Evaluation of p53 gene expression changes on Lung (A549) and gastric (AGS) cancer cell lines under the impression of hydroalcoholic extract of Nepeta glomerulosa species

Document Type : Research Paper

Authors
Sepideh Sahebi
Golaleh Mostafavi
Seyyedeh Mahdokht Maddah
Department of Biology, Yadegar-e-Imam Khomeini (RAH) Shahre Rey Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
10.22034/cmr.2024.2324
Abstract
Lung and Gastric cancer are one of the most common types of cancer in the world and also in Iran. For finding therapeutic ways, researchers have been focused on changes in carcinoma cells at molecular level. Some natural phytochemical compounds affect apoptosis path and play an important role in producing and regulating processes involved in cancer. In the present research, the toxic effect of hydro-alcoholic extract of Nepeta glomerulosa on A549 and AGS cell lines, and p53 expression changes have been evaluated. The plant shoots were collected from Binalud region from Khorasan Province and 80% ethanolic extract was prepared by maceration technique. The cytotoxic properties of extract on two cell lines in three times, i.e., 24, 48, and 72 hours were assessed by MTT assay. Apoptosis induction amount was evaluated by DAPI staining. p53 gene expression alterations were determined using Real-time PCR. According to the results, the IC50 was 15 and 7.5 mg/mL, for A549 and AGS respectively (P

Keywords

Subjects

بررسی تغییرات بیان ژن p53 در سلول­های ردهA549  )سرطان ریه( و AGS )سرطان معده( تحت تاثیر عصاره هیدروالکلی گونه Nepeta glomerulosa

سپیده صاحبی، سیده مهدخت مداح* و گلاله مصطفوی

ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد یادگار امام خمینی (ره) شهرری، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 22/05/1402          تاریخ پذیرش: 19/07/1402

چکیده

سرطان­های ریه و معده از شایع­ترین انواع سرطان­ها در جهان و نیز در ایران هستند. برای یافتن راه­های درمانی محققان روی تغییرات در سطح مولکولی در سلول­های سرطانی متمرکز شدند. برخی ترکیبات شیمیایی گیاهی طبیعی بر مسیر پیام­رسانی آپوپتوزیس تاثیر گذاشته و در ایجاد و تنظیم فرایندهای درگیر در سرطان نقش مهمی را ایفا می­کنند. لذا در تحقیق حاضر اثر سمیت سلولی عصاره­ی هیدروالکلی گیاه Nepeta glomerulosa ، بر روی رده­های سلولی A549 و AGS و نیز تاثیر عصاره بر تغییرات بیان ژن p53 در این سلول­های سرطانی بررسی شد. سرشاخه­های گیاه از منطقه­ی بینالود در استان خراسان جمع­آوری شد و عصاره اتانولی %80 آن به روش خیساندن تهیه گردید. خاصیت سیتوتوکسیک عصاره بر روی دو رده سلولی در سه زمان،  یعنی 24 ،48 و 72 ساعت با استفاده از سنجش MTT مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان القای آپوپتوز با رنگ آمیزی DAPI ارزیابی شد. تغییرات بیان ژن p53 با کمک Real-time PCR تعیین گردید. بر طبق نتایج بدست آمده IC50 برای رده­های سلولی A549 و AGS به ترتیب mg/ml 15 و mg/ml 5/7 بدست آمد (05/0 P<). نتایج حاصل از رنگ آمیزی DAPI نشان داد تحت تاثیر عصاره در غلظت­های  IC50 القای آپوپتوز در هر دو رده نسبت به شاهد بیشتر بود. افزایش بیان ژن p53 تحت تأثیر عصاره در سلول­های ردة AGS بیشتر از سلول های رده A549 بود (05/0 P<)؛ که نشان دهنده بیشتر بودن اثر مهارکنندگی تکثیر عصارة این گونه بر روی سلول­های سرطان معده از طریق افزایش بیان ژن p53 و القای آپوپتوز است.

واژه های کلیدی: آپوپتوز، ژن p53 ، سمیت سلولی،  Nepeta glomerulosa

* نویسنده مسئول، تلفن 09122123712، پست الکترونیکی: s.m.maddah@iau.ac.ir

مقدمه

 

سرطان، تمام جنبه های زندگی بشر را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار داده است، به دلیل عدم درمان قطعی سرطان و افزایش تومورهای مقاوم به دارو و شیوع زیاد سرطان، تعداد مبتلایان به انواع این بیماری رو به افزایش است. آمارها نشان می دهد در سال 2020، حدود 10 میلیون مرگ مربوط به سرطان بوده است. پیش بینی شده است تعداد مبتلایان به سرطان از 3/19 میلیون در سال 2020 به 2/30 میلیون نفر در سال 2040 خواهد رسید (13).

سرطان ریه عامل اصلی مرگ و میر ناشی از سرطان در سراسر جهان است (20). نورسته­های (نئوپلاسم­های) ایجاد شده در سرطان ریه از نظر بافت شناسی بسیار ناهمگن هستند. تقریبا 98 درصد از سرطان­های ریه از نوع کارسینوم (تومور­های ایجاد شده از سلول­های اپیتلیال) می­باشند. سلول­های سرطانی کارسینوم ریه بر اساس سایز به دو دسته تقسیم می­شوند: SCLC (Small Cell Lung Cancer) سرطان ریه با سلول­های کوچک و سیتوپلاسم اندک که %10-15 مبتلایان را شامل می­شوند؛ گروه دوم  NSCLC (Non-small Cell Lung Cancer) که در این نوع، سلول­ها از نظر اندازه بزرگتر و نسبت هسته به سیتوپلاسم بیشتر است. %85-90 موارد ابتلا از نوع دوم یعنی NSCLC می­باشند (23و34). رده A549 سرطان ریه از دسته دوم می­باشد. در کشور ما آلودگی هوا، سیگار و وجود آزبست از عوامل اصلی ایجاد و بروز سرطان ریه هستند. بر طبق آماری در سال 2014 تعداد مبتلایان به سرطان ریه در کشور حدود 8 هزار نفر برآورد شده است. پیش بینی می­شود در سال 2030 این تعداد به 28 هزار نفر برسد و در صورت عدم توجه، مشکل اصلی کشور در سال 2030، خواهد بود (3).

