Document Type : Research Paper
تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی ژنومی و پروتئومی دو نوع پروتئین شوک حرارتی (HSP90-a و HSP90-b) نژاد بز تالی و مقایسه آنها در هفت گونه حیوان اهلی
الهام رضوان نژاد
ایران، کرمان دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی وفناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم وتکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی
تاریخ دریافت: 12/01/1401 تاریخ پذیرش: 11/07/1401
چکیده
پروتئین های شوک حرارتی (HSPs) نقش مهمی در پاسخ به تنش های محیطی مختلف دارند. در این مطالعه، ویژگیهای ژنومی و پروتئومی دو نوع HSP (HSP90-a و HSP90-b) در بز نژاد تالی(Tali goat breed) بعلاوه ۷ گونه حیوان اهلی شامل گاو
(B. taurus) ، گاومیش (B. bubalis)، گاو زبو (B. indicus)، بز(C. hircus)،گوسفند (O. aries) ، شتر تک کوهانه
(C. dromedarius)، شتر دوکوهانه (C. bactrianus)با استفاده از ابزارهای مدلسازی و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک، همترازی توالی چندگانه وسوییس مدل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. با استفاده از تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی جایگاه دو ژن برای گونه های موردیررسی تعیین گردید و مشخص شد جایگاه آنها در ژنوم شتر دوکوهانه تعیین نگردیده است. تعداد اگزون ها برای HSP90-a و HSP90-b در تمام گونه های موردبررسی بجز دو گونه شتر مشابه بود. مقایسه جهش های اتفاق افتاده در نژاد تالی بز با بز رفرنس نشان داد که هیچ کدام از جهش های بروزیافته منجر به تغییر اسیدآمینه نشده است. تجزیه و تحلیل Expasy نشان داد که HSP90-a و HSP90-b به ترتیب 733 و 724 اسید آمینه را برای همه گونه ها، بجز شتر دوکوهانه (۶۴۹ اسیدآمینه برای توالی HSP90-a) کد می کنند. داده ها نشان داد که پروتئینHSP90-a در گاومیش و شتر تک کوهانه دارای یک اسیدآمینه متغیر و در شتر دوکوهانه دارای شش اسید آمینه متغیر است، در حالی که پروتئینHSP90-b تنها شتر تک کوهانه و دوکوهانه دارای دو اسیدآمینه متغیر می باشند. مطالعه حاضر می تواند در انتخاب ژنهای هدف برای سازگاری مولکولی دام کمک کننده باشد.
واژه های کلیدی: پروتئین های شوک حرارتی (HSPs)، سازگار شدن گرمایی، تجزیه و تحلیل ژنومی، تجزیه و تحلیل پروتئومی، گونه های حیوانات اهلی
* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: rezvannejad2002@yahoo.com
مقدمه
تغییرات اقلیم جهانی باعث ایجاد اثرات مخرب زیادی از جمله کاهش کیفیت و کمیت مراتع و منابع آب، تشدید شیوع آفات و بیماری های جدید در دوره های خشکسالی و در نهایت کاهش کیفیت و کمیت محصولاتی مانند شیر و گوشت می شود که منجر به خسارت اقتصادی در صنعت دام زنده خواهد شد(5,6). از آنجا که حیوانات با اصلاح ویژگی های فنوتیپی و ژنوتیپی خود در دوره های طولانی با شرایط نامطلوب محیطی سازگار می شوند(6,32) می توان دانست که آنها دارای مکانیسم های تطبیقی زیادی برای زنده ماندن در شرایط آب و هوایی نامساعد می باشند (3,4,36).
مطالعات مختلف نشان داده اند که استرس گرمایی اثرات منفی بر بهره وری حیوانات، مانند رشد، تولید شیر، مصرف خوراک، باروری و سلامت آنها دارد (35). اخیراً با توجه به آگاهی روزافزون به تأثیر گرمایش جهانی بر سیستم های تولید حیوانات، نگرانی های بیشتری در مورد اثرات استرس گرمایی مطرح شده است (4,43). با این حال، چگونگی و چرایی اینکه استرس چنین اثرات منفی بر حیوانات در سطوح سلولی و مولکولی دارد، نامشخص باقی مانده است. لذا شناسایی و درک ژن های مرتبط با تحمل گرما و پروتئین های آنها در نژادهای مقاوم به گرما و مقایسه آنها با سایر موجودات به منظور کاهش تاثیر منفی استرس گرمایی می تواند موثر باشد (13). به این ترتیب، درک تنوع ژنومی و پروتئومی میتواند برای شناسایی و تفسیر مؤلفههای ژنتیکی صفات مرتبط به سازگاری مفید باشد (15).
