Document Type : Research Paper
Author
Academic member of Shahid Bahonar University of Kerman
Abstract
Producing tender meat that consumer's desire is one of the major problems facing the sheep industry. Therefore, study of the biochemical mechanisms for muscle degradation is essential at the molecular level. Calpastatin is an endogenous inhibitor and plays an essential role in regulation of calpain activity in cells. Sanjabi sheep is an important animal producing meat in Kermanshah province that until now has not been studied by DNA markers, especially in the case of calpastatin gene. Therefore, present study was conducted to determine the genetic diversity of calpastatin gene in Sanjabi sheep and to compare this breed with other sheep breeds. A 622 bp fragment from this gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from DNA samples of 142 Sanjabi sheep. PCR products were characterized by the restriction fragment length polymorphism (RFLP) method using two restriction enzymes, MspI, and NcoI, yielding 3 genotypes, MM, MN and NN. Genotype frequencies of MM, MN and NN were 0.67, 0.25 and 0.08, respectively. Gene frequencies of M and N were 0.79 and 0.21, respectively and mean of Nei's and Shanon's indexes were 0.51 and 0.33, respectively. Population was not in Hardy-Weinberg equilibrium for this locus. The results of this experiment indicated that this population is highly polymorphic. Furthermore, in the most studied Iranian sheep breeds, all 3 genotypes of this gene have not been detected whereas in this breed all 3 genotypes were observed.
Keywords
Main Subjects
تنوع آللی ژن کالپاستاتین در گوسفند سنجابی
محمدرضا محمدآبادی
کرمان، دانشگاه شهید باهنر، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی، ژنتیک و بیوتکنولوژی
تاریخ دریافت: 25/1/91 تاریخ پذیرش: 29/7/92
چکیده
تولید گوشت ترد که مطلوب مصرف کنندگان باشد یکی از مسائل مهم در صنعت پرورش گوسفند است. لذا، مطالعه سازکارهای بیوشیمیایی تجزیه ماهیچه در سطح مولکولی ضروری است. کالپاستاتین یک مهار کننده داخلی است و نقش اصلی را در تنظیم فعالیت کالپاین در سلولها ایفاء می کند. گوسفند سنجابی یک حیوان مهم تولید کننده گوشت در استان کرمانشاه است که با نشانگرهای مولکولی، به ویژه از نظر ژن کالپاستاتین مورد مطالعه قرار نگرفته است. بنابراین، هدف این تحقیق تعیین تنوع ژنتیکی گوسفندان سنجابی از نظر ژن کالپاستاتین و مقایسه این نژاد با نژادهای دیگر بود. برای انجام این مطالعه یک قطعه 622 جفت بازی از این ژن از روی 142 نمونه DNA گوسفند سنجابی با واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) تکثیر شد. محصولات PCR با روش RFLP و با استفاده از دو آنزیم MspI و NcoI هضم و سه ژنوتیپ MM، MN و NN مشاهده شدند. فراوانی ژنوتیپهای MM، MN و NN به ترتیب 67/0، 25/0 و 08/0، فراوانی ژنهای M و N به ترتیب 79/0 و 21/0 و میانگین شاخصهای شانون و نئی به ترتیب 51/0 و 33/0 به دست آمد و جمعیت برای این جایگاه در تعادل هاردی-وینبرگ قرار نداشت. نتایج این آزمایش نشان داد که این جمعیت چند شکلی بالایی دارد، به علاوه در بیشتر نژادهای گوسفند ایرانی مطالعه شده هر سه ژنوتیپ مشاهده نشدند ولی در این نژاد هر سه ژنوتیپ وجود داشت.
