Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)

Identification and studying of Enterobacter sp. DGH3 antibacterial activity

Document Type : Research Paper

Authors

Academic Staff

27211

Abstract

Citrus take over important roles in economy for every country and Iran is no exception to this rule is where the economic self-sufficiency in agriculture is the reason that the incidence of pests as possible to prevent. We have to do drastic an actions in order to their control. There are a variety of bacterial and fungal diseases that can have devastating effects on agriculture, especially citrus. Control of bacterial infections, is only by pesticides and antibiotics and through the cross section is possible. Use of antimicrobial compounds for the control of these diseases can be very useful. Enterobacter sp. DGH3 is a native bacterium which isolate from south west of Iran, can destroy the cause bacterial canker disease in citrus. It is hope that, controlling this disease with optimization of its medium and production of antimicrobial component by foregoing bacteria.
Key words: Bacterial disease, antibacterial component, Enterobacter sp. DGH3

Keywords

شناسایی و بررسی برخی فعالیتهای آنتی میکروبی باکتری بومیEnterobacter sp. DGH3

داریوش غلامی1و2 ، سعید امین زاده1*، سیدمهدی علوی1، نسرین کاظمی پور2 ، جعفر ولیزاده2 و طناز گودرزی1

1تهران، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری

2زاهدان، دانشگاه سیستان و بلوچستان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی 

تاریخ دریافت:20/6/91                تاریخ پذیرش: 22/9/91 

چکیده

مرکبات نقش بسیار مهمی را در اقتصاد هر کشور برعهده دارند و ایران نیز از این قاعده مستثنی نیست تا جایی که باعث خودکفایی اقتصادی در زمینه کشاورزی شده است. به­همین دلیل لازم است که از بروز آفات تا حد امکان جلوگیری بعمل آید و در جهت کنترل آنها اقدامات اساسی انجام شود. بیماریهای باکتریایی و قارچی گوناگونی وجود دارند که اثرات مخربی در صنعت کشاورزی و به خصوص مرکبات وارد می نمایند. کنترل بیماریهای باکتریایی، تنها از طریق سموم و آنتی بیوتیکها و آن هم به طور مقطعی امکان پذیر می باشد. استفاده از ترکیبات آنتی باکتریال جهت کنترل این بیماریها می تواند بسیار مفید واقع شود. باکتری Enterobacter sp. DGH3، نوعی باکتری بومی می باشد که قادر است باکتری عامل بیماری شانکر در مرکبات را از بین ببرد. امید است که با بهینه سازی محیط کشت این باکتری و همچنین بهینه سازی تولید ترکیب آنتی باکتریال توسط باکتری مذکور بتوان گام مهمی در جهت کنترل این بیماری برداشت.

واژه­های کلیدی: بیماری باکتریایی، ترکیب آنتی باکتریال، Enterobacter sp. DGH3 

* نویسنده مسئول: تلفن: 02144580412 ، پست الکترونیکی:  aminzade@nigeb.ac.ir

مقدمه

 

