کلونینگ و بیان ژن کد کننده پروتئین Csu از باکتری اسینتوباکتر بومانی مقاوم به کارباپنم به منظور ایجاد واکسن ژنی نوترکیب

اسکندر حسین نژاد لزرجانی­¹ ، عباس دوستی^2* و علی شریف زاده³

¹ ایران، شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی.

² ایران، شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی.

³  ایران، شهرکرد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد شهرکرد، دانشکده دامپزشکی، گروه میکروبیولوژی.

تاریخ دریافت: 18/03/1401          تاریخ پذیرش: 11/07/1401

چکیده

اسینتوباکتر بومانی، کوکوباسیل گرم منفی غیرتخمیری است که مقاومت بالایی به ترکیبات ضد میکروبی نشان می دهد. تشکیل بیوفیلم یکی از ویژگی های مهم بسیاری از گونه های اسینتوباکتر است که منجر به مقاومت بالا به آنتی بیوتیک ها می شود. مطالعه حاضر با هدف گیری پروتئین چاپرون بیوژنز فیمبریال Csu از باکتری اسینتوباکتر بومانی مقاوم به کارباپنم جهت ساخت سازواره ژنی انجام شد.در این مطالعه تجربی، ژن کد کننده ی پروتئین چاپرون بیوژنز فیمبریال Csu از باکتری اسینتوباکتر بومانی مقاوم به کارباپنم به روش PCR تکثیر شد. سپس، سازواره هدف توسط برنامه آنلاین PlasMapper طراحی شد. ژن مذکور به ترتیب در ناقل های T و pcDNA3.1 همسانه سازی و زیر همسانه سازی گردید. تایید صحت کلونینگ ژن با سه روش PCR، آنزیم های برش دهنده و تعیین توالی مورد ارزیابی قرار گرفت. خالص سازی پلاسمید با کیت استخراج پلاسمید LPS-Free انجام شد. سپس، مقدار 100 میکرولیتر از غلظت 100ng/ml از ناقل نوترکیب نهاییpcDNA3.1-csuC به عضله 4 سر ران موش BALB/c تزریق گردید و بیان ژن هدف در عضله 4 سر ران موش با روش RT-PCR بررسی شد. سپس اثر زمان بر  تغییرات بیان ژن در روزهای 2، 10، 20، 30، 40 و 60 پس از تزریق توسط آزمون کمی real time- PCR بررسی شد و نتایج اختلاف بیان در سطوح معناداری P<0.05، P<0.01 و P<0.001 گزارش شد.قطعه 831 جفت بازی مربوط به ژن csuC اسینتوباکتر بومانی با موفقیت تکثیر شد. همچنین، نتایج تحقیق نشان داد که سازواره نهاییpcDNA3.1-csuC تشکیل گردیده است. مشاهده باند 831 جفت بازی پس از انجام RT-PCR، در عضله 4 سر ران موش در گروهpcDNA3.1-csuC نسبت به گروه  شاهد (PBS)، موید بیان ژن csuC در عضله 4 سر ران موش می باشد.  نتایج بررسی تغییرات بیان ژن در گروه هدف نسبت گروه کنترل نشان داد که در گروه هدف میزان بیان ژن هدف پس از 2 روز افزایش بیان قابل توجهی را نشان داد. این افزایش بیان تا روز 30 پس از تزریق به بالاترین سطح خود رسید و اختلاف بیان در سطح P<0.001 معنادار بود. افزایش بیان ژن 40 روز پس از تزریق به سطح معناداری P<0.01 کاهش یافت. این کاهش میزان بیان تا روز 60 پس از تزریق ادامه داشت (P<0.001). سازواره نوترکیبpcDNA3.1-csuC ساخته شده در این تحقیق توان بیان ژن csuC اسینتوباکتر بومانی را در عضله 4 سر ران موش دارد. بیان موفق ژن هدف می تواند در راستای بررسی ایمنی زایی در حیوانات آزمایشگاهی به عنوان یک واکسن نوترکیب مدنظر قرار گیرد. همچنین، سازوارهpcDNA3.1-csuC از پتانسیل لازم برای بررسی به عنوان واکسن ژنی در تحقیقات آینده برخوردار است.    

