Document Type : Research Paper
Author
Abstract
In plants many genes have been identified with a significant role in the control of flowering pathway. Most of these genes belong to a large family of MADS-box transcription factors. Crocus sativus is a triploid sterile plant characterized by its long red stigmas having commercial value. Understanding flower development in this plant can be useful in increasing yield and reducing production cost. In the present study, the expression pattern of two classes of MADS-box genes (Ag1 and Sep3) involved in flower formation was analyzed in both flower parts and vegetative organs by semi quantitative RT-PCR. Based on the analysis, two C classes of MADS-box genes including Ag1a and Ag1b were expressed in three sexual organs including ovary, stigma and stamens. These two genes showed higher expression in saffron stigma and stamens compared to ovary. Expression level of Ag1a and Ag1b genes was low in petal, leaf, corn and root organs. The expression of Sep3a, Sep3b, Sep3c and Sep3d genes from class E of MADS-box family detected in petal, stamen, stigma and ovary while it was not detectable in vegetative organs including corn and root by semi quantitative RT-PCR.
Keywords
Main Subjects
بررسی بیان ژنهای عوامل رونویسی MADS-box موثر در تشکیل گل در زعفران (Crocus sativus L.)
سونیا جدیر و فاطمه دهقان نیری*
قزوین، دانشگاه بینالمللی امام خمینی(ره)، دانشکده فنی و مهندسی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی
تاریخ دریافت: 13/9/93 تاریخ پذیرش: 23/12/93
چکیده
بسیاری از ژنهای کنترل کننده گلدهی در گیاهان شناسایی شدهاند که بیشتر آنها متعلق به خانواده بزرگ عوامل رونویسی MADS-box هستند. گیاه زعفران (Crocus sativus) یک گیاه تریپلوئید نرعقیم و ارزشمند است که به منظور استفاده از گل و به ویژه کلاله آن کشت میشود. درک چگونگی تشکیل گل در گیاه زعفران به افزایش عملکرد و کاهش هزینههای تولید آن کمک زیادی میکند. در این تحقیق بیان ژنهای دو گروه Ag1 و Sep3 از خانواده MADS-box که در تشکیل گل به ویژه در شکلگیری کلاله نقش دارند با روش PCR نیمه کمی (semi quantitative RT-PCR) در زعفران واریته ایرانی بررسی شد و میزان بیان این ژنها در کلاله و سایر اندامهای گل و نیز اندامهای رویشی مورد مقایسه قرار گرفت. ژنهای Ag1a و Ag1b از کلاس C خانوادهMADS-box در سه اندام جنسی تخمدان، کلاله و پرچم بیان شدند به طوری که میزان بیان آنها در اندامهای کلاله و پرچم نسبت به تخمدان بیشتر بود. بیان این ژنها در اندامهای گلبرگ، برگ، پیاز و ریشه در مقایسه با کلاله و پرچم پایین بود. بیان ژنهای Sep3a، Sep3b، Sep3c و Sep3d از کلاس E این خانواده ژنی در چهار اندام گلبرگ، پرچم، کلاله و تخمدان تعیین شد در صورتی که میزان بیان با روش PCR نیمه کمی در اندامهای رویشی برگ، پیاز و ریشه تعیین نگردید.
واژههای کلیدی: بیان ژن، زعفران، عوامل رونویسی MADS-box، روش PCR نیمه کمی.