پروتئینهای شوک حرارتی (HSPs) گروهی از چپرونهای مولکولی هستند که از تجمع پروتئینهای غیر اختصاصی اجتناب میکنند و به پروتئینهای سلولی کمک میکنند تا ساختار اصلی خود را برای حفظ هموستاز سلولی به دست آورند (3,37). HSPها یک خانواده پروتئینی بزرگ هستند که به سلولها اجازه میدهند به تدریج با محیط در حال تغییر سازگار شوند و در نتیجه تأثیرقابلتوجهی بر سازگاری حرارتی و تحمل استرس دارند (16). پاسخ سلولی به استرس گرمایی شامل فعال شدن فاکتورهای شوک حرارتی، بهبود بیانHSPs، افزایش سطح اکسیداسیون اسیدهای آمینه و گلوکز، کاهش متابولیسم اسیدهای چرب، و تحریک سیستم ایمنی و غدد درون ریز از طریق ترشح خارج سلولیHSPs است (3,8).HSP ها پروتین هایی هستند که تقریباً در همه موجودات پروکاریوتی و یوکاریوتی وجود دارند. در میان آن ها، HSP70 ها نقش اصلی را در کنترل کیفیت پروتئین و تا شدن پروتئین ایفا می کنند که منجر به جلوگیری از تجمع پروتئین و تصحیح پروتئین های بدتاخورده می شود (26). خانواده پروتئینهایHSP90 پستانداران مجموعهای از مولکولهای بسیار حفاظتشده هستند که در فعالیتهای سلولی مختلف شرکت میکنند(17). توزیع آنها در مکان های مختلف سلولی نقش مهم آنها را در هموستاز سلولی برجسته می کند. گروه پروتئین هایHSP90 مسیرهای فیزیولوژیکی ضروری مانند کنترل چرخه سلولی، بقای سلولی، هموستاز هورمونی، اتوفاژی و آپوپتوز را هماهنگ می کنند (24). علاوه بر این،مطالعات قبلی نشان داده اند که بیان ژن HSP در فولیکولهای مو در گوسالههای گوشتی، سلولهای تک هستهای خون محیطی در گاو مطالب دقیقی را برای ارزیابی استرس گرمایی فراهم میکند و میتواند یک شاخص جدید استرس گرمایی در گاو در نظر گرفته شود(10,21). فرض بر این است که ژنهایHSP ممکن است بهعنوان نشانگرهای زیستی برای ارزیابی پاسخ استرس در گاو و گاومیش مورد استفاده قرار گیرند و بیان اختصاصی بر اساس گونه و نژاد خاص داشته باشند(10,22). علاوه بر این،تفاوت در بیان پروتئین های HSP با مقاومت حرارتی و سازگاری با شرایط مختلف آب و هوایی مرتبط است. مشخص شده است که تفاوت در الگوی رونوشت خانواده HSP70 و سایر ژن هایHSP در طول فصول مختلف ممکن است دلیل عمده مکانیسم قابل توجه برای سازگاری بهتر در گاو زبو هند باشد (22) . مقایسه ژنومیک و پروتئومیک ژن ها و پروتئین های شوک حرارتی بین گونه های جانوری نزدیک به هم شرایط را برای درک رابطه تکاملیHSP ها و فشارهای انتخابی که تکامل این ژن ها را کنترل می کنند، فراهم می کند. تحقیق حاضرگامی برای درک چندشکلی ژنتیکی بین برخی از گونههای حیوانات اهلی است که انواع مختلفی از سازگاری را با استرس گرمایی متحمل شدهاند و از جمله این نژادها بز تالی متعلق به ناحیه گرمسیری جنوب ایران می باشد. این مطالعه به درک چگونگی واکنش جاندارن به استرس های محیطی کمک کند و برای بهبود نحوه انتخاب در آینده مفید می باشد.
مواد و روشها
توالی یابی کل ژنوم حیوانات مورد استفاده
نمونه خون از 15 راس بز از نژاد تالی در استان هرمزگان (منطقه گرمسیری) ایران جمع آوری شد. DNA از نمونه های خون کامل با استفاده از کیت استخراج DNA از خون (QiagenDNA، Hilden، آلمان) استخراج شد. DNA ادغام شده برای تولید کتابخانههای جفت انتهایی با استفاده از کیت آمادهسازی نمونه DNA ژنومیک (Illumina، San Diego، CA، USA) استفاده شد. توالی ها با Illumina equencing Kit v3 و Illumina Genome AnalyzerIIx System در Novogene (http://www.novogene.com) ایجاد شدند.
شناسایی تغییرات ژنتیکی بز تالی
خوانش ها با ژنوم مرجع بز CHIR_2.0 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000317765.2) و از طریقBWA (نسخه 0.6.2-r126) به منظورحذف تکراری ها توسط ( Picard-Tools-1 http:// broadinstitute. github.io/picard/ ) انجام شد. ابزار تجزیه و تحلیل ژنوم (GATK-2.6) هم ترازی موضعی را حول شاخص های موجود و ارزیابی مجدد امتیاز کیفیت پایه انجام داد. تشخیص واریانت ها با استفاده از ژنوتایپر GATK انجام شد. برای فیلتر کردن SNPها برای تجزیه و تحلیل، حداقل سه مورد خوانده شده با محل های شروع متنوع باید وجود داشته باشد.
انتخاب ژن، همترازی و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی بر اساس ژن
برای مقایسه توالی ژنهایHSP90-a و HSP90-b، در نژاد بز تالی، جهشهای مختلف در این ژن ها شناسایی و بر اساس توالی ژنوم رفرنس بز(Capra hircus) توالی ژن تعیین گردید. همچنین توالی این ژنها برای گاو(Bos taurus) ، گاومیش (Bubalus bubalis)، گاو زبو (Bos indicus)، بز(Capra hircus)،گوسفند (Ovis aries) ، شتر تک کوهانه (Camelus dromedarius)، شتر دوکوهانه (bactrianu sCamelus) از پایگاه داده NCBI برای تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ annotation_euk به دست آمد. بررسی همترازیها، استخراج اگزونها و ترسیم شجره فیلوژنتیکی با استفاده از برنامهCLC Genomics Workbench 21(7) صورت گرفت.
