Evaluation of genetic diversity among wild isolates of Ganoderma lucidum using ISSR marker

ارزیابی تنوع ژنتیکی جدایه­های وحشی گانودرما لوسیدوم با استفاده از نشانگر ISSR

شبنم لطفی¹، مهدی بهنامیان^1*، سارا دژستان²، اصغر استاجی¹ و یونس پوربیرامی هیر¹

¹ اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، گروه علوم باغبانی

² اردبیل، دانشگاه محقق اردبیلی، گروه مهندسی تولید و ژنتیک گیاهی

تاریخ دریافت: 13/07/1400          تاریخ پذیرش: 08/03/1401

چکیده

ایران کشوری با اقلیم بسیار متنوع و غنی از گیاهان و قارچ‌های دارویی وحشی است. بنابراین، برای استفاده از این تنوع در برنامه‌های اصلاحی و همچنین حفظ این منابع طبیعی، بررسی تنوع ژنتیکی از اهمیت زیادی برخوردار است. در این مطالعه، تنوع ژنتیکی 32 سویه قارچ گانودرما لوسیدوم (Ganoderma lucidum) جمع­آوری شده از نوار شمالی کشور با استفاده از 21 نشانگر ISSR بررسی شد. با توجه به نتایج به دست آمده، میزان اطلاعات چندشکلی بین نشانگرها از 294/0 تا 469/0 با میانگین 407/0 متغیر بود. همچنین تنوع ژنتیکی نی، شاخص شانون و متوسط فاصله ژنتیکی نیز به ترتیب 214/0، 317/0 و 278/0 بود. براساس تجزیه به مولفه­های اصلی، سه مولفه اول 63% از تنوع کل را به خود اختصاص داد. براساس تجزیه خوشه­ای، سویه­های مورد مطالعه در هشت گروه اصلی قرار گرفتند. آنالیز Sturcture نیز حضور 9 گروه مجزای ژنتیکی را نشان داد. در مجموع، نتایج نشان داد تنوع ژنتیکی مطلوبی بین سویه‌های مورد مطالعه قارچ گانودرما مورد مطالعه وجود داشت که می­تواند در برنامه­های اصلاحی مورد توجه قرار گیرد.

واژه های کلیدی: گانودرما، تجزیه کلاستر، چند شکلی، تجزیه ساختار ژنتیکی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09144145072 ، پست الکترونیکی: mbehnamian@gmail.com