* نویسنده مسئول، تلفن: 02833901157، پست الکترونیکی: nayeri@eng.ikiu.ac.ir
مقدمه
مطالعه جهشهای هومئوتیک (Homeotic) گل منجر به شناسایی بسیاری از ژنهای کنترل کننده فرآیند تکامل گل شده است (12 و 34). اغلب این ژنها متعلق به خانواده بزرگ عوامل رونویسی MADS-box هستند (35). عوامل MADS-box علاوه بر گیاهان در مخمر و جانوران نیز وجود دارند و نقش مهمی در کنترل فرآیندهای مهم به ویژه تمایز ایفاء میکنند به طور مثال، در جانوران سبب تمایز بافت ماهیچه میشوند (40). ژنهای MADS-box علاوه بر تعیین نوع اندام گل و تکامل آن در گیاه، در فعالیتهای تنظیمی مثل تعیین نوع مریستم، توسعه جانبی ریشه و کنترل زمان گلدهی نیز دخالت دارند (25، 26 و 46). برای درک چگونگی تکامل و نمو گل مطالعه فعالیت و برهمکنش ژنهای MADS-box با سایر عوامل رونویسی در تنظیم بیان ژنهای دخیل در گلدهی ضروری است (16 و 17). در اوایل دهه 1990 میرز و کوئن براساس مطالعات مورفولوژیکی و ژنتیکی جهشهای هومئوتیک گل در دو گیاه آرابیدوپسیس و آنتوریوم مدلی برای تکامل و تمایز اندامهای گل پیشنهاد کردند. این مدل بعدها به عنوان مدل ABC شناخته شد و به دلیل سادگی و قابل اجرا بودن به طور گسترده برای بسیاری از گونههای نهاندانگان مورد توجه قرار گرفت (42). گل آرابیدوپسیس مانند بسیاری از گونههای نهاندانگان شامل چهار نوع اندام است که در چهار محور متحدالمرکز سازماندهی شدهاند. در محور شماره 1 (خارجیترین محور) کاسبرگها، در محور شماره 2 گلبرگها، در محور شماره 3 پرچمها و در محور شماره 4 که داخلیترین محور است مادگی قرار دارد (8 و 10). مطالعه ژنتیکی جهشهای هومئوتیک که سبب اختلال در فرآیند تکامل گل و تغییر هومئوتیک یک اندام به اندام دیگر میشود منجر به ارائه مدل ABC شد (13). این جهشها در سه کلاس A، B و C گروهبندی میشوند. در جهشهای کلاس A که شامل جهش در ژنهای Ap1 و Ap2 هستند نقص اندام در محورهای 1 و 2 باعث جایگزینی مادگی در محور اول به جای کاسبرگها میشود و در محور دوم به جای گلبرگ، پرچمها توسعه مییابند. در جهش ژن Ap2 علاوه بر نقص اندام، نوعی نقص در تعیین مریستم گل نیز به وجود میآید و بخشی از مریستم گل به شاخه تبدیل میشود. جهشهای کلاس B (جهش در ژنهای Pi و Ap3) منجر به توسعه کاسبرگ به جای گلبرگ در محور 2 و تبدیل مادگی به پرچم در محور 3 میشود. جهش در کلاس C (جهش در ژن Ag) سبب نقص اندام در محورهای 3 و 4 میشود به طوری که در محور 3 گلبرگها و در حلقه 4 کاسبرگها توسعه مییابند. براساس مدل ABC، ژنهای کلاس A، B و C در دو محور مجاور فعالیت دارند و فعالیت هر یک از آنها به تنهایی و یا به صورت ترکیبی در هر محور گل نوع اندام را تعیین میکند. در محور اول فعالیت ژنهای کلاس A به تنهایی سبب تشکیل کاسبرگها میشود. بیان همزمان ژنهای کلاس A و B گلبرگها را در محور دوم ایجاد میکند. در محور سوم پرچمها از فعالیت مشترک ژنهای کلاس B و C به وجود میآیند و سرانجام مادگی در محور چهارم نتیجه بیان ژنهای کلاس C به تنهایی است (7 و 9).
مدل ABC فنوتیپ اندامهای گل را در بسیاری از جهشهای منفرد، دوگانه و سهگانه پیشبینی میکند اما در جهشهای سهگانهای که همه ژنهای کلاسهای A، B و C غیرفعال شدهاند مدل نمیتواند نوع اندامی را که در هر محور توسعه مییابد پیشبینی نماید. ممکن است فرض شود که اگر همه ژنهای کلاسهای A، B و C مورد نیاز برای تعیین نوع اندام گل حذف شوند، اندام حاصل برگ است. اما واقعیت این است که در جهشهای سهگانه نوع اندامی که به وجود میآید دارای ظاهری مشابه با برگ و مادگی است. بنابراین باید ژنهای دیگری وجود داشته باشند که در عدم حضور ژنهای کلاس C سبب ظهور مادگی شدهاند (6 و 9). از سوی دیگر بیان نابهجای ژنهای ABC به طور مثال ژنهای کلاس B (25) و یا ژنهای کلاس C (11، 14، 15و 31) تغییری را در اندامهای رویشی ایجاد نکرد. این یافتهها نشان میدهد که ژنهای ABC برای تشکیل اندامهای گل ضروری هستند اما کافی نیستند و این ژنها تنها میتوانند در بافتهای گل که از