepacia J231 (19) و فعالیت آنزیمی باکتری Bacillus Pallidus Dac521 روی دو سوبسترای گلوتارونیتریل و آدیپونیتریل در مقایسه با سوبسترای کنترل بنزونیتریل با مقادیر 10 و 14 درصد اشاره نمود(3). ترکیب نیتریل به عنوان یک منبع کربن و یا انرژی در این باکتریها مورد استفاده قرار میگیرد و در نهایت به کربوکسیلیک اسید و آمونیاک تبدیل میشود(8). از آنجایی که بهترین روش برای حذف مالونونیتریل از محیط زیست، استفاده از باکتریهای تجزیهکننده این ترکیب است. در این تحقیق یک باکتری ایرانی با توانایی حذف مالونونیتریل از فاضلاب شهری کرمان جداسازی گردید. سپس این سویه (AKH25) با استفاده از ژن 16S rRNA شناسایی و پتانسیل حذف مالونونیتریل آن مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
تهیه نمونه، جداسازی و شناسایی باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل: نمونههای حاوی باکتری از محل فاضلاب شهر کرمان تهیه گردید. جداسازی باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل به روش غنیسازی در محیط حاوی سوبسترای اختصاصی صورت گرفت. برای این منظور از محیط حداقل نمکهای معدنی (MM1) به همراه یک درصد مالونونیتریل به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده شد(22). محیط حداقل نمکهای معدنی (7 pH) حاوی ترکیبات: 8/6 گرم دی پتاسیم هیدروژن فسفات، 2/1 گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات، 1/0 گرم سولفات منیزیم، 1/0 گرم سولفات منگنز، 1/0 گرم کلسیم دیکلرید، 1 /0 گرم سولفات آهن و 006/0 گرم سدیم مولیبدات در یک لیتر آب مقطر بود. میزان 5 میلیلیتر از نمونههای آب درون این محیط جهت غنیسازی اولیه تلقیح شد و روی شیکر-انکوباتور با rpm160 و دمای 30 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از گذشت یک هفته، 5 میلیلیتر از محیط برداشته شد و به محیط حداقل نمکهای معدنی جدید انتقال یافت. این عمل تا 3 پاساژ ادامه یافت تا اینکه کدورت به دست آمده ناشی از رشد باکتریها باشد و آلودگی ترکیبات دیگر در نمونه کاهش یابد. از پاساژ نهایی میزان 100 میکرولیتر بر روی محیط کشت جامد نمکهای معدنی منتقل گردید. پس از رشد، باکتریها به صورت تک کلنی جداسازی و به محیط حداقل نمکهای معدنی جدید انتقال یافتند. باکتریهایی که در مراحل قبلی جداسازی شده بودند، در پلیتهای حاوی محیط حداقل نمکهای معدنی، 100 میکرولیتر مالونونیتریل و 02/0 درصد فنلرد به عنوان شناساگر کشت داده شده و سپس در دمای 30 درجه سانتیگراد به مدت 48-24 ساعت گرماگذاری شدند. پس از سه دوره کشت از میان سویههای با فعالیت هیدرولیز مالونونیتریل، سویهای که بیشترین هاله و میزان شدت رنگ در محیط جامد و مایع حاوی سوبسترا و فنلرد، بود به عنوان سویه برتر مولد آنزیم تجزیه کننده مالونونیتریل جهت مطالعات بعدی انتخاب شد. با استفاده از برخی آزمونهای میکروبی و بیوشیمیایی مانند رنگآمیزی گرم، شکل میکروسکوپی، آزمون حرکت، تولید اندول، تولید سولفید هیدروژن، احیای نیترات، آزمایش وژز-پروسکوئر، هیدرولیز ژلاتین، شناسایی اولیه باکتری برتر هیدرولیز کننده مالونونیتریل انجام گرفت(17).