مقدمه

قارچ گانودرما لوسیدوم (Ganoderma lucidum) قارچی یک ساله متعلق به شاخه Basidiomaycota، راسته Aphyllopholales، تیره Ganodermatacea و جنسGanoderma  می‌باشد (2) و با  نام‌های عمومی Lingzhi، Mannetake، Sachitaker، Reishi، Yangzhi شناخته می­شود (23). این قارچ جزو قارچ‌های تجزیه کننده چوب بوده و از گذشته­های بسیار دور برای اهداف دارویی به ویژه در کشورهای چین، ژاپن و کره به صورت تجاری کشت می­شده است (25). گانودرما حاوی ترکیباتی است که دارای خواص ضد آلرژی و ضدتوموری بوده، باعث افزایش سطح سیستم ایمنی بدن شده، در درمان بیماری‌های قلبی و عروقی، دیابت، بیماری‌های مرتبط با کبد و برونشیت و همچنین در کاهش فشار خون و کلسترول نقش داشته و از تجمع پلاکت‌ها جلوگیری می­کند (4). در گذشته طبقه‌بندی گانودرما براساس مشخصات ریخت­شناسی انجام می­گرفت ولی امروزه با استفاده از روش انگشت‌نگاریDNA ، شناسایی ارقام و گونه‌های گانودرما به راحتی امکان پذیر بوده و به عنوان ابزاری مفید برای حفظ مالکیت ارقام اصلاح شده جدید مورد استفاده قرار می­گیرد (27). تنوع ژنتیکی برای توصیف تنوع ماده وراثتی در موجودات بیولوژیکی استفاده می­شود و در سطح فرد، جمعیت و گونه قابل اندازه‌گیری است (14). بدون تنوع ژنتیکی یک جمعیت قادر به تکامل و سازگاری با تغییرات محیطی نبوده و حفظ تنوع ژنتیکی به اولویت اصلی بسیاری از برنامه‌های حفاظتی تبدیل شده است (27). تنوع ژنتیکی پایه و اساس گزینش فنوتیپی، ژنوتیپی و اصلاح کمَی و کیفی گونه‌های مختلف بوده و کسب اطلاع از فاصله ژنتیکی میان افراد جمعیت و آگاهی از روابط خویشاوندی گونه­ها در برنامه اصلاحی امکان سازماندهی ژرم­پلاسم و نمونه­‌گیری مؤثر از ژنوتیپ‌ها را فراهم می‌سازد. امروزه انواع مختلفی از روش‌های آزمایشگاهی برای مطالعه تنوع ژنتیکی در گانودرما مانند آنالیز ایزوآنزیم‌ها، RAPD (Random amplified polymorphic DNA) ،AFLP (Amplified fragment length polymorphism)، ITS  (Internal Transcribed Spacer) و RFLP (Restriction fragment length polymorphism) و ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) به طور گسترده استفاده می­شود (1، 25 .(در بین نشانگرهای مختلف، نشانگر بین ریز ماهواره ای یا همان ISSR روشی است که به دانش اولیه در مورد ژنوم، کلون سازی و یا طراحی پرایمر اختصاصی نیاز ندارد چرا که قطعات بین توالی های تکراری تکثیر می شوند (26، 28). نشانگر ISSR به دلیل ویژگی‌های مطلوبی مانند تکرارپذیری، آنالیز همزمان، تعداد زیاد جایگاه ژنی، دقت بالا، تنوع بسیار بالا، هزینه پایین و سرعت و سهولت اجرا به طور گسترده و موفقیت­آمیز برای بررسی تنوع ژنتیکی در سطوح بین گونه‌ای و درون گونه‌ای طیف وسیعی از قارچ­های مختلف به کار رفته است (8، 15). برای نمونه، در مطالعه­ای تنوع ژنتیکی 10 سویه گانودرما با استفاده از آغازگرهای RAPD و ISSR، مورد ارزیابی قرار گرفت که در مجموع 220 و 214 باند چندشکل به ترتیب به وسیله 24 آغازگر RAPD و 17 آغازگر ISSR به دست آمد (11). همچنین سو و همکاران (2008) بیان کردند که نشانگر ISSR به خوبی می­تواند برای شناسایی سویه­های گانودرما مورد استفاده قرار گیرد(24). رولیم و همکاران (2011) نیز چندشکلی بین 22 تا 80 درصد و ضریب تشابه بین 52/0 تا 72/0 را بین سویه­های G. lucidum جمع­آوری شده از مناطق مختلف چین و برزیل گزارش کردند (21). در پژوهشی دیگر، تنوع ژنتیکی 9 جمعیت گانودرما با استفاده از 20 آغازگر ISSR مورد برسی قرار گرفت که 242 (25/99%) باند چندشکل تولید و فاصله ژنتیکی قابل توجهی بین سویه‌های مختلف گانودرما با ضریب تشابه 52/0 تا 74/0 مشاهده شد (11). با توجه به پراکنش قارچ گانودرما در نوار شمالی کشور و اهمیت بررسی تنوع ژنتیکی موجود، در این مطالعه تنوع ژنتیکی 36 سویه گاندورما لوسیدوم جمع­آوری شده با 21 نشانگر ISSR مورد بررسی قرار گرفت.  

مواد و روشها

نمونه­برداری و خالص­سازی: در پژوهش حاضر، 36 سویه وحشی گانودرما لوسیدوم از جنگل‌های مازندران، گرگان و گیلان جمع‌آوری (جدول 1، شکل 1) و از طریق کشت تکه­ای از کلاهک در محیط کشت مالت اکسترکت آگار خالص­سازی شدند. پس از خالص­سازی، تمام سویه‌ها به مدت 3 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی 85 درصد نگهداری شدند.