پیش تثبیت شدهاند دارای فعالیت باشند. به خوبی مشخص شده است که عوامل رونویسی MADS-box از طریق تشکیل ساختارهای همودایمر و یا هترودایمر به DNA متصل میشوند (38). بنابراین این فرضیه پیش آمد که فعالیت ترکیبی عوامل رونویسی MADS-box جهت تعیین نوع اندام از طریق تشکیل ساختارهای پیچیده صورت میگیرد. به طور مثال در تشکیل پرچم برهمکنش میان عوامل کلاس B و C و ایجاد ساختارهای دایمر مکانیسمی را برای اتصالهای مختلف با DNA فراهم میکند. اما شواهد نشان داد که پروتئینهای کلاس B به طور مستقیم هیچ برهمکنشی با سایر عوامل ABC ندارند و تنها به یکدیگر متصل میشوند (16 و 37). برای اولین بار عوامل موثر بر فعالیت ژنهای ABC شامل ژنهای Fbp2 و Tm5 بترتیب در گونههای اطلسی و گوجهفرنگی شناسایی شدند (20). غیرفعال کردن این ژنها منجر به فنوتیپی مشابه فنوتیپ جهش یافتههای کلاسهای B و C شد (4، 5، 16 و 34). سپس سه ژن Sep1، Sep2 و Sep3 از گیاه آرابیدوپسیس جداسازی شدند. در هیچ یک از جهشهای منفرد و دوگانه این ژنها فنوتیپ قابل توجهی مشاهده نشد در حالیکه جهش سهگانه در ژنهای Sep1، Sep2 و Sep3 فنوتیپی مشابه لاینهای Tm5 و Fbp2 نشان میداد که در تمام محورها کاسبرگ تشکیل شده بود (5 و 35). این فنوتیپها که یادآور جهشهای دوگانه C و B (Pi , Ag) و (Ap3, Ag) بودند نشان دادند که اولا این گروه از ژنها برای فعالیت کلاسهای B و C ضروری هستند و جهش یک یا دو ژن Sep بر نوع اندام گل اثری ندارد اما حذف به طور همزمان هر سه ژن Sep نقص چشمگیری را در نوع اندام گل ایجاد میکند. با وجود این بعید بنظر میرسد که بیان ژنهایSep به طور کامل بیتأثیر باشد. اگر این ژنها یکی باشند هیچ مزیت انتخابی در حفظ کپیهای این سه ژن وجود ندارد در حالیکه آنالیزهای تکاملی نشان میدهد که ژنهای Sep برای میلیونها سال در گیاهان حفظ شدهاند (20). از طرفی الگوی بیان Sep3 در مقایسه با Sep1 و Sep2 متفاوت است. ژنهای Sep1 و Sep2 در مراحل اولیه تکامل گل و در همه محورها بیان میشوند (21 و 36). اما Sep3 تنها در محورهای دوم، سوم و چهارم بیان میشود (29). بررسی بیان این ژنها و نیز ژنهای مرتبط از گیاه آنتوریوم (ژنهای Defh200 وDerh72 ) (17 و 39) این نکته را آشکار کرد که این ژنها بعد از بیان ژنهای تعیین کننده مریستم گل و پیش از بیان ژنهای ABC تعیین کننده نوع اندام هستند. این یافتهها نقش این ژنها را در ایجاد بافت اولیه گل به خوبی مشخص میکند. قبلاً این گروه ژنها به عنوان ژنهای حدواسط MADS نامیده میشدند اما اکنون در همراهی با نامگذاری مدل ABC به عنوان ژنهای کلاس E شناخته میشوند. براساس مطالعاتی که روی پروتئینها صورت گرفته است پروتئینهای کلاس E به طور مستقیم با پروتئینهای کلاس C برهمکنش دارند (16، 19 و 22). پروتئینهای Sep با هترودایمرهای کلاس B برهمکنش دارند و نیز در حضور Sep3 میان هترودایمر Pi-Ap3 و پروتئین Ag برهمکنش صورت میگیرد (24). این نتایج آشکار میکند که مدل ترکیبی ABC برای واکنش میان پروتئینهای تعیین کننده نوع اندام به حضور پروتئینهای Sep به عنوان حدواسط نیاز دارد. به نظر میرسد که پروتئینهای Sep نه تنها سبب ایجاد کمپلکسهای پیچیده میان پروتئینهای ABC طی دوره تکامل گل میشوند بلکه در بسیاری دیگر از فرآیندهای تنظیمی گیاه که توسط پروتئینهای MADS-box کنترل میشوند نیز نقش دارند (42).
آنچه در بالا ذکر شد مکانیسم تکامل گل در گیاهان دولپهای بود. ساختمان گل در گیاهان تکلپهای با گیاهان دولپهای تفاوت دارد و از این رو تکامل گل در گیاهان تکلپهای با مدل ABC در گیاهان دولپهای متفاوت است. در گیاهان تکلپهای به طور مثال در خانواده لیلیاسه مانند گیاهان دولپهای دو محور داخلی شامل پرچم ومادگی است اما برخلاف گیاهان دولپهای در گیاهان تکلپهای پوشش گل تنها شامل یک نوع اندام است که در دو محور مجزا قرار گرفتهاند. در این گونهها در محورهای اول و دوم بجای کاسبرگ و گلبرگ، اندامهای گلبرگ مانند وجود دارد. علت این امر دخالت ژنهای کلاس B در حلقه دوم است (28).
