مطالعه دینامیک مولکولی و حرکات عملکردی آنزیم لیپاز A از گونه باسیلوس سوبتیلیس

محمدرضا گنجعلی خانی و بیژن رنجبر^*

تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوفیزیک

تاریخ دریافت: 22/12/90             تاریخ پذیرش: 27/4/91

چکیده

آنزیم لیپاز باسیلوس سوبتیلیس یکی از کوچک ترین پروتئینهای متعلق به خانواده β/α هیدرولازها می­باشد. این آنزیم بر خلاف همه لیپازها  خاصیت فعال سازی سطحی را از خود نشان نمی­دهد ولی همانند دیگر لیپازها کاربردهای فرآوانی در زمینه­های صنعتی، دارویی، صنایع غذایی و زیست محیطی دارا می­باشد. تعدادی گزارش از تولید این لیپاز مهندسی شده ارائه شده که اساس طراحی در آن­ به صورت جهشهای تصادفی می­باشد. لذا مطالعه دینامیک مولکولی این آنزیم در دماهای مختلف برای بررسی خصوصیات دینامیکی آن ضروری به نظر می­رسد.  شناسایی این حرکات مولکولی برای تغییر در روش طراحی از تصادفی به طراحی منطقی آنزیم بسیار موثر می­باشند. بر اساس مطالعه شبیه سازی دینامیک مولکولی این آنزیم در مدت 15 نانوثانیه، حرکات مولکولی در لوپهای دوطرف جایگاه فعال مشاهده گردید که میزان آن در دماهای مختلف با هم متفاوت بودند. از سوی دیگر دو لوپ کلیدی که در ایجاد حرکات عملکردی نقش دارند در طرف دیگر آنزیم شناسایی شدند که دارای نقش لولا در محور حرکتی اجزای ساختاری دوم در اطراف جایگاه فعال می­باشند.

واژه های کلیدی: لیپاز، باسیلوس سوبتیلیس لیپاز، حرکات عملکردی، شبیه سازی دینامیک مولکولی

* نویسند مسئول، تلفن : 82883418-021 ، پست الکترونیکی:  ranjbarb@modares.ac.ir

مقدمه

آنزیم لیپاز (EC 3.1.1.3) قابلیت شکستن پیوندهای استری کربوکسیلی در چربیهای تری گلیسرید را به عهده دارد و این ترکیبات را به اسیدهای چرب سازنده تبدیل می نماید. این آنزیم توانایی انجام واکنش سنتزی استرها را  نیز دارا می باشد. لیپازها دارای قابلیتهای دیگری از جمله تجزیه آمینها، الکلها، اسیدها می­باشند (4).

لیپازها یکی از پرکاربردترین آنزیمها در زمینه های متنوع زیست­فناوری هستند که از این جمله می­توان به کاربرد آنها­ در زمینه­های صنایع غذایی، صنعتی، دارویی و مصارف خانگی اشاره نمود.  یکی از قابلیتهای این آنزیم در تولید بیوپلیمرهای جدیدی می­باشد که به دلیل پیچیدگی ساختار منومری آنها، روشهای تولید صنعتی مقرون به صرفه نبوده ولی در عوض استفاده از انواع لیپازها برای تولید در مقیاسهای صنعتی اقتصادی به نظر می­رسد. از کاربردهای دیگر لیپاز در تولید بیودیزل­ها به عنوان سوختهای پاک و تجدید پذیر می­توان نام برد. تولید ترکیبات شیمیایی خالص یکی دیگر از کاربردهای این آنزیم است که علاوه بر خلوص، نوع ساختار فضایی نیز در آن مهم می باشد و این ترکیبات معمولاً در تولید داروها مورد استفاده قرار می گیرد. از کاربردهای دیگر می­توان به تولید انواع ترکیبات غذایی فرآوری شده و استفاده این آنزیم در ترکیبات شوینده نیز اشاره نمود (2، 12، 15، 16، 17 و 18)

