Expression of recombinant protein contain CTLA4 in bacteria and study of its biological activity

Document Type : Research Paper

Authors
hossein Mahdizadeh 1
jafar salimian 2
jafar amani 3
Raheleh Halabian 3
Zahra Noormohammadi 4
Yunes Panahi 2
1 Dept. of Biology, Science and Research branch, Islamic Azad University, Tehran, I.R. of Iran.
2 Chemical Injuries Research Center, Systems Biology and Poisonings Institute, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran
3 Applied Microbiology Research Center, Systems Biology and Poisonings Institute, Baqiyatallah University of Medical Sciences, Tehran, Iran.
4 Department of Biology, Science and Research branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
10.22034/cmr.2022.2198
Abstract
Aim and Background: The chimer structure consisting of the extracellular domain of CTLA4 and the FC fragment of human IgG1 antibody binds to CD80 (B7-1) and CD86 (B7-2) ligands on APCs as a result inhibits CD28 binding and T lymphocyte activation. This structure, called Abatasept, was approved by the US FDA in 2005 to treat rheumatoid arthritis.



Material and methods: In this study, the CTLA4-FC chimer structure was designed and then some of its features were investigated using bioinformatics tools. The gene was then cloned into the pET-28a plasmid and transformed into E.coli BL21DE3. Recombinant protein was expressed and purified, and flow cytometry was used to evaluate the binding affinity. Mixed lymphocyte culture (MLR) method was also used to evaluate the biological activity of recombinant protein.



Results: Bioinformatics results showed that the designed structure of CTLA4-FC is suitable in terms of physicochemical properties, second and third structure, how it binds to the receptor, antigenic properties and mRNA properties. Recombinant protein was well expressed in bacteria. Purification was performed as required. Western blotting and ELISA results were positive and flow cytometry and MLR tests were acceptable.



Conclusion: Recombinant CTLA4-FC protein was produced in bacterial cells and bound well to CD80 and CD86 receptors and was able to inhibit T cells. So it can be a good candidate for drug production.

Keywords

Subjects

بیان سازه نوترکیب حاوی CTLA4 در باکتری و بررسی فعالیت بیولوژیکی آن

حسین مهدی زاده1، جعفر سلیمیان2*، زهرا نورمحمدی1، جعفر امانی3، راحله حبیبیان3 و یونس پناهی2

1 ایران، تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران، گروه زیست‌شناسی

2 ایران، تهران، دانشگاه علوم پزشکی بقیة الله (عج)، پژوهشکده سیستم بیولوژی مسمویت‌ها، مرکز تحقیقات آسیب های شیمیایی

3 ایران، تهران، دانشگاه علوم پزشکی بقیة الله (عج)، پژوهشکده سیستم بیولوژی مسمویت‌ها، مرکز تحقیقات بیولوژی مولکولی

تاریخ دریافت: 30/11/1400          تاریخ پذیرش: 11/07/1401

چکیده

CTLA4 گیرنده مهاری لنفوسیت های T می باشد. سازه کایمر متشکل از دمین خارج سلولی CTLA4 و بخش FC از آنتی بادی IgG1 انسانی  با اتصال به لیگاندهای CD80 ( B7-1) و CD86 ( B7-2) بر روی سلول های عرضه کننده آنتی ژن APC)) مانع اتصال CD28 و در نتیجه مانع فعال شدن لنفوسیت T و مهار پاسخ ایمنی می شود. این سازه به نام داروی آباتاسپت جهت درمان بیماری آرتریت روماتوئید، در سال 2005 مجوز گرفت. در این تحقیق، سازه کایمرCTLA4-FC   طراحی گردید و به کمک ابزارهای بیوانفورماتیک ویژگی های آن بررسی شد. ژن سنتز شده در پلاسمید pET-28a کلون و در باکتری E.coli BL21DE3 ترانسفورم شد. پروتئین نوترکیب بیان و تخلیص شد و بررسی تمایل اتصال با روش فلوسایتومتری انجام شد. برای بررسی فعالیت بیولوژیک پروتئین نوترکیب از روش کشت لنفوسیتی مختلط (MLR) استفاده شد. ویژگی های بیوانفورماتیکCTLA4-FC  نشان داد که ساختار طراحی شده جهت بیان در سلول پروکاریوت مناسب می باشد. پروتئین نوترکیب در باکتری با غلظتmg/L 10 بیان شد. نتایج وسترن بلاتینگ و الایزا صحت پروتئین را تایید کرد. نتایج فلوسایتومتری رابطه مستقیم بین غلظت پروتئین ها و میزان MFI را نشان داد. در تست MLR هم رابطه مستقیم بین غلظت پروتئین و مهار لنفوسیت های T  تایید شد. پروتئین نوترکیب CTLA4-FC تولید شده در سلول باکتریایی بخوبی به گیرنده های CD80 وCD86  متصل شد و توانست سلول های T را مهار نماید. بنابراین می تواند کاندیدای خوبی برای تولید دارو باشد.

واژه های کلیدی: بیوانفورماتیک، آباتاسپت، فلوسایتومتری،CTLA4-FC

* نویسنده مسئول، تلفن:    02176294339 ،  پست الکترونیکی: jafar.salimian@bmsu.ac.ir

مقدمه

 

