متیلاسیون پروموتر ژنهای p14, p15 و p16 در مبتلایان ایرانی سرطان بافت سنگفرشی مری

شهلا محمدگنجی^*، صدف مهبودی و فردوس رستگار جزی

تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

تاریخ دریافت: 27/8/92                تاریخ پذیرش: 16/1/93 

چکیده

مطالعات نشان داده است که متیلاسیون نابه جای ژنهای سرکوبگرتومور باعث خاموش شدن آنها و درنتیجه کاهش بیان آنها شده و زمینه برای ایجاد سرطان مهیا می شود. هدف از این مطالعه، بررسی متیلاسیون سه ژن سرکوبگرتومور p15، p14 و p16 در مبتلایان به سرطان بافت سنگفرشی مری (ESCC) و ارتباط آن با خصوصیات دموگرافی و پاتولوژیکی بیماران می باشد. به این منظور از 44نفر بیمار ESCC غیرخویشاوند، 44عدد نمونه بافت توموری و 19عدد نمونه سالم (مجاور تومور)تهیه و مورد استخراج DNA وRNA قرار گرفت. سپس باپرایمر اختصاصی حالتهای متیله وغیرمتیله این ژنها، واکنش زنجیره ای پلیمراز ویژه متیلاسیون(MSPCR) انجام شد. بیان این ژنها نیزباRT-PCR بررسی گردید. نتایج نشان داد درمیان نمونه های توموری، درصد متیلاسیون برای ژنهای p14، p15 و p16 به ترتیب عبارتست از 53، 9 و 27 درصد و در هیچ یک از نمونه های نرمال (مجاور تومور) متیلاسیونی مشاهده نشد و نیز میزان بیان این ژنها با میزان متیلاسیون نسبت عکس داشت (p<0.05). فراوانی متیلاسیون پروموتر ژنهای p15 و p14 در نمونه های توموری SCCE به ترتیب 41، 9 درصد و فراوانی وجود متیلاسیون همزمان در ژنهای p15+p16 و p14+p15 به ترتیب 6/13 و 5/4 درصد بود در حالی که فراوانی متیلاسیون در ژنهای p14+p16، 9% مشاهده شد (P=0.0036). بدین معنا که در تمامی بیماران متیله برای ژن p14، متیلاسیون p16 مشاهده شد اما در بیشتر بیمارانی کهp15 متیله بود، ژنهای p14 و یا p16 متیلاسیون نشان نداد. مقایسه این نتایج با سایر یافته های مشابه در جهان، نشان می دهد وضعیت متیلاسیون ژنهای p15، p14 و p16 در جمعیت ایرانی مورد بررسی ‌در محدوده گزارشاتی از شمال چین قرار دارد. به عبارتی احتمالاً مکانیسمهای مولکولی و عوامل اتیولوژیک مشابهی می توانند در بروز سرطان ESCC در این دو جمعیت (ایران و چین) نقش داشته باشند.

واژه های کلیدی: متیلاسیون، ژنهای p14، p15، P16، سرطان بافت سنگفرشی مری

* نویسنده مسئول، تلفن: 44787466-021 پست الکترونیکی: shahlamg@yahoo.com

مقدمه  

بیماری سرطان دومین عامل مرگ و میر بعد از بیماریهای قلبی و عروقی در کشور های صنعتی و کشورهای در حال توسعه می باشد. از بین انواع سرطان، سرطان مری با رتبه ششم مرگ و میر در بین انواع سرطانها در دنیا، شیوع بالایی دارد بنابراین امروزه توجه زیادی معطوف تشخیص و درمان این بیماری شده است. در ایران نیز سرطان مری یکی از شایع ترین سرطانها است و بالاترین شیوع آن در نواحی شمال و شمال شرقی کشور که جزء ناحیه کمربند سرطانی دنیا است، مشاهده می شود. بر اساس گزارش منتشر شده توسط انستیتو سرطان ایران، 9 درصد کل سرطانها و 27 درصد سرطانهای معده ای- روده ای مربوط به کارسینومای مری است (7) و از هر 100 مرگ حاصل از سرطان، 6 مورد مربوط به سرطان مری می باشد. در مراحل اولیه که تومور رشد کندی دارد، بیمار معمولاً فاقد نشانه می باشد با این وجود زمانی که نیمی از محیط مری به وسیله تومور اشغال شود، dysphagia یا عدم توانایی بلع رخ می دهد که یکی از متداول ترین نشانه های سرطان بافت سنگفرشی مری می باشد. نحوه درمان ESCC به مرحله بیماری بستگی دارد. در مراحل اولیه بیماری، نواحی آسیب دیده توسط جراحی برداشته می شود و در صورتی که نواحی میان سینه درگیر شده باشد، کل مری برداشته می شود. درمان با جراحی در مراحل اولیه بیماری مفید است اما پس از انتشار نئوپلاسم به بخش زیر مخاطی، رشد تومور سریع بوده و به گره های لنفاوی، کبد، شش و استخوان متاستاز می دهد (1).