واژه های کلیدی: اسینتوباکتر بومانی، csuC، سازواره نوترکیبpcDNA3.1-csuC، RT-PCR

^* نویسنده مسئول: تلفن: 03832324419 ، پست الکترونیکی: abbasdoosti@yahoo.com

مقدمه

عفونت­های بیمارستانی یک مشکل جدی مراکز بهداشتی درمانی می­باشند و هرساله هزینه­های زیادی را به بیماران و مراکز بهداشتی درمانی تحمیل می کنند(1). امروزه کنترل عفونت‌های بیمارستانی به دلیل رشد روزافزون جمعیت و در نتیجه تراکم و شلوغی بیشتر مراکز درمانی و تشخیصی، افزایش بیماران با نقص سیستم‌ ایمنی و بیماری‌های مزمن و ظهور میکروارگانیسم‌های نوپدید و مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها  از اولویت های حیاتی سیستم‌های بهداشتی و درمانی هر کشور محسوب می‌شود (2-4). اسینتوباکتر بومانی پاتوژن فرصت طلبی است که همواره به عنوان یکی از مهم ترین عوامل بیماری زای عفونت های بیمارستانی شناسایی شده است (5). اسینتوباکتر بومانی  یک کوکوباسیل گرم منفی است که به عنوان یکی از عوامل عفونی فرصت طلب مطرح است (6-8). کشف اسینتوباکتر به سال 1911 میلادی بر می گردد. این باکتری بیماریزا که اولین بار از خاک جدا شده بود، ابتدا میکروکوکوس کالکواستیکوس نامیده شد. برای چندین سال، باکتری های این گروه با نام های مختلف نام گذاری شدند تا اینکه در دهه ی 1950 میلادی، نام اسینتوباکتر به کار گرفته شد (4-8). اسینتوباکتر بومانی مسئول طیف وسیعی از بیماری ها شامل عفونت ریه، عفونت خون، عفونت زخم و پوست، مننژیت و عفونت دستگاه ادراری می  باشد (9). باکتری های جنس اسینتوباکتر از نظر باکتری شناسی و ویژگیهای بیوشیمیایی، هوازی اجباری، نامتحرک و فاقد تاژک، غیرتخمیرکننده، کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی هستند (10-12).  اسینتوباکتر بومانی به اغلب آنتی بیوتیک های رایج مقاوم است (8)؛ به طوریکه کنترل عفونت حاصل از این باکتری با گروه های آنتی بیوتیکی نظیر کارباپنم ها، فلوروکوئینولون ها و آمینوگلیکوزیدها با شکست روبرو شده است. جدیدترین آنتی بیوتیکی که برای کنترل عفونت اسینتوباکتر بومانی مورد استفاده قرار گرفته است، کولیستین نام دارد، اما گزارش های اخیر نیز حاکی از ظهور سویه های مقاوم نسبت به این آنتی بیوتیک است (9-14). اسینتوباکتر بومانی مقاومت چند دارویی (MDR) ایجاد می کند که این پدیده توسط انواع مقاومت های آنتی بیوتیکی مختلف ثابت شده است از جمله  فعال سازی پمپ های افلاکس، سنتز آنزیم هایی مثل فسفریل ترانسفرازها و استیل ترانسفرازها که باعث مقاومت به آمینو گلیکوزید ها می شود. علاوه بر موارد ذکر شده مکانیسم دیگری در مقاومت آنتی بیوتیکی اسینتوباکتر بومانی تحت عنوان بیوفیلم وجود دارد (15،28). بیوفیلم، در حال حاضر به عنوان یکی از ترکیبات مهم مقاومت باکتری ها به اکثر گروه­­های آنتی­بیوتیکی شناخته شده است (16). بیوفیلم ها تجمع پیچیده ای از کلنی های میکروبی می باشند که منجر به تشکیل یک شبکه  سلولی می شوند که از یک لایه محافظ پلی ساکاریدی تشکیل شده است (7-10، 17). سلول چسبنده در بیوفیلم درون یک ماتریکس خارج سلولی قرار دارد که حاوی مواد پلیمری خارج سلولی (EPS) است. سلول های میکروبی اجزای اصلی بیوفیلم ها هستند که EPS تولید می کنند که شامل 50 تا 90 درصد کل کربن آلی موجود در بیوفیلم ها است (6، 18). لذا تشکیل بیوفیلم عامل اصلی در بقا و مقاومت باکتریایی است (10،19). تشکیل بیوفیلم اسینتوباکتر بومانی در سطوح غیر زنده به طور عمده توسط پیلی(مژه)  حاوی پروتئین­ Csu انجام می شود. این مجموعه از 4 زیرواحد تشکیل شده است که ساختار کریستالی­CsuC-CsuA /B  به عنوان چاپرون پیش ساز این مجموعه می باشد و از اهمیت بالایی در تشکیل این ساختاربرخوردار است. لذا ایجاد اختلال در یکی از این اجزا باعث اختلال در تشکیل  مجموعه  CsuC-CsuA/B شده، که متعاقبا از تشکیل بیوفیلم جلوگیری می کند (11، 20). CsuC یک پروتئین در سطح خارجی اسینتوباکتر بومانی می باشد که شامل هسته ی مرکزی در ارتباط با انواع پروتئین های دخیل در مقاومت می باشد. این پروتئین به باکتری قابلیت تشکیل بیوفیلم و اتصال به سطوح را می دهد و به این ترتیب نقش مهمی در عفونت زایی پاتوژن ها دارند (21، 26). هرچند تاکنون واکسن موثری علیه این باکتری ایجاد نشده است، اما موارد متعددی به عنوان کاندیداهای واکسن علیه اسینتوباکتر بومانی مورد ارزیابی قرار گرفته اند. برخی از واکسن هایی که تاکنون در این زمینه مورد تحقیق و بررسی قرار گرفته اند و در حیوانات آزمایشگاهی (اغلب موش) سبب ایجاد ایمنی نسبی شده اند شامل: باکتری کشته شده، کمپلکس پوشش خارجی، وزیکول های غشای خارجی، پلی ساکارید کپسولی K1 و پروتئین غشای خارجی A می باشند (22، 17).  واکسن های متنوع و متعددی نظیر واکسن های ژنی علیه عفونت های باکتریایی ابداع شده اند. واکسن ژنی یک نوع واکسن بر پایه DNA است که با تولید آن با روش های نوین مهندسی ژنتیک و تزریق آن به موجود زنده، باعث ایجاد پاسخ ایمنی می شود. این واکسن می­تواند در برابر  بیماری های ناشی از عوامل بیماری­زای عفونی مثل باکتری ها،  ویروس ها، قارچ ها و تک یاخته­ای ها و حتی برای  سرطان ها و  بیماری ها با منشاء ژنتیکی مورد استفاده قرار گیرد (23، 32).