شناسایی مولکولی باکتری با تکثیر قسمتی از ژن 16S rRNA توسط پرایمرهای Forward: 5'-AGTTTGATCCTGGCTCCAG-3' باTm=53.7ºC و پرایمر :Reverse -'GGCTACCTTGTTACGACTT- 3ʹ 5با Tm = 53.4 ºC انجام شد. واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR)، در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 2 میکرولیتر DNA الگو (10 mM)، 5/0 میکرولیتر از هر پرایمر (50 پیکومول)، 2 میکرولیتر(10 mM) dNTP ، 1 میکرولیتر (50 mM) MgCl2، 5/2 میکرولیتر بافر PCR (10X)، 2/0 میکرولیتر آنزیم (5u/ml) Taq DNA Polymerase خریداری شده از شرکت سیناژن و 3/16 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه با برنامه ذیل انجام شد. 1) دمای اولیه 94 درجه سانتیگراد، 45 ثانیه، 2) 52 درجه سانتیگراد، 45 ثانیه، 3) 72 درجه سانتیگراد، 90 ثانیه، 4) برای تکثیر نهایی 72 درجه سانتیگراد، برای مدت 8 دقیقه. محصولPCR پس از الکتروفورز ژل آگارز 1 درصد با استفاده از کیت استخراج DNA خالصسازی شد. سپس توالی DNA با استفاده از توالییاب DNA توسط شرکت بیونیر (کره) تعیین شد. شباهت توالی نوکلئوتیدهای ژن16S rRNA سویه هیدرولیز کننده به کمک نرمافزار BLAST با توالیهای ثبت شده در پایگاه اطلاعاتی ژنوم Gene Bank مقایسه شد(16). به این ترتیب نزدیکترین سویهها با ترادف 16S rRNA با سویه تعیین شد. همچنین، توالی به دست آمده در این پژوهش در بانک ژنی NCBI ثبت و شماره دستیابی ژنی مربوطه دریافت شد. درخت فیلوژنی توالی سویه با توالی حاصل از جستجو در پایگاه اطلاعاتی Gene Bank به کمک نرمافزار MEGA4 با روش neighbour joining رسم شد(24).
سنجش فعالیت آنزیمی: فعالیت آنزیم بر اساس مقدار آمونیاک تولیدی با استفاده از روش فنل-هیپوکلریت ارائه شده توسط فاست و اسکات سنجیده شد(9). بر اساس این روش به مقدار 100 میکرولیتر محلول حاوی آنزیم، 100 میکرولیتر مالونونیتریل 25 میلیمولار و 200 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلیمولار با 7pH اضافه شد. مخلوط حاصل به مدت 30 دقیقه در دمای 30 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. پس از آن مقادیر 400 میکرولیتر محلولA (فنل 59/0 مولار و سدیم نیتروپروساید 1 میلیمولار) و 400 میکرولیتر محلولB (سدیم هیپوکلریت 11/0 مولار و سدیم هیدروکسید 2 مولار) به آن اضافه شد. پس از پدیدارشدن رنگ آبی مقدار جذب نمونهها در طولموج 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (مرئی-فرابنفش) خوانده شد. در تمامی واکنشها از محلول شاهدی که در آن آنزیم پس از انکوباسیون مخلوط واکنش به آن اضافه شده بود استفاده گردید. بر این اساس، یک واحد فعالیت آنزیم عبارت است از مقدار آنزیمی که قادر است 1 میکرومول آمونیاک به ازای 1 دقیقه تحت شرایط استاندارد واکنش آزاد نماید. آزمایشات 3 بار تکرار و منحنی استاندارد توسط آمونیوم کلراید رسم شد (21).
بررسی میزان هیدرولیز مالونونیتریل وتغییرات pH در طی زمان: سویه باکتریایی مورد نظر در حضور غلظت یک درصد مالونونیتریل در دمای 30 درجه سانتی گراد و دور 160 کشت داده شد. میزان تغییرات pHو تولید آمونیاک ناشی از فعالیت آنزیم در مدت زمان 0، 24، 48، 72 ساعت انکوباسیون و همچنین تجزیه مالونونیتریل در حضور و عدم حضور سوبسترا در مدت زمان 0 و 72 ساعت، با روش گفته شده مورد بررسی قرار گرفت(22).