شکل1- موقعیت جغرافیایی نمونه‌های جمع‌آوری شده گانودرما لوسیدوم

استخراج DNA: بمنظور استخراج DNA ژنومی، میسلیوم هر سویه در محیط کشت مایع حاوی 20 گرم دکستروز، دو گرم پپتون، دو گرم عصاره مخمر، 5/0 گرم K2HPO4 و 5/0 گرم MgSO4.7H2O مایه­زنی شده و در شیکر انکوباتور با سرعت 110 دور در دقیقه و دمای 30 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. بعد از گذشت 10 تا 14 روز از زمان مایه‌زنی، توده میسلیومی از محیط مایع جداسازی شد. سپس 5/0 گرم از میسلیوم قارچ در نیتروژن مایع ساییده شده و به آن 1000 میکرولیتر بافر استخراج (Tris-HCl 1 مولار، NaCl 5 مولار، EDTA 5 مولار) با 8 pH و 5/2 میکرولیتر پروتئیناز K اضافه گردید و میکروتیوب‌ها در حمام آب گرم با دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه نگهداری شدند به طوری که هر دو دقیقه، عمل اینورت کردن میکروتیوب‌ها انجام گرفت. پس از آن، میکروتیوب‌ها به مدت 15 تا 20 دقیقه روی یخ نگهداری شده و سپس به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. بعد از برداشتن یک میلی­لیتر از فاز رویی و انتقال به میکروتیوب 5/1 میلی لیتری، ایزوپروپانول سرد به میزان 6/0 حجم فاز رویی به میکروتیوب‌های فوق افزوده شد و به مدت یک ساعت در فریزر 20- درجه سانتیگراد نگهداری شدند. سپس عمل سانتریفیوژ با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه انجام گرفت و فاز رویی حذف شد. رسوب حاصل در زیر هود لامینار خشک شد و در نهایت، 70 میکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر به میکروتیوب‌ها اضافه گردید و در یخچال در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. تعیین کیفیت DNA به وسیله ژل آگارز 8/0 درصد انجام گرفت.

جدول 1- مشخصات موقعیت جغرافیایی نمونه‌های جمع‌آوری شده قارچ گانودرما

واکنش زنجیره­ای پلیمراز: بررسی تنوع ژنتیکی سویه‌های گانودرما لوسیدوم با استفاده از 21 نشانگر ISSR انجام شد (جدول 2). مخلوط واکنش PCR در حجم 10 میکرولیتر (1/1 میکرولیتر DNA، 7/2 میکرولیتر آب مقطر استریل، 2/1 میکرولیتر آغازگر، 5 میکرولیتر Master mix) تهیه شد و در دستگاه PCR با برنامه واسرشته­سازی اولیه به مدت دو دقیقه در دمای 94 درجه سانتیگراد، واسرشت­سازی به مدت 45 ثانیه در دمای 94 درجه سانتیگراد، اتصال به صورت تاچ داون (به ازای هر چرخه، 3/0 درجه کاهش از دو درجه بالاتر از دمای ذوب آغازگر) و توسعه به مدت 90 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد با 10 چرخه قرار گرفت. مرحله دوم شامل واسرشت­سازی به مدت 45 ثانیه در دمای 94 درجه سانتیگراد، اتصال به مدت 60 ثانیه در دمای آغازگر مربوطه، توسعه به مدت 90 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد با 35 چرخه بود و در نهایت، توسعه نهایی به مدت 5 دقیقه با دمای 72 درجه سانتیگراد انجام گرفت. پس از انجام واکنش PCR، محصول نهایی واکنش در چاهک‌های ژل آگارز 2/1 درصد در بافر TBE بارگذاری و با ولتاژ 75 ولت به مدت 70 دقیقه الکتروفورز شد. سپس عکس‌برداری با کمک دستگاه ژل داک صورت گرفت (شکل 2).

جدول 2- توالی آغازگرهای ISSR مورد استفاده

B= not A, D= not C, H= not G, V= not T, Y= C or T

آنالیز داده­های مولکولی: بمنظور تعیین تشابه سویه‌های گانودرما لوسیدوم ابتدا باندهای واضح در ژل مشخص شدند. سپس باندهای حاصل از هر آغازگر بر روی ژل براساس همردیفی باندها به صورت حضور (1) یا عدم حضور باند (0) وارد نرم افزار Excel شدند. در نهایت، پارامترهای مولکولی با نرم افزارهای POPGENE،GenAlex ، NTYSYS و STRUCTURE 284 آنالیز شدند.