از جمله فرآیندهای مولکولی سرطان متیلاسیون دی نوکلئوتید CpG است که در تمام انواع سرطانها متداول می باشد. امروزه فرآیند هایپرمتیلاسیون پروموتر، افقهای نوینی را در جهت دستیابی به مارکرهای مولکولی سرطان گشوده است. تقریباً 90- 60 درصد از دی نوکلئوتیدهای CpG ژنوم پستانداران متیله است با این وجود عمده CpGهای غیر متیله در توالیهای غنی از CpG (جزایر CpG) که در ناحیه پروموتر ژنها قرار دارند متمرکز شده اند (18). در شرایط طبیعی، جزایر CpG که پروموتر و جایگاه آغاز رونویسی را در بر می گیرند غیر متیله اند (به جز ژنهای Imprint و ژنهای موجود بر روی کروموزم x غیر فعال) و در صورتی که این ناحیه هایپرمتیله شود بیان ژن متوقف می شود(5). البته این در حالی است که الگوی متیلاسیون ژنومی در سلولهای سوماتیک، پایدار و قابل توارث می باشد. تغییر الگوی متیلاسیون در بسیاری از انواع سرطانها رخ می دهد که باعث مهار بیان ژنها و ناپایداری کل ژنوم می گردد (3). ثابت بودن موقعیت متیلاسیون نابه هنجار در ژنهای هدف (یعنی جزایر CpG)، تشخیص وجود آن را نسبت به جهشهای متعدد، آسان تر می­کند. موقعیت جهشهایی از این دست در ژن ممکن است حتی برای یک نوع خاص تومور از یک بیمار به بیمار دیگر متفاوت باشد اما برای هر ژن می توان با یک تست تشخیصی نابهنجاری متیلاسیون پروموتر را بررسی کرد. یکی از کاربردهای متیلاسیون به عنوان مارکر توموری این است که جزایر CpG ناحیه پروموتر ژنها در سلول های نرمال متیله نمی شود بنابراین مشاهده ناحیه هایپرمتیله، سیگنالی مثبت دال بر وجود نابه هنجاری می باشد (9). مزیت دیگر استفاده از هایپرمتیلاسیون جزایر CpG به عنوان مارکر توموری، وجود روشهای بسیار حساس نظیر Methylation Specific PCR برای شناسایی توالیهای متیله بوده که می تواند مقادیر جزیی از DNA متیله را آشکار سازد (5).

در این پروژه، متیلاسیون پروموتر ژنهای p14 و p15 و P16 در بیماران مبتلا به سرطان بافت سنگفرشی مری مورد بررسی قرار گرفت. این ژنها در واقع، ژنهای سرکوبگر تومور هستند که محصول آنها پروتئینهای مهاری اختصاصی می باشد. این پروتئینهای مهاری اعضای خانواده INK بوده که به ترتیب به صورت p15INK4b, p16INK4a, p14INK4c نام گذاری شده و باعث مهار اینترکشن سیکلینها با cdks می شوند.