آنزیم لیپاز باسیلوس سوبتیلیس از باکتری باسیلوس سوبتیلیس به دست آمده که یک باکتری گرم مثبت هوازی می باشد و در آب و خاک به راحتی مشاهده می شود. این باکتری لیپاز ترشحی تولید می نماید که دارای هر دو قابلیت تجزیه و سنتز تری اسیل گلیسرول­ها می باشد. این آنزیم همچنین به دلیل ساختمان بسیار کوچک خود (kDa 19) و اختصاصی بودن بالا در انتخاب ساختارهای آنانتیومری بسیار مورد توجه قرار گرفته و در صنعت کاربردهای فراوانی دارد. آنزیم لیپاز باسیلوس سوبتیلیس از ژن lipA به دست آمده که دارای 181 اسیدآمینه می باشد (آنزیم باسیلوس سوبتیلیس A) که به اختصار BsLA خوانده می شود. این آنزیم جزء معدود لیپازهایی است که خاصیت فعال سازی سطحی در تماس با سطح آب و روغن ندارند و همچنین دارای مقاومت زیادی در مقابل تغییرات pH  می­باشد به طوری که در pH قلیایی (حدود 10) دارای فعالیت بهینه­ می­باشد (33).

آنزیمBsLA  یک ساختار کروی در ابعاد 35*35*42 آنگستروم دارد که از یک دومین فشرده شامل شش روبان بتای موازی  تشکیل شده است که این روبانها به وسیله مارپیچهای آلفا احاطه شده­اند. تاخوردگی این آنزیم نیز مانند دیگر لیپازها از نوع α/β هیدرولاز می­باشد. به دلیل اندازه کوچک و عدم وجود دهانه جایگاه فعال، این آنزیم به عنوان کوچکترین آنزیم از خانواده α/β هیدرولازها محسوب می شود[5].

جایگاه فعال این آنزیم همانند دیگر آنزیمهای لیپاز از فرم کلاسیک سه تایی پیروی می نماید. در لیپازها سه اسیدآمینه کلیدی Ser، Asp/Glu و His به عنوان جایگاه فعال عمل می کنند. در این آنزیم Ser 77 به عنوان عامل نوکلئوفیل، Asp 133 به عنوان عامل اسیدی و His 156 به عنوان جایگاه کاتالیتیک عمل می نمایند (33).

مطالعه شبیه سازی دینامیک مولکولی آنزیمها یکی از روشهای مفید و مؤثر در شناسایی خصوصیات ساختاری و عملکردی آنزیمها می باشد. با استفاده از این روش می­توان از نحوه عملکرد آنزیم در دماهای مختلف و یا انواع حلالها اطلاعات مفیدی استخراج نمود. اطلاعات به دست آمده از این روش می­تواند دید مناسبی نسبت به مولکول مورد نظر در سطح اتمی در شرایط طبیعی برای محققین فراهم سازد. از سوی دیگر درک حرکات عملکردی در مولکول، در طراحی و مهندسی پروتئین نقش به سزایی ایفاء می نماید (3، 10، 11، 14، 19، 23 و 27).

لیپازها به دلیل گستردگی و کاربردهای فراوان بسیار مورد مطالعه قرار گرفته اندکه از آن جمله می توان به مطالعه حرکات مولکولی و دینامیک ساختاری بسیاری از لیپازها با استفاده از تکنیک شبیه سازی دینامیک مولکولی اشاره کرد. به طور مثال مطالعات زیادی بر روی خصوصیات ساختاری و عملکردی آنزیم Candida antarcticaLipase B صورت گرفته است؛ انتخاب نوع انانتیومر فضایی در سوبسترا در این آنزیم (20 و 28) و همچنین اثر دما بر این فرآیند با استفاده از شبیه سازی دینامیک مولکولی[1][1, 2][1] بررسی گردید (25)[3]. از جمله دیگر مطالعات بر آنزیم ذکر شده می توان به بررسی انعطاف پذیری ساختار در حلالهای مختلف (31)[4]، حرکات مولکولی در دریچه جایگاه فعال و همچنین انعطاف پذیری آن با استفاده از این تکنیک اشاره نمود (10 و 30). مطالعات مشابهی بر روی آنزیم لیپاز گونه Burkholderia cepacia[5, 6] انجام گرفت؛ به طور مثال نوع انتخابگری این آنزیم برای الکلهای نوع دوم (22)، حرکات مولکولی دریچه جایگاه فعال در حلالهای مختلف (5 و 32)[8, 9] [7] با استفاده از دینامیک مولکولی مورد بررسی قرار گرفت. مطالعات دیگری نیز بر روی آنزیمهای لیپاز متعدد به منظور بررسی حرکات عملکردی انجام گرفته است که از آن جمله می توان به لیپاز Geobacillus zalihae T1[10] (34)، Candida rugosa، Rhizomucor miehei و  Thermomyces lanuginose اشاره نمود (29)[11].