سرطان معده یکی از علل عمده مرگ ومیر ناشی از سرطان در کل دنیاست و در حال حاضر پس از سرطان ریه مقام دوم را دارد. کارسینوما که در واقع بدخیمی سلول­های اپیتلیالی است از پرتکرارترین انواع سرطان­هاست. آدنوکارسینوماها %95 تومورهای بدخیم معده را شامل می­شود و شایع­ترین فرم سرطان معده است. انواع دیگر مانند  لنفوما، تومورهای استرومال و سایر تومورهای نادر %5 باقی­مانده انواع سرطان معده را شامل می­شوند (14). ردة سلولی AGS (Adenocarcinoma Gastric Line)، ردة سلولی سرطان معده از نوع آدنوکارسینوما می­باشد. در ایران، عفونت ناشی از هلیکوباکترپیلوری، مصرف دخانیات، رژیم غذایی پرنمک و عدم دریافت کافی آنتی اکسیدان از عوامل ابتلا به این بیماری گزارش شده­اند (17و35).

برای یافتن راه­های درمانی، محققان روی تغییرات در سطح مولکولی در سلول­های سرطانی متمرکز شدند. در انسان در %50 یا بیش از %50 سرطان­ها ژن سرکوب­گر تومور p53 جهش یافته است و در نتیجه سنتز پروتئین آپوپتوزی P53 صورت نمی­گیرد؛ بنابراین عملکرد این پروتئین برای فعال­ کردن ژن­های هدف که مربوط به چرخه سلول و آپوپتوز هستند مختل می­شود (34). ژن p53 در موقعیت 17p13.1 قرار گرفته است و یک فسفو پروتئین با عملکرد چندگانه را کد می­کند که این پروتئین با سرطان­زایی ارتباط دارد (33). نقص مسیرهای سیگنال­دهی سلولی مختلف می­تواند منجر به اختلال در تنظیم آپوپتوز و بروز سرطان ­شود، ژن سرکوب­گر تومور p53 چرخه سلولی را تنظیم می­کند وگسترده­ترین ژن جهش یافته در تومورزایی انسان است (8). در پاسخ آسیب به  DNA، به واسطه عمل پروتئین P53، چرخه سلولی متوقف می­شود و اجازه می­دهد سیستم­های ترمیم سلولی فعال شود. فعال شدن سیستم­های ترمیمی مانع تثبیت دائمی جهش­ها در ژنوم، بعد از میتوز می­شود و در مواردی که آسیب جبران ناپذیر است، آپوپتوز را القا می­کند که با افزایش رونویسی از ژن BAX انجام می­شود. پروتئین BAX، می­تواند با مهارکننده­های آپوپتوز دیمر تشکیل دهد و آنها را غیرفعال کند تا سلول بتواند دچار مرگ برنامه­ریزی شده سلولی شود (30).

در بین بیماران مبتلا به سرطان ریه جهش در ژن p53 شایع است. در سرطان ریة سلول­های غیر کوچک   (NSCLC) تا %50 و در نوع سلول­های کوچک (SCLC) تا %80 ژن p53 دارای جهش است (21). با توجه به مطالعه­های انجام شده روی جهش­های ژنی، p53 قابل توجه­ترین ژن جهش یافته در بدخیمی­ها از جمله سرطان معده است (22). جوشقانی و همکاران مطالعه­ای را برای تعیین جهش­های p53 در مبتلایان سرطان معده سه مرکز بیمارستانی در تهران به روش PCR-SSCP انجام دادند که در آن میزان بروز جهش در ژن p53 در سرطان معده 5/20درصد به دست آمدکه بیانگر فراوانی متوسط جهش ژن p53  در جامعة مورد مطالعه است (18). طبق گزارش­های شیائو در ایتالیا، میزان جهش در ژن p53  مبتلایان به سرطان معده 66درصد گزارش شد (31).

برخی شواهد حاکی از تاثیر ترکیبات گیاهی طبیعی بر مسیر پیام­رسانی آپوپتوز می­باشد که در ایجاد و تنظیم فرایندهای درگیر در سرطان نقش مهمی را ایفا می­کند. این تاثیر می­تواند بر مسیر داخلی یا خارجی آپوپتوز از طریق افزایش تولید گونه­های فعال اکسیژن، تغییر فعالیت پروتئین­های پروآپوپتوتیک یا آنتی­آپوپتوتیک و هم­چنین آنزیم­های کاسپاز باشد. بنابراین استفاده از مواد فیتوشیمیایی برای تنظیم این مسیر پیام­رسانی به عنوان راهکار امیدوارکننده­ای در تکمیل و کاهش عوارض جانبی شیمی­درمانی بیماری سرطان مطرح می­باشد(1).

جنس نپتا از خانواده Lamiaceae با حدود 300 گونه پراکنده در مرکز و جنوب اروپا، شرق نزدیک و آسیای مرکزی و جنوبی است. بسیاری از گونه­های این جنس از جمله 76 گونه بومی ایران هستند (6). تنوع زیاد و محتوای غنی از ترپنوئید ، فلانوئید و ترکیبات فنلی گونه­های نپتا اثرات فارماکولوژیکی دارند و توجیهی برای استفاده سنتی آنها برای اهداف دارویی است (12و 32). گونة Nepeta glomerulosa معروف به پونه سای انبوه، گیاهی چند ساله به ارتفاع 30-50 سانتیمتر پوشیده از کرک­های تار مانند و ساقه بلند و باریک و متعدد است که در قسمت انتهایی فاقد برگ می­باشد (5).  اندام­های هوایی نپتا گلومرولوزا به طور تجربی در طب عامیانه به عنوان ضد سرفه استفاده می­شود (16). مواد تشکیل­دهنده عصاره نپتا گلومرولوزا آلکالوئید، ساپونین و روغن است (11).

از آنجائیکه که ترکیبات فلانوئیدی و فنلی این جنس­ ممکن است خواص آنتی­اکسیدانی و ضد­توموری داشته باشد و تاکنون تاثیر عصارة نپتا گلومرولوزا بر سلول­های A549 سرطان ریه و ردة سلولی AGS سرطان معده مورد مطالعه قرار نگرفته است، در پژوهش حاضر ضمن بررسی خواص سیتوتوکسیک عصاره هیدروالکلی بخش­های هوایی این گیاه تاثیر آن بر تغییرات بیان ژن p53 مورد مطالعه قرار گرفت.