یکی از لیگاندهای کمک تحریکی که بر روی سلول های T بیان می شود، CD28 است که به گیرنده های CD80 (B7-1) و CD86 ( B7-2) بر روی APC ها متصل می شود و باعث تحریک تکثیر سلولی و ترشح سایتوکاین ها توسط سلول T می شود. برخی گیرنده های اعضاء خانواده CD28 نقش مهارکنندگی دارند و باعث مهار سلول T فعال شده می شوند یکی از این گیرنده ها CTLA4 می باشد که بر روی سلول T فعال شده بیان می شود و به CD80 (B7-1) و CD86 ( B7-2) بر روی APC ها متصل شده و باعث مهار تکثیر سلول T می شود. میل پیوندی CTLA4 به CD80 ( B7-1) و CD86 ( B7-2) 10 تا 15 برابر بیشتر از CD28  است. (8 و 12). CTLA4-FC یک پروتئین کایمر محلول است که از دمین خارج سلولی رسپتور CTLA4 و بخش FC از ایمنوگلوبین G انسانی تشکیل شده است و بعنوان یک داروی مهار کننده ایمنی مورد استفاده قرار می گیرد. این دارو بعنوان مهار کننده رقابتی در مسیر CD28/B7 (CD80,CD86) عمل می کند. به این ترتیب که CTLA4 که بر روی سلول های T  بیان می شوند برخلاف  CD28  با اتصال رقابتی به گیرنده های CD80  و CD86  بر روی سلول های عرضه کننده  آنتی ژن باعث مهار لنفوسیتهای T می شوند. این دارو با نام آباتاسپت امروزه در درمان بیماری آرتریت روماتوئید و برخی بیماری های خود ایمن دیگر مورد استفاده قرارمی گیرد (8 و 13). با ایجاد دو جهش (A29Y و L104E) در دمین اتصالی CTLA4 داروی موثرتری با تمایل اتصال ( افینیتی ) بیشتر بنام بلاتاسپت تولید شد که برای جلوگیری از رد پیوند آلوگرافت در بیماران پیوند کلیوی مورد استفاده قرار می گیرد. جهش های ایجاد شده در دمین اتصالی باعث افزایش تمایل اتصال گردید (24).CTLA4-FC  توسط محققان مختلف در میزبان های مختلف بیان شده است. بعنوان مثال لی و همکاران در سال 2006 فیوژن پروتئین CTLA4-Ig را در گیاه برنج کلون و بیان کردند و ویژگی ها و فعالیت پروتئین تولید شده را در محیط برون تنی مورد بررسی قرار دادند و نشان دادند که پروتئین تولید شده دارای فعالیت بیولوژیکی می باشد و قادر است تکثیر سلول T را مهار نماید (12). زنگ و همکاران در سال 2007، پلاسمیدهای خطی حاوی ژن CTLA4-Ig را در سلول CHO کلون و بیان کردند و پس از تخلیص نشان دادند که پروتئین تولیدی فعالیت بیولوژیک دارد (29). بیان پروتئین در میزبان پروکاریوتی نسبت به میزبان یوکاریوتی مزایای زیادی از جمله ارزان بودن، بازدهی بالا و سادگی فرایند تولید و تخلیص دارد (11 و 30). در این تحقیق پروتئین  CTLA4-Ig پس از بررسی های بیوانفورماتیک در سلول E.coli BL21DE3 بیان و فعالیت بیولوژیکی آن بررسی شد.

مواد و روشها

بررسی های بیوانفورماتیک: جهت طراحی ساختار مورد نظر، انتهای کربوکسیلی دمین خارج سلولی CTLA4 به انتهای آمینی، FC آنتی بادی IgG1 انسانی متصل شد. برخی از خواص فیزیکوشیمیایی پروتئین با استفاده از نرم‌افزار آنلاین پروت پرام  به آدرس http://expasy.org/tools/protparam.html مورد بررسی قرار ‌گرفت (17). ارزیابی ساختمان دوم پروتئین نوترکیب به کمک نرم افزار گور 4  به آدرس الکترونیکی http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl صورت گرفت (20). برای پیش‌بینی ساختار سه بعدی پروتئین، از نرم‌افزار آی-تاسر به آدرس http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER استفاده گردید (30). و جهت تصویرسازی فایل PDB ارائه شده توسط آی-تاسر ، از نرم‌افزار استودیو 7/1 استفاده شد. ساختار دوم mRNA مربوط به سازه های ‌ژنی، با نرم‌افزار تحت وب  ام فولد در http://mfold.rna.albany.edu/ پیش‌بینی شد (32 و 16). داکینگ یا نحوه اندرکنش پروتئین با لیگاند CD80  و CD86 با استفاده از سرور زد داک (http://zdock.umassmed.edu/)  انجام شد (19). افینیتی ( تمایل اتصال ) پروتئین های نوترکیب به وسیله سرورPPA-Pred (http://www.iitm.ac.in/bioinfo/PPA-Pred/)  بررسی شد (27و15). آنتی ژنیسیتی پروتئین های نوترکیب با سرور واکسی ژن (http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/scripts/VaxiJen_scripts/VaxiJen3.pl)  بررسی گردید (4،9 و28 ).

کلونینگ و ترانسفورماسیون پلاسمید نوترکیب: توالی بهینه سازی شده جهت سنتز به شرکتBiomatik  کانادا ارسال گردید. پس از طراحی و سفارش پرایمر، ژن مورد نظر با روش PCR تکثیر شد. همچنین پلاسمید pET-28a استخراج شد. سپس محصول PCR و پلاسمید با استفاده از آنزیم های محدود کنندهHindIII  و XhoI هضم شد. واکنش الحاق بین قطعه ژن و پلاسمید برش خورده با استفاده از آنزیم لیگازT4 DNA انجام شد و ژن مورد نظر در پلاسمید pET-28a کلون شد. تایید کلونینگ با استفاده از واکنش PCR، هضم آنزیمی و تعیین سکانس انجام شد. پلاسمید نوترکیب با استفاده از روش شوک حرارتی در باکتری مستعد E.coli BL21DE3ترانسفورم شد.

بیان پروتئین نوترکیب: پس از تایید کلونینگ بمنظور بررسی بیان ژن در پلاسمید pET-28a بررسی بر روی چند کلونی حاوی پلاسمید نوترکیب انجام گرفت. باکتری مورد نظر در محیط کشت حاوی کانامایسین (μg/ml50) بمدت یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد و سرعت rpm150 کشت داده شدند. سپس مقدار 50 میکرولیتر از هر کشت به طور جداگانه به 5 میلی‌لیتر محیط LB دارای μg/ml50 کانامایسین اضافه و انکوبه شدند. پس از رسیدن کدورت رشد باکتری در طول موج 600 نانومتر به 7/0 ،  IPTG با غلظت نهایی  mM 1 در شرایط استریل اضافه ‌شده و بمدت 6 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و سرعت rpm150 در شیکر انکوباتور نگهداری شدند. یک لوله شاهد نیز بدون افزودن IPTG طبق شرایط فوق تهیه گردید. پس از اتمام زمان فوق مقدار 5/1 میلی‌لیتر از هر کدام از لوله‌های کشت تست و شاهد درون میکروتیوب های 5/1 میلی‌لیتری ریخته شد و به کمک سانتریفوژ در سرعت rpm5000 بمدت  5 دقیقه سلول‌ها جمع شدند. سلول‌های جمع شده را با 60 میکرولیتر اوره 8 مولار شکسته شد و با بافر نمونه با رقت x5/2 مخلوط و پس از جوشانیدن بمدت 5 دقیقه روی ژل  پلی اکریل آمید (SDS-PAGE) 12 درصد الکتروفورز شد.