از مهم ترین کاربردهای مطالعه دینامیک مولکولی پروتئینها می­توان به هرچه بهتر طراحی کردن آنزیمهای نوترکیب و مهندسی شده اشاره نمود. [12][12][12][12]از آنجایی که بررسی وقایع در سطح مولکولی به وسیله تکنیکهای عملی و آزمایشگاهی بسیار پیچیده، پرهزینه و عمدتاً غیرقابل انجام می باشد لذا یک محقق با در دست داشتن دینامیک و حرکات عملکردی در آنزیم، توانایی طراحی هدفمند و دقیق تر را به دست خواهد آورد.

تا امروز تعدادی گزارش در مورد دستورزی آنزیم لیپاز باسیلوس سوبتیلیس A وجود دارد. تغییرات مطلوب اعمال­شده عمدتاً با استفاده از روشهای تصادفی به دست آمده است؛ به طور مثال در یکی از آنها از کتابخانه ژنی آنزیم با روش رونمایی فاژی برای جداسازی آنزیم جدید که قابلیت عملکرد بر آنانتیومر فضایی متفاوت دارد استفاده گردید (8) و در مطالعه دیگر برای افزایش پایداری آنزیم از روشهای جهش تصادفی برای بالا بردن پایداری حرارتی استفاده شد (1). تنها روش مبتنی بر مطالعات و محاسبات رایانه ای بر روی آنزیم BsLA برای بررسی انتخابگری فضایی این آنزیم بر روی ترکیب آنانتیومری کتوبروفن مورد استفاده قرار گفت (24).

علی رغم کاربردهای زیاد شبیه سازی دینامیک مولکولی در مهندسی پروتئین در لیپازها،[15, 16] هنوز هیچ مطالعه مشابهی بر روی این آنزیم صورت نگرفته است. لذا بررسی خصوصیات دینامیک ساختاری در این آنزیم در دماهای مختلف می­تواند دریچه ای جدید برای طراحی آنزیم BsLA با خصوصیات متفاوت فرآهم سازد.

مواد و روشها

ساختار بلور آنزیم از پایگاه ذخیره اطلاعات PDB با کد 1ISP (تفکیک 3/1 آنگستروم) به دست آمد و بعد از بررسی به عنوان ساختار اولیه جهت شبیه سازی دینامیک مولکولی مورد استفاده قرار گرفت. مطالعات ساختار با استفاده از نرم افزارهایSwiss-PDB viewer 4.0.1  و  Pymol 1.3انجام شد (26).[15]

شبیه سازی دینامیک مولکولی بر روی ساختار به وسیله نرم افزار AMBER 10.0 (6) و به وسیله میدان نیروی ff99SB انجام شد (13)[16][16]. وضعیت صحیح هیدروژن هیستیدین 156 در ساختار ایجاد و سپس بار سطحی ساختار با افزودن چند یون سدیم خنثی گردید. پروتئین در لایه­ای از مولکولهای آب TIP3P به ضخامت 10 آنگستروم به حالت مرزهای متناوب با استفاده از نرم افزار xLEaP قرار گرفت. کاهش انرژی بر روی ساختار با 2500 گام، 1000 گام به روش Steepest descent و 1500 گام به روش conjugate gradient انجام شد.