پروتئین خارج سلولی CsuC می تواند به عنوان یکی از آنتی ژن های مهم، جهت ساخت واکسن ژنی مورد استفاده قرار گیرد. با توجه به اینکه اسینتوباکتر بومانی یکی از موفق ترین باکتری هادر بروز بیماری های عفونی است و پروتکل های درمانی را معمولا با شکست روبرو می کند و تاکنون واکسن موثری علیه این باکتری تولید نشده است (5، 24)، لذا یافتن راهی برای پیشگیری از این عامل عفونی خطرناک ضروری به نظر میرسد. در همین راستا، در تحقیق حاضر اقدام به  همسانه سازی، طراحی وکلون سازی ژن  کدکننده پروتئین چاپرون بیوژنز فیمبریال Csu از باکتری اسینتوباکتر بومانی مقاوم به کارباپنم شد.

مواد و روشها

تهیه میکروارگانیسم ها: برای انجام این پژوهش تجربی از دو سویه باکتریایی استفاده شد. به منظور تکثیر و به دست آوردن ژن CsuC از سویه استاندارد باکتری اسینتوباکتر بومانی (ATCC 19606) (مرکز ملی ذخایر ژنتیکی ایران، ایران) بهرهگرفته شد. میزبان کلون سازی ژن و تکثیر وکتورهای نوترکیب نیز باکتری E. coli سویه TOP10F بود. به منظور کلون سازی ژن از ناقل pcDNA3.1 استفاده شد. وکتور pcDNA3.1 به عنوان یک وکتور بیانی پرقدرت مورد استفاده بوده و دارای پروموتور قوی CMV برای بیان ژن کلون شده در سلول های پستانداران می باشد. اندازه این وکتور برابر 5428 bp است و نشانگر انتخابی آن ژن مقاوت  به آنتی بیوتیک آمپی سیلین می باشد. موش های BALB/c نیز به عنوان میزبان برای بررسی بیان ژن مورد استفاده قرار گرفت. پس از وارد کردن ژن csuC در وکتور pcDNA3.1، اندازه این وکتور 6235 جفت باز خواهد بود.

استخراج  DNAو تکثیر ژن CsuC: خالص­سازی DNA ژنومی از اسینتوباکتر بومانی با استفاده از کیت استخراج DNA (سیناژن، ایران) انجام شد. استخراج پلاسمید از باکتری سویه Top10f توسط کیت FavareGene تایوان که LPS-Free می باشد، انجام شد. همچنین کیفیت پلاسمید استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ (ND-1000 PeqLab) سنجیده شد. غلظت  و کیفیت DNA تخلیص شده با استفاده از نانودراپ (ND-1000 PeqLab) مورد ارزیابی قرار گرفت. برای تکثیر ژن CsuC ردیف نوکلئوتیدی آن از درون ژنوم ثبت شده اسینتوباکتر بومانی در پایگاه بانک جهانی ژن به شماره دسترسی Q6XBY4 گرفته شد. سپس، پرایمرهای مورد استفاده در این تحقیق با کمک نرم افزار Gene Runner طراحی شدند. ردیف نوکلئوتیدی پرایمرهای طراحی شده در این تحقیق در جدول 1 ثبت شد است.

آزمایش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 5/2 میکرولیتر از بافر PCR 10X، 2 میلی مولار MgCl2 (1 میکرولیتر)، 200 میکرو- مولار dNTPs (5/0 میکرولیتر)، 100 نانومولار از هریک از پرایمرهای رفت و برگشت (1 میکرولیتر از هر پرایمر)، 100 نانوگرم از DNA ژنومی تخلیص شده از اسینتوباکتر بومانی (2 میکرولیتر DNA)، و 1 واحد آنزیم DNA پلیمراز Taq (25/0 میکرولیتر) (همه مواد و واکنشگرهای PCR ساخت شرکت سیناژن، ایران) در دستگاه ترمال سایکلر  (اپندروف، آلمان) انجام شد.