ژنهای خانواده MADS-box عوامل رونویسی را رمز می کنند که در فرآیندهای گوناگون در یوکاریوتها نقش دارند. در گیاهان این ژنها در تکامل گل و میوه دخالت دارند (6). براساس منشاء تکاملی، عوامل رونویسی MADS-box به دو گروه I و گروه II تقسیم میشوند. ژنهای گروه II بیشتر مورد مطالعه قرار گرفتهاند و تنظیم کنندههای کلیدی در فرآیندهای تکاملی مانند تعیین نوع مریستم، زمان گلدهی و تکامل میوه و بذر هستند، در مقابل ژنهای گروه I خیلی شناخته شده نیستند. گروه II دارای 4 دامین و گروه I تنها دارای 1 دامین حفاظت شده هستند (32 و 41).
ساختار عوامل رونویسی MADS-box. عوامل گروه I دارای1 دامین و عوامل گروه II دارای 4 دامین هستند.
تسافتاریس و همکاران (2004) بیان 3 ژن همولوگ Ap1 را در گیاه زعفران واریته یونانی بررسی و آنها را به صورت CsAp1a، CsAp1b و CsAp1c نامگذاری کردند. این ژنها اولین ژنهای MADS-Box بودند که در گیاه زعفران شناسایی شدند. توالی اسیدآمینهای این 3 ژن همولوژی بالایی را با عوامل رونویسی MADS-Box به ویژه خانواده Ap1-like نشان دادند. تمامی توالیهای جدا شده فاقد موتیف CAAX بودند. این موتیف در پروتئینهای Ap1 گیاهان تکلپهای برخلاف گیاهان دولپهای وجود ندارد. آنالیز فیلوژنی ژنهای جداسازی شده در سطح اسیدهای آمینه نشان داد که آنها دارای اجداد مشترکی با ژنهای Ap1 گیاهان تکلپهای ذرت، جو و برنج هستند (46).
تسافتاریس و همکاران (2011) همسانهسازی چهار ژن از کلاس E خانواده MADS-Box با نامهای Sep3a، Sep3b، Sep3c و Sep3c-as را گزارش کردند. نتایج توالییابی نشان داد که توالی Sep3c-as محصول پردازش ژن Sep3c است. نتایج بررسی خویشاوندی نشان داد که این توالیها بسیار مشابه با توالیهای Sep3-like جدا شده از سایر گیاهان تکلپهای هستند. هر چهار توالی به طور قوی در تمام اندامهای گل بیان شدند. تسافتاریس و همکاران اظهار داشتند که بیان ژنهای Sep3-like به همراه ژنهای کلاس A و کلاس B اولا تشکیل گلبرگ بجای کاسبرگ در محور اول و ثانیاً توسعه مدل تکامل گل را از ABC به ABCE توضیح میدهد. از سوی دیگر بیان ژنهای کلاس C به همراه ژنهای کلاس E و B در اندام مادگی نشان داد که برای یافتن نقش این ژنها در تشکیل مادگی باید آزمایشات بیشتری صورت گیرد (43).
زعفران (Crocus sativus) گیاهی تک لپه و تریپلوئید از خانواده زنبقیان (Iridaceae) و دارای گلهایی با ارزش اقتصادی بالاست. کلاله قرمز رنگ آن با نام تجاری زعفران یک افزودنی محبوب در صنایع غذایی با خواص دارویی به شمار میرود که دارای رایحه و رنگ جذابی است. گل زعفران دوجنسی و عقیم است. پوشش گل در این گیاه شامل 6 قسمت گلبرگ مانند است که 3 گلبرگ در محور اول (گلبرگهای خارجی) و 3 گلبرگ در محور دوم (گلبرگهای داخلی) قرار دارند. نرینگی شامل 3 پرچم مجزا است و مادگی آن از یک تخمدان که در وسط قرار گرفته تشکیل شده است. از قسمت تخمدان خامه باریک و بلندی خارج میشود که در انتها به کلاله بوقی شکل ختم میشود (41). درک چگونگی رشد گل در گیاه زعفران به افزایش عملکرد و کاهش هزینههای تولید گل به ویژه کلاله کمک به سزایی خواهد کرد. در این مطالعه بیان ژنهایی از خانواده MADS-box که در تشکیل گل بویژه کلاله نقش دارند مورد بررسی قرار گرفت و میزان بیان آنها با یکدیگر در کلاله و سایر اندامهای گل و اندامهای رویشی مقایسه شد.
