شرایط استخراج روی توان آنتی اکسیدانی و ترکیب بیوشیمیایی آرتیمیزیا آفسنطین

ریحانه سریری^1*، حسین غفوری¹ و محمد رضا نقوی²

¹ رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی 

² کرج، دانشگاه تهران، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 24/5/91               تاریخ پذیرش: 25/2/92 

چکیده

اثرات دما و نوع حلال بر روی استخراج ترکیبات بیوشیمیایی و ظرفیت آنتی اکسیدانی Artemisia absinthium مطالعه شدند. تغییر مقدار ترکیبات بیوشیمیایی و ظرفیت آنتی اکسیدانی عصاره­ها در شرایط­ استخراجی متفاوت شامل دما (60-30 درجه سانتی گراد)، حلال (متانول اتانول و استونیتریل) و غلظت­ حلال (100-25 درصد) مطالعه شد. مقادیر کل فنل­ (mg GAE/100 g DW  1033-612) و توتال فلاونوئید (mg CE/100 g DW 392) در نمونه­ها اندازه گیری شد. ظرفیت شکار رادیکالهای آزاد با استفاده از روشهای مختلف، DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (79-51 درصد)، FRAP (ferric reducing antioxidant power) (µM TE /100g DW287-151) و ABTS (2,2-azinobis 3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) (39-17 mM TE/g FM) اندازه گیری گردید. بر اساس نتایج به دست آمده، متانول به عنوان حلال مناسب استخراج انتخاب شد. عصاره های به دست آمده در شرایط متانول 75 درصد و دمای 45 درجه بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی را نشان دادند، در حالی که عصارهای به دست آمده با استفاده از متانول 75 درصد و دمای 60 درجه بالاترین سطح فنل را داشتند. آنالیز نمونه­ها برای ترکیب آرتمیزینین با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (HPLC) انجام شد اما برخلاف برخی مطالعات، این ترکیب در نمونه­ها شناسایی نشد . نتایج HPLC  وجود بیشترین مقدار ترکیب anabsinthin (58/16 میکروگرم در گرم گیاه) را در متانول 75 درصد و  کمترین مقدار ( 45/9 میکروگرم در گرم گیاه ) را درمتانول 25 درصد نشان داد.

واژه های کلیدی :  Artemisia absinthium ، ظرفیت آنتی اکسیدانی، anabsinthin ، آرتمیزینین

* نویسنده مسئول، تلفن: 01333333647 ، پست الکترونیکی: sariri2@yahoo.co.uk

مقدمه

جهت جلوگیری از بسیاری از بیماریها، مصرف غذاهای مشتق از گیاهان بسیار توصیه شده است. برخی از گیاهان دارای آنتی اکسیدان طبیعی به میزان قابل توجه ای هستند و به دنبال مصرف آنها ملاحظه گردیده است ظرفیت آنتی اکسیدانی پلاسما به طور معنی داری افزایش می­یابد. آرتمیزیا یکی از گسترده ترین جنسهای مربوط به خانواده Asteraceae  (Compositae)  با حدود 34 گونه در ایران است. تعداد گونه­های این جنس در دنیا با توجه به منابع مختلف بین 500-250 گونه برآورد شده است که بیشتر در آسیا، اروپا و شمال آمریکا پراکنده است (3و10). با تحقیق در مورد انواع آن در کشور، مشخص شد A. absinthium   یکی از گونه­های پراستفاده این جنس در ایران است که بیشتر در شمال ایران پراکندگی دارد. بر اساس مطالعات صورت گرفته، این گونه از نظر ترکیبات آنتی اکسیدانی بسیار غنی است به طوری که ترکیبی مثل کوئورسیتین به مقدار قابل توجهی در آن شناسایی شده است (4). برخی مطالعات، ویژگی ضد پارازیتی (6) و همچنین توانایی بهبود نارسایهای کبدی آن را گزارش نموده اند (1 و 5). علی رغم وجود روشهای متنوع جهت استخراج ترکیبات فیتوشیمیایی، تا به حال یک روش تکرار پذیر و کامل برای استخراج ترکیبات مختلف از گیاه کمتر گزارش شده است. از طرفی، نتایج بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی در گیاه شدیداً به نوع حلال و شرایط استخراج وابسته است. به همین دلیل حلالهای مختلف از قبیل متانول، استونیتریل، اتیل استات و اتانول برای عصاره گیری و استخراج آنتی اکسیدان­ها و فنلها استفاده می شوند (2،9و10). هدف اول از این تحقیق بررسی اثر تکنیکها و حلالهای مختلف بر میزان استخراج  ترکیبات بیوشیمیایی و آنتی اکسیدانی گیاه A. absinthium بود . همچنین، با توجه به اینکه ترکیب مؤثره گیاه مذکور تا به حال گزارش نشده است، هدف دیگر مطالعه حاضر بررسی میزان ترکیب مؤثره این گونه را با استفاده از روش تجزیه ای کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا HPLC برای اولین بار در کشور بود.