جدول 1- لیست پرایمرهایمورد استفاده در این پژوهش

برنامه دمایی شامل 5 دقیقه واسرشت شدن ابتدایی به صورت تک مرحله ای در دمای 95 درجه سانتیگراد، سپس، 32 چرخه دمایی متناوب شامل واسرشت شدن در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای 56 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، طویل شدن در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و طویل شدن نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. پس از انجام PCR محصولات آن به چاهک های ژل آگارز 1 درصد حاوی اتیدیوم بروماید منتقل شده و در 90 ولت به مدت 40 دقیقه الکتروفورز شدند و با نور ماورای بنفش مشاهده گردیدند.  

کلون سازی ژن چاپرون: برای کلون­سازی مرحله لازم است قطعه خالصی از ژن csuC تهیه شده و در وکتور درج گردد. در تحقیق حاضر قطعات تکثیر شده ژن csuC روی ژل آگارز الکتروفورز شدند و در برابر نور ماورای بنفش با طول موج بالا، قطعه DNA مربوط به ژن csuC با آگارز همراه آن با استفاده از اسکالپل بریده شد. ژن csuC با استفاده از کیت خالص سازی DNA از ژل (Bioneer، کره جنوبی) تخلیص شد. واکنش اتصال بین محصولات PCR و وکتور براساس روش کار کیت صورت پذیرفت. ترانسفورماسیون محصول اتصال در باکتری E. coli سویه TOP10F به روش شیمیایی (با کاربرد CaCl2 1/0 مولار) و متعاقب آن با انجام شوک حرارتی (42 درجه سانتیگراد به مدت 90 ثانیه) مطابق روش های استاندارد انجام شد (3). سپس، باکتری های مذکور روی پلیت کشت LB-آگار حاوی آمپی سیلین (100 میکروگرم در هر میلی لیتر) کشت داده شدند. پلیت های کشت به مدت 18 ساعت در 37 درجه سانتیگراد، گرمخانه گذاری شده و کلونی های حاصل برای غربالگری حضور ژن کلون شده ارزیابی گردیدند. برای تایید حضور ژن کلون شده در وکتور و بررسی تشکیل وکتور نوترکیب از روش های PCR و هضم آنزیمی با آنزیم های برش دهنده BamHI/EcoRV (Genray ، چین) استفاده شد.  csuC از ناقلT و زیرهمسانه سازی کردن آن در ناقل pcDNA3.1به دست می آید. بدین منظور، ابتدا ناقل نوترکیب با دو آنزیم BamHI/EcoRV برش داده شد تا ژن csuC از آن خارج گردد. همچنین، ناقل یوکاریوتی pcDNA3.1 نیز با همین دو آنزیم بریده شد تا به صورت خطی درآید. همه محصولات برش آنزیمی روی ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز شدند. سپس، قطعه ژن csuC و ناقل از روی ژل با کمک اسکالپل بریده شدند و با استفاده از کیت تخلیص گردیدند. واکنش اتصال بین ناقل یوکاریوتی pcDNA3.1و ژن csuC با کمک آنزیم T4 -لیگاز (سیناژن، ایران) انجام شد و مراحل ترانسفورماسیون محصولات اتصال به درون باکتری E. coli سویه TOP10F انجام شد. به منظور تأیید صحت ساب کلونینگ و بررسی تشکیل سازواره نهایی pcDNA3.1 حاوی ژن csuC­، ابتدا واکنش PCR با استفاده از پرایمرهای رفت و برگشت مخصوص ژن csuC انجام گرفت. برای تایید بیشتر و دقیقتر سازواره نهایی هضم آنزیمی با آنزیم­های BamHI/EcoRV و تعیین توالی صورت پذیرفت. تعیین توالی ژن موردنظر به روش سانگر و توسط شرکت Genray کشور چین انجام شد.  

تزریق سازواره نهاییpcDNA3.1-csuC به موش های BALB/c: آزمایشات این مرحله با هدف انتقال سازواره نهایی حامل ژن csuC به موش های BALB/c انجام شد. برای این منظور 34 عددموش 5 هفته­ای BALB/c ماده، به وزن 20 گرم تهیه و در 2 گروه دسته بندی شدند. گروه کنترل مقدار 100 میکرولیتر PBS در قسمت عضله چهارسر ران دریافت نمود. سپس به گروه هدف، مقدار 100 میکرولیتر از سازواره نهاییpcDNA3.1-csuC با غلظت 100ng/ml در محل عضله چهارسر ران تزریق شد.  1 ماه پس از تزریق، موش­ها بوسیله فرمالین بی هوش شده و عضله 4 سر ران با تیغ اسکالپل برداشته شد و به سرعت در ازت مایع 180- درجه سانتی گراد قرار گرفت. 