ژنهای P14 و  p16که به صورت CDKN2A نیز نشان داده می شوند در کنار ژن p15 (CDKN2B ) و بر روی کروموزوم 9p21 انسان قرار دارد. ژن p15 در کنار CDKN2A و در منطقه ای قرار دارد که اغلب اوقات و در طیف وسیعی از تومورها دچار موتاسیون یا حذف می شود. این ژن مهار کننده، CDK ای را کد می کند که با تشکیل کمپلکس با CDK4 یا CDK6، از فعال شدن کینازهای CDK جلوگیری می کند. بنابراین پروتئینی را کد می کند که به عنوان تنظیم کننده رشد سلول، پیشروی مرحله  G1 چرخه سلولی را کنترل می کند. بیان این ژن تحت تأثیر TGF beta قرار دارد و پیشنهاد شده است که نقش مهاری در القاء رشد TGF beta دارد.

حاصل رونویسی از ژن p16، چند رونوشت متفاوت است که تفاوت این رونوشتها در اگزون اولشان می باشد. Kamb در 1994 نشان داد ژن CDKN2A واجد سه اگزون E1، E2 و E3   می باشد (شکل 1). طول اگزونهای یک، دو و سه به ترتیب 125bp،  307bpو 12bp می باشد(13 و 14). مطالعاتQuelle  نشان داد اگزون E1 شامل بخشهای آلفا و بتا است و نقش اگزون آلفا، کد کردن رونوشت p16(INK4a) می باشد که سبب القاء اتمام رشد در فیبروبلاست پستانداران می گردد(20 و 21). محصول ترجمه ژن CDKN2A، حداقل سه واریانت مشخص پروتئینها است که یکی از آنها (p16) بوده که از نظر ساختمانی و عملکردی، ایزوفرمهای مهار کننده کینازی CDK4 است. P16 در فسفریلاسیون رتینوبلاستوما نقش دارد و در کنترل رشد با مهار CDK4 و CDK6 در ارتباط است. کاهش بیان p16 با بسیاری از سرطانهای انسانی، از جمله گلیوما، سرطانهای مری و معده ارتباط دارد (11). آنالیز بیان مولکول  p16می تواند در پیشگویی رفتار تومورهای astrocytic جهت درمان بسیار مفید باشد (24).   

شکل 1- کروموزوم 9 و لکوسهای مربوط به p14، p16، p15 (14)

بدین منظور در این پروژه تحقیقاتی، به بررسی مارکرهای چندگانه ژنتیکی در ایجاد سرطان بافت پوششی سنگفرشی مری در مبتلایان ایرانی پرداخته شد. بررسی هایپرمتیلاسیون پروموتر های چند ژن مهم مهار­کننده کینازی وابسته به سیکلینها (p14، p15 و p16)، به عنوان یکی از مهمترین فرآیندهای مولکولی متداول در تمام انواع سرطانها از جمله سرطان مری، از اهداف انجام این پروژه تحقیقی بود.

مواد و روشها

روش کار: در این مطالعه ابتدا جامعه آماری مورد نظر و حجم نمونه با توجه به عواملی چون شیوع سرطان مری در ایران، مطالعات انجام شده قبلی توسط سایر محققین  بر روی این ژن و نتایج حاصله، درنظر گرفتن خطاهای نوع اول و دوم، تعداد 44 نمونه توموری و19 عدد نمونه سالم تعیین گردید. این تعداد نمونه از میان بیماران مراجعه کننده به بیمارستان امام خمینی و تومور بانک ایران تهیه شد. همراه با نمونه های بافتی، اطلاعات کاملی در مورد دموگرافی و پاتولوژی بیماران مبتلایان به سرطان مری به دست آمد. بافتها به صورت تازه و در شرایط ازت مایع به فریزر 70 – درجه سانتی گراد پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری منتقل گردید. همچنین به منظور رعایت قوانین اخلاق زیستی، قبل از نمونه گیری از تمامی بیمارانی که مایل به شرکت در این پروژه تحقیقاتی بودند، رضایت نامه ای گرفته شد. در ادامه، اطلاعات حاصل از بیماران و نمونه ها مورد بررسی دقیق قرار گرفت و تعدادی از نمونه ها از ادامه مطالعه در این پروژه خارج شد. در واقع، اینها نمونه هایی بودند که فاقد شرایط لازم زیر بودند: اگر محل اولیه سرطان نامشخص بود، اگر بیمار علاوه بر مری به نوع دیگری از سرطان مبتلا بود، اگر از نظر هیستولوژیکی برای تومور، تشخیصی غیر از مری تأیید شده بود، اگر اطلاعات دقیقی در مورد تاریخچه یا گزارشات پاتولوژی بیماران در دسترس نبود و در صورتی که بیماران با هم نسبت فامیلی داشتند.