شکل 2- محصول PCR بر روی ژل آگاروز 2/1 درصد برای نشانگر ISSR17، لدرkb 100 (L)

نتایج و بحث

میزان اطلاعات چند شکلی (PIC= Polymorphism information content): در پژوهش حاضر، میزان PIC برای نشانگرهای ISSR مورد استفاده بین 294/0 برای نشانگر ISSR16 تا 469/0 برای نشانگر ISSR22 متغیر بود (جدول 3). متوسط PIC برای تمامی نشانگرها 407/0 بود. هو و همکاران (2019) در مطالعه‌ای روی نه سویه از Ganoderma spp. با استفاده از 20 نشانگر ISSR میزان PIC را 85/0 بیان کردند. همچنین حیاتی و همکاران (2020) در بررسی روی 49 سویه از Ganoderma boninense  میانگین PIC را 44 /0 به دست آوردند. میزان اطلاعات چندشکلی یکی از معیارهای قدرت تمایزدهندگی نشانگر مولکولی بوده و هرچه مقدار عددی آن بزرگ­تر باشد، نشان­دهنده وجود چندشکلی بالا می‌باشد (16).

جدول 3 - میزان اطلاعات چند شکلی آغازگرهای ISSR مورد استفاده

در مطالعه حاضر، PIC بالا می‌تواند ناشی از وجود تنوع زیاد بین سویه‌های مورد مطالعه، چندشکلی بالا و وجود آلل‌های نادر در یک مکان ژنی باشد که در تمایز افراد نقش مهمی دارند و  نشانگرهایی با PIC بالا برای تمایز افراد با خویشاوندی نزدیک مفیدتر هستند.

میزان هتروزیگوتی مورد انتظار، آلل‌های مؤثر و شاخص اطلاعات شانون: در این پژوهش، میانگین هتروزیگوتی مورد انتظار برابر با 214/0 بود. این شاخص در محدوده 192/0 در جمعیت سه و 358/0 در جمعیت یک متغیر بود. بالا بودن میزان تنوع ژنی بیانگر قدرت قابل توجه نشانگر ISSR در تشخیص تنوع موجود بین جمعیت‌ها و تفکیک دقیق آنهاست. در مقایسه‌ای که روی دو پارامتر PIC و تنوع ژنی انجام گرفت، مشاهده شد که نشانگرهای دارای PIC بالا، دارای تنوع ژنی بالاتری نیز هستند. میانگین تعداد آلل‌های مؤثر برای سه جمعیت مورد مطالعه، 492/1 بود که بیشترین مقدار آن برای جمعیت یک برابر با 62/1 و کمترین آن مربوط به جمعیت سه با مقدار 33/1 برآورد شد (جدول 4). پوربا و همکاران (2020) در پژوهشی روی سویه­های قارچ Ganoderma boninese  با استفاده از 6 نشانگر SSR میانگین تعداد آلل‌های مؤثر، شاخص اطلاعات شانون و هتروزیگوتی مورد انتظار را به ترتیب 64/6، 45/1 و 6/0 به دست آوردند. میانگین شاخص اطلاعات شانون در مطالعه حاضر 317/0 بود که بیشترین مقدار این شاخص در جمعیت یک (5321/0) و کمترین مقدار آن در جمعیت سه (285/0) مشاهده شد.