مواد وروشها

جمع­آوری گیاه : سرشاخه­های گلدار گیاه نپتا گلومرولوزا Nepeta glomerulosa)) از ارتفاع2203 متر کوه­های بینالود در استان خراسان رضوی (شمال شرق نیشابور و غرب مشهد) N=36°,16,826و E= 0.59°,0.7,484 در اوایل تیر ماه جمع آوری گردید. با کدFUMH) ) 36809 توسط پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد شناسایی شد. به منظور خشک شدن گیاه، سرشاخه­های گلدار جمع آوری شده در مجاورت با هوا در شرایط و مکان مناسب و در سایه به مدت یک هفته قرار داده شدند و سپس با خردکن پودر شدند.

عصاره­گیری: عصاره­گیری از گیاه نپتا گلومرولوزا به روش خیساندن انجام شد. 40 گرم از پودر خشک شده گیاه در ظرف شیشه­ای در­دار ریخته شد و سپس 400 میلی لیتر اتانول %80 به آن اضافه گردید. ظرف به مدت 24 ساعت در دستگاه انکوباتور شیکر­دار (innova42) ساخت شرکت اپندورف آلمان در دمای 40 درجه سانتی­گراد با دور 100 rpm قرار داده شد. بعد از 24 ساعت عصاره­ی رویی با کاغذ صافی واتمن 1 و پارچه تنظیف صاف شد، عصاره­ها در چند پلیت ریخته و با کمک هیتر در دمای 40 درجه سانتی­گراد و باد سرد سشوار تغلیظ و خشک گردید(7).

کشت سلول : سلول­های رده­ی A549 سرطان ریه، سلول­های رده­ی AGS سرطان معده و رده  سلولی نرمال فیبروبلاست HDF، از مرکز ذخایر ژنتیکی ایران خریداری شدند. محیط کشت DMEM برای رده­ی  A549و محیط کشت RPMI-1640 برای رده­ی AGS به همراه سرم جنین گاوی یا FBS 10% (همگی مارک Gibco ساخت آمریکای جنوبی) استفاده شد. برای رده نرمال محیط رشد فیبروبلاست PCS-201-030  بکار رفت. همچنین آنتی بیوتیک­های پنی سیلین (100U/ml) و استرپتومایسین 100 میلی­گرم در میلی­لیتر (BIO-IDEA، ایران) به محیط اضافه گردید. فلاسک­های 25 سانتی­متر مربعی حاوی سلو­ل­های کشت شده تا زمان استفاده در انکوباتور CO2دار حاوی 5 درصد CO2 و رطوبت 95%  در دمای 37 درجه سانتی­گراد قرار داده شد. سلول­ها هر سه روز یک بار پاساژ داده شدند(25 و 27).

بررسی اثر سیتوتوکسیک عصاره با آزمون MTT: پس از رشد وتکثیر مناسب سلول­ها در فلاسک­ها سلول­ها به کمک لام نئوبار شمارش شد. سه پلیت 96 خانه برای زمان­های  48،24 و72 ساعت آماده گردید؛ به طوریکه در هر چاهک پلیت 96 خانه 10000سلول کشت شد. بعد از 24ساعت محیط رویی هر چاهک خارج ­شد. مقدار 2 گرم از عصاره تغلیظ و خشک شده  نپتا گلومرولوزا با 10میلی­لیتر محیط کشت رقیق شد. از استوک ساخته شده برای عصاره غلظت­های25، 20، 15، 5/7، 75/3، 62/1، 81/0، 40/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر تهیه و برای هر غلظت سه تکرار در نظر گرفته شد. پس از تیماردهی پلیت­ها در انکوباتور قرار داده شد. پلیت اول 24 ساعت بعد از انکوباتور خارج شد و پس از خروج مایة رویی، در تاریکی به هر چاهک 50 میکرولیتر محلول MTT  5 میلی­گرم بر میلی­لیتر زرد رنگ، اضافه گردید. پس از4 ساعت انکوبه شدن پلیت در انکوباتور، رنگ MTT خالی و به هر چاهک 50 میکرولیتر DMSO  اضافه شد و پلیت با فویل آلومینیومی پیچیده شد؛ سپس پلیت، حدود 1 ساعت، در انکوباتور انکوبه شد تا کریستال­های ارغوانی رنگ حاصل از احیاءMTT  در آن حل شود. در نهایت جذب نوری هر نمونه در طول موج 570 نانومتر با دستگاه الایزا ریدر (Epoch Microplate Spectrophotometer) شرکت Biotek هند، اندازه گیری شد (4 و31). شدت رنگ ارغوانی حاصله معرف نسبت سلول­های زنده در هر چاهک است. این مراحل 48 ساعت بعد برای پلیت دوم و 72 ساعت بعد برای پلیت سوم تکرار شد. درصد زنده مانی سلول­ها بر اساس فرمول زیر محاسبه گردید:

100× (میانگین جذب نوری کنترل/میانگین جذب نوری نمونه)= میزان بقا­ی­سلول

سنجش میزان آپوپتوز با روش DAPI: بر اساس نتایج تست MTT رده­های سلولی A549 و AGS به مدت 24 ساعت به ترتیب با غلظت 15 و 5/7 میلی­گرم بر میلی­لیتر(غلظت­های IC50) تحت تیمار عصاره گیاه نپتا گلومرولوزا در پلیت های 6 خانه کشت شدند. سپس محلول­رویی سلول­ها خارج و سلول­ها با بافر شستشوی سالین فسفات PBS  شسته شدند و سپس با فرمالدئید/PBS 4% (پارافرمالدئید)، به مدت 15 دقیقه تثبیت شدند. 1/2 میلی­لیتر از محلول استوک DAPI (5 میلی­گرم بر میلی­لیتر) را به 100 میکرولیتر PBS اضافه نموده تا رقت 300 میکرومولار ساخته شود. محلول DAPI  آماده شده روی سلول­ها ریخته شد تا آنها را کامل بپوشاند.5 دقیقه دور از نور انکوبه کرده و سپس محلول را دور ریخته و در نهایت 2- 3 بار سلول­ها با PBS شستشو داده شدند. سلول­ها با میکروسکوپ فلورسنت (فیلتر آبیNikon آلمان) مشاهده و عکسبرداری گردیدند.