مواد و روشها
مواد گیاهی مورد استفاده در این تحقیق شامل اندامهای تخمدان،کلاله، پرچم، گلبرگ، برگ، پیاز و ریشه گیاه زعفران بود. پس از برداشت گلها از منطقه قائنات استان خراسان، اندامهای ذکر شده توزین و درون ورقههای آلومینیومی پیچیده شدند. نمونههای آماده شده فورا" درون ازت مایع تثبیت و در دمای 80- درجه سانتیگراد تا زمان استخراج RNA نگهداری شدند.
استخراج RNA: استخراج RNA از 7 اندام رویشی و زایشی گیاه زعفران شامل ریشه، پیاز، برگ، گلبرگ، پرچم،کلاله و تخمدان با کیت استخراج RNA (ساخت شرکت سیناکلون ((RNXTM – PLUS) صورت گرفت.
واکنش نسخهبرداری معکوس (سنتز cDNA): سنتز cDNA با استفاده از 1 میکروگرم از RNA کل با استفاده از Oligo dT به عنوان آغازگر عمومی توسط آنزیم ترانسکریپتازمعکوس با نام تجاری M-MuLV Reverse Transcriptase Rnase H صورت گرفت. برای انجام روش PCR نیمه کمی، غلظت cDNA نمونههای حاصل از واکنش نسخهبرداری معکوس با اسپکتروفتومتری تعیین شد و سپس جهت انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز از هر یک از نمونهها استوک کاری با غلظت µg/µl1 تهیه شد.
واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR): در این تحقیق از روش PCR نیمه کمی جهت بررسی بیان ژنهای مورد نظر استفاده شد. برای این منظور ابتدا با استفاده از یک جفت آغازگر ژن18S rRNA به عنوان ژن خانهدار شرایط انجام واکنش بهینه شد. ژن 18S rRNA براساس منابع موجود از گیاه زعفران انتخاب شد (3). سپس واکنش زنجیرهای پلیمراز برای 6 ژن اختصاصی شامل Ag1a و Ag1b از ژنهای کلاس C و Sep3a، Sep3b، Sep3c و Sep3d از ژنهای کلاس E صورت گرفت. آغازگرهای اختصاصی ژن با استفاده از توالیهای موجود ژنها در پایگاه NCBI (EU424140.1، EU424139.1، EU424138.1، EU424137.1، AY555580.1، AY555579.1) بوسیله نرمافزار Oligo 5 (http://www.oligo.net) و با در نظر گرفتن همه پارامترهای لازم طراحی شدند. درستی آغازگرهای طراحی شده از لحاظ عدم اتصال غیراختصاصی و تشکیل دایمر آغازگرها، با استفاده ازPrimer Blast مورد تایید قرار گرفت (جدول 1). شرایط انجام واکنش PCR نیمه کمی به این شرح بود: واسرشتگی اولیه 3 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد، 35 چرخه شامل واسرشتگی بمدت 1 دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد، اتصال بمدت 1 دقیقه در دمای بهینه شده برای هر آغازگر، گسترش بمدت 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد و گسترش نهایی بمدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد.
جدول 1- مشخصات آغازگرهای مورد استفاده برای ژنهای MADS-Box گیاه زعفران. در این جدول F و R به ترتیب نشان دهنده آغازگرهای Forward (رفت) و Reverse (برگشت) هستند.
%GC |
دمای اتصال (ºC) |
طول قطعه |
توالی '5 به '3 آغازگرها |
آغازگرها |
|
60 |
60 |
681 |
'-AACGGATCCATGGGGAgGGGGAAgATCG-3'5 |
Ag1a F |
|
|
60 |
'5'-TGCGGATCCTTACCCTAgTTGGAgGGCAgTC-3 |
Ag1a R |
||
57 |
60 |
686 |
'-TAgGATCCATGGGGAgGGGGAAgATCG-3'5 |
Ag1b F |
|
55 |
60 |
'-CGCGGATCCCTACACAAAACCTAgTTGGAg-3'5 |
Ag1b R |
||
57 |
58 |
716 |
'-ATGGGATCCATGGGGAgAgGAAgAgTCGAg-3'5 |
Sep3a F |
|
51 |
58 |
'-ATCGGATCCTCATTGCAACCATCCAgGCA-3'5 |
Sep3aR |
||
59 |
58 |
719 |
'-AAgGGATCCATGGGGAgAgGGAgAgTCGAg-3'5 |
Sep3bF |
|
55 |
58 |
'-GTCGGATCCTCATTGCAACCATCCAgGCA-3'5 |
Sep3bR |
||
60 |
58 |
724 |
'-ACCGGATCCATGGGTAgAgGGAgAgTCGAgC-3'5 |
Sep3cF |
|
59 |
58 |
'-ACGGGATCCTCATGGGAACCATCCTGGAg-3'5 |
Sep3cR |
||
57 |
58 |
720 |
'-ATCGGATCCATGGGTAgAgGGAgAgTCGAg-3'5 |
Sep3dF |
|
55 |
58 |
'-ATCGGATCCTCATGGGAACCATCCTGGAg-3'5 |
Sep3dR |
||
50 |
56 |
703 |
5'-TTCAATCCGTAGGAGCGACA-3' |
18srnaF |
|
52 |
56 |
5'-CGAACGAGACCTCAGTCTGCTAA-3' |
18srnaR |
||
بررسی بیان ژنها: در بررسی بیان هر ژن به ازای هر نمونه، واکنش زنجیرهای پلیمراز 3 بار تکرار شد. پس از انجام این واکنش مقدار µl 5 محصول واکنش روی ژل 2/1 درصد آگارز الکتروفورز و سپس به وسیله نرمافزار v 1.42q ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html) شدت باند موجود روی ژل آنالیز شد. این نرمافزار قادر است شدت نسبی باند موجود روی ژل را اندازهگیری کند و به صورت عدد نمایش دهد. در نهایت آنالیز آماری دادههای حاصل و رسم نمودارها با نرمافزارهای SPSS v 15(www.spss.com) و Excel انجام شد.