بیماری شانکر باکتریایی یکی از مخرب ترین بیماریهای مرکبات می باشد (2 و 14). در مناطقی از جهان که کشت مرکبات به وفور یافت می شود، بیماری شانکر مرکبات وجود ندارد، باکتری زانتوموناس سیتری یک آفت قرنطینه ای محسوب می شود که، بیماری مذکور باعث افت شدیدی در بازار بین المللی مرکبات گردیده است (13). بیماری شانکر مرکبات توسط باکتری Xanthomonacin citri subsp.citri(xcici) ایجاد می شود (11). تلاشهای فراوان جهت ریشه کنی این بیماری تاکنون بی نتیجه مانده است و کشاورزان جهت کنترل این بیماری ناگزیر به استفاده از سموم شیمیایی و آنتی بیوتیکها می باشند. آنتی بیوتیکها موفق ترین خانواده دارویی جهت حفظ سلامتی انسان و گیاهان می باشند (15). با این حال تأثیر آنتی بیوتیکهای مورد استفاده جهت درمان عفونتهای باکتریایی و اهداف کشاورزی در انتخاب میکروارگانیسمهای مقاوم به آنتی بیوتیک با اهمیت می باشد که این موضوع سلامتی انسان و گیاه را تحت تاثیر قرار می دهد (5). نگرانیهای موجود پیرامون استفاده از آنتی بیوتیکها و مقاومتهای آنتی بیوتیکی از جنبه های زیادی به آلودگیهای فلزات سنگین شبیه می باشد. کسب مقاومت آنتی بیوتیکی به وسیله باکتری، تغییرات ویژه ای را در متابولیسم باکتری ایجاد می کند که می تواند برای رشد باکتری در مکانهای دیگر مفید واقع شود و باعث شیوع بیشتر باکتری با پایداری بالاتری نسبت به قبل گردد. ترکیبات مسی نیز همانند آنتی بیوتیکها، در اکوسیستمهای مختلف پراکنده می باشند. عناصر درگیر در مقاومت به فلزات سنگین و آنتی بیوتیکها بر روی کروموزومهای ژنوم باکتریایی رمزدهی می شوند (10). این مواد خود اثرات جانبی زیادی بر محیط زیست و سایر جانداران دارند؛ از طرفی، اثرات کنترلی این ترکیبات مقطعی می باشد و از نظر اقتصادی برای کشاورزان به صرفه نیست. به همین دلیل باید به دنبال ترکیباتی با منشاء بیولوژیک بود که بتوان این اثرات جانبی را به حداقل رساند. باکتریوسین ها به عنوان پپتید های آنتی باکتریال، کاندیداهای بسیار مناسبی برای این منظور می باشند (8). باکتریوسین ها پروتئین و یا پپتیدهای باکتریایی هستند که توسط طیف وسیعی از باکتریها تولید می شوند و علیه باکتریهایی فعالیت می کنند که با باکتری تولیدکننده باکتریوسین مورد نظر قرابت خویشاوندی دارند (9). باکتریوسین ها از چندین جنبه مختلف با آنتی بیوتیکها متفاوت می باشند که از مهم ترین آنها می توان به موارد زیر اشاره نمود:

1) باکتریوسین ها بر روی ریبوزومها در سلولهای میکروبی تولید می شوند، در حالیکه آنتی بیوتیکها متابولیتهای ثانویه سلولی می باشند.

2) مولکولهای باکتریوسین ممکن است به دیواره سلول هدف در هر جایی از سطح سلول متصل شوند، حتی اگر هیچ گونه گیرنده مخصوصی در سطح سلول وجود نداشته باشد.

3) باکتریوسین ها از مکانیسمهای مختلفی جهت کشتن سلولهای هدف استفاده می کنند و همین امر باعث می گردد که باکتری قادر به کسب مقاومت علیه باکتریوسین نباشد (4). بنابراین شایسته است که تحقیقات پیرامون باکتریوسین ها جهت کنترل بیولوژیکی بیماریهای باکتریایی و به ویژه بیماری باکتریایی شانکر مرکبات، انجام گیرد. Enterobacter sp. DGH3 نوعی مهارکننده باکتری زانتوموناس می باشد که قادر است اغلب سویه­های بیماری زای زانتوموناس را در ایران و سایر نقاط جهان کنترل کند. اهدافی را که از این تحقیق متصور می شود شامل کنترل و ریشه کنی بیماری باکتریایی شانکر مرکبات و همچنین بهبود کیفیت بازار مرکبات در ایران می باشد از طرفی این تحقیق می تواند به پیشبرد اقتصاد کشاورزی و همچنین کاهش خسارت ناشی از بیماری شانکر مرکبات مفید واقع شود.