تنوع ژنتیکی نی بر اساس ماتریس فاصله و شباهت: متوسط فاصله ژنتیکی بین سه گروه گانودرما لوسیدوم براساس ماتریس ژنتیکی نی (17) برابر با 179/0 و میانگین ماتریس شباهت 628/0 برآورد شد. در این مطالعه بیشترین فاصله ژنتیکی بین جمعیت‌های یک و سه با مقدار 247/0 و کمترین فاصله ژنتیکی بین جمعیت‌های یک و دو با مقدار 087/0 مشاهده شد. به عبارت دیگر، جمعیت­های یک و دو گانودرما لوسیدوم با مقدار 917/0 بیشترین تشابه ژنتیکی و جمعیت‌های یک و سه با مقدار 781/0 کمترین تشابه ژنتیکی را بین سه جمعیت مورد مطالعه نشان دادند (جدول 5) که می‌توان علت تشابه ژنتیکی بالای جمعیت‌های یک و دو را به نزدیکی زیستگاه‌های این دو جمعیت با هم و انتقال اسپورهای آن‌ها توسط عواملی چون باد، پرندگان، انسان‌ها و تشابه شرایط اکولوژی حاکم بر آن‌ها و همچنین جریان ژنی بین دو جمعیت ارتباط داد (12). در پژوهشی روی 10 نمونه Ganoderma spp. میزان فاصله ژنتیکی از 48/0 تا 85/0 متغیر بود (15). در مطالعه حاضر، تنوع ژنی یا هتروزیگوتی کل (Ht) و تنوع ژنی درون جمعیتی (Hs) برای نشانگرهای ISSR به ترتیب حدود 3629/0 و 2137/0 بود. مقادیر تمایز ژنتیکی (Gst) نیز با 411/0 سطح پایینی از تمایز جمعیت‌ها را نشان داد. در مکان‌های ژنی تحت بررسی در این پژوهش بیشترین جریان ژنی مربوط به جایگاه‌های 93 و 125 با مقدار 5453/10 و کمترین میزان جریان ژنی مربوط به جایگاه‌های 129 و 133 با مقدار 0895/0 بود. متوسط جریان ژنی و تمایز ژنی به ترتیب 7164/0 و 411/0 بود. دیودی و همکاران (2018) در بررسی روی چهار سویه گانودرما لوسیدوم با استفاده از 7 آغازگر RAPD، میزان هتروزیگوتی کل و تنوع ژنی درون جمعیتی را به ترتیب 186/0 و 056/0 گزارش کردند. مقادیر پایین Gst در پژوهش حاضر، تمایز واضحی را بین جمعیت­ها نشان نداد که علت این امر را می­توان کم بودن فاصله جغرافیایی بین جمعیت‌ها و انتقال بالای اسپورهای این قارچ به وسیله باد نسبت داد. همچنین گانودرما لوسیدوم یک قارچ هتروتالیک و دارای تیپ آمیزشی چهار قطبی (تتراپولار) است (5) که این امر می‌تواند بالا بودن میزان تنوع ژنتیکی درون جمعیت‌ها را نیز اثبات کند. بالا بودن میزان Nm نسبت به Gst نیز می‌تواند هتروتالیک بودن این قارچ را توجیه کند.

جدول 4- داده‌های به دست آمده از آغازگرهای ISSR در سه جمعیت مورد مطالعه

جدول 5 - مقادیر فاصله ژنتیکی درون جمعیت‌ها، فاصله ژنتیکی (پایین قطر) و تشابه ژنتیکی (بالای قطر) بین جمعیت‌ها

تجزیه به مؤلفه­های هماهنگ اصلی: تجزیه به مؤلفه‌های هماهنگ اصلی یک روش مقیاس گذاری یا مختصات‌یابی است که با ماتریس شباهت یا تفاوت‌هایی بین مجموعه‌ای از افراد شروع می‌شود و هدف از آن به وجود آوردن یک نمودار گرافیکی از داده‌ها با ابعاد کمتر است. بدین منظور برای بررسی سویه‌های تحت مطالعه از تجزیه به مؤلفه‌های هماهنگ اصلی برای تکمیل تجزیه خوشه‌ای استفاده شد. نتایج تجزیه به مؤلفه‌های هماهنگ اصلی نشان داد که سه مؤلفه هماهنگ اول حدود 02/63 درصد تغییرات مولکولی بین جمعیت‌ها را تبیین کردند (مؤلفه اول 75/28 درصد، مؤلفه دوم 94/17 درصد و مؤلفه سوم 32/16 درصد). این نتایج نشان داد که این نشانگر حاوی اطلاعات مفید برای گروه‌بندی سویه‌ها بود، هرچند استفاده از تعداد بیشتری از آغازگرها نیز توصیه می‌شود. در این پژوهش، تجزیه اطلاعات مولکولی به دست آمده از نشانگر ISSR، 32 سویه مورد بررسی را براساس محل جمع­آوری آن‌ها به سه گروه اصلی نور، گلستان و گیلان تقسیم کرد (شکل 3).