از تمامی نمونه های بافتی، استخراجDNA  به روش فنل - کلروفرم انجام شد. سپس DNA ها توسط کیت EZDNA Methylation-GoldTM Kit (ZymoResearch Co.,CA,USA) مورد تیمار با بی سولفیت سدیم قرار گرفت. پرایمر اختصاصی برای حالتهای متیله و غیرمتیله ژنهای  P16 و P14 ,  P15طراحی شده مطالعه قبلی همین گروه مورد استفاده قرار گرفت (9). آزمایش Methylation Specific PCR (MSP) برای ژن فوق به شرح زیر انجام شد. برای آزمایش MSP ، مواد زیر در حجم 12.5 µL   به میکروتیوب اضافه شد 1 mM dNTPs (Fermentase Co., Burlington, Ontario, Canada), 0.2 µM specific oligonucleotide primers, 100 ng modified DNA, U/µL Taq polymerase (Hot start,Qiagen,Valencia, CA, USA).

میکروتیوبهای بالا در شرایط دمایی 95 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه، و سپس 35 سیکل به صورت 95 درجه سانتی گراد، annealing  64 درجه سانتی گراد برای پرایمر های متیله و غیر متیله ژن P14 و دمای 60 درجه سانتی گراد برای پرایمرهای متیله و غیر متیله ژن P15)  و 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه برای هر دما و در نهایت 10 دقیقه در 72 درجه سانتی گراد و در دستگاه ترموسیکلر مدل PeQLab, 96 universal gradient, UK thermal cycler قرار داده شد. نمونه کنترل مثبت نیز از شرکت New England Biolab خریداری گردید. پس از الکتروفورز محصول  PCR بر روی ژل آگارز 5/1 درصد، مشاهده باند با طول 122bp نشانه وجود متیله بودن پروموتر ژن P14 و وجود باند با طول132 bp نشانه عدم متیله بودن آن می باشد. همچنین مشاهده باند با طول 148bp نشانه وجود متیله بودن پروموتر ژن P15 و وجود باند با طول154 bp نشانه عدم متیله بودن این ژن می باشد. توالی پرایمرهای اختصاصی برای حالت  متیله و غیر متیله پروموتر ژنهای مورد نظر برای آزمایش MSPCR عبارتست از:

p14_meth_F: 5' GTG TTA AAG GGC GGC GTA GC 3'

p14_meth_R: 5' AAA ACC CTC ACT CGC GAC GA 3'

p14_Un meth_F: 5' TTT TTG GTG TTA AAG GGT GGT GTA GT 3'

p14_Un meth_R: 5' CAC AAA AAC CCT CAC TCA CAA CAA 3'

p15_meth_F: 5'GCG TTC GTA TTT TGC GGT T 3'

p15_meth_R: 5' CGT ACA ATA ACC GAA CGA CCG A 3' 

p15_Un meth_F: 5' TGT GAT GTG TTT GTA TTT TGT GGT T 3'

p15_Un meth_R: 5' CCA TAC  AAT AAC CAA ACA ACC AA 3'

p16_meth_F: 5' TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CGC 3'

p16_meth_R: 5' CCA CCT AAA TCG ACC TCC GAC CG 3'

p16_Un meth_F: 5' TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TGT 3'

p16_Un meth_R: 5' CAA CCC CAA ACC ACA ACC ATA A 3'

در مرحله بعد، استخراج RNA از بافتهای سرطانی و نرمال (بافت مجاور تومور) به کمک کیت استخراج RNA شرکت Intron و مطابق پروتکل آن انجام شد. در ادامه سنتز cDNA به کمک کیت Intron و مطابق دستور کار مربوطه انجام گرفت.