واژه های کلیدی: کالپاستاتین، گوسفند سنجابی، PCR-RFLP، تردی گوشت
نویسنده مسئول، تلفن: 32312043-0341 پست الکترونیکی: mmohammadabadi@yahoo.ca
مقدمه
پرورش گوسفند در ایران بیشتر به منظور تولید گوشت، پشم و پوست صورت می گیرد که در بین آنها تولید گوشت از اهمیت بیشتری برخوردار است. گوسفند به علت داشتن خصوصیاتی از جمله کم توقع بودن از نظر غذایی نسبت به دامهای بزرگ، سازگاری با شرایط آب وهوایی گوناگون، تنوع محصولات تولیدی و بی آزار بودن سابقه پرورش در ایران را داشته و نیز به خاطر سازگاری با ذائقه و سنتهای مذهبی مردم ایران از اهمیت خاصی برخوردار است (3). اکثر گوسفند داران کشور تنها راه افزایش تولیدات گوسفند را افزایش تعداد حیوانات می دانند در حالی که مراتع موجود که بزرگترین تأمین کننده غذای گوسفند است به هیچ وجه ظرفیت پذیرش تعداد بیشتر دام را ندارد. بنابراین ضروری است با ارائه راهکارهایی مناسب راندمان تولید مربوط به هر دام را افزایش داد (2).
در حال حاضر اصلاح ژنتیکی صفات در حیوانات اهلی کشورمان عمدتاً متکی به روشهای ژنتیک کمی است. این روشها بسیار مفید و کارآمد بوده و هنوز هم در تمام دنیا از آنها استفاده می شود، اما اگر در کنار آنها از روشهای مولکولی استفاده گردد با دقت و سرعت بیشتری می توان به اهداف مورد نظر رسید.
در ایران منابع غنی حیوانی، به خصوص گوسفند وجود دارد که جهت شناسایی ژنهای کنترل کننده صفات آنها از طریق ژنتیک مولکولی کارهای جامع وکاملی صورت نگرفته است. شناسایی ژنهای کاندیدا در نژادهای بومی گوسفند می تواند به اصلاح نژاد گوسفندان بومی کمک نماید (7). پیشرفتهای تحسین برانگیزی اخیراً در ژنتیک مولکولی و فناوری زیستی صورت گرفته است و ابزارهای قدرتمند و جدیدی را برای اصلاح ژنتیکی حیوانات فراهم کرده است. یکی از مفیدترین این ابزارها نشانگرهای DNA می باشند که وراثت پذیر بوده و نشان دهنده تفاوتهای اطلاعات ژنتیکی (ردیفهای بازی DNA) موجود بین افراد در داخل و بین جمعیتها می باشند (5). استفاده از نشانگرها در اصلاح دام جایگاه خاصی را به خود اختصاص داده است و استفاده مناسب از آنها باعث افزایش دقت و سرعت در میزان بهبود ژنتیکی دام می شود. انتخاب براساس نشانگرها در مورد صفات دارای وراثت پذیری پایین، مشکل اندازه گیری، محدود به جنس و همچنین آنهایی که در ابتدای زندگی بروز نمی کنند، موفق بوده است (13)، لذا یکی از ابتداییترین گامها در مطالعات مولکولی محاسبه تنوع ژنتیکی می باشد. تنوع ژنتیکی در یک جایگاه را می توان با معیارهایی همچون هتروزیگوسیتی مورد انتظار، هتروزیگوسیتی مشاهده شده و تنوع آللی مشخص نمود. میزان هتروزیگوسیتی معمول ترین معیار تنوع ژنتیکی در یک جمعیت می باشد که به دو صورت هتروزیگوسیتی مشاهده شده (H0) وهتروزیگوسیتی مورد انتظار (HE) یا تنوع ژنی (D) گزارش می شود (20). از آنجا که گوشت گوسفند یکی از مهم ترین منابع تأمین پروتئین برای بشر است و علاوه بر این طعم بسیار لذیذی دارد، بنابراین تحقیقاتی در زمینه کمیت و کیفیت این گوشت باید انجام گیرد. مصرف کنندگان تردی گوشت را از مهم ترین خصوصیات کیفیت گوشت می دانند (18) و عدم تردی گوشت را از مهم ترین مشکلات کیفیت بیان میدارند (14). از آنجا