دینامیک مولکولی در سه مرحله صورت گرفت، بدین صورت که در مرحله اول به مدت 150 پیکوثانیه در شرایط حجم ثابت دما از صفر کلوین تا دمای اتاق از طریق روش لانگوین بالا برده شد. در مرحله دوم در فشار ثابت به مدت 500 پیکوثانیه سیستم به حالت تعادل رسانده شد. در مرحله سوم شبیه سازی دینامیک مولکولی در فشار ثابت به مدت 15 نانوثانیه در دمای 5، 35 و 60 درجه سانتی گراد انجام گرفت. میانکنشهای غیرپیوندی با فاصله Å 10 به روش PME محاسبه گردید (9) [18]و دما در [18]سامانه مدل شده با روش دینامیک لانگوین با فرکانس برخوردی ps^-1 2 تنظیم شد (21). برای افزایش سرعت محاسبات از الگوریتم SHAKE برای محدود کردن پیوندهای درگیر در اتم هیدروژن استفاده گردید (7).[18]

نتایج شبیه سازی در نرم افزار AMBER tools 1.4 بعد از بررسی دما، فشار و پارامترهای انرژتیکی شبیه سازی مورد آنالیز قرار گرفت. نتایج به صورت ریشه میانگین مجذور انحراف­ها (RMSD)، ریشه میانگین مجذور نوسانات (RMSF)، شعاع ژیراسیون (R_gyr) مورد بررسی قرار گرفت. نوسانات دو لوپ 15-10 و 137-131 به عنوان معیاری از حرکات عملکردی آنزیم در دماهای مختلف در طول زمان شبیه سازی مورد استفاده قرار گرفت. تابع توزیع شعاعی مولکولهای آب و همچنین انرژی ساختار نیز محاسبه گردید. پارامترهای ترمودینامیکی ساختار با استفاده از نرم افزار MMPBSA موجود در AMBER tools 1.4 محاسبه شد. در این روش با استفاده از تقریب تعمیم یافته بورن میزان انرژی ساختار محاسبه گردید و همچنین مقدار آنتروپی از روش تقریب شبه هارمونیک محاسبه و در مقدار نهایی انرژی آزاد لحاظ گردید.

نتایج

نتایج به دست آمده از شبیه سازی دینامیک مولکولی آنزیم BsLA در مدت 15 نانوثانیه در دماهای مختلف شامل RMSD، RMSF وR_gyr  می باشد. پارامترهای ترمودینامیکی ساختار نیز با توجه به شبیه سازی های انجام شده محاسبه گردیدند. اطلاعات مربوط به نقشه دوبعدی ساختار آنزیم از پایگاه BPBsum استخراج گردید.

در شکل 1 RMSD کربن آلفا مربوط به آنزیم BsLA در سه دمای 5، 35 و 60 درجه سانتی گراد نشان داده شده است. میزان RMSD با افزایش دما به میزان اندکی افزایش می یابد. میانگین RMSD در دمای 5 درجه سانتی گراد از 25/1 انگستروم به 5/1 در دو دمای 35 و 60 درجه افزایش یافته است.{Ottosson, 2002 #282[2]

شکل 1- ریشه میانگین مجذور انحراف کربن آلفا در آنزیم BsLA در سه دمای 5 (خط مشکی)، 35 (خط قرمز) و 60 درجه سانتی گراد (خط سبز)

1.  Raza, S., L. Fransson, and K. Hult, Enantioselectivity in Candida antarctica lipase B: a molecular dynamics study. Protein science : a publication of the Protein Society, 2001. 10(2): p. 329-38.

شکل 2 نشان دهنده ریشه میانگین مجذور نوسانات کربن آلفا برای هر باقی مانده در آنزیم می باشد. با افزایش دما میزان RMSF به طور میانگین در ساختار افزایش یافته است که این افزایش نوسانات در 60 درجه سانتی گراد در دو لوپ در اسیدآمینه های 15-10 و اسیدآمینه های 46-40 مشاهده شد. این دو لوپ در لبه جایگاه فعال واقع شده اند که  به ترتیب متصل کننده اولین روبان بتا به اولین مارپیچ آلفا  و همچنین دومین روبان بتا به چهارمین مارپیچ آلفا می باشند. در دمای 35 درجه سانتی گراد نوسان قابل توجهی در اسیدآمینه های 137-131 مشاهده گردید که یک لوپ حاوی یک دور بتای متصل کننده روبان بتای پنجم به مارپیچ آلفای هفتم می باشد.1. Raza, S., L. Fransson, and K. Hult, Enantioselectivity in Candida antarctica lipase B: a molecular dynamics study. Protein science : a publication of the Protein Society, 2001. 10(2): p. 329-38.

2.         Li, W., et al., Molecular modeling of substrate selectivity of Candida antarctica lipase B and Candida rugosa lipase towards c9, t11- and t10, c12-conjugated linoleic acid. 2009. p. 299-303.