تخلیص پروتئین نوترکیب: برای تخلیص پروتئین نوترکیب ابتدا محلول حاوی پروتئین روی ستون Ni-NTA اضافه گردید و مایع خروجی جمع‌آوری شد. سپس ستون بترتیب با بافر فروشویی حاوی ایمیدازول mM2۰ ، بافر فروشویی حاوی ایمیدازول mM2۵۰ و بافر MES (mM20) شستشو داده شد و خروجی آن جمع‌آوری شد. مقدار ۲۰ میکرولیتر از خروجی‌های ستون بهمراه ۵ میکرولیتر بافر نمونه پس از ۵ دقیقه قراردادن در آب جوش روی ژل SDS-PAGE 1۲٪ الکتروفورز شد تا نتیجه تخلیص بررسی شود. بقیه محلول‌ها در C˚-۲۰ نگهداری شد. پس از تخلیص پروتئین بمنظور حذف ایمیدازول، دیالیز انجام ‌شده و سپس با استفاده از روش برادفورد پروتئین مورد نظر تعیین غلظت شد. در نهایت پروتئین تخلیص شده مورد نظر در 70- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

وسترن بلاتینگ بمنظور تأیید پروتئین بیان‌شده: جهت انجام این تکنیک از آنتی بادی Anti- FC با کانجوگه HRP بصورت زیر استفاده شد. یکی از نمونه‌های بعد از بیان و نمونه شاهد (بدون القاء) مربوط به آن انتخاب شدند و برروی ژل SDS-PAGE 12 درصد الکتروفورز شدند. کاغذ نتیروسلولز به ابعاد ژل بریده و روی ژل قرار داده شد سپس ساندویچ در داخل تانک قرار داده شد و بلاتینگ بمدت 45 دقیقه با ولتاژ 75 انجام شد. پس از بلاتینگ کاغذ نیتروسلولز بمدت 12 ساعت، در داخل بافر بلاکینگ شناور شد سپس با بافر PBST شستشو داده شد. آنتی بادی Anti- FC بر روی کاغذ نیتروسلولز ریخته شد و بمدت یک ساعت در دمای اتاق روی شیکر قرار داده شد. سپس سه بار با PBST و هر بار بمدت 15 دقیقه شستشو داده شد. محلول DAB روی کاغذهای نیتروسلولز ریخته شد و پس از ظهور باندها با آب مقطر واکنش مهار شد (4).

تایید پروتئین های نوترکیب بوسیله تست الایزا : با توجه به اینکه پروتئین های نوترکیب حاوی بخش FC آنتی بادی می باشند لذا بمنظور تأیید پروتئین های نوترکیب سنجش الایزا غیر مستقیم استفاده شد. ابتدا غلظت های مختلف پروتئین (5-3/0 میکروگرم) در 100 میکرولیتر بافر پوشش دهنده (بافر کربنات-بی‌کربنات سدیم، 05/0 مولار، 6/9=pH) در چاهک های میکروپلیت ریخته شد. در چاهک کنترل تنها بافر پوشش دهنده اضافه شد. سپس میکروپلیت بمدت یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید. چاهک­ها پس از تخلیه، با بافر PBST (بافر PBS با 05/0 درصد توئین 20) چندین مرتبه شستشو داده شده و خشک شدند. سپس چاهک ها با 100 میکرولیتر از بافر بلاکینگ ( PBST حاوی شیرخشک 05/0) و قرار دادن بمدت یک ساعت در 37 درجه سانتی­گراد تثبیت شدند. در مرحله بعد، آنتی بادی آنتی IgG کونژوگه شده با آنزیم HRP با رقت 4/1 در PBST تهیه و درون هر چاهک ریخته شد و بمدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شد. 50 میکرولیتر سوبسترای TMB به هر چاهک اضافه و میکروپلیت به محل تاریک منتقل شد تا واکنش انجام گیرد. پس از تغییر رنگ محلول به آبی، واکنش با محلول بازدارنده ( اسید کلریدریک N1) متوقف گردید. در نهایت جذب در طول موج 450 نانومتر خوانده شد.

انجام Circular Dichroism: جهت مقایسه ساختار دوم پروتئین های نوترکیب با ساختار دوم پیش بینی شده توسط نرم افزارهای بیوانفورماتیک بررسی ساختار دوم یا CD با استفاده از دستگاه اسپکتروپلاریمترJASCO J-810  با طیف اندازه گیری 240-180 نانومتر و دمای ۲5 درجه سانتی گراد انجام شد. غلظت نمونه پروتئین مورد استفاده برابر با g/mlμ200  بود و از محلول شستشویی که پروتئین در آن حل شده بود بعنوان نمونه بلانک استفاده شد.