که مصرف کنندگان برای گوشت ترد پول بیشتری پرداخت می کنند، لازم است تا روشهایی برای برآورد تردی گوشت توسعه یابد و درجه بندی کیفیت گوشت تکمیل گردد تا پرورش دامهای گوشتی اقتصادی تر باشد (25). اگر علتهای تغییر در تردی گوشت شناسایی شوند، می توان مکانیسم مؤثر در فرآیند تردی را دستکاری نمود تا به اهداف مورد نظر رسید. اگر چه بافت گوشت، بخصوص تردی آن در حیوانات مختلف بسیار متغیر است اما دارای ساختارهای مشابه و خصوصیات شیمیایی یکسانی در کلیه مهره داران است. اکثر محققان معتقدند که با کنترل ژنتیکی می توان مشکل تردی گوشت را تا حدودی بهبود بخشید و در این میان سیستم آنزیمی کالپاین مهم ترین نقش را دارد (9، 10، 11، 19 و 22)، لذا بهترین شیوه پیش بینی تردی گوشت باید بر اساس شناسایی شاخصی باشد که توانایی این سیستم را اندازه گیری کند. مهم ترین تنظیم کننده سیستم آنزیمی کالپاین در ماهیچه، پس از مرگ کالپاستاتین است که یک بازدارنده اختصاصی و داخلی (اندوژنوس) است، از این رو یکی از روشهای برآورد تردی گوشت تعیین میزان فعالیت کالپاین و کالپاستاتین می باشد. نتایج تحقیقات انجام شده نشان می دهد که انتخاب حیوانات دارای فعالیت کالپاستاتین کمتر می تواند منجر به بهبود تردی گوشت گردد (12، 19، 20، 21 و 24). ژن کالپاستاتین روی کروموزوم شماره 5 گوسفند واقع است و 100 کیلو باز طول دارد و شامل 4 اگزون می باشد. اهمیت مطالعه ژن کالپاستاتین این است که ایجاد کننده یک سیستم آنزیمی است که اگر تغییری در نسبت آنزیمهای این سیستم ایجاد شود بیماریهای گوناگونی بروز می کند (8). فرآیندهای گوناگونی توسط سیستم کالپاین-کالپاستاتین تحت تأثیر قرار می گیرند (23). نتایج تحقیقات مختلف نشان می دهد که بین تردی، آب داری و نرمی گوشت و ژنوتیپ کالپاستاتین ارتباط معنی داری وجود دارد و بعضی ژنوتیپهای کالپاستاتین (CAST28) بر ضخامت چربی پشت اثر می گذارند، اما ژنوتیپهای دیگر (CAST67) اثری بر وزن یا خصوصیات لاشه ندارد (6). همه تحقیقات این حقیقت را بیان می دارند که شناخت مکانیسمهای غیر فعال سازی کالپاستاتین در ماهیچه های اسکلتی بعد از مرگ بسیار مهم می باشد. چند شکلی در این ژن برای اولین بار در گوسفند توسط پالمر و همکاران (1998) و با روش PCR-RFLP انجام شد که دو آلل M و N را به ترتیب با فراوانی 77/0 و 23/0 در گوسفند نژاد دورست هورن به دست آوردند (17). در ایران نیز تنوع ژنتیکی این ژن برای نژادهای قره گل و کردی (1و 15) انجام شده است. گوسفند سنجابی بعد از گوسفند بلوچی دارای بیشترین تعداد در بین گوسفندان ایران است و در اکثر نقاط استان کرمانشاه پراکنده است. این حیوان به علت درشتی جثه از نظر تولید گوشت مورد توجه دامداران می باشد (3). دامداران زیادی در استان کرمانشاه به پرورش و نگهداری آن علاقهمند هستند. این گوسفند در مقابل سرما نسبتاً مقاوم است و از مراتع کوهستانی به خوبی استفاده می کند (4). این نژاد تا کنون با روشهای مولکولی بسیار کم مورد تحقیق قرار گرفته و از نظر ژن کالپاستاتین نیز تا کنون بررسی و مطالعه نشده است. هدف این تحقیق بررسی چند شکلی ژن کالپاستاتین و تعیین فراوانی ژنی و ژنوتیپی در گوسفند سنجابی و مقایسه این نتایج با نژادهای دیگر می باشد.