نتایج
بررسی بیان ژنهای کلاس C : ژنهای Ag1a و Ag1b از کلاس C خانواده MADS-box به ترتیب دارای طول 1078 و 1127 جفت باز هستند. مقایسه میانگین دادههای مربوط به بیان ژن Ag1a در اندامهای مختلف گیاه زعفران نشان داد که اختلاف بین اندامها در سطح 1 درصد معنیدار شد. آنالیزهای آماری، شدت باند Ag1a در اندامهای مختلف زعفران را در دو سطح کاملاً متفاوت قرار میدهد به طوری که شدت باند در اندامهای کلاله و پرچم خیلی زیاد است در حالیکه در اندامهای تخمدان، گلبرگ، برگ، پیاز و ریشه در مقایسه با کلاله و پرچم پایین است. از سوی دیگر همان گونه که در شکل1 نشان داده شده است ژن Ag1a در اندامهای کلاله، پرچم و تخمدان بیان شده است، با این تفاوت که میزان بیان آن در اندامهای کلاله و پرچم نسبت به تخمدان بیشتر است.
اختلاف میانگین بیان ژن Ag1b در اندامهای مختلف گیاه زعفران در سطح 1 درصد معنیدار بود. براساس آنالیزهای آماری شدت باند ژن Ag1b بدست آمده در اندامهای مختلف گیاه زعفران نیز مانند ژن Ag1a در دو سطح متفاوت قرار میگیرد و در اندامهای کلاله و پرچم نسبت به سایر اندامها اختلاف معنیداری دارد. با وجود این، شکل1 نشان میدهد که این ژن در اندامهای تخمدان، کلاله و پرچم بیان میشود، البته با این تفاوت که میزان بیان آن در اندامهای کلاله و پرچم نسبت به تخمدان بیشتر است.
بررسی بیان ژنهای کلاس E: ژنهای Sep3a، Sep3b، Sep3c و Sep3d متعلق به کلاس E خانواده MADS-box هستند. طول این ژنها به ترتیب 1110، 1157، 1070 و 1059 جفت باز است. مقایسه میانگین بیان ژن Sep3a در اندامهای مختلف گیاه زعفران معنیدار شد.
شکل1- بیان ژنهایAg1a و Ag1b در اندامهای مختلف زعفران. این ژنها در اندامهای تخمدان و به ویژه در کلاله و پرچم بیان بالایی دارند ولی در اندامهای رویشی (برگ، پیاز و ریشه) بیان نمیشوند یا بیان بسیار کمی دارند. شکل پایین بیان ژن18S rRNA را نشان میدهد که در همه اندامها به یک میزان بیان شده است. طول قطعه مربوط به ژن Ag1b 681، ژن Ag1a 686 و ژن 18S rRNA 703 جفت باز است.
آنالیزهای آماری بیشترین میزان شدت باند را در اندامهای گلبرگ و پرچم و سپس در اندامهای تخمدان و کلاله نشان داد. شکل2 تفاوت در میزان بیان Sep3a را در اندامهای مختلف گیاه زعفران نشان میدهد، این ژن در اندامهای گل شامل تخمدان، کلاله، پرچم و گلبرگها بیان میشود ولی در اندامهای رویشی برگ، ریشه و پیاز بیان نمیشود. مقایسه میانگین بیان ژنSep3b در اندامهای مختلف زعفران در سطح 1 درصد معنیدار بود. بیشترین میزان شدت باند در اندامهای کلاله، پرچم، گلبرگ و سپس در اندام تخمدان مشاهده شد. همانطور که در شکل2 نشان داده شده است این ژن در اندامهای برگ، ریشه و پیاز بیان نمیشود.