همچنین جهت تعیین تغییرات ژنتیکی در توالی ژن بز تالی نسبت به بز رفرنس و سایر گونه های موردمطالعه و همچنین تاثیر آنها بر توالی پروتئین، تمام SNPهای موجود در توالی ژنهایHSP90-a و HSP90-bدر بز نژاد تالی با استفاده از وب سایت VEP.ensemble (https://asia. ensembl.org/info/docs/tools/vep/index.html)(19,27) تحت همترازی چندگانه قرار گرفتند. علاوه بر این تمامی SNPها، محل قرارگیری و تاثیر آنها بر توالی پروتئین در تمامی گونه های مورد بررسی با استفاده از https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/))Cluster omega (38) برروی هم همتراز شده و مورد مطالعه قرار گرفت.
مدل سازی پروتئین
ساختارهای سه بعدی (3D) پروتئین های HSP90-a و HSP90-b با استفاده از وب سایت سوییس مدل https://swissmodel.expasy.org/interactive))(42) پیش بینی شدند.
نتایج و بحث
اندازه ژنوم، متوسط GC٪
و تعداد متوسط پروتئین های حیوانات موردمطالعه
اطلاعات مربوط به ژنوم بز(Capra hircus)،گاو(Bos taurus)، گاومیش(Bubalus bubalis)، گاو زبو(Bos indicus)، گوسفند(Ovis aries)، شتر تک کوهانه(Camelus dromedarius) و شتر دوکوهانه(Camelus bactrianus) از پایگاه داده NCBI به دست آمد (جدول ۱).
با توجه به اطلاعات موجود در پایگاه داده NCBI، ژنوم گاو Mb۲۷۱۵/۸۵ بوده که در ۲۹ جفت کروموزوم سوماتیک و دو کروموزوم جنسی، با تعداد پروتئین حدود ۴۲۴۹۷ و میانگین درصد,GC ۴۱/۸۷٪ توزیع شده است (جدول۱). اندازه ژنوم بز(C. hircus) Mb ۲۹۳۲/۲۶ بوده که بر روی۲۹ جفت کروموزوم سوماتیک و دو کروموزوم جنسی با متوسط تعداد پروتئین حدود ۴۲۶۸۷ و میانگین درصد,GC۴۲/۰۷٪ توزیع شده است(جدول ۱). اندازه ژنوم گوسفند(O. aries)Mb۲۷۶۷/۷۲ که در ۲۶ کروموزوم سوماتیک و دو کروموزوم جنسی با تعداد متوسط پروتئین حدود ۴۲۳۹۱ و میانگین,GC۴۲/۲۸٪ سازماندهی شده است(جدول ۱). اندازه ژنوم گاومیش(B. bubalis) Mb ۲۸۳۶/۱۷ بوده که در ۲۴ جفت کروموزوم سوماتیک و دو کروموزوم جنسی، با تعداد پروتئین حدود ۵۸۲۰۴ و میانگین درصد,GC۴۱/۹۰٪ سازماندهی شده است (جدول۱). ژنوم گاو زبو(B. indicus) دارای اندازه Mb ۲۷۰۷/۱۵ بوده که روی۲۹ جفت کروموزوم سوماتیک و دو کروموزوم جنسی با متوسط تعداد پروتئین حدود ۳۵۹۹۲ و میانگین درصد,GC ۴۲/۱۴ ٪ توزیع شده است(جدول۱). همچنین اندازه ژنوم شتر نک کوهانه (C. dromedarius) Mb ۲۰۸۴/۵۴ بوده که در ۳۶ کروموزوم سوماتیک و دو کروموزوم جنسی با تعداد متوسط پروتئین حدود ۵۱۷۳۶ و میانگین درصد,GC ۴۱/۵۰٪ سازماندهی شده است(جدول ۱). اندازه ژنوم شتر دوکوهانه(C. bactrianus) Mb۱۷۸۰/۷۲ بوده که در ۳۶ جفت کروموزوم سوماتیک و دو کروموزوم جنسی، با تعداد پروتئین حدود ۲۸۶۰۱ و میانگین درصد ,GC ۴۰/۴۵٪ توزیع شده است (جدول۱).
جدول۱- اندازه ژنوم، متوسط GC٪ و تعداد پروتئین متوسط حیوانات انتخاب شده
|
جاندار |
سایز ژنوم (Mb) |
GC% |
تعداد پروتئین |
|
بز C. hircus |
2932.26 |
42.07 |
42687 |
|
گاوB. taurus |
2715.85 |
41.87 |
42497 |
|
گوسفند O. aries |
2767.82 |
42.28 |
42391 |
|
گاومیش B. bubalis |
2836.17 |
41.90 |
58204 |
|
گاو زبو B. indicus |
2707.15 |
42.14 |
35992 |
|
شتر تک کوهانه C. dromedaries |
2084.54 |
41.50 |
51736 |
|
شتر دوکوهانه C. bactrianus |
1780.72 |
40.45 |
28601 |
بر اساس مقایسه ژنومی این حیوانات، تجزیه و تحلیل حاضر نشان داد که جانداران موردبررسی در اندازه ژنوم و محتوایGC متفاوت هستند، بنابراین آنها ممکن است ویژگی های متغیری داشته باشند. ژنومی که غنی از GC باشد نشانگر خوبی برای پایداریDNA در برابر تغییرات حرارت در نظر گرفته می شود. در یوکاریوت ها، نواحی ای از ژنوم که غنی از GC هستند غنی از ژن می باشند و همچنین این نواحی در برابر حرارت پایدار بوده و به طور فعال رونویسی می شوند (11,29). تجزیه و تحلیل انجام شده در اینجا نشان داد که گوسفند و بز دارای بالاترین محتوایGC است، در حالی که گاومیش و شتر دوکوهانه دارای کمترین مقدار است. این ممکن است پراکندگی گستردهتر گوسفند و بز را در طیف وسیعی از شرایط اقلیمی و جغرافیایی در مقایسه با بوفالوها و شتر دوکوهانه که تنها در باتلاقها و مناطق سروسیر گسترده است را توضیح دهد، زیرا اخیراً تأیید شده است که پایداری حرارتی ژنها در حیوانات با افزایش محتوایGC کندتر از توالیهای تصادفی افزایش مییابد، در حالی که انعطافپذیری آنها سریعتر افزایش مییابد(41).