مواد و روشها
این تحقیق از 142 رأس گوسفند سنجابی در 33 گله استان کرمانشاه، که تحت پوشش امور دام این استان بودند و سنجابی بودن آنها به تأیید این سازمان رسیده بود به صورت کاملاً تصادفی خون گیری و نمونه های 5 میلی لیتری خون در لوله های خلاء دار حاوی EDTA جمع آوری گردید و بلافاصله به درون یخ منتقل شد. سپس استخراج DNA با استفاده از کیت Diatom DNA Prep به روش گوانیدین-سیلیکاژل انجام و مولکولهای بزرگی به طول تقریبی 50-60 هزار جفت باز حاصل شد (19). در این مطالعه از یک جفت آغازگر با توالیهای زیر استفاده شده:
5'TGG GGC CCA ATG ACG CCA TCG ATG-3'
5'GGT GGA GCA GCA CTT CTG ATC ACC-3'
واکنش PCR با استفاده از کیت PCR یونیورسال (Universal PCR) (شرکت سینا ژن) انجام شد. شرایط واکنش PCR عبارت بودند از: واسرشت سازی اولیه DNA به مدت 1 دقیقه و 95 درجه سانتی گراد، انجام 35 سیکل با واسرشت سازی DNAطی40 ثانیه و 95 درجه سانتی گراد، اتصال آغازگر به DNAطی 60 ثانیه و 62 درجه سانتی گراد و بسط آغازگر طی 2 دقیقه و 72 درجه سانتی گراد و بسط انتهایی 10 دقیقه و 72 درجه سانتی گراد. پس از عمل تکثیر، 5 میکرولیتر از محصولات PCR در ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز گردید تا از انجام آن اطمینان حاصل شود. باقیمانده محصولات تکثیر با استفاده از آنزیمهای برشی MspI و NcoI در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 2 ساعت هضم گردید (17). محصولات هضم آنزیمی نیز روی ژل آگارز 2 درصد بارگذاری و سپس از ژل عکسبرداری شد و با نرم افزار Onedscan اندازه قطعات محاسبه گردید. در نهایت با نرم افزار PopGen 32 فراوانیهای ژنوتیپی و آللی، شاخص شانون، شاخص هتروزیگوسیتی نئی (Nei) (1987) (16) و تعادل هاردی-وینبرگ محاسبه شد.
نتایج
با استفاده از الکتروفورز در ژل آگارز و اسپکتروفتومتری مشخص شد که DNA استخراج شده کمیت و کیفیت بسیار خوبی دارد و نسبت A260/A280 آن در دستگاه اسپکتروفتومتر 9/1 بود. این کیفیت نشان می دهد که DNA تقریباً عاری از آلودگی است و برای کارهای مولکولی، از جمله PCR بسیار مناسب می باشد. تصویری از محصولات PCR برای ژن کالپاستاتین در شکل 1 نشان داده شده است. پس از انجام PCR با برنامه حرارتی بهینه شده فقط یک باند با اندازه 622 جفت باز تولید کرد که محصول تکثیر DNA الگو با آغازگرهای مورد استفاده می باشد و نشان دهنده اختصاصی عمل کردن آغازگرها می باشد.