بررسی تمایل اتصال پروتئین های نوترکیب با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری: جهت مقایسه تمایل اتصال پروتئین نوترکیب با پروتئین استاندارد، پروتئین استانداردCD152 [CTLA-4] (human):Fc (human)  از شرکت آدیپوژن (شماره کاتالوگ:CHI-HF-210A4-C500) خریداری گردید. اتصال پروتئین نوترکیب و پروتئین استاندارد به گیرنده سلولی B7  بر سطح سلولهای راجی با روش فلوسیتومتری مورد ارزیابی قرار گرفت. از سلولهای HEK-293 که گیرنده  B7را بیان نمی کنند بعنوان کنترل منفی استفاده گردید. ابتدا 105×1 سلول از سلولهای Raji  و HEK-293 در لوله های جداگانه ریخته شده و با PBS سرد دو بار شستشو انجام شد. بلاکینگ با 100 میکرولیتر PBS حاوی 2 درصد FBS بمدت 45 دقیقه دردمای C ˚4 انجام شد. سپس دو بار شستشو با PBS سرد انجام شد. جهت بررسی بیان رسپتور CD80 بر روی سلولهای Raji آنتی بادی  PE Mouse Anti-Human CD80 بمیزان 5 میکرولیتر به هر میکروتیوپ اضافه شد و بمدت 45 دقیقه دردمای C ˚4 انکوبه شد. پس از شستشو با PBS سرد خوانش با دستگاه فلوسیتومتری BD Facs Calibur انجام شد. از سلول HEK-293 بعنوان کنترل منفی استفاده شد. همچنین برای تنظیم ولتاژ دستگاه ابتدا سلول های Raji بدون رنگ (آنتی بادی کانژوگه) استفاده شد. در مرحله بعد پروتئین نوترکیب بترتیب با غلظت های ml/gμ10 ، ml/gμ 1، ml/gμ 1/0و ml/gμ 01/0 به لوله ها اضافه شد و بمدت 45 دقیقه دردمای C ˚4 انکوبه شد. سپس آنتی بادیMonoclonal Anti-Human IgG1-FITC  بمیزان 2 میکرولیتر به سلول ها اضافه شد و بمدت 45 دقیقه دردمای C ˚4 انکوبه شد. در نهایت خوانش با دستگاه فلوسیتومتری انجام شد. ابتدا سلول Raji بدون رنگ برای تنظیم ولتاژ دستگاه و سپس نمونه های تست خوانش گردید. در نهایت آنالیز داده های بدست آمده با استفاده از نرم افزار Flowjo 7.6.1 انجام شد.

بررسی میزان مهار لنفوسیت T توسط پروتئین نوترکیب: ابتدا موش BALB/c با آنتی ژن CtxB (B subunit of Chlora toxin) ایمن شد سپس طحال موش جدا و سلول های طحالی جداسازی شد. تعداد 50000 سلول طحال در هر چاهک پلیت 96 خانه کشت داده شد و به هر چاهک مقدار 4 میکروگرم کانکاناوالین A و μg/ml 10 از آنتی ژن CtxB اضافه شد. غلظت های مختلف (g/mlμ5/2، g/mlμ5، g/mlμ10، g/mlμ20) از پروتئین های استاندارد و همچنین  نوترکیب به چاهک ها اضافه گردید و پلیت بمدت 48 ساعت انکوبه شد. پس از گذشت 48 ساعت درصد حیات سلول های تیمار شده با روش سنجش تکثیر و بقای سلولی (MTT) سنجش گردید.

نتایج

خصوصیات فیزیکوشیمیایی پروتئین نوترکیب: خصوصیات فیزیکوشیمیایی پروتئین نوترکیب در جدول 1 آورده شده است.

 

جدول1- پیش بینی برخی از خصوصیات فیزیکوشیمیایی پروتئین نوترکیب بوسیله نرم‌افزار پرات پرام

. میانگین هیدروپاتیسیتی (GRAVY)

شاخص آلیفاتیک

شاخص ناپایداری

نیمه عمر برآورد شده (رتیکولوسیت پستانداران در شرایط آزمایشگاه)

PH ایزوالکتریک نظری

وزن مولکولی

(دالتون)

تعداد اسیدهای آمینه

نام ساختار

-403/0

71/74

37/47

30 ساعت

67/5

6/39447

357

CTLA4-FC

 

 

نیمه عمر ساختار 30 ساعت تخمین زده شد. نیمه عمر مدت زمانی است که طول می کشد تا نیمی از میزان یک پروتئین بعد از سنتز در سلول باقی می ماند. شاخص ناپایداری تخمین میزان پایداری پروتئین در لوله تست می باشد. وقتی شاخص پایداری یک پروتئین کمتر از 40 باشد یعنی پروتئین پایدار است و شاخص بالاتر از 40 نشان دهنده ناپایداری پروتئین است. شاخص آلیفاتیک پروتئین بعنوان میزان نسبی زنجیره های جانبی آلیفاتیک ( آلانین، والین، ایزولوسین و لوسین ) که در یک پروتئین وجود دارد تعریف می شود و فاکتور مثبتی برای افزایش پایداری حرارتی پروتئین های گلوبولار می باشد. شاخص GRAVY برای پپتیدها و پروتئین ها به صورت مجموع ارزش های هیدروپاتی همه اسید های آمینه تقسیم بر تعداد رزیدوهای موجود در سکانس محاسبه می شود. GRAVY کمتر پروتئین باعث اندرکنش بهتر آن با آب می شود (5 و 22).

بررسی ساختمان دوم پروتئین: بر اساس پیش‌بینی‌های انجام گرفته با نرم افزار GORIV ، پروتنین کایمر طراحی شده از ساختارهای دوم آلفا هلیکس 52/9 % رشته گسترش یافته 77/32 %  و مارپیچ تصادفی 70/57 %  تشکیل شده است.

ارزیابی پایداری مدل های ساختاری: نتایج ارزیابی پایداری مدل های ساختاری طراحی شده با استفاده از نرم افزار راماچاندران پلات که در شکل 1 آورده شده است نشان داد که رزیدوها در سه ناحیه مطلوب 300 رزیدو ( 6/83 % )، ناحیه مجاز 46 رزیدو ( 8/12 %) و ناحیه خارج 13 رزیدو (6/3 %) قرار می گیرند. ساختاری پایدار است که حداقل 80 درصد از رزیدوهای آن در ناحیه های مطلوب و مجاز قرار داشته باشند. بنابراین ساختار بررسی شده پایدار می باشد.

 

شکل- نمودار راماچادران ساختار CTLA4-FC

 

پیش‌بینی ساختمان سوم: پس از ذخیره‌ء اطلاعات سرور I-TASSER به فرمت pdb، با استفاده از نرم افزار Accelrys Discovery Studio Visualizer 1.7 که قادر به تصویرسازی فرمت pdb است، مدل ساختار سه بعدی پروتئین نام‌گذاری و مکان نواحی پایدارکننده و عملکردی مشخص گردید (شکل2). نتایج بررسی ساختمان سوم نشان می دهد که دمین های عملکردی و پایدارکننده مجزا از یکدیگر در ساختارها قرار گرفته اند. C-score برابر با 56/0 ساختار هم نشان دهنده این است که این ساختار کیفیت مناسبی دارد.