استخراج RNA : سلول­های رده­ها­ی  A549 و AGS تحت تیمار غلظت(IC50)   15 و 5/7 میلی­گرم بر میلی­لیتر عصاره کشت داده شدند. تعداد106×5 سلول در700 میکرولیتر محلول(cat.No.302-001) RiboEX ساخت شرکت GeneAll کره هضم شدند و ادامه مراحل استخراج بر اساس دستور العمل کیت انجام شد. خلوص RNA استخراج شده با دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ ((Milton Roy- Spectronic 21D- USA تعیین شد (26).

سنتز cDNA : نمونه الگو در واکنش‌های Real-time PCR مولکولcDNA  می‌باشد که بایستی مولکولRNA به DNA تبدیل گردد برای این منظور از کیت Easy cDNA synthesis(cat.A101161) ساخت شرکت پارس طوس ایران استفاده شد و مطابق با دستورالعمل آن سنتز cDNA انجام شد. به طور خلاصه، در یک میکروویال در حجم واکنش 10 میکرولیتر، 5/0 میکرولیتر اولیگو (dT) پرایمر با 5/4 میکرولیتر (mRNA+آب) مخلوط شد، به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی­گراد انکوبه شد و سپس به مدت حداقل 1 دقیقه روی یخ قرار گرفت. سپس 5 میکرولیتر مخلوط Master و 10 میکرولیتر مخلوط سنتز cDNA به مدت 45 دقیقه در دمای 55 درجه سانتی­گراد انکوبه شد و واکنش­ها در دمای 85 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه، در نهایت در دمای 25 درجه سانتی­گراد، 5 دقیقه پایان یافت. نمونه روی یخ سرد شد و 1 میکرولیتر H RNase به لوله اضافه شد و به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شد. محصول واکنش سنتز cDNA در دمای 20- درجه سانتیگراد ذخیره شد.

Real-time PCR: تـوالی ژن p53 به عنـوان ژن هدف و ژن GAPDH به عنـوان ژن مرجـع از سـایت www.ncbinlm.nih.gov با کدهای دسترسی مندرج در جدول1، بدست آمد. با توجه به بررسی منابع و طراحی پرایمر با نرم‌افزارهای  Gene ruuner و ابزار Primer3 (version 0.40) توالی مناسب مطابق جدول 1 انتخاب گردید(29) و توسط شرکت ژن فناوران سنتز گردید.

 

 

جدول 1- توالی پرایمرهای ژن هدف و ژن مرجع و طول محصول هر جفت پرایمر

نام ژن و A.N

توالی پرایمر (دمای اتصال 60 درجه)

طول محصولbp

GAPDH

NM_001357943.2

Forward

CTCATTTCCTGGTATGACAACG

122

Reverse

CTTCCTCTTGTGCTCTTGCT

p53

NC_000017.11

Forward

GCGAGCACTGCCCAACAACAC

93

Reverse

TCACGCCCACGGATCTGAAGG

 

 

در این مطالعه از کیت   YTA SYBR Green qPCR, Master Mix 2X و رنگGreen  SYBR استفاده شد. واکنش qPCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 5/12 میکرولیتر سایبرگرین، 1 میکرولیتر cDNA، 1 میکرولیتر از هر پرایمر (pmol/µl 2/0) و 5/9 میکرولیتر آب مقطر بود. میکروویال ها در دستگاه Rotor Gene 6000 Qagen جهت تکثیر قطعات در 40 چرخه با برنامه دمایی زیر قرار داده شد: دناتوراسیون اولیه در دمای C° 95 به مدت 15 دقیقه و برای هر چرخه به مدت 15 ثانیه، در همین دما، برای اتصال پرایمرها در C°60 به مدت 1 دقیقه و برای گسترش در دمای C°71 به مدت 10 ثانیه در نظر گرفته شد. پس از آن تجزیه وتحلیل منحنی ذوب برای هر تکثیر PCR در محدوده دمایی از C°24 تا 35 انجام شد (29). آزمایش در دو تکرار انجام شد. داده­های بلند شدن نمودار و تکثیر برای بدست آوردن کارایی واکنش در نرم افزار 2009 REST انجام گردید. بعد از بدست آوردن E، از فرمول زیر برای محاسبه  Fold Change ژن از 2016 Excel استفاده شد.

بررسی تکثیر اختصاصی محصولات Real-time PCR توسط ژل الکتروفورز: محصولات تکثیر شده ژن هدف و مرجع طی Real-time PCR روی ژل آگارز 2% بارگذاری و الکتروفورز شد. این مرحله جهت تایید تکثیر قطعات اختصاصی هر ژن و عدم حضور محصولات غیر اختصاصی انجام گرفت.

تجزیه و تحلیل آماری: پس از محاسبه درصد زنده­مانی سلول­ها و IC50 به کمک نرم افزار Excel 2016 و GraphPad Prism 9.5.1 به منظور مقایسه میانگین زنده­مانی بین 24،48 و72 ساعت به کمک همان نرم افزارها از آزمونTwo way ANOVA استفاده شد. نتایج حاصل از آزمایش Real-time شامل CT نمونه­ها به همراه Amplification آن­ها، به وسیله نرم افزار REST مورد ارزیابی قرار گرفت. از داده­های به دست آمده برای رسم نمودار و انجام آزمون­های آماری T Test جهت مقایسه تغییرات بیان ژن بین دو رده سلولی و شاهد به طور مجزا به کمک نرم افزار GraphPad Prism 9.5.1 استفاده شد. مقایسه معنی داری اختلاف میانگین­ها با آزمون توکی انجام شد. تمام آزمون ها در سطح معناداری (p value < 0.05)  به انجام رسید.

نتایج

نتایج خواص سیتوتوکسیک عصاره: خواص سمیت سلولی عصاره هیدروالکلی نپتا گلومرولوزا در سه زمان 24 ، 48 و 72 ساعت بر روی رده­ی سلولی A549 سرطان ریه و رده­ی سلولی AGS سرطان معده و رده نرمال HDF مورد بررسی قرار گرفت. به منظور محاسبه و مقایسه درصد زنده­مانی سلول­ها ضمن نرمال­سازی داده­ها درصد زنده­مانی نمونه­های کنترل (بدون تاثیر عصاره) صددرصد در نظر گرفته شد. بمنظور یکسان بودن حجم در همه چاهک­ها در نمونه­های کنترل به جای عصاره همان حجم محیط کشت اضافه شد. IC50 برای سلول­های رده A549، mg/ml 15 عصاره پس از 24 ساعت تیماردهی بدست آمد (شکل1- الف).