شکل3 - گروه‌بندی سه جمعیت مورد مطالعه گانودرما لوسیدوم با استفاده از سه مؤلفه هماهنگ اول حاصل از تجزیه به مؤلفه‌های هماهنگ اصلی

تجزیه خوشه‌‌ای: در پژوهش حاضر، گروه‌بندی سویه‌ها بر اساس ضریب دایس و روش UPGMA، با نرم‌افزار NTSYS انجام شد. دندروگرام به دست آمده، سویه‌ها را در هشت گروه اصلی طبقه‌بندی کرد (شکل 4). گروه اول، دوم، سوم و چهارم تک عضو بودند که در مجموع 5/13 درصد سویه‌ها را در بر گرفتند و به ترتیب شامل سویه‌های G20، G36، G35 و G11 بودند. گروه پنجم با هفت عضو 91/18 درصد سویه‌ها را در برگرفت که شامل سویه‌های G29، G34، G33، G37، G30، G31 و G32 بود. سویه­های G26، G27، G18، G13، G6 و G5 نیز در گروه ششم قرار گرفتند که 21/16 درصد از سویه‌ها را شامل می‌شد. گروه هفتم با دو عضو 4/5 درصد سویه­ها را به خود اختصاص داد که شامل سویه‌های G7 و G2 بود و در نهایت، گروه هشتم با 17 عضو 9/45 درصد جمعیت سویه‌ها شامل G3، G25، G24، G22، G21، G19، G17، G10، G9، G8 ، G16، G15، G14، G4،  G28و G1 را در خود جای داد. نتایج حاصل از این دندروگرام، تنوع مولکولی بالا را بین سویه­های مختلف گانودرما نشان داد به طوری که حتی سویه‌های جمع‌آوری شده از یک شهر مانند نور در سه گروه هشتم، هفتم و اول قرار گرفتند که نشان­دهنده وجود تنوع ژنتیکی بالا در نمونه­های جمع­آوری شده از آن منطقه بود. بالا بودن میزان شاخص‌های He، Ne و I  برای این جمعیت، این موضوع را تصدیق می‌کند. از طرف دیگر، در گروه پنجم سویه‌هایی از شهرهای استان‌های گلستان و گیلان قرار گرفتند، که این مورد به دلیل تشابه ژنتیکی بالا بین سویه‌ها بود. سویه‌های G20، G36، G35 و G11 هر کدام به تنهایی در یک گروه اصلی قرار گرفتند که نشان­دهنده وجود تنوع ژنتیکی بالا در این سویه‌ها بود. قرار گرفتن گروه‌های اول، دوم، سوم و چهارم با فاصله کم در مجاورت یکدیگر قابل انتظار است و تشابه ژنتیکی بالا نی بین جمعیت‌های 1 و 2 که به ترتیب شامل سویه‌های نور و گلستان می­شوند با آن‌ها مطابقت دارد. سون و همکاران (2006) در پژوهشی روی جمعیت گانودرما به کمک نشانگرهای مولکولی SRAP، سویه‌ها را به وسیله روش UPGMA (Unweighted pair group method with arithmetic mean) در 5 گروه اصلی قرار دادند. می و همکاران (2014) بیان کردند که فاصله ژنتیکی بین گونه­های مختلف گانودرما و حتی سویه­های مختلف گونه G. lucidum قابل توجه هست و تفاوت­های جغرافیایی و ماهیت میزبان قارچ می­تواند در این مورد تاثیرگذار باشد. اسپورها می­تواند در اتمسفر با توجه به الگوی باد پراکنده شوند. جابجایی اسپور قارچ­­های اکتومایکوریزا تا 10 کیلومتر صورت می­گیرد (19). این موارد می­تواند سبب تنوع ژنتیکی بالا بین قارچ­هایی مانند قارچ­های گونه گانودرما شود که از طریق اسپور و به وسیله باد پراکنده می­شود.