مواد و روشها

نمونه مورد مطالعه برگ گیاه A. absinthium از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه و بعد از آورده شدن به آزمایشگاه تحقیقاتی بیوشیمی در آون خشک شده و تا انجام مراحل استخراج در ظرف درب بسته و در یخچال نگهداری شد. حلالهای مختلف همه با درجه خلوص بالا از مرک تهیه شدند و بدون تغییر مورد استفاده قرار گرفتند. دستگاههای مورد استفاده در دانشگاههای گیلان و تهران موجود بودند.

روش تهیه عصاره گیاهی: نمونه مورد نظر پس از خشک کردن در دمای 40 درجه، با استفاده از آسیاب پودر شده و وزن مشخص از آن در حجم مورد نظر در غلظتهای (25 ،50، 75 و 100 درصد) از حلالها (متانول، استونیتریل و اتانول) در دماهای (30، 45 و60 درجه) وتحت هم زدن مغناطیسی برای 24 ساعت قرار گرفتند. به از این مدت با استفاده از کاغذ صافی وایتمن شماره 4 صاف گردیدند و تا زمان استفاده در دمای 4 درجه نگهداری شدند.

سنجش مقدار فنل تام (TPC): سنجش مقدار فنل تام  با

استفاده از معرف Folin-Ciocalteu  انجام شد و منحنی استاندارد با غلظتهای مختلف اسید گالیک (100-5 میلی گرم بر لیتر) رسم گردید. جذبها در طول موج 765 نانومتر قرائت شد و نتایج بر حسب میلی گرم معادل اسید گالیک در صد گرم وزن خشک گیاه بیان گردید (9)

سنجش مقدار فلاونوئید تام (TFC): سنجش مقدار فلاونوئید تام با استفاده از کلرید آلومینیوم انجام گرفت. مخلوط واکنش شامل 300 میکرولیتر عصاره رقیق شده، 6/1 میلی لیتر آب و 100 میکرولیتر نیتریت سدیم 5 درصد بود. بعد از 6 دقیقه، 150 میکرولیتر آلومینیوم کلراید 10 درصد اضافه گردیده و در ادامه بعد از 5 دقیقه 6/0 میلی لیتر هیدروکسید سدیم 1 مولار و 250 میکرولیتر آب اضافه شد و با ورتکس به طور کامل مخلوط گردید. جذب مخلوط بلافاصله در طول موج 510 نانومتر قرائت شد. نتایج بر حسب میلی گرم معادل کاتچین در صد گرم وزن خشک گیاه بیان گردید (10)

تست DPPH: در این روش فعالیت نمونه برای پاکسازی رادیکال DPPH سنجش می شود. اساس عمل کاهش محلول الکلی DPPH در حضور آنتی­اکسیدان­های دهنده هیدروژن، مخصوصاً ترکیبات فنلی می باشد. جهت دستیابی به IC₅₀    نمونه ها، 4 غلظت مختلف از عصاره ها تهیه شد و برای رسم نمودار، درصد مهارکنندگی بر علیه غلظت استفاده گردید. در عمل 300 میکرولیتر DPPH  ا مولار با 100 میکرولیتر نمونه رقیق شده ترکیب و با استفاده از متانول به حجم نهایی 2 میلی لیتر رسانیده شد. بعد از نیم ساعت قرار گرفتن در تاریکی، جذب در طول موج 517 نانومتر قرائت شد و با استفاده از فرمول زیر در صد مهارکنندگی به دست آمد (10)