 

شکل1- نمودارهای درصد زنده­مانی سلول­ها: الف) نمودار IC50 در رده سلولی A549 ب) نمودار IC50 در رده سلولی AGS  ج و د) نمودارهای مقایسه میانگین درصد زنده­مانی سلول­های رده A549 (ج) و سلول­های رده  AGS(د) با تجزیه واریانس دو طرفه (اثر متقابل زمان در غلظت). درصد زنده­مانی در همه غلظت­ها در هر دو رده (24 ساعت پس از تیماردهی نشان داده شده است) اختلاف معنی­دار با شاهد داشتند (P=0.05 تاP=0.0001). ه) نمودار درصد زنده­مانی رده سلولی نرمال HDF که IC50 ندارد و بین غلظت­های مختلف عصاره تفاوت معنی­داری بین درصد زنده­مانی سلول­ها وجود ندارد.                                      (***= 001/0P و ****= 0001/0 P و ns= بی معنی).

 

48 و 72 ساعت پس از تیماردهی در همین غلظت حدود 61 درصد سلول­ها زنده بودند که نشان دهنده آن است که قدرت سیتوتوکسیک ترکیبات عصاره این گیاه با گذر زمان کمتر شده است. IC50 برای سلول­های ردة AGS، mg/ml 5/7 عصاره پس از 24 ساعت تیماردهی بدست آمد (شکل1- ب). اما پس از 48 و 72 ساعت پس از تیماردهی IC50 مقداری بین  mg/ml 15 و 5/7 می­باشد. اثر سمیت سلولی عصاره بر روی هر دو رده با افزایش غلظت افزایش ­یافت. با توجه به کمتر بودن مقدار IC50 در رده سرطان معده تاثیر سیتوتوکسیک عصاره بر سلول­های سرطان معده بیش از سلول­های سرطان ریه بوده است.

تجزیه و تحلیل آماری اثر زمان و غلظت بر روی درصد زنده­مانی سلول­ها با تجزیه واریانس دوطرفه معنی­دار بودن اختلاف بین میانگین درصد زنده­مانی سلول­ها را در زمان­ها و غلظت­های مختلف در سطح کمتر از 5 درصد نشان داد (شکل 1- ج و د). کاهش تعداد سلول­های نرمال تحت تاثیر عصاره گیاه کم بود و به میزان IC50 نرسید ( شکل1- ه).

نتایج بررسی وضعیت آپوپتوز سلول­ها با رنگ آمیزی DAPI : به منظور بررسی میزان آپوپتوز القا شده با توجه به نتایج بدست آمده از تست MTT سلول­ها در دو گروه شاهد و 24 ساعت تیمار با غلظت mg/ml 15و 5/7 عصاره تام گیاه نپتا گلومرولوزا کشت شدند؛ سپس رنگ آمیزی DAPI انجام شد. تصاویر سلول­ها در شکل 2 برای هر گروه در بزرگنمایی -m50µ نشان داده شده است. به طور کلی هسته­ها تحت تاثیر رنگ DAPI آبی رنگ شده است. در نمونه­های شاهد یا کنترل هسته­ها سالم و شکل آنها بطور یکنواخت است (شکل 2 -الف وج). در نمونه­های تحت تیمار با عصاره تعداد سلول­ها کمتر شده و هسته تعدادی از سلول­ها تحت تیمار با عصاره­ها غیر یکنواخت و نقطه نقطه است که نشان دهنده بروز آپوپتوز است (شکل 2- ب و د).

 

 

شکل2- تصاویر رنگ­آمیزی سلول­ها با DAPI: الف) سلول­های رده A549 کنترل، ب) سلول­های رده A549 تیمارشده با  mg/ml 15عصاره نپتا گلومرولوزا ج) سلول­های رده AGS کنترل، د) سلول­های رده AGS تیمارشده با  mg/ml5/7 عصاره نپتا گلومرولوزا. فلش­ها سلول­هایی که غیر یکنواخت و نقطه نقطه هستند که نشان دهنده بروز آپوپتوز است را نشان می­دهند.

 

 

نتایج تغییر بیان ژن p53 : در شکل 3 تغییرات بیان ژن p53 در گروه های A549 و AGS بصورت جداگانه آنالیز شده اند، اما نتایج در یک نمودار ارائه شد­ه اند. در این نمودار گروه کنترل یا شاهد بعنوان مرجع محاسبه Fold change  در نظر گرفته شده است. مقایسه با آزمون تی تست (جدول2)، نشان داد افزایش بیان این ژن در سلول­های رده A549 سرطان ریه که تحت تیمار mg/ml15عصاره بودند نسبت به کنترل معنی دار نبوده است.  در حالیکه این افزایش بیان به میزان 1435/2 برابر در سلول­های رده AGS تحت تیمار mg/ml 5/7 عصاره نسبت به کنترل، در سطح یک درصد معنی دار بوده است (P<0.01).

 

شکل 3- مقایسه تغییرات بیان ژن P53 بین سلول های رده  A549 ونمونه شاهد ونیز بین سلول­های رده  AGS و نمونه کنترل یا شاهد به طور مجزا، اما نتایج در یک نمودار ارائه شده اند.

در شکل4 گروه  A549:کنترل،  به عنوان مرجع محاسبه Fold change در نظر گرفته شده است و همه گروه­ها با آن مقایسه شده است. در این حالت بیشترین میزان بیان p53 در گروه AGS : با عصاره، مشاهده گردید که میانگین بیان آن در این گروه برابر  با 0841/0 ± 1435/2 می باشد. بیان ژن در گروه­هایA549  با عصاره وAGS  با عصاره نسبت به گروه  A549: کنترل بترتیب افزایش معنی­داری در سطح 05/0و 01/0 نشان دادند.

 

شکل4- مقایسه تغییرات بیان ژن بین دو رده سلولی . در این مقایسه گروه  A549:کنترل، بعنوان مرجع محاسبه fold change در نظر گرفته شده است. در سلول­های هر دو ردة سلولی تحت تیمار با عصاره نپتا گلومرولوزا بیان ژن  p53 افزایش معنی دار داشته است. ns: معنی دار نیست، * در سطح 5 درصد معنی دار است، ** در سطح 1 درصد معنی دار است.