بررسی بیان ژن csuC در عضله چهارسر ران موش های BALB/c به روش RT-PCR : برای ارزیابی بیان اختصاصی ژن csuC در عضله چهارسر ران موش های BALB/c، ابتدا استخراج RNA از بافت عضله 5 سر موش (5سر گروه هدف، 5 سر گروه کنترل) با استفاده از کیت YTzol Pure RNA (ایران, یکتاتجهیز) انجام شد. سپس، تهیه cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA (یکتاتجهیز، ایران) بر اساس روش کار کیت صورت پذیرفت. واکنش رونوشت برداری معکوس (RT) برای تهیه cDNA با استفاده از 2 میکرولیتر بافرRT 10X، 4 میکرولیتر RNA تخلیص شده از عضله چهارسر ران موش های BALB/c (50  نانوگرم در هر میکرولیتر) ، 1 واحد آنزیم رونوشت بردار معکوس (1 میکرولیتر) ، 1 واحد آنزیم RNase Inhibitor (1 میکرولیتر) ، 2 میکرو لیتر Random Hexamer Primers (100 نانومول) و با افزودن 10 میکرولیتر آب مقطر در حجم نهایی 20 میکرولیتر انجام شد. مخلوط واکنشگرها به مدت یک ساعت در 42 درجه سانتیگراد و سپس 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد در دستگاه ترمال سایکلر (اپندروف، آلمان) قرار داده شدند. سپس، آزمایش PCR با استفاده از پرایمرهای رفت و برگشت مخصوص ژن csuC روی cDNAهای تولید شده انجام شد و نتایج روی ژل آگارز 1 درصد بررسی گردید. 

بررسی میزان بیان ژن csuC در دوره 60 روزه در عضله چهارسر ران موش های BALB/c به روش Real Time-PCR:

برای ارزیابی تغییرات بیان اختصاصی ژن csuC در عضله چهارسر ران موش های BALB/c، ابتدا 12 موش از گروه کنترل و 12 موش از گروه هدف انتخاب شدند و در زمان های مختلف از عضله 4 سر ران 2 سر موش نمونه گیری شد. میزان بیان ژن چاپرون در روزهای 2، 10، 20، 30، 40 و 60 بررسی شد. برای این منظور عضله 4 سر ران موش پس از استخراج RNA و سنتز cDNA توسط آزمون Real Time-PCR بررسی شد و نتایج توسط آزمون آماری لیواک سنجیده شد.

آنالیز آماری: در این پژوهش محاسبه آماری با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 19 انجام گردید و نتایج با آنالیز واریانس یک طرفه (One way ANOVA) مورد بررسی قرار گرفت. تفاوت بیان ژن‌های هدف، بین نمونه‌ های کنترل و تیمار شده با روش آماری Tukey‘s HSD post-hoc test محاسبه گردید. اطلاعات به صورت mean±standard deviation SD نمایش داده شده اند و مرز معناداری روی P<0.05 و P<0.001 قرار گرفته شد.

نتایج 

تکثیر ژن csuC اسینتوباکتر بومانی: در پژوهش حاضر تخلیص DNA ژنومی از سویه استاندارد باکتری اسینتوباکتر بومانی با موفقیت انجام شد. نتایج الکتروفورز DNA تخلیص شده روی ژل آگارز نشان دهنده کیفیت مناسب آن و بررسی غلظت DNA خالص سازی شده با نانودراپ نشان دهنده مقدار 140 نانوگرم در هر میکرولیتر بود. نتایج انجام PCR برای ژنcsuC  روی ژنوم اسینتوباکتر بومانی منجر به تشکیل باند 831 جفت بازی مربوط به این ژن شد. نتایج PCR در شکل 1 نشان داده شده است.  از باکتری استاندارد اسینتوباکتر بومانی 19606 به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

نتایج مراحل کلونسازی ژن csuC: نتیجه­ی واکنش اتصال بین ناقل و قطعه ژن csuC منجر به تشکیل سازواره نوترکیب شد. بررسی درستی تشکیل سازواره نوترکیب با PCR نشان دهنده موفقیت آزمایش بود. در واقع با انجام آزمایش PCR روی این سازواره باند اختصاصی مربوط به ژن هدف به اندازه 831 جفت باز تشکیل شد. هرچند وکتور نوترکیب حاصل شده در این تحقیق حامل ژن csuC بود، اما قادر به بیان آن نخواهد بود. لذا مرحله خارج ساختن ژن csuC از ناقل و انتقال آن به پلاسمید یوکاریوتی pcDNA3.1 انجام شد (جدول 1 کمکی).