نتیجه هضم محصولات PCR ژن کالپاستاتین توسط آنزیمهای برشی MspI و NcoI و ژنوتیپهای ممکن در شکل های 2 و 3 نشان داده شده است. مقایسه باندهای موجود در نمونه های هضم شده توسط این آنزیم با نشانگر وزنی DNA نشان داد که قطعات موجود در روی ژل با آنچه که از روی توالی DNA ژن کالپاستاتین پیش بینی می شد، یکسان می باشد.
شکل 1- قطعه 622 جفت بازی حاصل از تکثیر ژن کالپاستاتین
شکل 2- الکتروفورز محصولات حاصل از هضم آنزیم MspI برای ژن کالپاستاتین. از M100 به عنوان نشانگر وزنی استفاده شده است.
شکل 3- الکتروفورز محصولات حاصل از هضم آنزیم NcoI برای ژن کالپاستاتین. از M100 به عنوان نشانگر وزنی استفاده شده است.
فراوانیهای ژنی و ژنوتیپی، میانگین شاخص شانون و شاخص هتروزیگوسیتی نئی در جدول 1 آمده است. میزان هتروزیگوسیتی مشاهده شده، هتروزیگوسیتی مورد انتظار، هموزیگوسیتی مشاهده شده و هموزیگوسیتی مورد انتظار نیز به ترتیب 25/0، 33/0، 75/0 و 67/0 به دست آمد. تعادل هاردی وینبرگ با دو آزمون مربع کا و مربع جی برای این ژن مورد آزمایش قرار گرفت. برای محاسبه مربع کا از رابطه زیر استفاده می شود:
که در آن، oi= تعداد مشاهده شده، ei= تعداد مورد انتظار، 1-n= df= درجه آزادی، α-1= درجه اطمینان و n= تعداد نمونه های مورد مقایسه. آماره مربع جی نیز با استفاده از فرمول زیر محاسبه می گردد:
که در آن L0 و L1 به ترتیب برآوردهای حداکثر درست نمایی برای فرضهای صفر (برقراری تعادل) و یک (عدم تعادل) می باشند. هر دو آزمون نشان داد که این جایگاه در جمعیت مورد مطالعه دارای تعادل نیست.
جدول 1- فراوانیهای ژنی و ژنوتیپی، میانگین شاخص شانون و شاخص هتروزیگوسیتی نئی ژن کالپاستاتین برای جمعیت گوسفند سنجابی
فراوانی ژنوتیپی |
فراوانی آللی |
میانگین شاخص شانون |
شاخص هتروزیگوسیتی نئی |
|||
MM |
MN |
NN |
M |
N |
||
67/0 |
25/0 |
08/0 |
79/0 |
21/0 |
51/0 |
33/0 |
بحث و نتیجه گیری
دو آنزیم استفاده شده در این تحقیق، بر اساس جایگاههای برشی آنها مکمل یکدیگر بودند و نتایج همدیگر را تکمیل می کنند، لذا این دو آنزیم برای بررسی تنوع ژنتیکی این ژن و تعیین نقشه ژنی گوسفند با استفاده از داده های جایگاههای صفات کمی (QTL mapping ) مناسب می باشند. با توجه به اینکه این ژن در گوسفندان سنجابی دارای چند شکلی است و چون ژن کالپاستاتین به عنوان یک ژن کاندیدا در رابطه با تردی گوشت و صفات رشد دامها ارائه شده است (6) باید برای صفات مربوط به تردی گوشت اطلاعات لازم را جمع آوری نمود و با کمک آنها پیوستگی آللهای مربوطه را با تردی گوشت محاسبه کرد. در این نژاد فراوانی ژن M و N به ترتیب 79/0 و 21/0 بود که با نتایج افتخار شاهرودی و همکاران (1383) برای گوسفندان قره گل (79/0 و 21/0 برای آلل های M و N به ترتیب) کاملاً مطابقت دارد (1). فراوانیهای به دست آمده در این تحقیق به نتایج نصیری و همکاران (2007) برای نژاد کردی خراسان، که به ترتیب 88/0 و 