 

 

 

جدول 2-مقایسه نمونه شاهد با تیمارشده با عصاره برای هر رده سلولی به طور مجزا با آزمون T

مقایسه

آزمون

خلاصه

P.value

Fold change

شرح

تیمار با شاهد در A549

T

ns

06225/0

454/1

بیان ژن 1.454 برابر شده

تیمار با شاهد در AGS

T

**

00945/0

1435/2

بیان ژن 2.1435 برابر افزایش یافته

ns: معنی دار نیست، * در سطح 5 درصد معنی دار است، ** در سطح 1 درصد معنی دار است.

 

 

 

بحث

با توجه به شیوع سرطان ریه و معده و نیز سختی درمان آنها محققین در پی یافتن ترکیبات دارویی جدید هستند تا راهی برای درمان این سرطان­ها بیابند. اخیرا گیاهان دارویی و فرآورده­های مشتق شده از آنها به عنوان یک منبع ارزشمند فارماکولوژیکی و عوامل درمانی با فعالیت­های بیولوژیکی مختلف در نظر گرفته می­شوند (28). در پژوهش حاضر به بررسی میزان سمیت سلولی عصاره هیدروالکلی  نپتا گلومرولوزا بر رده A549 سرطان ریه و رده AGS  سرطان معده و تاثیر آن بر بیان ژن p53  پرداخته شد.

نتایج نشان داد خواص سیتوتوکسیک عصاره گیاه نپتا گلومرولوزا بر روی سلول­های ردة AGS  سرطان معده بطور معنی داری بیشتر از سلول­های ردة A549 سرطان ریه است زیرا IC50 در ردة AGS    mg/ml5/7 بود و در ردة A549 mg/ml 15 بود و عصاره این گیاه در غلظت­های کمتری توانسته موجب مرگ %50 سلول­های سرطان معده  شود. از آنجائیکه گیاه نپتا گلومرولوزا به سبب عطر و طعم خود بعنوان طعم دهنده در صنایع غذایی و بهداشتی استفاده می­گردد، می­توان امید داشت استفاده از عصارة این گیاه در برخی مواد غذایی ­بتواند نقش مهار تکثیر سلول­های سرطان معده را نیز ایفا کند بویژه که تاثیر خاصی بر سلول­های نرمال نداشت. حتی نقش پیشگیری از سرطان ترکیبات تشکیل دهندة عصاره این گیاه می­تواند مورد تحقیق و بررسی قرار گیرد. تنوع زیاد و محتوای غنی از ترپنوئید، فلانوئید و ترکیبات فنلی گونه­های نپتا اثرات فارماکولوژیکی دارند که استفاده سنتی آنها برای اهداف دارویی را توجیح می­کند (12). مواد تشکیل­دهنده عصارة نپتا گلومرولوزا آلکالوئید، ساپونین و روغن گزارش شده است (11) که می­توان خواص سیتوتوکسیکی عصارة این گیاه را به این ترکیبات نسبت داد. کانگول و همکاران در سال 2022 با بررسی خواص سیتوتوکسیک چندین گونه از نپتا بر رده­های سلولی سرطان سینه نشان دادند ساپونین و ترپنوئیدهای این عصاره­ها خواص سیتوتوکسیک دارند (19).

بررسی اثر ضد سرطانی عصاره کلروفرم نپتا دفلرزیانا نشان داد میزان زنده­مانی سلول­های سرطان سینه MCF-7 و سلول های سرطانی ریه A549 کاهش یافت و مورفولوژی سلول ها دستخوش تغییرات قرار گرفت (24). نتایج این تحقیق همسو با نتایج پژوهش حاضر است. اما در پژوهش دیگری که امامی و همکاران در سال 2018 انجام دادند عصاره گیاه نپتا گلومرولوزای منطقه چهارمحال و بختیاری بین 50-100 میکروگرم بر میلی­لیتر برچندین رده سلولی سرطانی مانند کبد تخمدان پروستات سینه خواص سیتوتوکسیک نداشت (9). در پژوهش حاضر نیز مقادیر کم عصاره مورد سنجش قرار گرفت که خواص سیتوتوکسیک نداشت لذا مقدار غلظت­های بکار رفته شده در این تحقیق از میکروگرم بر میلی­لیتر به میلی­گرم بر میلی­لیتر افزایش یافت. در پژوهشی مشابه غلظت­های مختلف عصاره هیدرواتانولی پونه (Mentha longifolia)و درمنه (Artemisia persica) نیز مهار تکثیر قوی و وابسته به غلظت سلول­های سرطانی AGS را نشان دادند و در انکوباسیون 72 ساعت بیشترین درصد مرگ سلولی مشاهده گردید(2).

تصاویر بدست آمده از رنگ آمیزی DAPI  کاهش تعداد سلول­های زنده و القای آپوپتوز را در سلول­های تحت تیمار با عصاره نشان داد هر چند انجام تست­های تکمیلی و دقیق­تر مانند فلوسایتومتری جهت اطمینان از میزان آپوپتوز توصیه می­گردد.  IC50 عصاره اتیل استات و عصاره اتانولی گل­های Nepeta paulsenii Briq بر روی ردة سلولی ریه A549 مقادیر 57/51 میکروگرم بر میلی­لیتر و 58/50 میکروگرم بر میلی­لیتر بود و نتایج رنگ­آمیزی Hoechst 33342 نشان دهنده آپوپتوز یعنی شکستگی در کروماتین و تکه تکه شدن هسته بود (15).