اختلاف میانگین بیان ژن Sep3c در اندامهای مختلف گیاه زعفران در سطح 1 درصد معنیدار شد. آنالیزهای آماری شدت باند در اندامهای مختلف گیاه زعفران را در 2 سطح متفاوت قرار میدهد. ژن Sep3c در اندامهای مختلف گل شامل تخمدان، کلاله، پرچم و گلبرگ بیان میشود ولی در اندامهای غیر گل شامل برگ، پیاز و ریشه بیان نمیشود (شکل2). اختلاف میانگین بیان ژن Sep3d در اندامهای مختلف زعفران در سطح 1 درصد معنیدار شد. آنالیزهای آماری شدت باند در اندامهای مختلف را در 3 سطح متفاوت قرار داد به طوری که اندامهای کلاله، پرچم، گلبرگ و سپس تخمدان دارای بیشترین شدت باند بودند و اندامهای رویشی برگ، پیاز و ریشه کمترین شدت باند را نشان دادند. شکل2 میزان بیان این ژن را در اندامهای مختلف گیاه زعفران نشان میدهد.
شکل2- بررسی بیان ژنهای کلاسE خانواده MADS box در اندامهای مختلف گیاه زعفران. این ژنها در اندامهای گل شامل تخمدان، کلاله ، پرچم و گلبرگ بیان بالایی دارند ولی در اندامهای رویشی (برگ، پیاز و ریشه) بیان نمیشوند یا بیان بسیار کمی دارند. شکل پایین بیان ژن18S rRNA را نشان میدهد که در همه اندامها به یک میزان بیان شده است. طول قطعه ژن Sep3a 716، ژن Sep3b 719، ژن Sep3c 724، ژن Sep3d 720 و ژن 18S rRNA 703 جفت باز است.
بحث
زعفران از گیاهان زراعی و ارزشمندی است که از جنبههای مختلفی مورد مطالعه قرار گرفته است. از جمله تحقیقات صورت گرفته در ایران میتوان به تکثیر سریع و انبوه بنههای سالم زعفران در شرایط آزمایشگاهی اشاره کرد که توسط رجب پور و همکاران (1390) انجام شده است. براساس گزارش این محققین از آنجایی که روش سنتی به علت حمله عوامل بیماریزا به بنهها زمانبر است میتوان از روشهای آزمایشگاهی برای تولید بنههای عاری از بیماری استفاده نمود (1). همچنین در تحقیق دیگری که توسط رضوانی و همکاران (1393) صورت گرفته است تأثیر هورمون اکسین و عنصر مس روی خصوصیات ظاهری ریشه و برگ زعفران مطالعه شده است. براساس نتایج این مطالعه اثر متقابل اکسین و مس باعث افزایش تعداد ریشه و وزن خشک برگ و ریشه میشود (2). در تحقیق حاضر نیز بیان ژنهای دو گروه Ag1 و Sep3 متعلق به کلاسهای C و E خانواده عوامل رونویسی MADS-box که در تشکیل گل به ویژه در تشکیل کلاله نقش دارند با روش PCR نیمه کمی در زعفران واریته ایرانی بررسی شد و میزان بیان این ژنها در کلاله و سایر اندامهای گل و نیز اندامهای رویشی مورد مقایسه قرار گرفت.
بیان ژنهای کلاس C: ژنهای Ag متعلق به کلاس C خانواده MADS-box هستند. دو ژن Ag1a و Ag1b فرمهای حاصل از پیرایشهای متفاوت ژن AG1 میباشند که 99 درصد تشابه توالی نوکلئوتیدی دارند. مطالعه الگوی بیان ژنهای Ag در سطح رونویسی طی دوره تکامل گل در گیاه آرابیدوپسیس، بیان این ژنها را در پریموردیای پرچم و مادگی نشان داد در صورتی که در اندامهای کاسبرگ و گلبرگ بیانی مشاهده نشد (18، 27 و 30). بیان این ژنها در محورهای سوم و چهارم نقش مهمی در تشکیل اندامهای جنسی پرچم و مادگی در این محورها دارد. ژنهای Ag در گیاهان دولپهای در محور سوم همراه با ژنهای کلاس B و E بیان میشوند. در محور چهارم این ژنها با ژنهای کلاس E به طور مشترک بیان میشوند. اما الگوی بیان در گیاه تکلپهای زعفران نسبت به آنچه در گیاهان دو لپهای گفته شد کمی متفاوت است. بررسی بیان ژن Ag1a در سه اندام کلاله، پرچم و برگ زعفران واریته ایرانی نشان داد که ژن Ag1a در اندامهای کلاله و پرچم دارای بیان ولی در برگ فاقد بیان است (44 و 45). نتایج این تحقیق نشان داد که ژنهای Ag فقط در اندامهای جنسی زعفران شامل تخمدان، کلاله و پرچم بیان میشوند و در گلبرگ و سایر اندامهای رویشی بیان نمیشوند.