DPPH درصد مهار = ( A_DPPH -A_Sample/ A_DPPH )*100

A_DPPH:  جذب DPPH در عدم حضور نمونه

A_Sample:  جذب DPPH در حضور نمونه

تست FRAP: روش FRAP  با استفاده از TPTZ (2, 4, 6- tripyridyl-s-triazine) انجام گرفت. اساس این روش احیای آهن فریک به فروس (Fe³⁺-TPTZ به  Fe²⁺-TPTZ) در حضور آنتی اکسیدان است. محلول FRAP به ترتیب محتوی بافر استات 0.3 مولار (pH 3.6) ، محلول TPTZ  10 میلی مولار در HCl 40 میلی مولار  و 20 میلی مولار محلول کلرید آهن (III) با نسبتهای 10-1-1 می باشد. محلول FRAP باید بصورت تازه تهیه شود. در این روش 100 میکرولیتر عصاره رقیق شده با 1/4 میلی لیتر محلول FRAP مخلوط شده و بعد از 20 دقیقه جذب در طول موج 593 نانومتر قرائت می شود  (7)

تست ABTS : در این روش ابتدا محلول ABTS با غلظت 7 میلی مولار تهیه شد، به این محلول پرسولفات پتاسیم اضافه گردید محلول حاصل به مدت یک شب در تاریکی و دمای اتاق قرار داده شد. 20 میکرولیتر از نمونه­ها با 1480 میکرولیتر رادیکال ABTS  مخلوط گردید و جذب در طول موج 734 نانومتر قرائت شد (7)

کروماتوگرافی لایه نازک (TLC): الگوی فنلی عصاره های متانولی با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک بررسی شد. در این روش 10 میکرولیتر نمونه بر روی صفحات RP-C18 لکه گذاری شد. فاز متحرک شامل نسبتهای ثابتی از متانول، آب، استونیتریل و اسید استیک (20، 11، 5/1 و 5/0 ) می باشد. بعد از اتمام جداسازی و خشک شدن صفحه TLC الگوی باندها در UV_254nm   مشاهده شد

آنالیز HPLC : گیاه  A. absinthium برای بررسی وجود ترکیب آرتمیزینین با استفاده از روشRP-HPLC  (فاز معکوس) آنالیز گردید. داروهای مشتق از آرتمیزینین یکی از مهم ترین داروها در ارتباط با درمان مالاریا  معرفی می شوند. این ترکیب در طول موج 203 نانومتر جذب دارد اما با توجه به مشکلات کار کردن در این طول موج، عمل مشتق سازی جهت بالا بردن جذب بیشنه  بر روی این ترکیب صورت گرفت  با استفاده از RP-HPLC و در طول موج 258 نانومتر  آنالیز ترکیب انجام پذیرفت. در این روش از HPLC Agilent 1200 با ستون C-18 به عنوان فاز ثابت و از استونیتریل و آب به عنوان فاز متحرک استفاده شد. سرعت جریان برابر یک میلی لیتر بر دقیقه تنظیم شد. ترکیب Anabsinthin نیز با استفاده از این روش آنالیز گردید.

در تمامی تستها، به منظور بررسی تفاوت آماری بین شرایط های مختلف از تجزیه واریانس یک طرفه (One way ANOVA) استفاده گردید، همچنین به منظور مقایسه میانگین از آزمون مقایسه Tukey استفاده شد.