مواد و روشها

مواد و دستگاهها: موادی که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند شامل موارد زیر می باشند:

کیت استخراج DNA (خریداری شده از شرکت Qiagen، کشور آمریکا)، کیت خالص سازی محصول PCR ( خریداری شده از شرکت Roche، کشور آلمان)، محیط کشت nutrient Broth (خریداری شده شرکت Merck، کشور آلمان)، محیط کشت Nutrient Agar (خریداری شده از شرکت Merck، کشور آلمان)، دستگاه ترموسایکلر ( primus 25 advanced، با شماره کاتالوگ 95-4002-us، کشور آمریکا)، دستگاه سانتریفیوژ و میکرو سانتریفیوژ (خریداری شده از شرکت Kendro، کشور آلمان)، سیستم عکسبرداری ChemiDoc-It®TS2 Imager ( خریداری شده از شرکت UVP، کشور انگلستان)

سویه­های باکتریایی و محیط کشت: نمونه­های خاک و آب و همچنین اندامهای گیاهی شامل میوه، برگ و ساقه اعم از آلوده به بیماری و سالم، از مناطق مختلف استانهای جنوبی کشور و به خصوص استان سیستان و بلوچستان جمع آوری گردید. نمونه­های مورد نظرتحت شرایط مناسب (نمونه­های خاک و آب در دمای 4 درجه سانتی گراد و اندامهای گیاهی در پاکتهای کاغذی مخصوص) به آزمایشگاه منتقل گردیدند و بلافاصله عملیات غربالگری انجام گرفت. جداسازی سویه­های مختلف باکتریایی بر طبق پروتوکولهای استاندارد در باکتری شناسی انجام گرفت (1).  غربالگری جدایه­های باکتریایی مورد نظر جهت فعالیت آنتی باکتریال علیه سویه­های مختلف زانتوموناس (150 سویه مختلف) انجام گرفت. تمامی سویه­های بیماری زا و همچنین سویه­های تولیدکننده عامل آنتی باکتریال در محیط کشت مایع (NB) و محیط کشت جامد (NA) کشت داده شدند. از همه سویه­های بیماری زا (شاخص) و همچنین سویه­های تولیدکننده، استوک با گلیسرول 40 درصد تهیه گردید و در 70- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

جداسازی سویه تولیدکننده : بعد از اینکه 500 جدایه باکتریایی مختلف از منبع باکتریایی مذکور جداسازی و در محیط کشت مایع پیش کشت داده شد و بعد از مدت 24 ساعت که از پیش کشت آنها سپری شد هر کدام جداگانه بر روی دیسکهای آنتی بیوگرام منتقل و با روش DD-AWDA کشت دیسکی داده شدند.

 جداسازی سویه تولیدکننده : بعد از اینکه 500 سویه باکتریایی مختلف از منابع باکتریایی خاک، آب و اندامهای گیاهی جداسازی و در محیط کشت مایع NB  پیش کشت داده شد و بعد از مدت 24 ساعت که از کشت آنها سپری شد، هرکدام جداگانه بر روی دیسکهای مخصوص منتقل و با روش نوین DD-AWDA کشت دیسکی داده شدند. کلنی تولیدکننده هاله (سویه­ تولیدکننده باکتریوسین) از دیگر کلنیها جدا و جهت بررسیهای آتی از آنها استوک تهیه شد و تستهای مورفولوژیکی (میکروبیولوژیکی) و بیوشیمیایی آنها انجام انجام گردید.  

تشخیص و شناسایی سویه جدا شده : سویه جداشده برای آزمونهای بیوشیمیایی از قبیل ژلاتین، سیترات، MR و سایر فاکتورها مورد ارزیابی قرار گرفت و تستهای میکروبی نیز طبق پروتوکولهای استاندارد انجام شد. شناسایی بیشتر با توالی یابی  16SrDNAو به دنبال آن آنالیز فیلوژنتیکی جهت شناسایی سویه تولید کننده انجام گرفت (7).