بیان ژنهای کلاس E: ژنهای Sep در کلاس E ژنهای خانواده MADS-box تقسیمبندی میشوند و نقش مهمی در تکامل گل دارند. عوامل رونویسی Sep تشکیل اندامهای مختلف گل را کنترل میکنند. ژنهای Sep1،Sep2 و Sep3 از ژنهای تعیین کننده اندام هستند که برای تکامل گلبرگ، پرچم و مادگی ضروری میباشند (34). الگوی بیان ژنهان Sep در گیاهان دولپهای و تکلپهای با هم متفاوت است. در گیاهان دولپهای بیان این ژنها در محورهای دوم، سوم و چهارم همراه با ژنهای ABC سبب تشکیل اندامهای مختلف گل میشود (33). این در حالی است که ژنهای Sep در محور اول بیان نمیشوند و بیان ژنهای کلاس A به تنهایی در این محور سبب تشکیل کاسبرگ میشود. مطالعه ژنهای Sep در گیاهان تک لپهای و به ویژه در برنج و ذرت صورت گرفته است (23). برخلاف گیاهان دو لپهای، بررسی بیان ژنهای Sep در گیاهان تک لپهای نشان میدهد که این ژنها در همه محورهای گل این گیاهان بیان میشوند. بیان ژنهای Sep3 در واریته یونانی گیاه زعفران در هر چهار حلقه گل در اندامهای کلاله، پرچم و گلبرگ شناسایی شده است (43).
در این تحقیق بیان ژنهای Sep3 در اندامهای مختلف گیاه زعفران واریته ایرانی مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده ژنهای Sep3 در همه اندامها و محورهای گل زعفران بیان میشوند. به نظر میرسد این ژنها در تشکیل همه اندامهای گل زعفران و یا به عبارت دیگر در تشکیل بافت اولیه گل جهت فعالیت ژنهای ABC نقش دارند. این نتایج با مدل تکامل گل ABCE در گیاهان سازگار است. با وجود این، جهت درک بیشتر چگونگی تشکیل گل زعفران و به خصوص مادگی آن آزمایشهای بیشتری در ارتباط با چگونگی تجمع پروتئینهای MADS و برهمکنش عوامل A، B، C و E باید انجام شود.
پلاز و همکاران (2000) نشان دادند که در گیاه آرابیدوپسیس فعالیت ژنهای کلاس B و C به فعالیت 3 ژن Sep1، Sep2 و Sep3 از خانواده MADS-Box نیاز دارد. در گیاهان جهش یافته سهگانه که فاقد فعالیت هر سه ژن Sep بودند در تمام محورهای گل کاسبرگ تشکیل شد. براین اساس پلاز و همکاران اعلام کردند که ژنهای Sep1، Sep2 و Sep3 از ژنهای تعیین کننده اندام هستند که برای تکامل گلبرگ، پرچم و مادگی ضروری میباشند. پلاز و همکاران (2001) طی آزمایشهایی توانستند در گیاه آرابیدوپسیس برگ را به گلبرگ تبدیل کنند. ترکیب فعالیت ژنهای Sep با ژنهای A و B سبب تغییر برگهای رزت به گلبرگ شد (34). هونما و گوتو (2001) نشان دادند پروتئینهای کلاس B از طریق پروتئینهای Sep با پروتئینهای Ap1 و Ag برهمکنش دارند. در این بررسی بیان نابجای Pi، Ap3 و Ap1 همچنین بیان نابجای Pi، Ap3 و Sep3 سبب تبدیل برگ به گلبرگ شد. بیان نابجای Pi، Ap3، Sep3 و Ag باعث تغییر برگ به پرچم شد (24).
درک چگونگی رشد گل در گیاه زعفران میتواند راه را برای افزایش عملکرد آن و کاهش هزینههای تولید گل به ویژه کلاله هموار سازد. در تحقیق حاضر بیان ژنهایی از خانواده MADS-Box را که در تشکیل گل به ویژه کلاله نقش دارند مورد بررسی قرار گرفت و میزان بیان آنها با یکدیگر در کلاله، سایر اندامهای گل و نیز اندامهای رویشی مقایسه شد. گام بعدی استفاده از مهندسی ژنتیک برای افزایش بیان ژنهایی است که در کلاله بیان میشوند.