مکان های
ژنومی ژن هایHSP90 در گونه های موردبررسی
مکان های ژنومی ژن هایHSP90با استفاده از پایگاه داده NCBI بر اساس شناسه ژنی آنها به منظور مشاهده موقعیت ژنومی و کروموزومی ژنی که آن را کد می کند تعیین شد (جدول ۲).
جدول۲- خصوصیات ژنومی و پروتئومیHSP90-a و HSP90-bبرای ۷گونه موردبررسی از حیوانات اهلی
|
نام جاندار |
خصوصیات ژنومی |
خصوصیات پروتئومی |
|||||
|
نوع پروتئین |
جایگاه ژنومی |
نام ژن |
اگزون |
طول پروتئین(aa) |
وزن ملکولی (kDa) |
شماره دسترسی |
|
|
بز C. hircus |
HSP90-a |
Chromosome 21-NC_030828.1 |
100860851 |
11 |
733 |
74.84 |
XP_017921728.1 |
|
HSP90-b |
Chromosome 23-NC_030830.1 |
100861006 |
12 |
724 |
83.26 |
XP_005696415.1 |
|
|
گاوB. taurus |
HSP90-a |
Chromosome 21-NC_037348.1 |
281832 |
11 |
733 |
74.84 |
NP_001012688.1 |
|
HSP90-b |
Chromosome 23-NC_037350.1 |
767874 |
12 |
724 |
83.26 |
NP_001073105.1 |
|
|
گوسفند O. aries |
HSP90-a |
Chromosome 18-NC_040269.1 |
100127209 |
11 |
733 |
74.84 |
XP_027813217.1 |
|
HSP90-b |
Chromosome 20-NC_040271.1 |
101117797 |
12 |
724 |
83.26 |
XP_004018903.1 |
|
|
گاومیش B. bubalis |
HSP90-a |
Chromosome 20-NC_037564.1 |
102409833 |
11 |
733 |
74.84 |
XP_025127285.1 |
|
HSP90-b |
Chromosome 2-NC_037546.1 |
102389823 |
12 |
724 |
83.26 |
XP_006069362.2 |
|
|
گاو زبو B. indicus |
HSP90-a |
Chromosome 21-NC_032670.1 |
109575457 |
11 |
733 |
74.84 |
XP_019839158.1 |
|
HSP90-b |
Chromosome 23-NC_032672.1 |
109577125 |
12 |
724 |
83.26 |
XP_019841450.1 |
|
|
شترتک کوهانه C. dromedarius |
HSP90-a |
Chromosome 6-NC_044516.1 |
105103462 |
13 |
733 |
74.84 |
XP_031310187.1 |
|
HSP90-b |
Chromosome 20-NC_044530.1 |
105088639 |
12 |
724 |
83.26 |
XP_010977847.2 |
|
|
شتر دوکوهانه C. bactrianus |
HSP90-a |
- |
105079942 |
10 |
649 |
76.71 |
XP_045361639.1 |
|
HSP90-b |
- |
105083823 |
14 |
724 |
83.26 |
XP_010972124.2 | |
مکانهای ژنومی و تعداد اگزونها با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی در گونه های مورد مطالعه تعیین شد (جدول ۲). تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک نشان داد که ژن HSP90-a و HSP90-b در گاو، گاو زبو و بز به ترتیب در کروموزوم۲۱ و ۲۳ قرار دارند، در حالی که این ژن ها در گاومیش به ترتیب در کروموزوم ۲۰و ۲ قرار دارند و در شتر تک کوهانه به ترتیب در کروموزوم ۶ و ۲۰ قرار گرفته اند و در شتر دوکوهانه جایگاه دقیق آنها مشخص نشده است. تجزیه و تحلیل همچنین نشان داد که ژن HSP90-a و hssp90-b در همه گونه های مورد بررسی بجز شتر به ترتیب دارای ۱۱ و ۱۲ اگزون بودند و تعداد اگزون در شتر تک کوهانه برای این دو ژن به ترتیب ۱۳ و ۱۲ و در شتر دوکوهانه دارای ۱۰ و۱۴ اگزون بودند.
همچنین تجزیه و تحلیل پروتئومیHSP90-a نشان داد که تمام پروتئینهایHSP90-aبجز شتر دوکوهانه از ۷۳۳ اسید آمینه در تمام گونه های مورد مطالعه تشکیل شده است درحالی که در شتر دوکوهانه تعداد اسیدآمینه ها برای این پروتئین۶۴۹ می باشد. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل محاسباتیHSP90-b نشان داد که تمام پروتئینهایHSP90-b از ۷۲۴ اسید آمینه در تمام گونه های موردمطالعه با وزن مولکولی۸۳/۲۶ کیلو دالتون تشکیل شدهاند (جدول ۲). نتایج تحقیق حاضر نشان از تشابه و حفاظت بالا برای این ژنها در گونه های مختلف حیوانی داشت.