منحنی رشد و هیدرولیز مالونونیتریل توسط سویه مورد نظر: سویه باکتریایی مورد نظر در حضور غلظتهای 2 و 5 میلیمولار مالونونیتریل در دمای 30 درجه سانتی گراد و دور 160 کشت داده شد. میزان آمونیاک آزاد شده حاصل از تجزیه مالونونیتریل طبق روش ذکر شده اندازه گیری شد. علاوه بر این، منحنی رشد سویه مورد نظر در غلظتهای 2 و 5 میلیمولار مالونونیتریل نیز به روش کدورت سنجی به وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر در طولموج 600 نانومتر در فاصلههای زمانی مشخص 0 تا 36 ساعت پس از انکوباسیون رسم شد.
نتایج
جداسازی باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل: جداسازی باکتریهای هیدرولیز کننده مالونونیتریل با غنیسازی نمونههای فاضلاب در محیط کشت حداقل نمکهای معدنی (MM1) حاوی یک درصد مالونونیتریل انجام شد. پس از رشد، تعداد 4 سویه با توانایی استفاده از مالونونیتریل به عنوان تنها منبع کربن و نیتروژن روی محیط کشت حاوی مالونونیتریل و فنلرد، جداسازی و خالصسازی شد. از میان 4 سویه جدا شده، سویه AKH25 با ایجاد بیشترین هاله و شدت رنگ صورتی در محیط جامد و مایع حاوی فنلرد برای ادامه مطالعات انتخاب گردید. نتایج حاصل از تجزیه مالونونیتریل و تغییر رنگ فنل رد در شکل 1 نشان داده شد. این نتایج نشان داد که تجزیه مالونونیتریل از 3 ساعت پس از انکوباسیون شروع و به تدریج افزایش یافته است به طوری که در 15 ساعت پس از انکوباسیون بیشترین فعالیت تجزیه کنندگی مشاهده گردید.
شکل1- روند تغییر رنگ محیط مایع حاوی فنلرد و مالونونیتریل از زرد به صورتی توسط باکتری پانتوآ آگلومرانس AKH25 درون میکروپلیت در بازه زمانی 0 تا 15 ساعت پس از رشد
بررسی میزان هیدرولیز مالونونیتریل وتغییرات pH در طی زمان: نتایج تغییرات pH و آمونیاک تولید شده حاصل از فعالیت آنزیمی سویه پانتوآ آگلومرانس AKH25 در زمانهای مختلف انکوباسیون در شکل 2 نشان داده شد. نتایج نشان داد زمان بهینه فعالیت هیدرولازی، 24 ساعت پس از انکوباسیون بود (شکل 2-الف). علاوه براین، نتایج خاطر نشان میسازد که میزان تغییرات pH محیط با میزان فعالیت آنزیم و تجزیه مالونونیتریل نیز رابطه مستقیم دارد به طوری که بیشترین میزان تغییر pH ناشی از آزادسازی آمونیاک پس از 24 ساعت انکوباسیون مشاهده گردید. به این ترتیب در اثر تجمع آمونیاک در محیط، pH خنثی اولیه به سمت قلیاییشدن پیش رفته و در زمان 24 ساعت پس از انکوباسیون به بالاترین حد خود رسید و پس از آن به تدریج کاهش یافت (شکل 2-ب).
نتایج حاصل از منحنی رشد و تجزیه مالونونیتریل (غلظتهای 2 و 5 میلیمولار) توسط سویه AKH25 در بازه زمانی 36 ساعت در شکل 2 نشان داده شد. در این آزمایش سویه AKH25 در محیط اختصاصی MM1 حاوی مالونونیتریل در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور rpm 160 کشت داده شد. سپس هر 3 ساعت یکبار میزان جذب در طولموج 600 نانومتر اندازه گیری گردید که معیاری از رشد باکتری بود. نتایج نشان داد که باکتری دارای فاز تأخیر تقریبی حدود 2 ساعت بوده و پس از آن در بازه زمانی حدود 3-12 ساعت، در فاز لگاریتمی قرار داشت. بعد از 12 ساعت انکوباسیون فاز سکون شروع شده و باکتری در حدود 27 ساعت بعد از کشت وارد فاز مرگ شد. مقایسه نمودارهای حاصل از فعالیت آنزیمی تجزیه غلظتهای 2 و 5 میلیمولار مالونونیتریل نشان داد که این باکتری در زمان تقریبی 21 ساعت رشد دارای بیشترین میزان فعالیت آنزیمی بود. از این رو، میزان آمونیاک آزاد شده ناشی از تجزیه مالونونیتریل در این زمان بیشترین مقدار بود.