3.         Ottosson, J., L. Fransson, and K. Hult, Substrate entropy in enzyme enantioselectivity : An experimental and molecular modeling study of a lipase. Protein Science, 2002: p. 1462-1471.

4.         Trodler, P. and J. Pleiss, Modeling structure and flexibility of Candida antarctica lipase B in organic solvents. BMC structural biology, 2008. 8: p. 9-9.

5.         Ferrario, V., et al., Conformational Changes of Lipases in Aqueous Media: A Comparative Computational Study and Experimental Implications. Advanced Synthesis & Catalysis, 2011: p. n/a-n/a.

6.         Skjøt, M., et al., Understanding the plasticity of the alpha/beta hydrolase fold: lid swapping on the Candida antarctica lipase B results in chimeras with interesting biocatalytic properties. Chembiochem : a European journal of chemical biology, 2009. 10(3): p. 520-7.

7.         Luić, M., et al., Combined X-ray diffraction and QM/MM study of the Burkholderia cepacia lipase-catalyzed secondary alcohol esterification. The journal of physical chemistry. B, 2008. 112(16): p. 4876-83.

8.         Barbe, S., et al., Insights into lid movements of Burkholderia cepacia lipase inferred from molecular dynamics simulations. Proteins, 2009. 77(3): p. 509-23.

9.         Trodler, P., R.D. Schmid, and J. Pleiss, Modeling of solvent-dependent conformational transitions in Burkholderia cepacia lipase. BMC structural biology, 2009. 9: p. 38-38.

10.        Wang, Y., D.-Q. Wei, and J.-F. Wang, Molecular dynamics studies on T1 lipase: insight into a double-flap mechanism. Journal of chemical information and modeling, 2010. 50(5): p. 875-8.

 لازم به ذکر است که این لوپ نیز لبه مقابل جایگاه فعال را نسبت به دو لوپ ذکر شده ایجاد می نماید.

شکل 2- ریشه مجذور میانگین نوسانات کربن آلفا آنزیم BsLA در سه دمای 5 (خط مشکی)، 35 (خط قرمز) و 60 درجه سانتی گراد (خط سبز)

شکل 3 نقشه ساختمان دوم آنزیم BsLA را نشان می­دهد. در این شکل مارپیچ های آلفا به صورت استوانه­ای و روبانهای بتا به صورت فلش مانند مشخص شده­اند. جهت شماره گذاری از انتهای آمین به کربوکسیل انجام گرفته است.

شکل 3- نقشه دوبعدی ساختار دوم در آنزیم BsLA

شکلهای 4 و 5 نشان دهنده جنبشها و نوسانات دو بخش کلیدی ساختار هستند که شامل دو لوپ واقع شده در دو لبه جایگاه فعال می باشند. به منظور بررسی بیشتر این دو بخش، RMSD اسیدآمینه­های 15-10 و 137-131 در سه دمای ذکر شده از کل ساختار جدا شده و مورد بررسی قرار گرفتند. شکل 4 نشان دهنده RMSD اسید آمینه های 15-10 و شکل 5 نشان دهنده RMSD اسید آمینه های 137-131 در مدت 15 نانوثانیه می باشد.

شکل 4- RMSD اسیدآمینه های 15-10 در مدت 15 نانوثانیه بر حسب آنگستروم در سه دمای 5 (خط مشکی)، 35 (خط قرمز) و 60 درجه سانتی گراد (خط سبز)

شکل 5- RMSD اسیدآمینه های137-131 در مدت 15 نانوثانیه بر حسب آنگستروم در سه دمای 5 (خط مشکی)، 35 (خط قرمز) و 60 درجه سانتی گراد (خط سبز)

همان گونه که در شکل 4 نشان داده شده میزان میانگین حرکات مولکولی در لوپ 15-10 در دمای 35 درجه سانتی گراد از دو دمای دیگر کمتر می باشد و این میزان بعد از 12 نانوثانیه کمی افزایش می یابد. این حرکات در لوپ 137-131 در دمای ذکر شده میزان بیشتری را نسبت به لوپ مقابل از خود نشان می دهد (شکل 5) به صورتی که بعد از 5/7 نانوثانیه مقدار آن افزایش قابل توجهی در مقایسه با دو دمای  5 و 60 درجه سانتی گراد پیدا می نماید.