تولید عامل آنتی باکتریال توسط باکتری تولیدکننده: بعد از اینکه مدت 24 ساعت از پیش کشت باکتری تولید کننده سپری گردید آن را سانتریفیوژ نموده (در دور ×g 7000 و به مدت 15دقیقه) و مایع رویی از فیلتر غشایی 2/0 میکرومتر عبور داده شد، سپس برای غیرفعال نمودن سرین پروتئازهای موجود در محیط، به سوپرناتانت مذکور PMSF افزوده گردید. سپس جهت بررسیهای آتی در یخچال با دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری گردید.

سنجش فعالیت و تعیین طیف آنتی میکروبیال: روشهای مختلفی جهت سنجش فعالیت آنتی میکروبیال باکتریوسین ها وجود دارد که در این تحقیق از دو روش انتشار در دیسک و انتشار در چاهک آگار و همچنین از روش نوین DD-AWDA استفاده گردید. در روش انتشار در دیسک، بعد از تهیه پلیتهای محتوی محیط کشت باکتریایی NA، سطح پلیت با 100 میکرولیتر از باکتری هدف تلقیح ( قبلا از باکتری هدف، استاندارد 5/0مک فارلند آماده شد) و دیسکهای استریل بر روی محیط کشت جامد مورد نظر در پلیت قرار گرفتند و مقدار 10 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری تولیدکننده بر روی دیسک گذارده شد. پلیتها به گرمخانه با دمای 35 درجه سانتی گراد منتقل گردیدند و بعد از 24ساعت تشکیل هاله بررسی گردید (9). در روش انتشار در چاهک آگار، بعد از تهیه آگار نیمه جامد (5/0 درصد)، مقدار 100 میکرولیتر از پیش کشت باکتریایی هدف در 5 میلی لیتر از آگار نیمه جامد مخلوط شد و در یک پلیت جداگانه که قبلا دو سوم آن با محیط کشت جامد NA پر گردیده بود اضافه شد. سپس چاهکهایی به قطر 5 میلی متر در آنها ایجاد و مقدار 100 میکرولیتر از سویه تولیدکننده به هر چاهک اضافه شد و به گرمخانه با دمای 35 درجه سانتی گراد منتقل و تشکیل هاله بعد از 24 ساعت بررسی گردید (3). 

روش DD-AWDA : در این روش ابتدا یک سوم از پلیت با محیط کشت جامد NA پر می گردد. پس از خنک شدن، محیط کشت نیمه جامد از NA با 7 = pH آماده و در دمای 121 درجه سانتی گراد و به مدت 20 دقیقه استریل شد. به 5 میلی لیتر از محیط کشت نیمه جامد مذکور، مقدار 100 تا 250 میکرولیتر از پیش کشت باکتریایی هدف تلقیح گردید و به پلیت محتوی محیط کشت جامد NA افزوده شد. سوسپانسیونی از هر باکتری بیماری زا با کدورتی معادل نیم مک فارلند در محیط کشت مایع NB تهیه و با دقت، دیسکهای آنتی بیوگرام  آغشته به 10 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی بر روی محیط کشت جامد NA مذکور قرار گرفت. سپس پلیتها به گرمخانه با دمای 32 تا 37 درجه سانتی گراد انتقال و بعد از 24 ساعت تشکیل هاله بررسی گردید.

استخراج DNA باکتری تولیدکننده: برای استخراج DNA باکتری تولیدکننده، از کیت استخراج DNA ژنومیک استفاده شد و DNA خالص شده جهت نگه داری به یخچال با دمای 20- درجه سانتی گراد منتقل گردید. در پایان برای اطمینان از کیفیت DNA استخراج شده، جذب نمونه های خالص شده در طول موجهای 260 و 280 نانومتر به وسیله دستگاه طیف سنج خوانده شد. 

الکتروفورز DNA : پس از انجام مراحل فوق، برای بررسی کیفیت DNA استخراج شده، 5 میکرولیتر از آن را روی الکتروفورز افقی ژل آگارز 1 درصد (تهیه شده در بافر TBE 1X) انتقال یافت و پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید عکس برداری صورت گرفت.