بیان ژنهای p14  و P15 با آزمایش RT-PCR بررسی گردید. ژن بتااکتین نیز به عنوان استاندارد داخلی و ژن خانه دار (House keeping) مورد آزمایش RT-PCRقرار گرفت.  دمای annealingبرای این مرحله از آزمایش 53 درجه سانتی گراد و طول قطعه مورد نظر، 174bp می باشد.

نتایج

نتایج حاصل از این مطالعه در چند بخش قابل ارائه است:

نتایج آنالیز بررسی مارکرهای ژنتیکی بر روی بیماران SCCE: در مجموع، این بیماران شامل 29 نفر مرد (66 درصد) و 15 نفر زن (34 درصد) در طیف سنی 37 تا 87 سال با میانگین  سنی (88/13±84/60) بودند در حالی که هیچیک، نسبت خویشاوندی با یکدیگر نداشتند و اکثر آنها بالاتر از 45 سال داشتند(1/81 درصد). اکثر بیماران نژاد آذری (5/70 درصد) و 5/29 درصد بیماران نژاد غیر آذری (کرد، لر، فارس) داشتند. اعتیاد سیگار و سایر مخدرها، در 41% بیماران دیده شد. از نظر تاریخچه خانوادگی نیز، هیچیک از افراد فامیل این بیماران مبتلا به سرطان مری یا سایر سرطانها نبودند (جدول 1). نتایج آزمایشات پاتولوژی نیز نشان داد 9 درصد بیماران از نظر تمایزی،  grade II و 6/63 درصد در مرحله T3 بودند. از نقطه نظر تهاجم لنفی، 8/47 درصد مرحله N1 را نشان دادند و فقط 16/9 درصد ایشان متاستاز داشتند (جدول 1).

جدول 3-1- اطلاعات فردی، دموگرافی، و پاتولوژی بیماران ESCC

تجزیه و تحلیل آماری ارتباط مثبتی بین متیلاسیون ژنهای p16، p14، p15، و برخی فاکتورهای دموگرافی و پاتولوژی بیماران مبتلایان SCCE، نشان داد که ارتیاط مثبت بین متیلاسیون CDKN2A/p16 و فاکتورهای ذرات آلاینده شغلی (P=0.0082) و چاقی (P=0.00142) BMI دیده شد. بین متیلاسیون پروموتر ژن CDKN2A/p14 و ذرات آلاینده هوا(P=0.02)، درجه تمایزی تومور (grade I نسبت به grade II) (P=0.005) و متاستاز (P=0.003)  ارتباط مثبت دیده شد. بین متیلاسیون پروموتر ژن p15 و فاکتورهای چاقی  (P=0.025)، Lymph node invasions  (P=0.04) ، Tumor Necrosis Present  (P=0.04)، و Perineural Invasion  (P=0.0036)  ارتباط معنادار مثبت مشاهده شد.  

نتایج حاصل از تستهای آزمایشگاهی: نتایج نشان داد که کیفیت و کمیت DNA و RNA استخراج  شده از بافتها دارای وضعیت خوبی هستند. میانگین غلظت DNA هر نمونه بین ng/ul330 تا 150 و نسبت 260l به 280l نیز بین 8/1 تا 2 بود و DNAها عاری از هر گونه آلودگی بودند.

نتایج حاصل از آزمایش MSPCR با پرایمرهای اختصاصی TPEF  نشان داد که کلیه DNAهای تیمار شده دارای کیفیت خوبی بوده و عمل modification به خوبی انجام شده است. این آزمایش جهت اطمینان از مناسب بودن واکنش تیمار با سدیم بی سولفیت،  از ژن  TPEF به عنوان کنترل تیمار و MSPCR  استفاده شد(شکل 2)

شکل2- آزمایش MSPCR با پرایمرهای ژن p14 بر روی ژل 5/1% آگارز. از چپ به راست(طول قطعه تکثیر شده با جفت پرایمر متیله، bp122 و با چفت پرایمر غیر متیله، bp132می باشد.)، چاهک 1: سایز مارکر bp123،  Invitrogen. چاهک 2: کنترل منفی برای حالت متیله، چاهک 3: حالت متیله برای نمونه توموری یکی از بیماران، چاهک 4: کنترل مثبت، چاهک 5: کنترل مثبت برای حالت غیر متیله، چاهک 6: حالت غیر متیله برای نمونه توموری یکی از بیماران. چاهک 7: حالت غیر متیله یکی از نمونه های نرمال بافتی ،چاهک 8: کنترل منفی برای حالت غیر متیله.