براساس نتایج به دست آمده در تحقیق حاضر میزان بیان ژن p53   در سلول­های هر دو رده تحت تیمار عصاره تام گیاه نپتا گلومرولوزا افزایش یافته است و این افزایش میزان بیان ژن در سلول­های ردة AGS  سرطان معده تحت تاثیر عصاره به طور معنی­داری هم بیشتر از نمونه­های شاهد و هم بیشتر از سلول­های ردة A549 سرطان ریه بوده است. به این ترتیب بنظر می­رسد عصاره گیاه نپتا گلومرولوزا از طریق تاثیر بر بیان ژن p53 موجب القای آپوپتوز شده است.  ژن p53  فاکتور رونویسی 53KD را کد می­کند که به طور طبیعی در غلظت­های پایین در سلول­ها وجود دارد و در شرایط استرس سلولی مانند هیپوکسی، آسیب DNA و کاهش ریبونوکلئوتید غلظت پروتئین  P53 به سرعت بالا می­رود و فعالیت P53 افزایش یافته و اتصال اختصاصی آن به DNA افزایش می­یابد فعال شدن p53 روی بیان تعدادی از ژن­های دخیل در توقف چرخه سلولی و آپوپتوز تاثیر می­گذارد (30). مطالعه فان و همکاران (2017) بر روی اثر فلاونوئید کل Nepeta cataria L بر رده سلولی A549 سرطان ریه نشان داد، فلاونوئید کل این گونه می­تواند بیان ژن miR-126 را مختل کند و مسیر سیگنالینگ PI3K-AKT را برای پاسخگویی به اثر ضد سرطانی تنظیم کند(10). در تحقیقی که  امیرزاده و همکاران (2022) بر روی اثر ضد سرطانی اسانس Nepeta mahanesis  انجام دادند، مشخص شد که این ترکیب باعث افزایش نسبت بیان Bax / Bcl2 در سلول‌های MCF-7 و القای آپوپتوز (27 درصد) و نکروز (18 درصد) در سلول‌ها شد(6).

نتیجه گیری کلی

 نتایج مطالعات حاضر نشان داد عصاره گیاه نپتا گلومرولوزا یا همان پونه­سای انبوه موجب کاهش تکثیر سلولی هر دو رده سرطانی ریه و معده شد. در حالیکه تاثیری بر سلول­های نرمال نداشت. در رده سلولی AGS سرطان معده در غلظت­ mg/ml 5/7 نقش مهار کنندگی تکثیر داشت که نشان دهنده تاثیر مهارکنندگی رشد بیشتر این عصاره برروی این رده است. لذا با توجه به طعم و بوی این گیاه و کاربرد آن بعنوان طعم دهنده می­توان از خواص درمانی آن نیز بهره برد. البته بررسی غلظت­های دیگر آن و نیز بررسی روش­های بهبود کارایی و کاهش غلظت مورد نیاز از عصاره مانند استفاده از آن در ساخت نانو ذرات برای تحقیقات آینده پیشنهاد می­گردد. همچنین در پژوهش حاضر مشخص گردید که این عصاره با کاهش بیان ژن p53 در هر دو رده سلولی موجب سمیت سلولی گردید.

تشکر و قدردانی

بر خود لازم می دانیم که از کلیه عزیزانی که ما را در انجام آزمایش­ها در دانشگاه آزاد واحد یادگار امام (ره) شهرری و نیز آزمایشگاه ژینوژن یاری نمودند کمال تشکر و قدردانی را داشته باشیم.

1- جوانمرد، ا. 1400. نقش مواد فیتو­شیمیایی در درمان سرطان از طریق راه­اندازی مسیر آپوپتوزیس. اولین همایش ملی گیاهان دارویی ،کارآفرینی و تجاری سازی، دانشگاه جیرفت.
2- سفالیان، ا، زارع ن، لطیفی ن، حسن­پور، س، ریحانی، ک، مطلبی نیا، س. 1399. بررسی اثر ضد سرطانی عصاره اتانلی دو گیاه پونه ((Mentha longifolia و درمنه (Artmisia persica ) بر علیه سلول­های سرطانی معده انسان AGS)). مهندسی ژنتیک و ایمنی زیستی 9: 1، 1-10.
3- ولی­اله، ص. 1394. تخمین بروز استاندارد شده سنی سرطان ریه در ایران برای سال­های 2014 و 2030، مجله علوم پیراپزشکی و بهداشت نظامی 10: 1.
4- مداح، س. م، مراقبی، ف، سرحدی، س، 1401.  مقایسه خواص سیتوتوکسیک اسانس و عصاره Juniperus excelsa در دو منطقه البرز بر رده­ی سلولی سرطان ریه A549. مجله پژوهش­های سلولی و مولکولی (مجله زیست­شناسی ایران)، 35: 4.
5- نجف پور نوایی، م. 1379. بررسی اکولوژیک گیاهان اسانس­دار روی سه جنس Mentha, Nepeta، Thymus  در استان تهران. تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران 5، 1 - 25.
 