شکل 2- ساختمان 3D پروتئین نوترکیب پیش‌بینی شده توسط نرم‌افزار I-TASSER و تصویرسازی شده توسط نرم‌افزار Accelrys DS Visualizer 1.7.( ناحیه زرد رنگ مربوط به بخش عملکردی و ناحیه آبی و قرمز مربوط به بخش پایدار کننده می باشد)

بررسی داکینگ  پروتئین نوترکیب با لیگاند CD80  و CD86: در سرور هکس داکینگ برای بررسی نحوه اندرکنش پروتئین نوترکیب با لیگاندهای CD80 و CD86 نیاز به فرمت PDB این لیگاندها بود که این فرمت از سایت یونی پرات اخذ شد. سپس نحوه اندرکنش آنها با پروتئین های نوترکیب بررسی گردید. همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است پروتئین های نوترکیب از ناحیه صحیح یعنی از ناحیه CTLA4 به لیگاندهای دایمر و مونومر CD80 و CD86 متصل می شوند.

 

B

A

شکل 3- نحوه اندرکنش (داکینگ) CTLA4-FC با لیگاندهای CD80 (1I8L و1DR9) و CD86 (1I85  و 1NCN): اندرکنش مناسب بین بخش عملکردی پروتئین های کایمر (آبی رنگ) و لیگاند های مونومر و دایمر CD80 و CD86 ( زرد رنگ) برقرار شده است.

 

 

پیش بینی میل پیوندی پروتئین های نوترکیب با لیگاندهای CD80  و CD86:  با استفاده از سرور PPA-Pred میل پیوندی پروتئین نوترکیب کایمری با لیگاندهای CD80 و CD86 به طور جداگانه بررسی گردید. مقدار Kd پیش بینی شده ( ثابت تفکیک) بترتیب برای CD86 برابر با 8/2e-07 M و برای  CD80 برابر با 0/26e-08M و مقدار دلتا G پیش بینی شده ( انرژی آزاد پیوند) برای CD86 برابر با -93/ 8 kcal/molو برای CD80 برابر با -48/10 kcal/molمی باشد. هرچه دلتا G و ثابت تفکیک کمتر باشد میل پیوندی بیشتر است  نتایج نشان داد که ساختار میل پیوندی مناسبی دارد.

پیش‌بینی ساختار mRNA و پایداری آن: جزئیات ترمودینامیک مربوط به انتهای '5 mRNA نشان داد که حداقل انرژی آزاد برابر با 10/336- و ΔG شروع برابر با 60/5- می باشد. (شکل 4).

شکل4- پیش بینی ساختمان دوم mRNA برای CTLA4-FC

نتایج نشان می دهد که انتهای ′5 ژن پروتئین نوترکیب همانند ساختار ژنهای پروکاریوتی فولد شده است. شواهد نشان می دهد که mRNA بمیزان کافی جهت بیان مناسب در میزبان باکتریایی پایدار می باشد.

آنتی ژنیسیتی پروتئین نوترکیب: نتایج بررسی آنتی ژنیسیته پروتئین کایمر با سرور واکسی ژن با حد آستانه 5/0 نشان می دهد که ساختار کایمر با شاخص آنتی ژن  4877/0 ، غیر آنتی ژن است و لذا سیستم ایمنی را تحریک نمی کند. (جدول6).

بررسی بیان و تخلیص پروتئین­ نوترکیب: پس از بیان پروتئین نوترکیب در همسانه انتخاب شده و بدنبال آن شکستن سلول‌های باکتری با استفاده از اوره 8 مولار، بقایای سلولی و سایر اجزاء نامحلول با سانتریفیوژ از عصاره شفاف سلولی جدا گردید. در ادامه عصاره محلول در بافر نمونه پروتئینی حل شده و با SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفتند. شکل 5 نتیجة بیان سازوارة نوترکیب را پس از انجام فرآیند تخلیص نشان می دهد. تصویر ژل مؤید بیان پروتئین نوترکیب با وزن تقریبی 45 کیلو دالتون بصورت ذرات مجتمع است. غلظت پروتئین تخلیص شده برای انجام آنالیزهای بعدی برابر باmg/L 10 اندازه گیری شد. بمنظور بازیافت پیوندهای دی سولفیدی پروتئین های نوترکیب که بصورت ذرات مجتمع بودند ریفولد شدند.

شکل5- بررسی تخلیص پروتئین نوترکیب جهت بیان پروتئین نوترکیب CTLA4-FC: ستون 1، مارکر پروتئینی (SMOBIO)  ستون2، نمونه عصاره سلول القاء نشده (کنترل منفی). 3، نمونه عصاره سلول بعد از القاء. ستون. ستون 4، فروشویی ستون با بافر حاوی ایمیدازول mM2۵۰

آنالیز پروتئین نوترکیب با روش وسترن بلات: همانگونه که در شکل 6 نشان داده شده است نتایج وسترن بلات نشان داد که آنتی-FC بطور اختصاصی با بخش FC پروتئین نوترکیب واکنش می­دهد. این در حالی است که آنتی-FC کوچکترین واکنشی با دیگر پروتئین­های موجود در سوپ سلولی که حاوی تمام پروتئین­های بیان شده در باکتری است، نداشت.

 

شکل 6- نتیجه وسترن بلاتینگ پروتئین نوترکیب:  1) مارکر پروتئینی( marker- proteintech  Prestained protein) 2) پروتئین نوترکیب

تایید پروتئین های نوترکیب به­ وسیله تست الایزا: با توجه به اینکه بخش پایدار کننده در پروتئین های نوترکیب تولید شده، FC آنتی بادی می باشد لذا با انجام الایزا با آنتی بادی کانژوگه ضد FC حضور پروتئین تایید شد. همانطور که در نمودار1 نشان داده شده است میزان جذب نوری در طول موج nm450 با افزایش غلظت پروتئین نوترکیب افزایش یافته است در حالی که جذب پروتئین کنترل BSA با افزایش غلظت ثابت مانده است.