شکل 6- نشان دهنده شعاع ژیراسیون آنزیم BsLA بر حسب آنگستروم در سه دمای ذکر شده می باشد. میزان شعاع ژیراسیون در دمای 35 درجه سانتی گراد از دو دمای دیگر بزرگتر می باشد. همچنین یک افزایش و کاهش نیز در شعاع مشاهده می شود. این افزایش شعاع در 5/7 نانوثانیه بعد از شروع شبیه سازی مشاهده می شود که در 13 نانوثانیه به حالت اولیه خود باز می گردد.

شکل 6- نشان دهنده شعاع ژیراسیون آنزیم BsLA بر حسب آنگستروم در مدت 15 نانوثانیه در سه دمای 5 (خط مشکی)، 35 (خط قرمز) و 60 درجه سانتی گراد (خط سبز)

نتایج مربوط به پارامترهای ترمودینامیکی با استفاده از نرم افزار MMPBSA محاسبه و در جدول (1) ذکر شده­اند. این پارامترها نشان دهنده این اصل می باشند که دما تأثیر چندانی بر انرژی آزاد ساختار BsLA ندارد. بر اساس نتایج به دست آمده میزان آنتروپی ساختار با افزایش دما به طور محسوسی افزایش یافته در حالی که انرژی آزاد آب­پوشی ساختار با افزایش دما تغییر قابل توجهی ندارد.

بحث و نتیجه گیری 

با توجه به نتایج به دست آمده می­توان نتیجه گیری کرد که آنزیم BsLA در دمای پایین ساختار خشک و محکمی پیدا می کند که حرکات مولکولی و در نتیجه فعالیت آن را تحت تأثیر قرار خواهد داد ( شکلهای 1، 2 و 6). میزان آنتروپی محاسبه شده از شبیه سازی که در جدول 1 ذکر شده است نیز گواه این مدعا می باشد. با افزایش دما و افزایش حرکات مولکولی، میزان آنتروپی نیز افزایش می­یابد که در نتیجه آن RMSD ساختار در دمای 35 و 60 درجه سانتی گراد نسبت به 5 درجه سانتی گراد تغییرات قابل مشاهده­ای از خود نشان می­دهد. شعاع ژیراسیون محاسبه شده نیز نشان دهنده افزایش این پارامتر در دمای بالاتر می­باشد. میزان شعاع ژیراسیون در دمای 35 درجه سانتی گراد که دمای بهینه عملکرد این آنزیم است، مقدار بیشتری را در مقایسه با 60 درجه سانتی گراد از خود نشان می دهد. یک افزایش ناگهانی در مقدار این پارامتر در دمای 35 درجه سانتی گراد در زمان 5/7 نانوثانیه قابل مشاهده می باشد (شکل 6) که بعد از حدود 5 نانوثانیه به حالت اولیه خود بازگشت می نماید. این تغییرات ناگهانی می تواند نشان دهنده حرکات عملکردی در آنزیم باشد که ناشی از باز شدگی در ساختار می باشد.

جدول 1- لیست انرژی جزئی محاسبه شده توسط روش MMGSA بر حسب کیلوکالری بر مول

نتایج بسیار جالب مشاهده شده از RMSF بیانگر اثر موضعی دما بر ساختار می باشد به طوری که در دمای پایین ساختار حالت خشک و انعطاف ناپذیری دارد و با افزایش دما میزان انعطاف پذیری افزایش یافته است. در دمای 35 درجه سانتی گراد یک انعطاف پذیری و نوسان چشمگیر در اسیدآمینه های 137-131 مشاهده شد که این بخش مربوط به لبه شکاف جایگاه فعال می باشد. از سوی دیگر در دماهای 35 و 60 درجه سانتی گراد اسید آمینه های 15-10 که لبه دیگر شکاف جایگاه فعال را تشکیل می­دهد نوسانات قابل توجهی پیدا کرده­اند.  منطقه سوم (46-40) که در نزدیکی جایگاه فعال و در قسمت پشتی منطقه 15-10 قرار گرفته نیز در 60 درجه سانتی گراد دچار نوسانات مشخصی شده است.