اگرچه ما ارتباط ژنتیکی ژنهایHSP با صفات مربوط به سازگاری محیط را بررسی نکردهایم، اما بر اساس تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیکی، میتوانیم پیشبینی کنیم که پلیمورفیسم در توالیهای پروتئینHSP90-aو HSP90-b در بین گونه و نژادهای مختلف ممکن است مشاهده شود. همچنین بررسی تغییرات ژنتیکی بین نژاد تالی که یک نژاد سازگار به شرایط گرمایی است با بز رفرنس و سایر گونه های از اهمیت زیادی برخوردار است. مطالعات قبلی نشان داده اند که تفاوت در الگوی رونوشت های خانواده HSP در طول فصول مختلف ممکن است به طور عمده مکانیسم قابل توجهی از سازگاری بهتر گاوهای زبو در هند را نشان دهد (22).
هم ترازی و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی بر اساس ژن HSP90-a
از طریق همترازی توالی ژنوم میتوان دانش زیستی گونههای مختلف را به نواحی حفاظت شدهی توالی انتقال داد. همچنین، از طریق همترازی شبکه زیستی، میتوان دانش نواحی حفاظت شدهی شبکههای مولکولی را به نواحی مختلف حفاظت شدهی گونههای متفاوت انتقال داد(2). پروتئین های شوک حرارتیHSP90-a با هم، همتراز شدند تا پلی مورفیسم ژنتیکی بین نژاد بز تالی و بر زفرنس همچنین با سایر گونه های موردبررسی مشخص شود (شکل ۱). هم ترازی نشان داد که طول توالی های ژنHSP90-a به ویژه در بز(C. hircus) و گوسفند(O. aries) حفاظت شده بودند. شجره فیلوژنتیکی بر اساس توالی این ژن در بین گونه های موردمطالعه رسم گردید (شکل۲). همچنین این همترازی بر اساس طول توالی اگزونهای HSP90-a بر روی گونه های موردبررسی انجام شد (شکل۳).
شکل۱- هم ترازی توالی نوکلیوتیدی ژن HSP90-a در گونه های موردبررسی
شکل۲- شجره فیلوژنتیکی براساس توالی ژن HSP90-a در گونه های موردبررسی
شکل۳- هم ترازی توالی اگزونی ژن HSP90-a در گونه های موردبررسی
همترازی
و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی بر اساس ژن HSP90-b
ژنهای پروتئین شوک حرارتیHSP90-bبا هم، همتراز شدند تا پلی مورفیسم ژنتیکی در بین بز نژاد تالی و بر زفرنس همچنین با سایر گونه های موردبررسی مشخص شود (شکل ۴). هم ترازی نشان داد که طول توالی های ژنHSP90-b تنها در بز نژاد تالی و بز رفرنس کاملا مشابه بودند. همچنین شجره فیلوژنتیکی بر اساس توالی این ژن در بین گونه های موردمطالعه رسم گردید (شکل۵). بعلاوه این همترازی بر اساس توالی اگزونهای HSP90-b بر روی گونه های موردبررسی انجام شد (شکل۶). طول توالی اگزونی این ژن بین همه گونه ها بجز شتر تک کوهانه و دوکوهانه برابر بود. درخت فیلوژنتیک براساس همترازی بدست آمده برای اگزون نیزترسیم شد (شکل۴) و نشان داد که میزان تنوع حاصل از مقایسه اگزونها تقریبا مشابه با تنوع حاصل از توالی کل ژن می باشد.
شکل۴- هم ترازی توالی نوکلیوتیدی ژن HSP90-b در گونه های موردبررسی
شکل۵- شجره فیلوژنتیکی براساس توالی ژن HSP90-bدر گونه های موردبررسی
شکل۶- هم ترازی توالی اگزونی ژن HSP90-b در گونه های موردبررسی
همترازی و تجزیه و تحلیل
فیلوژنتیکی بر اساس ژن HSP90-a و HSP90-b
به دلیل اینکه هر دو ژن از یک خانواده می باشند لذا دو ژن فوق به صورت همزمان مورد بررسی قرار گرفت. همترازی ژنها در گونه های مختلف مورد بررسی قرار گرفت و جهت مقایسه فاصله هر یک از گونه ها و ژنها از همترازی دو ژن مورد بررسی برای ترسیم درخت فیلوژنتیکی استفاده شد (شکل۷). همچنین جهت مشخص شدن تعداد نوکلئوتیدهای متفاوت بین دو ژن و همچنین گسستها و تفاوتهای آنها در گونه های مختلف جدول مقایسه تفاوتها ترسیم گردید (جدول۳). بعلاوه درخت فیلوژنتیکی براساس همترازی اگزونهای دو ژن در گونههای مختلف نیز ترسیم گردید (شکل۸)
شکل۷- درخت فیلوژنتیکی براساس نتایج همترازی توالی نوکلیوتیدی دو ژن خانواده HSP90 در گونه های مختلف
پراکنش SNPها بر روی ژنهای
HSP90-a وHSP90-bبز تالی در مقایسه با بز رفرنس
ژنهایHSP90 بز تالی حاوی تعداد کلی۲۳۱ و۱۴۵ پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی به ترتیب برایHSP90-a وHSP90-b هستند. از این تعداد۸۷ و۴۸SNPدر ناحیه ۳’ ژن (۳۵/۹۰٪)، ۹۹ و۶۴SNPدر نواحی بالادست وپایین دست ژن (۴۳/۳۵٪) تعداد۳۰ و ۲۴ SNP در ناحیه اینترونیک ژن(۱۴/۳۶٪)، تعداد ۲و ۰ SNP در ناحیه برش ژن(۰/۵۳٪) و تعداد ۱۳ و ۹ SNP (۵/۸۵٪) در ناحیه اگزون ژن به ترتیب برای برایHSP90-a وHSP90-b شناسایی شد. شکل ۹ توزیع تغییرات ژنتیکی را در هر دسته نشان می دهد.