شکل2- بررسی میزان تجزیه مالونونیتریل در طی زمان 72 ساعت. الف) تغییرات pH، ب) میزان آمونیاک تولیدی.
نتایج نشان داد که این سویه باکتریایی در این مدت، 48/1 میلی مولار آمونیاک را از تجزیه 2 میلی مولار مالونونیتریل تولید کرد (شکل 3-الف). علاوه بر این میزان تولید آمونیاک از تجزیه 5 میلی مولار مالونونیتریل در همین زمان حدود 33/3 میلی مولار بود (شکل 3-ب). پس از این مدت با کاهش یافتن میزان رشد باکتری، میزان تجزیه و تولید آمونیاک نیز کاهش یافت.
شناسایی بیوشیمیایی: برای شناسایی سویه موردنظر، خصوصیات فنوتیپیکی و برخی آزمونهای بیوشیمیایی-میکروبی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که این سویه از جمله باکتریهای گرم منفی، دارای پیگمان و از جنس پانتوآ بود (جدول 1).
جدول1- نتایج آزمونهای بیوشیمیایی- میکروبی باکتری پانتوآ آگلومرانس AKH25
|
خصوصیات سویه |
نتیجه |
|
واکنش گرم |
منفی |
|
شکل باکتری |
باسیلوس |
|
پیگمان |
زرد رنگ |
|
تولید اندول |
- |
|
اورهآز |
- |
|
حرکت |
+ |
|
احیا نیترات |
+ |
|
واکنش VP |
+ |
|
هیدرولیز ژلاتین |
+ |
|
رشد در 4 درجه سانتیگراد |
+ |
شکل3- منحنی رشد و فعالیت هیدرولیز مالونونیتریل در بازه زمانی 36 ساعت در دو غلظت مختلف آمونیاک. الف) غلظت 2 میلیمولار، ب) غلظت 5 میلیمولار.
شناسایی با استفاده 16S rRNA: تعیین گونه باکتریایی با استفاده از اطلاعات حاصل از توالی ژن 16S rRNA انجام شد. توالی ژن 16S rRNA دارای بخشهای حفاظت شده و غیر حفاظت شده میباشد که از اطلاعات مربوط به این بخشها برای شناسایی گونههای باکتریایی استفاده میشود. برای تهیه DNA ژنومی باکتری، از کیت استخراج DNA سیناژن استفاده شد و DNA تکثیر یافته با استفاده از PCR پس از مشاهده روی ژل آگارز 1 درصد (شکل4) توسط کیت تخلیص DNA از شرکت سیناژن تخلیص و برای تعیین توالی به شرکت بیونیر (کره) ارسال شد. درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرمافزار MEGA4 رسم گردید (شکل 5). مقایسه توالی ژن 16S rRNA این سویه باکتریایی با 13 گونه نزدیک از نظر توالی ژن مورد نظر موجود در NCBIنیز در جدول 2 آورده شد. نتایج حاصل از تطبیق توالی و درخت فیلوژنتیکی نشان دادند که گونه فوق به Pantoea agglomerans نزدیک و میزان شباهت نوکلئوتیدی آن 99درصد بود. توالی نوکلئوتیدی ارائه شده در بانک ژنی NCBI با شماره دسترسی KM229757 ثبت و در دسترس است.
شکل4. محصول PCR ژن 16S rRNA سویه پانتوآ آگلومرانس AKH25(چاهک شماره1) و DNA مارکر (چاهک شماره2).