شکل 1- نتیجه آزمایش PCR برای تکثیر ژن csuC  اسینتوباکتر بومانی

M: نشانگر DNA 100 جفت بازی، L1, L2: باند 831 جفت بازی مربوط به تکثیر ژن csuC   L3: کنترل منفی (بدون DNA) ، L4: باند 831 جفت بازی مربوط به باکتری استاندارد اسینتوباکتر بومانی ATCC19606 کنترل مثبت

زیرهمسانه سازی ژن csuC درون وکتور pcDNA3.1 نتایج موفقیت­آمیزی درپی داشت. تایید صحت ساب کلونینگ با روش های PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی انجام گرفت و یافته­های حاصل از این آزمایشات صحت تشکیل سازواره نهایی pcDNA3.1-csuC را نشان داد. برش آنزیمی این پلاسمید تشکیل دو باند حدودا 5400 و 831 جفت بازی که به ترتیب مربوط به وکتور pcDNA3.1 و ژن csuC می­باشند را روی ژل آگارز 1 درصد نمایان کرد (شکل 2).

نتایج تعیین توالی قطعه ژن csuC کلون شده در وکتور pcDNA3.1 پس از مقایسه با توالی های موجود از این ژن در پایگاه داده های NCBI نشان دهنده این بود که هیچ گونه تغییر نوکلئوتیدی در اجزای سکانس این ژن به وجود نیامده و صحت توالی آن مورد تایید است. تعیین ترادف انجام و عدم وجود خطا در ژن با آنالیز های همردیفی به اثبات رسیده است.

شکل 2- برش آنزیمی ناقل نوترکیب نهاییpcDNA3.1- csuC با آنزیم های BamHI/EcoRV

M: مارکر DNA ، L1: ناقل نوترکیب نهاییpcDNA3.1- csuC     L2: باندهای 831 و 5400 جفت بازی حاصل از برش ناقل با آنزیم های BamHI/EcoRV

نتایج بررسی رونویسی ژن csuC در عضله چهارسر ران موش های BALB/c به روش RT-PCR: برای اثبات ورودِ  سازواره نهاییpcDNA3.1-csuC که بیان کننده ژن csuC در عضله چهارسر ران موش های BALB/c است، از   روش RT-PCR بهره گرفته شد. میزان رونویسی ژن csuC در بافت عضله چهارسر ران موش نشان دهنده فعالیت موفق وکتورpcDNA3.1-c در بافت عضله و انتقال موفق این وکتور به سلول­های بافت عضله است. نتایج حاصل از انجام واکنش اختصاصی RT-PCR برای تایید رونویسی ژن csuC اسینتوباکتر بومانی در بافت عضله مثبت بود.  به طوریکه پس از انجام PCR روی  cDNAهای حاصل از آزمایش RT-PCR برای بافت عضله چهارسر ران موش های BALB/c در گروه هدف، هر 5 موش موجود در این گروه ، باند 831 جفت بازی مربوط به ژن csuC تشکیل شد. اما همین آزمایش برای گروه کنترل که فقط PBS دریافت کرده بودند (فاقد وکتور نوترکیب) مثبت نبود. نتایج این آزمایش موید  رونویسی موفق و 100 درصدی ژن csuC در بافت عضله چهار سر ران موش می‌باشد.

همچنین همان‌طور که در شکل 4 دیده می‍شود گروه هدف با باند 831 جفت بازی نشان دهنده بیان ژن csuC در بافت عضله چهار سر ران موش می باشد. اما در گروه کنترل فقط ژن GAPDH باند 120 جفت بازی را نشان داد که بیان این ژن رفرنس مشخص کننده صحیح بودن آزمایش می‍باشد. 

جدول 2- نتایج بررسی بیان ژن csuC در عضله چهار سر ران موش BALB/c

شکل 4- نتایج RT-PCR از عضله جهار سر ران در گروه هایpcDNA3.1-csuC و گروه PBS

M: DNA Ladder 100 جفت بازی    L1-L5: نمونه‌های موش آزمایش شده     L6: مسترمیکس فاقد DNA به عنوان کنترل منفی واکنش PCR

نتایج بررسی تغییرات بیان ژن csuC در عضله چهارسر ران موش های BALB/c در طول 60 روز: نتایج بررسی تغییرات بیان ژن در گروه هدف نسبت گروه کنترل مقایسه شد. گروه کنترل بیان ژن csuC در هیچ یک از موش ها مشاهده نشد. اما در گروه هدف میزان بیان ژن هدف پس از 2 روز افزایش بیان قابل توجهی را نشان داد. این افزایش بیان تا روز 30 پس از تزریق به بالاترین سطح خود رسید و میزان سیکل آستانه به 18 (ct=18) رسید کهاختلاف بیان نسبت به گره کنترل با سیکل آستانه 28 (ct=28)  در سطح P<0.001 معنادار بود. افزایش بیان ژن 40 روز پس از تزریق به سطح معناداری P<0.01 کاهش یافت. این کاهش میزان بیان تا روز 60 پس از تزریق ادامه داشت (P<0.05) و سیکل آستانه در گروه هدف به 23 (ct=23) رسید (P<0.05). داده های آزمون Real Time PCR توسط ژن رفرنس GAPDH موشی نرمال سازی شد.