 

نمودار 1- نمودار الایزای پروتئین نوترکیب

نتایج CD: آنالیز ساختار دوم پروتئین نوترکیب CTLA4-FC نشان داد که ساختار دوم این پروتئین با ساختار دوم پیش بینی شده آنها تقریبا مشابه می باشد. (جدول 7)

 

جدول 7- مقایسه ساختار دوم پروتئین نوترکیب با ساختار دوم پیش بینی شده

پیچ-بتا

آلفا-هلیکس

صفحه-بتا

مارپیچ تصادفی

ساختار دوم

نام ساختار

محاسبه نشد

28/7 %

45/34%

26/58 %

پیش بینی شده

CTLA4-FC

7/12 %

3/5 %

3/31 %

7/50 %

CD

 

 

بررسی تمایل اتصال پروتئین های نوترکیب با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری: شکل 7 شدت رنگ PE در سلول Raji که بیانگر بیان بالای رسپتور CD80 بر سطح این سلول می باشد را نشان می دهد. همانگونه که در شکل 7 نشان داده شده است نتایج شدت رنگ FITC در تمامی غلظت های پروتئین استاندارد و پروتئین نوترکیب تقریبا برابر و بالای 90 درصد مثبت می باشد ولی وقتی در آنالیز نتایج با نرم افزار Flowjo ، شدت فلورسانس میانگین (MFI) نمونه ها بررسی شد مشاهده شد که این پارامتر برای نمونه های مختلف متفاوت می باشد و با کاهش غلظت پروتئین ها میزان MFI بطور منطقی کاهش می یابد ( شکل 8). لذا می توان با مقایسه MFI پروتئین استاندارد با پروتئین نوترکیب غلظت های مختلف میزان تمایل اتصال آنها را بررسی نمود. نمودار 2،MFI  نمونه ها در غلظت های مختلف پروتئین استاندارد و پروتئین های نوترکیب را نشان می دهد. مطابق نمودار در غلظت های مختلف، پروتئین استاندارد میزان MFI  بیشتری نسبت به پروتئین نوترکیب دارد.

 

 

 

شکل7- شدت رنگ PE در سلول Raji که بیانگر بیان بالای رسپتور CD80 بر سطح این سلول می باشد: نمودار خاکستری نمونه بدون رنگ، نمودار آبی سلول Hek293 فاقد رسپتور CD80 و نمودار نارنجی سلول های Raji

B

A

 D

C

شکل 8- مقایسه شدت رنگ FITC در غلظت های مختلف پروتئین استاندارد (نمودار سبز)، پروتئینCTLA4-FC  (نمودار آبی): A) غلظتg/ml μ 10 B) غلظتg/ml μ 1 C) غلظتg/ml μ 1/0 D) غلظتg/ml μ 01/0 و نمونه بدون رنگ ( نمودار خاکستری)

 

 

نمودار2- مقایسهMFI  پروتئین استاندارد با پروتئین نوترکیب CTLA4-FC

 

بررسی میزان مهار لنفوسیت T توسط پروتئین های نوترکیب: میزان حیات سلول ها پس از تیمار با غلظت های مختلف پروتئین استاندارد و پروتئین نوترکیب با روش MTT سنجیده شد. نتایج نشان می دهد که میزان مهار کنندگی لنفوسیت های T توسط پروتئین نوترکیب CTLA4-FC در غلظت های مختلف از پروتئین استاندارد کمتر می باشد. (نمودار3)

 

نمودار 3- درصد حیات لنفوسیت های T در حضور غلظت های مختلف پروتئین نوترکیب ( ستون های قرمز) و مقایسه آن با پروتئین استاندارد ( ستون های سبز رنگ )،. ستون های آبی رنگ نمونه های کنترل ( فاقد پروتئین مهارکننده)

بحث

گیرنده CTLA4 بر روی سلول های T  فعال شده بمیزان زیاد بیان می شود و با اتصال رقابتی به لیگاند های B7 باعث مهار پاسخ ایمنی می شود. تمایل اتصال مولکول CTLA4 نسبت به لیگاند های B7 تقریبا 10 تا 15 برابر مولکول CD28 می باشد. بدلیل این تمایل اتصال زیاد از مولکول CTLA4 بعنوان مهار کننده لنفوسیت های T و مهار کننده سیستم ایمنی جهت درمان برخی بیماری های خود ایمن استفاده می شود.(8)  

در مطالعات قبلی CTLA4-Ig اغلب در سلول های یوکاریوتی بیان گردیده بود بعنوان مثال زنگ و همکاران در سال 2007 پلاسمید خطی حاوی CTLA4-Ig را در سلول های CHO کلون و بیان کردند (29). بیان در سلول یوکاریوتی با مشکلات زیادی مانند پیچیدگی پروسه استخراج خطر آلودگی ویروسی و هزینه های بالا همراه است. ولی در سیستم باکتریایی مزیت های زیادی همچون رشد سریع و زیاد، هزینه پایین استخراج، و به صرفه بودن از نظر اقتصادی دارد (1و2). لذا در این تحقیق پروتئین کایمر CTLA4-FC در سلول باکتریایی بیان شد و فعالیت بیولوژیکی آن با نمونه تولید شده در سلول های یوکاریوتی مقایسه گردید.