جدول 2- مقایسه توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA جدایه AKH25 با سایر گونههای موجود در NCBI
|
Identify (%) |
Reference |
AC. Number |
Strain |
No. |
|
|
This study |
KM229757 |
Pantoea agglomerans AKH25 |
1 |
|
99 |
You, C, and et al. 2013. |
KC764985.1 |
Pantoea agglomerans T224 |
2 |
|
99 |
Abraham, WR, and et al. 2006. |
AM184263.1 |
Pantoea agglomerans WAB1924 |
3 |
|
99 |
Abraham, WR, and et al. 2006. |
AM184264.1 |
Pantoea agglomerans WAB1925 |
4 |
|
99 |
Young, CC, and et al. 2003. |
AY315450.1 |
Pantoea agglomerans CC-88166 |
5 |
|
99 |
Avila-Quezada, GD, and et al. 2012. |
JX827461.1 |
Enterobacter cloacae GAQ7 |
6 |
|
99 |
Tripathy, S, and et al. 2013. |
KC895920.1 |
Enterobacter cancerogenus cifa chp29 |
7 |
|
99 |
Nataprawira, S, and et al. 2014. |
KJ574404.1 |
Enterobacter cloacae BB08-2 |
8 |
|
99 |
Hao, Y, and et al. 2014. |
KJ541760.1 |
Enterobacter cloacae ZL1103 |
9 |
|
99 |
Okubo, T, and et al. 2009(17). |
AB461749.1 |
Enterobacteriaceae bacterium M406 |
10 |
|
99 |
Nakagawa, Y, and et al. 2011. |
AB680427.1 |
Enterobacter cloacae NBRC13536 |
11 |
|
97 |
Putra, AE, and et al. 2014. |
KJ616368.1 |
Enterobacter cloacae BC11-4 |
12 |
|
99 |
Song, L, and et al. 2008. |
EU884395.1 |
Enterobacter cloacae XA-2 |
13 |
|
99 |
Liang, J, and et al. 2014. |
KJ806343.1 |
Leclercia adecarboxylata A-X9A |
14 |
بحث
در مطالعه حاضر، سویه باکتریایی پانتوآ آگلومرانس AKH25با فعالیت قابلتوجه تجزیه مالونونیتریل جداسازی و شناسایی گردید. فنل رد در pH اسیدی زرد رنگ و در pH قلیایی صورتی رنگ میشود. آمونیاک، محصول اصلی هیدرولیز ترکیبات نیتریلی است. اگر باکتری قادر به هیدرولیز مالونونیتریل باشد با انجام این فرآیند، آمونیاک در محیط تجمع یافته که منجر به قلیاییشدن و تغییر رنگ معرف فنل رد از زرد به صورتی میشود(25).
شکل5- درخت فیلوژنی سویه پانتوآ آگلومرانس AKH25رسم شده به روش neighbour joining و با استفاده از معیار Boot strap.
نتایج خاطرنشان میسازد که بیشترین میزان قلیاییشدن pH محیط ناشی از آزادسازی آمونیاک، پس از 24 ساعت انکوباسیون مشاهده میشود. علاوه بر این، میزان تغییرات pH محیط با میزان تجزیه مالونونیتریل نیز رابطه مستقیم دارد. سانتاشکومار و همکاران در 2010 گزارش کردند که هیدرولیز استونیتریل موجود در محیط به وسیله باکتری Paracoccus sp. SKG موجب تولید آمونیاک و افزایش pH محیط از 7 به 2/9 میشود و پس از آن به تدریج کاهش ویا ثابت میماند (22). آنها بر، اثرگذار بودن رشد باکتری و ایجاد این تغییرات اشاره کرده و نشان دادند که در فاز نمایی رشد، باکتری با مصرف سوبسترای نیتریلی به تدریج غلظت آن را در محیط کاهش داده و از طرفی میزان آمونیاک و محصول را افزایش میدهد. علاوه بر آن، در این مرحله، باکتری از محصول تولیدی حاصل از هیدرولیز و آمونیاک نیز به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده کرده و به رشد خود ادامه میدهد. پس از گذشت زمان و تجمع آمونیاک اضافی در محیط، به دلیل اثر مهاری بر رشد باکتری، فاز سکون منحنی رشد آغاز و pH محیط با عدم تولید آمونیاک افزایش نیافته و ثابت میماند(25).