انجام واکنش PCR و 16srDNA : برای تکثیر 16SrDNA مربوط به باکتری تولیدکننده از روش PCR استفاده شد (12 و 16). جداول 1 و 2 برنامه به کار گرفته شده در دستگاه ترموسیکلر و مخلوط واکنشها را نشان می دهد. ترادف آغازگر Forward و Reverse به کار گرفته جهت تکثیر  16SrDNAدر جدول 3 آمده است.

جدول1- برنامه دمایی و زمانی PCR

زمان (ثانیه)

دما (ºC)

مراحل

شماره

30

94

Denaturation

1

90

56

Annealing

2

30

74

Extension

3

300

74

Final-Extension

4

-

35

Cycle Count

5

 

جدول 2- غلظتهای مخلوط PCR (این واکنش در حجم نهایی µl 25 تهیه شد)

حجم به µl

غلظت

مواد

5/1

mM 5/1

Mgcl2

5/2

X 10

Reaction  buffer

1

mM 5

dNTP(mix)

1

pmol 20

Reverse primer

1

pmol 20

Forward primer

2

ng/ul70

DNA template

5/15

-

ddH2O

5/0

unit 1

Taq polymerase

 

 

جدول 3- آغازگرهای استفاده شده جهت تکثیر16SrDNA

توالی آغازگر

نام آغازگر

5´-GAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTG-3´

Forward      

5´- CCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAG-3´

Reverse


خالص سازی محصول PCR : خالص سازی با استفاده از کیت تخلیص محصول PCR انجام گرفت.  

الکتروفورز 16SrDNA : جهت اطمینان از درجه خلوص محصول استخراج PCR الکتروفورز ژل آگارز انجام گرفت. بدین ترتیب که 5 میکرولیتر از آن را روی الکتروفورز افقی ژل آگارز 1 درصد (تهیه شده در بافر TBE 1X) برده و پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید، عکس برداری صورت گرفت.

نتایج و بحث

جداسازی و تشخیص سویه تولیدکننده باکتریوسین : بعد از اینکه اثر مهاری باکتری تولیدکننده مشاهده شد تستهای بیوشیمیایی (جدول4) سویه مورد نظر انجام گرفت و باکتری مورد نظر یک سویه جدید از کرونوباکتر تشخیص داده شد و در Genebank با شماره پذیرش JX308306 ثبت گردید. انجام 16SrDNA مربوط به این سویه و رسم درخت فیلوژنی آن نیز تأییدکننده این ادعا می باشد (شکل1). این باکتری بومی با نام Enterobacter sp. DGH3 دومین باکتری مهارکننده باکتری عامل بیماری شانکر مرکبات می باشد.

 

جدول 4- نتایج تستهای بیوشیمیایی Enterobacter sp. DGH3

ماده بیوشیمیایی

واکنش باکتری

ماده بیوشیمیایی

واکنش باکتری

ماده بیوشیمیایی

واکنش باکتری

تولید اندول

-

اوره

-

تخمیرمانیتول

+

MRa

-

حرکت

+

تخمیرآرابینوز

+

VPb

+

 هیدرولیز ژلاتین در 22درجه سانتی گراد

+

تخمیرسوربیتول

+

H2S

-

تخمیر گزیلوز

+

ONPGc

+

مصرف سیترات

+

تخمیر لاکتوز

+

اورنیتین دکربوکسیلاز

+

a:metyl red                         b: voges-Proskauer                           c: ortho-Nitrophenyl-β-galactoside

 

 

شکل 1- رسم درخت فیلوژنی. باکتری مورد نظر از سایر باکتریها قابل تشخیص می باشد


تاکسونومی باکتری: تاکسونومی Enterobacter sp. DGH3 بدین صورت است که در قلمرو Bacteria، و در شاخه  Proteobacteria، و در رده Gama proteobacteria، و در دسته Enterobacteriales، در خانواده Enterobacteriaceae و در جنس Enterobacter قرار دارد. 