امروزه استفاده از ابزارهای بیوانفوماتیک قبل از انجام تست های آزمایشگاهی بدلیل مزایای بسیاری مانند در دسترس بودن، سریع و کم هزینه بودن امری معمول و مرسوم می باشد (16،23، 25 و 34). طبق نتایج حاصل از نرم افزارProtParam  کایمر مورد مطالعه بیشترین پایداری و طول عمر را خواهد داشت. نتایج نرم افزار I-TASSER نشان داد که ساختار سوم پیش بینی شده پروتئین، ساختاری صحیح است. چرا که ضریب اطمینان (C-score) ساختار تعیین شده در محدوده مجاز قرارگرفته است. نرم افزار آیتاسر، در مقایسه با سایر نرم‌افزارها در پیش‌بینی ساختمان سوم پروتئین از دقت عمل بیشتری برخوردار است و دارای روش‌های مختلفی برای نیل به این مهم است. پارامترهایی که توسط این نرم‌افزار لحاظ می‌شود، به انتخاب مدل برتر کمک می‌کند (19). C-score که از نظر عددی بین 5- تا 2 است، یک نمره اطمینان برای تعیین کیفیت ساختارهای پیش بینی شده توسط این نرم افزار می باشد که بر پایه اهمیت ساختار الگوهای همتراز و همگرایی پارامترهای ساختار شبیه سازی شده محاسبه می گردد. نمودار راماچاندران مناطق مجاز از نظر انرژی برای زوایای ψ  و φ رزیدوهای اسید آمینه در ساختار پروتئینی را بررسی می کند و بر این اساس تعداد رزیدوهای دلخواه، تعداد رزیدوهای مجاز و تعداد رزیدوهای خارج از محدوده را نشان می دهد. (9 و 33). سرور زد داک، سروری است که به آسانی و با سرعت بالا می تواند مدل های مناسب برای اندرکنش های پروتئین ها ارائه دهد (3 و 18). یکی از فاکتورهای مهم در طراحی ژنهای کایمر توجه به پایداری ساختارmRNA  می باشد. بمنظور بررسی پایداری ساختار RNA میزان ΔG، وجود ساختارهایی از قبیل لوپ های کاذب ارزیابی شد. حداقل انرژی آزاد (ΔG) که نشان دهنده پیشرفت خود به خودی واکنش بوده نشان می دهد که ساختار کایمر انتخاب شده پایدار بوده است. این واقعیت با بیان میزان بالای پروتئین در فاز آزمایشگاهی ثابت گردید (14).  بهینه سازی مناسب باعث بیان مناسب و بالای پروتئین های نوترکیب در میزبان گردید. از وﻛﺘـﻮر pET-28a بدلیل اینکه دارا بودن ﭘﺮوﻣﻮﺗﻮر ﻗﻮی و در دﺳﺘﺮس بودن استفاده شد. پروتئین های نوترکیب تحت شرایط دناتوره تخلیص و ریفولد شدند. در مقایسه با دیگر مطالعات انجام شده مانند مطالعه سئوب شین و همکارانش در سال 2007 که میزان پروتئین mg/L 6 تولید نمودند تولید پروتئین با غلظت mg/L 10 در این تحقیق نشان دهنده بهینه سازی مناسب بیان می باشد. (4 و 21). یکسان بودن تقریبی نتایج CD با پیش بینی های انجام شده نشان دهنده پیش بینی دقیق ساختار دوم می باشد. از استفاده از تکنیک فلوسایتومتری جهت بررسی افینیتی در مطالعات مختلف مرسوم می باشد. زنگای و همکاران برای بررسی تمایل اتصال فیوژن پروتئینCTLA4-FC  از روش فلوسایتومتری استفاده نمودند (26). در آنالیزهای فلوسایتومتری از سلول Raji  بدلیل اینکه رسپتور CD80 را در سطح خود بیان می کند استفاده شد. در مطالعات مختلف هم برای بررسی افینیتی از همین سلول استفاده می شود. میزان MFI پروتئین نوترکیب در غلظت های مختلف در مقایسه با میزان MFI پروتئین استاندارد مقادیر کمتری را نشان می دهد. این موضوع با توجه به اینکه پروتئین استاندارد در سلول های یوکاریوتی تولید شده است طبیعی به نظر می رسد. مخلوط سلول های طحالی حاوی سلول های T و سلول های عرضه کننده آنتی ژن هستند تحریک سیستم ایمنی موش با یک آنتی ژن باعث می شود تا افزودن این آنتی ژن در محیط کشت سلول های طحالی عرضه آنتی ژن توسط APC ها بهتر انجام شده و در نتیجه فعالسازی و تکثیر سلول های T را در پی خواهد داشت. پایین بودن اثر مهاری پروتئین نوترکیب در مقایسه با پروتئین استاندارد بدلیل تمایل اتصال کمتر این پروتئین ها به رسپتورشان نسبت به پروتئین استاندارد می باشد و موید نتایج تست فلوسایتومتری می باشد. مطالعات مختلف نشان داده است که گلیکوزیلاسیون CTLA4 در افزایش نیمه عمر پروتئین نقش دارد و در تمایل اتصال آن به گیرنده نقشی ندارد. (8) با توجه به اینکه پروتئین نوترکیب به گیرنده متصل شد و باعث مهار تکثیر سلول های T گردید  لذا به نظر می رسد بازیابی کامل پیوندهای دی سولفیدی و ایجاد ساختار صحیح پروتئین می تواند در افزایش عملکرد آن نقش داشته باشد. بنابراین با اصلاح و بهینه سازی روش های ریفولد پروتئین می توان به این مهم دست یافت.

نتیجه گیری

پروتئین CTLA4-FC تولید شده در این تحقیق در مقایسه با پروتئین استاندارد که در سلول های یوکاریوتی تولید شده بود تمایل اتصال کمتری در اتصال به سلول های T از خود نشان داد و در نتیجه اثربخشی کمتری بعنوان دارو خواهد داشت. علارغم این موضوع با توجه به اینکه تولید پروتئین نوترکیب در سلولهای پروکاریوتی مزایای بسیار زیادی دارد می توان این دارو را با بهینه سازی روش های بیان و تخلیص در فازهای بعدی مطالعه بعنوان دارو تولید نمود که این موضوع نیاز به مطالعات بیشتر و تکمیلی دارد.

1- افشین ح ، می آخورلی ن ، صفار ب ، خواجعلی ف. 1399 .کلون سازی و بیان ژن بتا( 1-3 )(1-4)گلوکاناز در باکتری اشیرشیاکلی جهت تولید مکمل خوراک دام. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). جلد 33 شماره 1.
2- مرتضوی م، ،صفار ب، میر آخورلی ن ، مبینی دهکردی م. 1395 .طراحی، سنتز، همسانه سازی، ارزیابی بیان و بررسی خاصیت ضد میکروبی پروتئین دفنزین گندم (Triticum aestivum) در میزبانE.coli . مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). جلد 29 شماره 1.
 