تجزیه ساختار ژنتیکی: در این پژوهش، برای ارزیابی ساختار ژنتیکی جمعیت مورد مطالعه از 73 جایگاه ژنومی تکثیر شده توسط آغازگرهای ISSR استفاده شد. شکل 5، نمودار دو طرفه تعیین بهینه K را نشان می‌دهد. با توجه به این نمودار، بهترین K در جمعیت مورد مطالعه اوج منحنی است (9=K) که به عنوان K بهینه در تخمین ساختار جمعیت و محاسبه ماتریس عضویت افراد در هر کلاستر (ماتریس Q) در نظر گرفته شد. براساس نتایج ارائه شده در بارپلات (شکل 6)، از کل ژنوتیپ‌های مورد مطالعه با احتمال بیشتر از 60% عضویت سویه‌ها، ساختار اول (قرمز) شامل 8 عضو (G5، G18، G26، G27،G13 ، G3، G1)، ساختار دوم (سبز) شامل یک عضو (G23)، ساختار سوم (آبی) شامل 13 عضو (G4، G8، G9، G10،G14 ،G15 ، G16،G17 ،G19 ، G21، G22، G24، G25) و ساختار چهارم شامل 10 عضو (G28، G29، G30، G31، G33، G34، G35، G37،G36 ،G32) بود.

شکل 4- نمودار درختی سویه‌های گانودرما لوسیدوم (Ganoerma lucidum) بر اساس ضریب تشابه دایس حاصل از داده‌های نشانگر ISSR با استفاده از روش گروه‌بندی UPGMA

در بررسی‌های انجام شده، سویه‌های گانودرما لوسیدوم در روش تجزیه ‌خوشه‌ای در هشت و در تجزیه ساختار ژنتیکی در 9 گروه اصلی طبقه­بندی شدند که قرارگیری سویه‌ها در هر دو روش به جز مواردی محدود با هم مطابقت داشت. برای مثال، سویه‌های G20 و G11 که در روش تجزیه خوشه­ای در گروه­های تک عضوی قرار گرفتند در تجزیه ساختار ژنتیکی نیز رنگ­بندی مجزایی داشتند. همچنین، سویه‌های G18، G13، G5، G26 وG27  در گروه شش تجزیه خوشه‌ای با گروه یک تجزیه ساختار ژنتیکی و سویه‌های G4، G8، G9، G10،G14 ،G15 ، G16،G17 ،G19 ، G21، G22، G24 و G25 در گروه 9 تجزیه خوشه‌ای با گروه سه تجزیه ساختار ژنتیکی و به همین ترتیب گروه پنج و شش این دو روش به جز مواردی مشابه هم بودند.

شکل 5- تعیین زیر گروه‌ها با استفاده از Suracture harvester و روش Evanno  (Evanno et al., 2005). محور عمودی مقدار آماره ΔK و محور افقی تعداد زیر جمعیت‌ها را نشان می‌دهد.

شکل 6- نمودار تجزیه ساختار حاصل از نرم‌افزار   Structureبر اساس 9= k (تکرار) در سویه‌های گانودرما لوسیدم بر اساس داده­های نشانگری ISSR. اعداد روی محور افقی ضریب عضویت Q هر سویه را به گروه مربوطه نشان می‌دهد. سویه‌هایی با رنگ مشترک مربوط به یک گروه هستند

این مطالعه نشان داد که نشانگر ISSR به خوبی توانست تنوع ژنتیکی بین سویه­های گانودرما لوسیدم را آشکار سازد. در بررسی فاصله ژنتیکی بین جمعیت ها مشخص شد که فاصله جغرافیایی و پراکنش اسپورها بر فاصله ژنتیکی سویه ها از همدیگر موثر بوده و بیشترین فاصله ژنتیکی در سویه هایی که دورتر از همدیگر بوده اند وجود داشته است، با این وجود در کل، سویه های مورد بررسی نیز تنوع ژنتیکی مناسبی داشتند که این تنوع ژنتیکی بالا زمینه را برای انتخاب سویه های مناسب فراهم می کند، این اولین گزارش در مورد بررسی تنوع ژنتیکی این قارچ در ایران می­باشد و نتایج به دست آمده نشان­دهنده وجود تفاوت­های ژنتیکی بالا بین سویه­های مختلف این قارچ بود. این تنوع می­تواند به تفاوت­های جغرافیایی و ژنتیکی و نحوه پراکنش اسپورهای قارچ نسبت داده شود.

تقدیر و تشکر

برخود لازم می­دانم از زحمات سایر اعضای گروه علوم باغبانی دانشگاه محقق اردبیلی که ما را در انجام این پایان نامه کمک نمودند کمال تشکر را داشته باشم.