مقایسه همترازی بین توالی پروتئینهای HSP90-a نشان داد که توالی ها برای تمام گونه های مورد بررسی به میزان بالایی حفاظت شده است. بجز اختلاف در طول توالی پروتئین که در شتر دو کوهانه کوتاهتر از سایر گونه ها است میزان تفاوت در نوع اسیدآمینه ها در طول توالی بسیار کم است تنها تفاوتهای مشاهده شده در موقعیت اسیدآمینه ۷ است که در دو گونه شتر تک کوهانه و شتر دوکوهانه متفاوت از سایر گونه هاست و به جای اسیدآمینه آلانین اسیدآمینه تریونین جایگذاری شده است.
جدول۳- مقایسه طول توالی نوکلیوتیدی بین دو ژن HSP90-aو HSP90-b در گونه های مختلف موردبررسی گسستها (در بخش بالای جدول) و تفاوتهای (در بخش پایین جدول)
|
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
|
HSP90AB1-Tali Breed |
1 |
|
0 |
39 |
146 |
92 |
89 |
642 |
2538 |
2721 |
2721 |
2783 |
2714 |
2758 |
2696 |
2794 |
3272 |
|
HSP90AB1-Goat
|
2 |
56 |
|
39 |
146 |
92 |
89 |
642 |
2538 |
2721 |
2721 |
2783 |
2714 |
2758 |
2696 |
2794 |
3272 |
|
HSP90AB1-Sheep |
3 |
164 |
108 |
|
149 |
95 |
102 |
657 |
2529 |
2720 |
2720 |
2782 |
2713 |
2757 |
2695 |
2803 |
3265 |
|
HSP90AB1-Cattle |
4 |
467 |
414 |
409 |
|
58 |
129 |
724 |
2482 |
2683 |
2683 |
2745 |
2676 |
2720 |
2658 |
2827 |
3232 |
|
HSP90AB1-Indicus(Zebu) |
5 |
416 |
368 |
357 |
67 |
|
75 |
670 |
2538 |
2739 |
2739 |
2801 |
2732 |
2776 |
2714 |
2818 |
3288 |
|
HSP90AB1-Water Buffalo |
6 |
417 |
363 |
363 |
288 |
234 |
|
651 |
2579 |
2756 |
2756 |
2818 |
2749 |
2793 |
2731 |
2807 |
3309 |
|
HSP90AB1-Arabian Camel |
7 |
1480 |
1442 |
1456 |
1516 |
1472 |
1470 |
|
2332 |
2893 |
2893 |
2955 |
2888 |
2932 |
2870 |
2876 |
3464 |
|
HSP90AB1-Bacterian Camel |
8 |
2963 |
2932 |
2924 |
2882 |
2939 |
2993 |
2338 |
|
2927 |
2927 |
2831 |
2926 |
2868 |
2922 |
4402 |
2340 |
|
HSP90AA1-Tali Breed |
9 |
3910 |
3887 |
3887 |
3853 |
3907 |
3930 |
4210 |
3763 |
|
0 |
114 |
105 |
161 |
123 |
2179 |
1197 |
|
HSP90AA1-Goat
|
10 |
3882 |
3859 |
3860 |
3823 |
3878 |
3900 |
4183 |
3737 |
48 |
|
114 |
105 |
161 |
123 |
2179 |
1197 |
|
HSP90AA1-Sheep |
11 |
3926 |
3901 |
3900 |
3864 |
3919 |
3943 |
4222 |
3641 |
242 |
198 |
|
197 |
139 |
215 |
2267 |
1119 |
|
HSP90AA1-Cattle |
12 |
3895 |
3870 |
3867 |
3825 |
3880 |
3905 |
4174 |
3743 |
431 |
386 |
485 |
|
58 |
72 |
2196 |
1194 |
|
HSP90AA1-Indicus(Zebu) |
13 |
3920 |
3895 |
3893 |
3850 |
3905 |
3929 |
4200 |
3684 |
479 |
434 |
418 |
70 |
|
130 |
2252 |
1136 |
|
HSP90AA1-Water Buffalo |
14 |
3895 |
3872 |
3868 |
3822 |
3878 |
3902 |
4189 |
3751 |
448 |
402 |
504 |
227 |
275 |
|
2172 |
1188 |
|
HSP90AA1-Arabian Camel |
15 |
4635 |
4606 |
4600 |
4622 |
4604 |
4612 |
4853 |
5322 |
3019 |
2981 |
3066 |
2994 |
3043 |
2982 |
|
2070 |
|
HSP90AA1-Bacterian Camel |
16 |
4353 |
4326 |
4316 |
4263 |
4320 |
4344 |
4593 |
3258 |
1912 |
1875 |
1798 |
1874 |
1811 |
1882 |
2081 |
|
شکل۸- درخت فیلوژنتیکی براساس نتایج همترازی اگزونی دو ژن خانواده HSP90 در گونه های مختلف
شکل۹- توزیع تغییرات ژنتیکی در قسمتهای مختلف ژنهای HSP90a و HSP90b در بز تالی
که یک اسیدآمینه آب گریز با یک اسیدآمینه آب دوست جایگزین گردیده است و این نوع تغییرات می تواند تاثیر زیادی بر عملکرد پروتئین داشته باشد (20). همچنین در موقعیت ۷۰۸ در گاومیش آبی اسید آمینه اسید آسپارتیک با اسیدآمینه اسید گلوتامیک جایگزین شده است اما از نظر ویژگی فیزیکوشیمیایی این دو اسید آمینه در یک گروه قرار می گیرند و احتمالا تغییر محسوسی در عملکرد و ساختار پروتئین ایجاد نمی کنند (شکل۱۰ پیوست).