12/0 بود نیز نزدیک هستند (15). البته آنها ژنوتیپ NN را مشاهده نکردند. این نتایج نشان می دهد که از نظر فراوانیهای آللی به هم شبیه هستند، اما از نظر صفات مربوط به تولید و تردی گوشت باید مورد مطالعه قرار گیرند و علت یابی شوند. از طرف دیگر، مقایسه نتایج این تحقیق با فراوانی دو آلل M و N برای گوسفندان نژاد آرخارمرینو، قزل و دورگهای حاصل از قزل و آرخارمرینو که به ترتیب 48/0 و 52/0، 69/0 و 31/0، و 50/0 و 50/0 بودند نزدیک نیست و نشان دهنده این است که از نظر جایگاه کالپاستاتین این نژادها تفاوت دارند (2). بنابراین، باید نمونه بزرگتری را از این نژادها انتخاب نمود و با ثبت رکوردهای دقیق مربوط به صفات تولیدی و تردی گوشت در این مورد اظهار نظر نمود و به تجزیه و تحلیل نتایج QTL پرداخت و با بررسی ژنوم این نژادها از نظر تکاملی با اطمینان قضاوت نمود که از نظر منشأ چه شباهتها و تفاوتهایی دارند و کدام نژاد یا نژادها بهترین کیفیت و تردی گوشت را دارند. شاخص هتروزیگوسیتی نئی برای گوسفندان سنجابی برابر 33/0 شد که این مقدار برای این جایگاه دو آللی بالا است و بیانگر تنوع ژنتیکی خوبی است، چرا که شاخص هتروزیگوسیتی یکی از شاخصهای مهم در تعیین تنوع ژنتیکی است و همیشه مورد توجه اصلاح گران دام می باشد. لازم به ذکر است که این شاخص برای گوسفندان کردی خراسان 21/0 به دست آمده است (15). جمعیت مورد مطالعه گوسفندان سنجابی در تعادل هاردی-وینبرگ نبود. شرایط برقراری تعادل در جمعیتها شامل بزرگ بودن جمعیت، عدم وجود جهش، انجام نشدن مهاجرت، در کار نبودن انتخاب و انجام آمیزشها به صورت تصادفی است. از آنجا که جمعیت در تعادل نیست باید یک یا چند شرط از شرایط برقراری تعادل برقرار نباشد. در جمعیت گوسفندان مورد مطالعه کارهای گزینش یا انتخاب و اصلاح نژادی انجام می شود و آمیزشها هم آن چنان کنترل شده نیستند و در بعضی گله ها آمیزشهای خویشاوندی ممکن است انجام شده باشد، از طرفی نمونه مورد مطالعه نسبت به کل جمعیت گوسفندان سنجابی کوچک است که می تواند باعث بر هم زدن تعادل شود. به طور کلی، نتایج این تحقیق بیانگر این حقیقت است که روش PCR-RFLP برای مطالعه ژن کالپاستاتین و بررسی ارتباط آن با صفات تولید و تردی گوشت مناسب است و این که این نژاد تنوع بسیار خوبی دارد و با توجه به اهمیت این گوسفند در استان کرمانشاه باید مورد توجه خاص قرار گیرد تا حیوانات از هر سه ژنوتیپ حفظ شوند و هیچیک از سه ژنوتیپ از دست نرود. از آنجا که هنوز مشخص نشده کدام ژنوتیپ باعث بهبود کیفیت و تردی گوشت می شود و رابطه آللی این دو آلل از چه نوعی است نمی توان قضاوت کرد که کدام ژنوتیپ ارزش بهتری دارد، لذا باید با روشهای نوین این دام را کامل مورد بررسی قرار داد و رابطه آللی این جایگاه و چگونگی اثر هر آلل را بر کیفیت گوشت و تردی آن کشف کرد تا بتوان کیفیت و تردی گوشت را افزایش داد بدون اینکه بر کیفیت صفات دیگر آن تأثیر منفی داشته باشد.