نتایج حاصل از آزمایش MSPCR برای ژن p14، نشان داد که فقط 4  نمونه از 44 عدد DNA  بیماران، متیله است و تمامی نمونه های غیر توموری (بخش سالم هم جوار تومورها) غیر متیله می باشد (شکل2(. بدین ترتیب 9 درصد نمونه ها برای پروموتور ژن p14  متیله می باشند.

نتایج حاصل از آزمایش MSPCR برای ژن p15 نیز نشان داد که 18 نمونه از  DNA  بیماران متیله (41 درصد) و 26 عدد از نمونه های توموری بیماران و تمامی نمونه های غیر توموری (بخش سالم هم جوار تومورها) غیر متیله می باشند (شکل3). همچنین نتایج آزمایش MSPCR برای ژن p16 نیز نشان داد که 12 عدد از 44 عدد نمونه DNA  بیماران متیله بود (27 درصد) در حالی که تمامی نمونه های غیر توموری (بخش سالم هم جوار تومورها) غیر متیله هستند )شکل 3).

فراوانی وجود متیلاسیون همزمان در ژنهای p15+p16 و p14+p15 به ترتیب 6/13 و 5/4 درصد بود در حالی که فراوانی متیلاسیون در ژنهای p14+p16، 9 درصد مشاهده شد (P=0.0036).  بدین معنا که در تمامی بیمارانی که برای ژن p14 متیله بود، متیلاسیون p16 هم مشاهده شد اما در بیشتر بیمارانی کهp15  متیله بود، ژنهای p14 و یا p16 متیلاسیون نشان نمی داد.

از طرف دیگر آزمایشهای RT-PCR برای بررسی بیان نمونه هایی که برای این ژنها متیله بودند، نشان از ارتباط معکوس بین میزان متیلاسیون و بیان این ژنها در بافتها داشت. در واقع مطابق نتایج، اولاً برای ژن بتااکتین در همه نمونه های نرمال و توموری بیان مشاهده شد. دوماً بیان RT-PCR با پرایمرهای اختصاصی برای تک تک ژنهای سرکوبگر توموری (p14, p15 و p16)، متناسب با حالت متیله یا غیر متیله بودن این ژنها بود. به عبارت دیگر، برای نمونه های توموری که از نظر هر یک از ژنهای سرکوبگر تومور متیله بود، بیانی مشاهده نشد در حالی که نمونه های توموری غیر متیله برای این ژنها، بیان داشتند. همچنین تمامی بافتهای نرمال برای تک تک این ژنها بیان نشان دادند زیرا هیچیک از آنها متیله نبودند.   

شکل3- آزمایش MSPCR با پرایمرهای ژن p15 بر روی ژل 5/1% آگارز. از چپ به راست(طول قطعه تکثیر شده با جفت پرایمر متیله، bp 148 و با چفت پرایمر غیر متیله، bp154 می باشد.). چاهک 1: سایز مارکر bp123، Invitrogen. چاهک2: کنترل منفی برای حالت متیله نمونه های توموری، چاهک 3: حالت متیله برای یکی از نمونه های توموری بیماران. چاهک 4: کنترل مثبت برای حالت متیله، چاهک 5:کنترل منفی برای حالت غیر متیله، چاهک 6: کنترل مثبت برای حالت غیر متیله، چاهک 7: حالت غیر متیله برای نمونه توموری یکی از بیماران. چاهک 8: حالت غیر متیله یکی از نمونه های نرمال بافتی. نمونه های کنترل مثبت جهت انجام این آزمایشها خریداری شده از شرکت New England Biolab است.