همچنین مقایسه همترازی بین توالی پروتئینهای HSP90-b نشان داد که توالی این پروتئین برای همه گونه های موردبررسی بسیار محافظت شده بوده است. تفاوتها در موقعیت ۹۹ و ۱۸۴ بین گونه های مختلف شتر با سایر گونه های موردبررسی بوده است به ترتیب که در موقعیت۹۹ ایزولوسین جایگزین والین شده است که هردو جز اسیدآمینه های آب گریز طبقه بندی می شوند و در موقعیت ۱۸۴ تیروزین جایگزین هیستیدین شده است که تیروزین یک اسیدآمینه آب دوست و حلقوی بوده درحالی که هیستیدین یک اسیدآمینه بازی می باشد (شکل۱۱ پیوست).
به این ترتیب نتایج این بررسی نشان داد که پروتئینهای HSP90-a و HSP90-b در گونه های موردمطالعه به شدت حفاظت شده هستند.
همراستایی پروتئین هایHSP90-a و HSP90-b نشان داد که این دو پروتئین در گونه های موردبررسی که سهم قابل توجهی در عرضه غذا در سطح جهان دارند، یعنی گاو(B. taurus)، گاو زبو(B. indicus)، گاومیش(B. bubalis)، گوسفند(O. aries)، بز(C. hircus)، شتر تک کوهانه(C. dromedarius) و شتر دوکوهانه(C. bactrianus) دارای حفاظت بالایی هست. همچنین نشان داده شده است که HSP90 نقشی محوری در ایجاد تحمل گرما برای دام دارد (23). بعلاوه HSP90 , HSP70 پاسخ سلولی را با حضور کلیدی در انتقال سیگنال و برهمکنش با پروتئین کینازها و فاکتورهای رونویسی تعدیل میکنند و بنابراین نقش محافظت از سلول ها و بدن را به عهده دارند (1,3, 23). مطالعات گدشته نشان داده اند که HSP70 و HSP90 برای محافظت در برابر شرایط محیطی سخت در گاوها با یکدیگر همکاری می کنند وبه صورت تداخلی عمل می کنند. در مورد گاومیش در تحقیق حاضر نشان داده شد که با سایر گونه ها در یک اسیدآمینه از HSP90-a متفاوت بود و می تواند تاییدی بر مطالعات انجام شده بر روی گاومیش رودخانه ای باشد ریرا گاومیش رودخانه ای (B. bubalis) به ویژه نسبت به گرما مقاوم نیست. طیف گسترده ای از تحقیقات نشان داده است که ویژگی های فیزیولوژیکی، تولیدی و تولیدمثلی با قرار گرفتن در معرض دمای محیطی بالا در بوفالوها کاهش می یابد(9,25). پیشنهاد شده است که حساسیت نسبی گاومیش به استرس گرمایی به دلیل پوست تیره و فولیکول های مو و غدد عرق کمتر آنها در مقایسه با سطوح گاو است (25). همچنین مشاهده شده است که خانواده ژن HSP90 گاومیش دارای شاخص آلیفاتیک بیشتر از 65 است که پایداری پروتئین ها را در دماهای بالا نشان می دهد (40). این ممکن است با میزان پایداری حرارتیHSP ها در گاومیش مرتبط باشد (44). علاوه بر این، شناسایی ژنومی برایHSPs گاومیش،Rehman و همکاران(40) دریافتند که میانگین سنی بسیار منفی شاخص هیدروپاتیسیتیHSP90 نشان دهنده ماهیت آبدوست برتر اعضای آن است. این می تواند به تقویت عملکردهای الیگومریزاسیون و اتصال پروتئین کمک کند.