فعالیت آنتی باکتریال و محدوده آن: بعد از اینکه فعالیت آنتی باکتریال سویه Enterobacter sp. DGH3  با روش DD-AWDA بررسی گردید و سویه­های مختلف باکتری پاتوژنیک تحت اثر مهاری باکتری تولیدکننده قرار گرفتند، به گرمخانه با دمای 35 درجه سانتی گراد منتقل گردیدند و بعد از گذشت 24 ساعت هاله ای به قطر  cm2 مشاهده شد (شکل2). از سویه­های جهانی 3369-CFBP وLMG-2392 به عنوان سویه شاهد استفاده گردید که این سویه­ها نیز توسط باکتری Enterobacter sp. DGH3 مهار گردید.

 

 

تشکیل هاله عدم رشد

 

N

 

b46

 

 

 

 

 

 

 


شکل 2- شکیل هاله عدم رشد توسط ماده آنتی باکتریال ترشحی توسطEnterobacter sp. DGH3

 N : کنترل منفی، b46 : ماده آنتی باکتریال ترشحی توسط باکتری. سطح پلیت آغشته به باکتری بیماری زای زانتوموناس سیتری می باشد.


استخراج DNA باکتری تولیدکننده: بعد از استخراج DNA از Enterobacter sp. DGH3 برای محصول مورد نظر الکتروفورز ژل آگارز انجام شد و DNA ژنومیک این باکتری مشاهده گردید (شکل3). 

الکتروفورز 16srDNA : از محصول استخراج PCR الکتروفورز ژل آگارز انجام گرفت و اندازه ژن 16SrDNA باکتری مورد نظر bp505 تخمین زده شد (شکل3).

نتیجه گیری نهایی 

بیماری باکتریایی شانکر مرکبات یکی از مخرب ترین بیماریهای باکتریایی می باشد که علی رغم تلاشهای فراوان در ایران و سایر نقاط جهان تاکنون درمان قطعی برای این بیماری یافت نشده است. لذا پیدا کردن جایگزین مناسب، جهت مهار این بیماری بسیار ارزشمند می باشد.

M

 

A

 

B

 

C

 

500bp

 

750bp

 

16SrDNA

 

DNA باکتری

 


 

 

 

 

 

شکل3- الکتروفورز ژل آگارز DNA استخراج شده و 16SrDNA باکتری Enterobacter sp. DGH3    M: مارکر DNA   A: 16SrDNA  B: کنترل منفی  C: DNA باکتری 

ترکیبات مترشحه باکتریها کاندیدای مناسبی برای این مهم می باشد. ترکیب آنتی باکتریال ترشحی توسط Enterobacter sp. DGH3 یکی از این ترکیبات مهم جهت مهار باکتری عامل بیماری مذکور می باشد. از آن جایی که باکتری مذکور یک باکتری بومی می باشد و میزبان بیولوژیک آن نیز درختان مرکبات می باشد و از بخش سالم گیاه آلوده به باکتری بیماری زا جداسازی شده است و با توجه به سازش پذیری بالای این باکتری با شرایط آب و هوایی که این بیماری در آن جا یافت می شود امید است که با تحقیقات بیشتر بر روی این باکتری بتوان گام مهمی جهت درمان بیماری باکتریایی شانکر مرکبات برداشت.

تقدیر و تشکر: از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری که طی طرح ماموریت محور کنترل بیماری شانکر مرکبات به شماره م – 406 از انجام این پروژه حمایت نموده است تشکر و قدردانی می گردد.