در شکل 7 دو مدل مولکولی آنزیم BsLA نمایش داده شده است. دو لوپ 15-10 و 46-40 که در قسمت بالایی مولکول قرار گرفته­اند لبه بالایی جایگاه فعال و لوپ 137-131 لبه دیگر جایگاه فعال را ایجاد می نمایند. اسیدآمینه های سه تایی جایگاه فعال نیز در قسمت میانی قابل مشاهده هستند. اسیدآمینه Asp 133 که اسید آمینه کلیدی جایگاه فعال می باشد نیز در لوپ 137-131 واقع شده است.

با توجه به مشاهدات انجام شده حرکت و نوسان لوپ 137-131 برای فعالیت مهم به نظر می رسد. همان گونه که در شکل 5 مشخص شده است این بخش در دماهای 5 و 60 درجه سانتی گراد تحرک کمتری از خود نشان می دهد. تحرک بخش 15-10 در دمای 35 به طور محسوسی نسبت به دو دمای دیگر کمتر می باشد.

با توجه به حرکات دینامیک مولکولی که در نواحی 15-10 و 46-40 مشاهده گردید افزایش دما نقش مهمی در تحرک و نوسان در این دو بخش ایفاء می­کند. لذا به منظور افزایش پایداری فعالیتی در این آنزیم، تغییراتی مفید هستند که میزان انعطاف­پذیری را با افزایش دما به میزان کمتری دستخوش تغییر قرار دهند.

شکل 7- مدل مولکولی آنزیم BsLA به صورت ریبون (سمت راست) و به صورت سطح در دسترس (سمت چپ) . دو لوپ 15-10 و 46-40 در قسمت بالایی مولکول و لوپ 137-131 در قسمت پایین مولکول

همان­گونه که در شکل 8 مشخص شده به نظر می رسد دو لوپ واقع شده در سمت مقابل جایگاه فعال که متصل کننده عناصر ساختاری جایگاه فعال می باشند نقش کلیدی را در این حرکات ایفاء می­نمایند. این دو بخش شامل اسیدآمینه های 34-30 و همچنین 71-67 می­باشد و از لحاظ انعطاف­پذیری و نوسانات مقدار چشمگیری نشان نمی­دهند. ولی این دو بخش به دلیل ایجاد یک بخش لولا مانند که نواحی  15-10 و 46-40 را دربر می­گیرد به عنوان بهترین گزینه های دستورزی به­نظر می­رسند. این امر زمانی بهتر مشخص می­گردد که در لوپ اول Gly 30 و در لوپ دوم Gly 67 و Ala 68 مشاهد می­شود. لذا جابه جایی اسیدآمینه های ذکر شده با انواع حجیم تر که چرخش آزاد در زوایای دی هدرال را در زنجیره اصلی محدود می نماید پیشنهاد می­گردد. در لوپ 34-30 اسیدامینه Asp 34 و Lys 35 در کنار یکدیگر به پایداری بیشتر لوپ کمک نموده اند در حالی که در لوپ 71-67 دو جفت اسید آمینه با بارهای هم نام در دو طرف لوپ واقع شده اند که می توانند باعث عدم پایداری در آن بخش شوند. این دو جفت اسید آمینه شامل Asp 64 و Glu 65 در سمت آمین لوپ و Lys 69  و Lys 70 در طرف کربوکسیل لوپ می باشند. پیشنهاد می­شود که با جابه جایی Asp 64 با اسیدآمینه Lys از شدت دافعه بار منفی در آن بخش کاسته شود. با توجه به نزدیکی Lys 70 با اسیدآمینه­هایی با بار منفی (شامل Asp 72 و 118) نیاز به جابه جایی در این اسیدآمینه مشاهد نمی شود. اما با توجه به اینکه Lys 69 به دلیل اینکه هیچ بار مخالفی در فاصله 6 آنگسترمی از زنجیره جانبی آن به غیر از Lys 70 وجود ندارد و بر روی سطح در دسترس حلال قرار دارد، جابه جایی آن با یک اسید­آمینه قطبی پیشنهاد می شود.

شکل 8- جایگاه لوپهای 34-30 و 71-67 در مقایسه با جایگاه دو لوپ 15-10 و 46-40