علاوه بر این، ثابت شده است که B. indicus در مقایسه با نژادهای گاو دارای تحمل حرارتی منحصر به فردی است. B. indicus بعنوان یک نژاد که می تواند در مناطق خشک زنده بماند و با دمای بالا و شرایط آب و هوایی سخت سازگار شود شناخته شده است (12,32,34). مهمترین سازگاریهای ژنتیکی که در طول تکامل گاو زبو ایجاد شدهاند شامل دستیابی به ژنهایی برای تحمل حرارت است. گاوهای نژادهای زبو نسبت به گاوهایی از نژادهایB.taurus با منشاء اروپایی بهتر می توانند دمای بدن خود را در پاسخ به استرس گرمایی تنظیم کنند (14). علاوه بر این، تفاوت در آناتومی مانند اندازه بدن، رنگ، تعداد غدد عرق و پارامترهای فیزیولوژیکی، به عنوان مثال، پوست، دمای بدن، نبض و نرخ تنفس در حیوانات، پاسخ متغیری به عوامل استرس زای محیطی نشان داده است(25,27,30). همچنین گزارش شده است که شرایط محیطی نامطلوب میتواند باعث ایجاد پروتئینهای اشتباه تاخورده یا بازشده در سلولها شود و HSP ها می توانند این نوع پروتئینها را حذف یا محدود کنند. از این رو، درک معماری ژنتیکیHSP ها در حیوانات مختلف می تواند تنوع در سازگاری و بقا در شرایط سخت در میان گونه ها را روشن کند (16,17). همچنین مطالعات نشان دادند که در توالی پروتئینی گاو زبو حفاظت کامل وجود دارد، که ممکن است توضیح دهد که چرا این گونه ممکن است ویژگی های منحصر به فردی در سازگاری با شرایط محیطی داشته باشد (22,39). این مساله در مورد بزها و توانایی سازگاری آنها در شرایط مختلف محیطی و غذایی نیز همانند گاو زبو صادق است (33) به ویژه که بز تالی نیز از جمله نژادهای مقاوم در برابر گرما در جنوب ایران می باشد.
مطالعه حاضر نشان داد که گونه های شتر تک کوهانه و دوکوهانه در توالی اسیدهای آمینه در هر دو فرم HSP90 متفاوت از سایر گونه های موردبررسی بودند که منطبق بر نتایج مطالعات پیشین بوده است. تجزیه و تحلیل توالی پروتئین مقایسه ای بیش از 85٪ تشابه بین شتر و سایر حیوانات از جمله گاو، اسب، سگ، گربه و انسان را نشان می دهد (31).
نتایج مربوط به خواص عملکردیHSP90 در حیوانات مختلف به افزایش دانش ما در مورد مکانیسمهای مولکولی برای انتخاب حیوانات با مقاومت حرارتی در برابر تغییر آب و هوای سالهای آینده کمک می نماید. با این حال، مکانیسم های ژنتیکی مسئول تحمل حرارتی و ساختارهای فیزیولوژیکی مقاوم در برابر استرس حرارتی به طور کامل شناخته نشده است
مدل سازی پروتئین شوک حرارتی HSP90
ساختارهای سه بعدی (D3) پروتئین هایHSP90-a و HSP90-b با استفاده از پایگاه داده سوییس مدل تولید شدند. ساختار سه بعدیHSPها شامل دو حوزه اصلی است: یک دامنه که با نوکلئوتیدهای واقع در Nترمینال معرفی می شود و یک دامنه که به بستر واقع درC ترمینال (SBD) متصل می شود (شکل۱۲). ساختار خانواده HSP90 در بین گونه های موردمطالعه به خوبی حفظ شده است: اینها شامل دامنه N ترمینال، دامنه میانی و دامنه C ترمینال با موتیف پپتیدMEEVD آن است. که در مرکز آن نوکلئوتیدها (ATPیاADP) متصل می شوند. SBD از یک پپتید آب گریز و یک زیر دامنه a-مارپیچ (SBD-a) تشکیل شده است که اتصال بستر به SBD-b را تنظیم می کند. هر دو NBD و SBD توسط یک پیوند دهنده آب گریز حفاظت شده محدود می شوند(18). مطالعه حاضر نشان داد با توجه به عدم تغییر زیاد در توالی اسیدهای آمینه در گونه های موردبررسی ساختار شبیه سازی شده برای HSP90 در تمام گونه ها براساس پایگاه داده سوییس مدل یکسان بوده است (شکل۱۲).
شکل۱۲- ساختار سه بعدی HSP90 شبیه سازی شده با استفاده از وب سرور سوییس مدل
نتیجه گیری کلی
این مطالعه دو نوع پروتئین شوک حرارتی(HSP90-a و HSP90-b)را در سطح ژن و پروتئین در هفت گونه حیوان اهلی بعلاوه نژاد بز تالی شناسایی و مشخص کرد.
این مطالعه تاییدی بود بر میزان بالای حفاظت شدگی در این پروتئینها و اما بهرحال میزانی تفاوت در طول ژنها و تعداد اگزون ها در بین گونه های مورد مطالعه مشاهده شد. همچنین تفاوت در محتوایGC در ژنوم آنها ممکن است با توزیع برخی از حیوانات در شرایط اقلیمی و جغرافیایی متفاوت مرتبط باشد و آن را توضیح دهد. تفاوت در طول و نوع اسیدآمینه های بکاررفته در توالی پروتئینی بویژه در در دو گونه شتر موردبررسی و بوفالو می تواند عدم توانایی این گونه ها را در پاسخ به فشار انتخابی تحمیل شده توسط شرایط محیطی خاص ایجاد کند. بر اساس تجزیه و تحلیل محاسباتیHSP90 در این تحقیق، نیاز به کاوش عمیقتر مکانیسمهای سازگاری مولکولی در این حیوانات به منظور تقویت پرورش ژنتیکی برای مقابله با تأثیرات منفی دمای بالا مرتبط با تغییرات آب و هوایی وجود دارد.
| Article View | 1,713 |
| PDF Download | 503 |
Cellular and Molecular Research
(Iranian Journal of Biology)