  1. Amrita Ro., 2010, "Handbook of bacteriology". Oxford Book Company, Jaipur, New Delhi.
  2. Ana Carolina, A.M.d.A., Rafael, A. H., Marcos, A. M., 2010, "Differential expression of pathogenicity- and virulence-related genes of Xanthomonas axonopodis pv. citri under copper stress". Genetics and Molecular Biology,  32: 348-353.
  3. Collise, Nj., Anthony, J. A., Amidou, Sa., Roland, N. Nd.,2011, "Inhibitory and Bactericidal Potential of Crude Acetone Extracts of Combretum molle (Combretaceae) on Drug-resistant Strains ofHelicobacter pylori".j health popul NUTR, 29:438-445.
  4. Edward, A. S., 2011, "Isolation of Lactobacillus salivarius 1077 (NRRL B-50053) and Characterization of Its Bacteriocin, Including the Antimicrobial Activity Spectrum".Applied and environmental microbiology. 77: 2749-2754.
  5. 5.    Ferber, D., 2003, "Antibiotic resistance. WHO advises kicking the livestock antibiotic habit". Science. 301: 1027. 
  6. 6.    Hitoshi Y., H.T., Takako I.,Yasuyoshi I., 2011, "Genetic Organization and Mode of Action of a Novel Bacteriocin, Bacteriocin 51: Determinant of VanA-TypeVancomycin-Resistant Enterococcus faecium" . Antimicrobial agents and chemoterapy. 55: 4352-4360. 
  7. Kozaki, U.T., Okada, S.,1992, ʺExperimental manual of lactic acid bacteriaʺ. Asakurasyoten, 1: 34-37.
  8. 8.    Manu S. M., S.Z., James L., Michael  M., 2010, "Electrical detection of pathogenic bacteria via immobilized antimicrobial peptides ". PNAS. 107: 19207-19212.
  9. Marisa, Al., Viviana, B., Laura, G., Angela, F., Carlos, V.,2010, ʺIn vitro susceptibility of Achromobacter spp. isolates: comparison of disk diffusion, Etest and agar dilution methodsʺ. International Journal of Antimicrobial Agents, 35:68-71.

10. Martinez, J.L., 2009, "Environmental pollution by antibiotics and by antibiotic resistance determinants". Environmental Pollution. 152: 2893-2902.

11. Natalia, G., Betiana, S. G., Lucas D. D., Alex, V., Chris, G., Elena ,G. O., Jorgelina, O., 2008, "Xanthomonas axonopodis pv. citri uses a plant natriuretic peptide-like protein to modify host homeostasis". PNAS. 105: 18631–18636.

12. Ota-Tsuzuki, C.,   Brunheira, A.T.P., Mayer, M.P.A., 2008, "16S rRNA region based  PCR    protocol for identification and subtyping of parvimonas micra". Brazilian Journal of   Microbiology. 39:605-607

13. Qing, Y., Nian ,W., 2011, "The ColR/ColS Two-Component System Plays Multiple Roles in the Pathogenicity of the Citrus Canker Pathogen Xanthomonas citri subsp. Citri". Journal of Bacteriology. 193:1590-1599.

14. Rubio, L., 2001, "Genetic  variation  of  Citrus  tristeza  virus  isolates  from California and Spain: evidence for mixed infections and recombination". J Viro,75: 8054-62.

15. Stepanauskas, R., Glenn, T.C., Jagoe, C.H., Tuckfield, R.C., Lindell, A.H., King, C.J., and J.V. McArthur,2006, "Coselection for microbial resistance to metals and antibiotics in freshwater microcosms". Environ. Microbiol. 8:  1510-1514.

16. Svetoslav, D. T., Monica, Wa., Elisabetta, T., Xavier, D., Maria, T. D., Leon, M. T. D.,  Bernadette, D. G. de M. F., Manuella, Vaz-V., Djamel, D., 2010, "Characterisation of  antiviral pediocin-like bacteriocin produced by Enterococcus faecium". Food   Microbiology. 27: 869-879.

 

 

Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 27, Issue 2 - Serial Number 2
August 2014
Pages 269-276
  • Receive Date: 10 September 2012
  • Revise Date: 06 December 2012
  • Accept Date: 12 December 2012