بررسی فعالیت آنزیمی باکتری جداسازی شده نیز نشان داد که تجزیه مالونونیتریل از 3 ساعت پس از انکوباسیون شروع شده و به تدریج افزایش مییابد و تا 15 ساعت پس از انکوباسیون به بیشترین میزان تجزیه میرسد. در پژوهشی که در سال 2005 روی نیتریلاز Pyrococcus abyssi انجام گردید، مشخص شد که این آنزیم تمایل به هیدرولیز سوبستراهای دینیتریل آلیفاتیک داشته و در میان آنها، مالونونیتریل با مقدار Km 48/3 میلیمولار، بهترین سوبسترای هیدرولیزی است. همچنین اثر مهاری این سوبسترا در غلظتهای بالاتر از 12 میلیمولار نیز مشاهده گردید(18). علیرغم پژوهشهای گستردهای که در مورد هیدرولیز ترکیبات مختلف نیتریلی صورت گرفته است، گزارشات معدودی به بررسی هیدرولیز ترکیبات دینیتریلی مانند مالونونیتریل، سوکسینونیتریل، گلوتارونیتریل، آدیپونیتریل و ... به وسیله سویههای مختلف باکتریایی منتشر شده است(20). از جمله باکتری های تجزیهکننده مالونونیتریل میتوان به Burkholderia cenocepacia J2315 و Rhodococcus rhodochrous 21197 اشاره نمود(7).
سویه پانتوآ آگلومرانس AKH25قادر است پس از 21 ساعت انکوباسون میزان 74 درصد از مالونونیتریل اولیه (2 میلیمولار) را تجزیه کرده و آمونیاک تولید کند. علاوه بر این، در صورتیکه میزان مالونونیتریل اولیه 5 میلیمولار باشد این سویه قادر است در همین شرایط میزان 67 درصد آن را تجزیه کند. کمتر شدن درصد تجزیه احتمالاً به خاطر سمی بودن ترکیب و ممانعت از رشد بیشتر باکتری میباشد (25). گاواگان و همکاران در 1999، جداسازی باکتری گرم منفی Acidovorax facilis 72W با توانایی طیف گسترده هیدرولیز دینیتریلها از جمله مالونونیتریل را گزارش دادند(11). در این پژوهش، میزان تبدیل سوبسترای مالونونیتریل، گلوتارونیتریل و سوکسینونیتریل به ازای میلیگرم وزن تر بر حسب میکرومول بر دقیقه بترتیب 144/0، 09/0 و 08/0 گزارش شد(11). در میان باکتریهای گرم مثبت، فعالیت هیدرولیزی مالونونیتریل توسط Bacillus RAPc8 به میزان 7 درصد در مقایسه با سوبسترای استونیتریل گزارش شد (27).
وانگ و همکاران در 2013 در طی بررسی اختصاصیت سوبسترایی آنزیم نیتریلاز سویه Burkholderia cenocepacia J231 در مقایسه با سوبسترای کنترل فنیلاستونیتریل، فعالیت 17 درصدی هیدرولیز مالونونیتریل در کنار هیدرولیز 78 درصدی و 5 درصدی دینیتریلهای فومارونیتریل و سوکسینونیتریل گزارش دادند(25). در پژوهشی که در سال 2003 روی فعالیت آنزیمی سویه سیانوباکتریایی PCC6803 انجام شد، فعالیت 5 درصدی نیتریلاز در حضور سوبستراهای دینیتریل به خصوص مالونونیتریل در مقایسه با کنترل بنزونیتریل مشاهده گردید(13). در پایان خاطر نشان میسازد، تاکنون از جنس پانتوآ به عنوان باکتری هیدرولیز کننده ترکیبات دینیتریل به ویژه مالونونیتریل گزارشی منتشر نشده است.
نتیجهگیری
با توجه به مصرف روزافزون محصولات مالونونیتریل و مشتقات آن، رهاسازی این ترکیبات در محیط زیست تأثیر منفی بر سلامت انسان و موجودات زنده دارد. تجزیه زیستی توسط میکروارگانیسم ها به عنوان یک راهکار مؤثر در حذف این آلایندهها مطرح میباشد. بنابراین پانتوآ آگلومرانس سویه AKH25میتواند برای هیدرولیز مالونونیتریل در مراحل تصفیه فاضلاب شهری و پاکسازی محیط زیست مورد استفاده قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید باهنر کرمان کمال تشکر و قدردانی را دارند.
', './data/cell/coversheet/221478435298.jpg'))
Volume 29, Issue 2 - Serial Number 2
September 2016Pages 198-208
- Receive Date: 09 March 2015
- Revise Date: 01 June 2015
- Accept Date: 01 June 2015