3-Ahmad A, Javed MR, Rao AQ, Khan MA, Ahad A, Shahid AA, et al. 2015. In-silico determination of insecticidal potential of Vip3Aa-Cry1Ac fusion protein against Lepidopteran targets using molecular docking. Frontiers in plant science. 6:1081.
4-Bollag DM, Edelstein SJ, Rozycki MD. 1996. Protein methods: Wiley-Liss New York.
5-Bidkar A, Thakur N, Bolshette JD, Gogoi R. 2014. In-silico Structural and Functional analysis of Hypothetical proteins of Leptospira Interrogans. Biochem Pharmacol. 3(136):2167-88.
6-Doytchinova IA, Flower DR. 2007. Identifying candidate subunit vaccines using an alignment-independent method based on principal amino acid properties. Vaccine. 25(5):856-66.
7-Doytchinova IA, Flower DR. VaxiJen: a server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC
8-Gardner D, Jeffery L, Sansom D. 2014. Understanding the CD28/CTLA‐4 (CD152) pathway and its implications for costimulatory blockade. American Journal of Transplantation.;14(9):1985-91.
9-Hooft RW, Sander C, Vriend G. 1997. Objectively judging the quality of a protein structure from a Ramachandran plot. Bioinformatics. 13(4):425-30.
10-Jethra G, Mishra A, Pandey P, Chandrasekharan H. 2012. Structure and function prediction of unknown wheat protein using LOMETS and I-TASSER. Indian Journal of Agricultural Sciences. 82(10):867.
11-Kroll DJ, ABDEL-HAFIZ HA-M, MARCELL T, SIMPSON S, CHEN C-Y, GUTIERREZ-HARTMANN A, et al. 1993. A multifunctional prokaryotic protein expression system: overproduction, affinity purification, and selective detection. DNA and cell biology. 12(5):441-53.
12-Lee S-J, Park C-I, Park M-Y, Jung H-S, Ryu W-S, Lim S-M, et al. 2007. Production and characterization of human CTLA4Ig expressed in transgenic rice cell suspension cultures. Protein expression and purification. 51(2):293-302.
13-Larsen CP, Pearson TC, Adams AB, Tso P, Shirasugi N, StrobertM E, et al. 2005. Rational development of LEA29Y (belatacept), a high‐affinity variant of CTLA4‐Ig with potent immunosuppressive properties. American Journal of Transplantation. 5(3):443-53.
14-McFadden P. 1998. The fold test as an analytical tool. Geophysical Journal International. 135(2):329-38.
15-Nikam R, Yugandhar K, Gromiha MM, editors. 2018. Discrimination and Prediction of Protein-Protein Binding Affinity Using Deep Learning Approach. International Conference on Intelligent Computing;: Springer.
16-Partovi Nasr M, Motallebi M, Zamani MR, and Jourabchi E. 2020. In Silico Analysis and Expression of Osmotin-EAAAK-LTP Fused Protein. J Genet Resour. 6(1 ): 41 -48
17-ProtParam E. ExPASy-ProtParam tool. 2017.
18-Pierce BG, Wiehe K, Hwang H, Kim B-H, Vreven T, Weng Z. 2014. ZDOCK server: interactive docking prediction of protein–protein complexes and symmetric multimers. Bioinformatics. 30(12):1771-3.
19-Roy A, Kucukural A, Zhang Y. 2010. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. Nature protocols. 5(4):725-38.
20-Suresh V, Parthasarathy S. 2014. SVM-PB-Pred: SVM based protein block prediction method using sequence profiles and secondary structures. Protein and peptide letters. 21(8):736-42
21-Shin I-S, Choi E-W, Chung J-Y, Hwang C-Y, Lee C-W, Youn H-Y. 2007. Cloning, expression and bioassay of canine CTLA4Ig. Veterinary immunology and immunopathology. 118(1-2):12-8.
22-Sivakumar K, Balaji S. 2007. In silico characterization of antifreeze proteins using computational tools and servers. Journal of Chemical Sciences. 119(5):571-9.
23-Thapar P, editor 2018. Bioinformatics-tools and applications. the proceedings of the 12th INDIACom International Conference.
24-Vincenti F, Rostaing L, Grinyo J, Rice K, Steinberg S, Gaite L, et al. 2016. Belatacept and long-term outcomes in kidney transplantation. New England Journal of Medicine. 374(4):333-43.
25-Woo PC, Huang Y, Lau SK, Yuen K-Y. 2010. Coronavirus genomics and bioinformatics analysis. viruses. 2(8):1804-20.
26-Xu Z, Juan V, Ivanov A, Ma Z, Polakoff D, Powers DB, et al. 2012. Affinity and cross-reactivity engineering of CTLA4-Ig to modulate T cell costimulation. The Journal of Immunology.189(9):4470-7
27-Yugandhar K, Gromiha MM. 2014. Protein–protein binding affinity prediction from amino acid sequence. Bioinformatics. 30(24):3583-9.
28-Yugandhar K, Gromiha MM. 2015. Response to the comment on ‘protein‐protein binding affinity prediction from amino acid sequence’. Bioinformatics. 31(6):978-82
29-Zheng L, Liu Q. 2007. The high level expression of CTLA-4/Ig fusion protein in CHO cell. Sichuan da xue xue bao Yi xue ban= Journal of Sichuan University Medical science edition. 38(3):370-3.
30-Zemella A, Thoring L, Hoffmeister C, Kubick S. 2015. Cell-free protein synthesis: pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16(17):2420.
31-Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC bioinformatics. 2009;40(1)
32-Zuker M. 2003. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic acids research. 31(13):3406-15.
33-Zhou AQ, O'Hern CS, Regan L. 2011. Revisiting the Ramachandran plot from a new angle. Protein Science. 20(7):1166-71.
34- Zali Benekohal M, Ghadam P, Gharavi S, Abdi Ali A and Piroozmand F. 2021. Overexpression of Thermal and pH Stable Alginate Lyase of P. aeruginosa 293 and in silico Study of algL Gene.J Genet Resour. 7(1): 49-58
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 37, Issue 1
Winter 2024
Pages 60-73

  • Receive Date 19 February 2022
  • Revise Date 01 July 2022
  • Accept Date 03 October 2022