شکل 5- نتایج تاثیر زمان بر تغییرات بیان ژن در بافت عضله چهار سر ران موش. میزان بیان تا 30 روز پس از تزریق افزایشی (P<0.001)، و پس از آن کاهش بیان تا روز 60 پس از تزریق مشاهده شد. ***P<0.001, **P<0.01, P<0.05, ns   P>0.05

بحث

به علت افزایش روزافزون مقاومت دارویی نسبت به آنتی بیوتیک های مختلف در سال های اخیر، شاهد حضور ایزوله هایی از اسینتوباکتر بومانی با الگوی مقاومت دارویی چندگانه (MDR) هستیم که از نقاط مختلف جهان گزارش می شوند (2، 25-29). افزایش مقاومت نسبت به عوامل ضدمیکروبی و محدود بودن گزینه های درمانی، مشکلات جدی در مراکز درمانی به ویژه در بخش مراقبت های ویژه است که سلامت و اقتصاد کشور را تحت تأثیر قرار می دهد (30-33).

در این تحقیق ،ژن مؤثر در بیماریزایـی و تشکیل بیوفیلم اسینتوباکتر بومانی و کاندیدای واکسن، جداسازی و کلون شدند. در مطالعـه حاضـر از پلاسمید pcDNA3.1برای کلون کردن ژن csuC جهت تهیه واکسن ژنی استفاده شـد، پلاسـمید pcDNA3.1مدت هاست که جهت کلونینگ با بازده بـالا معرفی شـده است (20،34).

سازواره ژنی به دست آمده در این تحقیق پتانسیل تولید محصول ژن csuC را داشت. بررسی رونویسی این ژن در سطح RNA در بافت عضله چهار سر ران موش BALB/c ارزیابی شد و نتایج آزمایش RT-PCR نشان از موفقیت آمیز بودن رونویسی این ژن در بافت موش داشت. سازواره نوترکیبpcDNA3.1-csuC از دو دیدگاه پتانسیل کاربرد در تحقیقات در زمینه واکسن های نوترکیب  را دارد. اول جنبه این که می توان محصول پروتئینی آن را تولید نموده و به عنوان واکسن پپتیدی نوترکیب مورد بررسی قرار داد. دیدگاه دوم اینکه این  ناقل یوکاریوتی امکان کاربرد به صورت واکسن ژنی در راستای تحقیقات واکسیناسیون علیه اسینتوباکتر بومانی در مدل حیوانات آزمایشگاهی را دارد.

در سال های اخیر تحقیقات زیادی در زمینه یافتن واکسن علیه اسینتوباکتر بومانی انجام شده است. در یک تحقیق صورت گرفته توسط انصاری و همکاران در سال 2017، محققان این طرح با تزریق پروتئین نوترکیب OmpA مربوط به باکتری اسینتوباکتر بومانی به موش، القای بالای آنتی بادی ضد OmpA را مشاهده نمودند. همچنین، تیتر بالای IgG در موش های واکسینه شده نسبت به گروه شاهد دیده شد (1). ایمنی زایی پروتئین های فیمبریال در سال های اخیر مورد توجه قرار گرفته است اما تاکنون مطالعه ای بر روی ایمنی زایی پروتئین چاپرون فیمبریال csu در اسینتوباکتر انجام نشده است. در مطالعه ای که در سال 2013 انجام شد محققان اقدام به کلون سازی ژن ompA اسینتوباکتر بومانی نمودند. در این تحقیق محصول پروتئینی این ژن به صورت نوترکیب تولید و تخلیص گردید. در نهایت، تزریق دوزهای مختلف پروتئین نوترکیب به موش به همراه هیدروکسید آلومینیوم به عنوان ادجوانت نشان داد که OmpA اسینتوباکتر بومانی قادر به تحریک سیستم ایمنی میزبان در سطوح مختلف است (19).  در سال های اخیر تحقیقات مهندسی ژنتیک در زمینه کلون سازی و کاربرد ژن های اسینتوباکتر بومانی بیشتر شده است. مثلاً Hashemzehi و همکاران در سال 2018 ژن NlpA را به عنوان واکسن­ژنی در اسینتوباکتر بومانی بررسی کرد. از طریق این مطالعه pEGFP-C2- NlpA نوترکیب تولید شد و با موفقیت ژنNlpA را در سلول های یوکاریوتی بیان کرد. علاوه بر این، مطالعه in vivo این گروه تایید کرد که ساختار نوترکیبی قادر به القا پاسخ ایمنی در موش­های ایمن شده است. این یافته­ها نشان داد pEGFP-C2- NlpA ممکن است به عنوان کاندید واکسن DNA علیه Ab در نظر گرفته شود (13). Huang و همکاران در سال 2016 نیز به بررسی آنتی­ژن­های بیشتر پرداخته و پروتئین Omp22 را نیز به عنوان هدف واکسن معرفی کردند (14). Gargو همکاران در سال 2016 نوکلئاز غشای خارجی­ (NucAb) اسینتوباکتر بومانی را به عنوان هدف واکسن شناسایی و نقش آن را در بهبود بقا در حیوانات آزمایشگاهی نشان دادند (12).