6-      Amirzadeh, M., Soltanian S., & Mohamadi N. 2022. Chemical composition, anticancer and antibacterial activity of Nepeta mahanensis essential oil. BMC Complementary Medicine and Therapies, 22,173.
7-      Azimi, Y., Maddah, S. M., & Mostafavi, G. 2021. 'The comparative study of the antioxidant activity of aqueous and hydroalcoholic extracts of an Iranian endemic species Rhabdosciadium aucheri Boiss.' Iranian Journal of Plant Physiology, 11 (3), 3701- 3708.
8-      Elmore S. 2007. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death.
9-      Emami, S. A., Kheshami S., Ramazani E., Akaberi M., Iranshahy M., Kazemi S.M., Tayarani-Najaran Z. 2018. Cytotoxic Activity of Thirteen Endemic and Rare Plants from Chaharmahal and Bakhtiari Province in Iran. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 18(4),1912-1920.
10-   Fan, J., Bao, Y., Meng, X., Wang, S.H., Li, T., Chang, X., Yang, G., & Bo, T. 2017. Mechanism of modulation through PI3K-AKT pathway about Nepeta cataria L.’s extract in non-small cell lung cancer. Oncotarget, 8(19), 31395-31405.
11-   Fazly Bazzaz B.S., Haririzadeh, G., Imami, S.A., & Rashed, M.H.1997. Survey of Iranian plants for alkaloids, flavonoids, saponins,and tannins (Khorasan province). International Journal of Pharmacy, 35, 17-30.
12-   Formisano, C., Rigano, D., Arnold, N. A., Piozzi, F., & Senatore, F. 2013. GC and GC–MS analysis of the essential oil of Nepeta cilicica Boiss. ex Benth. from Lebanon. Natural Product Research, 27(21), 1975–1981.
13-   Ganjouzadeh, F., Khorrami, S., & Gharbi, S. 2022. Controlled cytotoxicity of Ag-GO nanocomposite biosynthesized using black peel pomegranate extract against MCF-7 cell line. Journal of Drug Delivery Science Technology, 71, 103340.
14-   Ghasemi Gerami, K. 2009. Investigation of biological anti-cancer and antibacterial properties of some nanometer materials and halloo complexes of intermediate elements. Ph.D. thesis, Department of Biology, Faculty of Science, Mohaghegh Ardabili University, Ministry Science Research and Technology, Ardabil.
15-   Hanif, A., Ibrahim, H., Sidra I., Sawsan S., Al-Rawi, J., Nazeer, A., Mansoor H., Ghulam, M., & Samina, T. 2023. Cytotoxicity against A549 Human Lung Cancer Cell Line via the Mitochondrial Membrane Potential and Nuclear Condensation Effects of Nepeta paulsenii Briq., a Perennial Herb Aqsa. Molecules, 28 (6), 2812.
16-   Hosseinzade, H., & Ziaee T. 2006. Effect of Nepeta glomerulosa Boiss. Aerial Parts Aqueous Extract on Morphine Withdrawal Syndrome in Mice. Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(1), 41-46.
17-   Ilson, D.H., Bains, M., Kelsen, D.P., O’Reilly, E., Karpeh, M., Coit, D., Rusch, V., Gonen, M., Wilson, K., & Minsky, B.D. 2003. Aug, Phase I trial of escalating-dose irinotecan given weekly with cisplatin and concurrent radiotherapy in locally advanced esophageal cancer. Journal of clinical oncology 21(15), 2926-32.
18-   Joshaghani, H.R., Koochaki, E., Amini, R., Derakhshandeh, P., Ehsani, A., Shabani, M., & Kadivar, M. 2003. Determination of P53 gene mutations in gastric cancer by PCR-SSCP. Journal of Gorgan University of Medical Sciences, 5(2), 36-42.
19-   Kongul S.E., Seker K.G., Dirmenci, T., Duman, H., & Kucukboyaci, N. 2022. Cytotoxic Effects of Some Nepeta Species against Breast Cancer Cell Lines and Their Associated Phytochemical Properties. Plants (Basel), 11(11), 1427.
20-   Leiter, A., Veluswary, R., & Wisnivesky, J. 2023. The global burden of lung cancer: status and future trends, Nature Reviews Clinical Oncology.
21-   Liu, X., Lin, X.J., Wang, C.P., Yan, K.K., Zhao, L.Y., & Lin, X.D. 2014. Association between Smoking and p53 Mutation in Lung Cancer: A Meta-analysis. Clinical Oncology, 26(1),18-24.
22-   Lodish, H., Berk, A., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P., Bretscher, A., Ploegh, H., & Matsudaira, P. 2007. Molecular Cell Biology (Lodish. Molecular Cell Biology, sixth ed. WH Freeman.
23-   Lu, X.X., Ji, X.X., Bao, J., Li, Q.Q., Ji, D.D., & Luo, L. 2016. Inhibition of proliferation, migration, and invasion of human non-small cell lung cancer cell line A549 by phlomisoside F from Phlomis younghusbandii Mukerjee. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 15, 1413-21.
24-   Mai, M., Al-Oqail, E., Al-Sheddi, S., Siddiqui, M.A., Musarrat, J., Al-Khedhairy, A.A., & Farshori, N.N. 2015. Anticancer Activity of Chloroform Extract and Sub-fractions of Nepeta deflersiana on Human Breast and Lung Cancer Cells: An In vitro Cytotoxicity Assessment Pharmacognosy Magazine Published by Wolters Kluwer – Medknow.
25-   Maddah, S.M., Mostafavi, G., Amin Malek, M., Anbarestani, M., Sharif, Y., & Mir Hassani, Z. 2021. Combined application of cisplatin and salicylic acid suppresses cell growth and promotes apoptosis in human lung cancer cell lines. Biologia, 77, 215–223.
26-   Murphy, N.R., & Hellwig, R.J. 1996. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques 21 (5), 934-6, 938-9.
27-   Naderi, M., & Cherati, M.R., Mohammadian, A., Bidhendy, M.B., Ghiasvand, S., Marzouni, H.Z., Aryan, H., Jangholi, E., & Javidi, M.A. 2020. Hypericin induces apoptosis in the AGS cell line with no significant effect on normal cells. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 19(3), 349-357.
28-   Parham, S., Kharazi, A.Z., Bakhsheshi-Rad, H.R., Nur, H., Ismail, A.F., Sharif, S., et al. 2020. Antioxidant, antimicrobial and antiviral properties of herbal materials. Antioxidants, 9 (12),1309.
29-   Safarian,Sh., Erfani, A.2022. Study of autophagy and cell death induction in MCF-7 cells in the presence of quercetin. Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology), 35(3), 465-477.
30-   Sak, K., Lust H., Kase M., & Jall, J. 2018. Cytotoxic action of methylquercetins in human lung adenocarcinoma cells. Oncology Letters,15(2),1973- 1978.
31-   Shiao, Y.H., Rugge, M.A., Correa, P.E., Lehmann, H.P., & Scheer, W.D. 1994. p53alteration in gastric precancerous lesions. The American journal of pathology,144(3), 511.
32-   Poulsen, T., Pedersen, N.S., & Poulsen, H. 2005. Replacement and Suicide Gene Therapy for TargetedTreatment of Lung Cancer. Clinical Lung Cancer, 6(4), 227-36.
33-   Vähäkangas, K. 2011. Molecular Epidemiology of Human Cancer Risk Gene–Environment Interactions and p53 Mutation Spectrum in Human Lung Cancer. Methods of Molecular Medicine, 74, 43-59.  
34-   Venkat, S.G., Swati, P.D., Sumitra, D., & Raj, R.R. 2014. Lung Cancer Stem Cells, p53 Mutations and MDM2. Subcellular Biochemistry, 85, 359-70.
35-   Zhang, W., Na, C., Jin, Y., Bingyou, Y., Yanping, S., & Haixue, K. 2022. Curcumin’s prevention of inflammation-driven early gastric cancer and its molecularh mechanism, Chinese Herbal Medicines, 14, 244–253.
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 37, Issue 3
Autumn 2024
Pages 220-237

  • Receive Date 13 August 2023
  • Revise Date 26 September 2023
  • Accept Date 11 October 2023