نتایج

نتایج تحقیق حاضر نشان دادند که مقدار قطبیت حلال نقش بسیار مهمی در استخراج ترکیبات بیوشیمیایی و آنتی اکسیدانی از منابع طبیعی دارد. برای همه حلالهای بررسی شده مشخص گردید که افزایش دمای استخراج از 30 به 60 باعث افزایش استخراج مقدار فنل کل و فلاونوئید کل می شود که با مطالعات قبلی همخوانی دارد در صورتی که ظرفیت آنتی اکسیدانی با افزایش دما نتایج متفاوتی نشان می دهد. در اغلب موارد افزایش دما (60 درجه) موجب کاهش ظرفیت آنتی اکسیداتی می شود و بر اساس نتایج به دست آمده دمای 45 درجه دمای مناسب برای فعالیتهای آنتی اکسیدانی می باشد (شکل 1).

شکل 1- اثر دمای استخراج (45،30 و 60) در تستهای TPC، TFC، FRAP ، DPPH  و ABTS ( متانول 75 درصد) (نتایج در 100 گرم گیاه خشک بوده و به منظور مقایسه میانگین از آزمون مقایسه

Tukey استفاده شد).

بر اساس نتایج به دست آمده در شکل 2 متانول نسبت به استونیتریل و اتانول، حلال مناسبتری در استخراج بیشتر ترکیبات معرفی شد و به همین دلیل بررسی تأثیر دماهای مختلف بر استخراج فقط بر روی متانول انجام گرفت.

شکل2- اثر حلالهای استخراج بر میزان ترکیبات فنولی و ظرفیت آنتی اکسیدانی در دمای 45 درجه (1- متانول 75 درصد، 2- اتانول 75 درصد و 3- استونیتریل 75 درصد) در تستهای TPC، TFC، FRAP ، DPPH و ABTS (نتایج در 100 گرم گیاه خشک بوده و به منظور مقایسه میانگین از آزمون مقایسه Tukey استفاده شد).

بر اساس شکل 3، بالاترین و پایین ترین مقدار آنتی اکسیدانی در تست DPPH به ترتیب در متانول 75 و 25 درصد به دست آمد، در صورتی که در تست FRAP بالاترین مقدار آنتی اکسیدانی در متانول 100 درصد حاصل شد (شکل 3). بطور کلی در این مطالعه ارتباط منطقی بین مقدار فنل کل، فلاونوئیدها و ظرفیت آنتی اکسیدانی مشاهده نشد.

نتایج TLC نشان دادند که حلال استخراج، اثر معنی داری بر مقدار محتوی فنلی عصاره دارد به طوری که بیشترین مقدار در متانول 75 درصد و کمترین مقدار آن در متانول 25 درصد مشاهده گردید (شکل 4).

شکل 3-  اثر  غلظتهای مختلف متانول (1- متانول 100 درصد، 2- متانول 25 درصد، 3- استونیتریل 50 درصد و 4- متانول 75 درصد) در تستهای TPC، TFC، FRAP ،  DPPHو ABTS (A: C°30، B: C° 45، C: C°60) (نتایج در 100 گرم گیاه خشک بوده و به منظور مقایسه میانگین از آزمون مقایسه Tukey استفاده شد).

شکل 4- اثر حلالهای استخراج بر الگوی TLC در دمای 45 ºC (1- متانول 75 درصد، 2- متانول 50 درصد، 3- استونیتریل 75 درصد ،4- متانول 25 درصد و 5- متانول 100 درصد).

یکی از نتایح بسیار جالب توجه این مطالعه عدم شناسایی ترکیب آرتمیزینین در گونه آرتمیزیای مطالعه شده است. بر اساس نتایج HPLC  به دست آمده، هیچ کدام از عصاره ها حاوی ترکیب آرتمیزینین نبودند. این نتایج مخالف با تحقیقاتی بودند که وجود ماده مذکور را گزارش نموده بودند (8 و 12) بود. در ارتباط با آنالیز ترکیب Anabsinthin با HPLC و بر اساس نتایج به دست آمده در متانول 75 درصد مقدار Anabsinthin بالاترین (58/16 µg/g DW) و در متانول 25 درصد پایین ترین (45/9 µg/g DW) مشخص گردید (شکل 5).

شکل 5- اثر حلالهای استخراج بر میزان ترکیب anabsinthin در دمای 45 ºC (A- متانول 100 درصد، B- متانول 75 درصد، C- متانول 50

درصد ،D- متانول 25 درصد و E- استونیتریل 75 درصد).