در سال 2016 Singh و همکاران با استفاده از واکسینولوژی معکوس از بین 57 پروتئین مورد بررسی از باکتری مذکور، پروتئین غشای خارجی پیلوس (FilF) را مناسب یافتند. پروتئین FilF در بین سویه های مختلف اسینتوباکتربومانی توالی اسید آمینه ای حفظ شده ای دارد. این محققان ژن filF را از ژنوم اسینتوباکتر بومانی جداسازی کرده و در وکتور بیانی پروکاریوتی pET-28a کلون سازی نمودند و بیان این ژن را در باکتری E. coli سویه BL21 بررسی کردند (30). افزایش مطالعات واکسن ژنی نگرانی هایی از قبیل درج احتمالی توالی ژن در ژنوم میزبان را افزایش داده است. اما با وجود مطالعات گوناگون تا کنون نمونه ای برای اثبات این نگرانی وجود نداشته است.

Nie و همکاران در سال 2020 در مطالعه­ای عنوان کردند که پروتئین OmpA می­تواند به عنوان هدف درمانی برای اسینتوباکتر بومانی باشد. (21). Hashemi و همکاران در سال 2019 به بررسی کارآیی پپتیدهای طراحی شده کاندید واکسن از پروتئین غشای خارجی اسینتوباکتر بومانی با آنتی­بادی­های سرمی پرسنل شاغل در بخش ICU ( intensive care unit) پرداختند. (24). Huang و همکاران به بررسی ژن ompW باکتری اسینتوباکتر بومانی پرداختند. این محققان ژن ompW را بین دو سایت آنزیمی BamHI و EcoRI در پلاسمید pThioHisA کلونسازی نمودند و سازواره نوترکیب را به باکتری E. coli سویه BL21 منتقل نمودند. این ژن در باکتری میزبان بیان بسیار بالایی را نشان داد. در تحقیق مذکور برخلاف تحقیق ما از وکتور پروکاریوتی استفاده شده بود، اما شباهت آن استفاده از یکی از ژن های مهم و آنتی ژنتیک اسینتوباکتر بومانی است (15، 35، 36). مزیت محصول به دست آمده در تحقیق ما (سازواره نهاییpcDNA3.1-csuC) در این است که رونویسی موفقی را در بافت عضله 4 سر ران موش BALB/c نشان داد و امکان کاربرد به صورت تزریق مستقیم به عضله حیوان آزمایشگاهی را به عنوان واکسن ژنی دارد. اما کاستی های آن ممکن است عدم جذب کافی این وکتور نوترکیب توسط سلول های عضلانی حیوانات مدل، در صورت تزریق به صورت مستقیم باشد که در این صورت سبب کاهش تولید محصول ژن نوترکیب و عدم وجود ایمنی زایی کافی خواهد شد.  

در مطالعه حاضر ژن  csuCباکتری بیماریزای اسینتوباکتر بومانی به طور موفقیت آمیز در ناقل  نوترکیب درج شد و سازواره نوترکیبpcDNA3.1-csuC حاصل گردید. باتوجه به صحت نتایج به دست آمده از تعیین توالی می توان از سازوارهpcDNA3.1-csuC به عنوان منبعی از ژن هدف برای انجام تحقیقات آینده استفاده کرد. از طرف دیگر، سازواره نهاییpcDNA3.1-csuC که از ترکیب ناقل بیانی یوکاریوتی pcDNA3.1به علاوه ژن csuC به دست آمده است، می تواند در زمینه تولید واکسن های نوترکیب به صورت بیان ژن csuC و تولید محصول پروتئینی و خالص سازی آن با اهداف کاربردی به صورت واکسن پپتیدی مدنظر قرار گیرد. همچنین، بیان اولیه و موفق ژن  csuC در عضله 4 سر ران موش BALB/c که در پژوهش حاضر محقق شد، راهی روشن در راستای کاربرد pcDNA3.1-csuC به عنوان واکسن ژنی در مدل حیوانی پیش رو قرار می دهد. 

تشکر و قدردانی

این مقاله حاصل بخشی از پایان نامه دانشجوی دکترای تخصصی است. محققان و نویسندگان این مقاله برخود لازم می دانند مراتب تقدیر و تشکر خود را از تمامی همکاران و محققانی که ما را در به ثمر رسیدن این پایان نامه یاری نمودند به خصوص خانم دکتر فرانک عالی، اعلام نمایند.

جدول کمکی 1- توالی ساختاری پلاسمید طراحی شده