Investigating the ddifferent amounts of urea and calcium on the formation of different forms of calcium carbonate in precipitation medium using Sporosarcina pasteurii

Document Type : Research Paper

Authors
Narjes Gandali Mostafa
Gholamreza Ghezelbash
Mohammad Shafiei
Department of Biology, Faculty of Science, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, I.R. of Iran
10.22034/cmr.2022.2180
Abstract
Bio-cementation is a new process in which urea hydrolyzing bacteria decompose urea into ammonia and produce calcium carbonate crystals in higher pH due to the production of an alkaline environment. The aim of this study was to investigate the production of calcite using S. pasteurii in precipitation medium and optimization the factors affecting on this reaction. In addition, in this study, the effect of carbon sources in precipitation medium was studied. In this study, according to the results of quantitative XRD analysis, it was found that 1% urea with 94% calcite, 2.4% vaterite and 2% calcium with 92.3% calcite, 4.9% vaterite productivity, respectively, were the best condition for the highest calcite productivity in precipitation medium. Particle size analysis using FESEM revealed that particles produced in 1% urea were often in the range below 100 nm. With increasing urea concentration, the frequency of particles below 100nm in size decreased. The particle size distribution showed that the particles of less than 100nm were lower in 2% urea compared to 1%.FESEM analysis showed that with increasing calcium chloride particles of less than 50nm decreases significantly. The same was true of urea, and it was found that the particle size of the crystals increased at high concentrations of the reactants. In addition, the effect of the presence of carbon sources in the precipitation medium on the production of calcium carbonate crystals was also investigated, which was not significantly different from their absence ( glucose and sucrose). Maltose sugar decreases calcite and increases other crystals.

Keywords

Subjects

بررسی اثر مقادیر مختلف اوره و کلسیم در تشکیل فرمهای مختلف کربنات کلسیم با استفاده از اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی

نرجس گندلی مصطفی، غلامرضا قزلباش* و محمد شفیعی

ایران، اهواز، دانشگاه شهیدچمران اهواز، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 29/11/1400          تاریخ پذیرش: 11/03/1401

چکیده

سیمان سازی زیستی، فرآیند جدیدی است که در آن باکتری های هیدرولیزکننده­ی اوره با تجزیه­ی اوره و افزایش pH محیط و در حضور یون کلسیم امکان تشکیل کربنات کلسیم جامد را فراهم می­کنند. هدف از این بررسی تولید کلسیت توسط باکتری اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی و بهینه سازی فاکتورهای موثر در تولید آن است . بعلاوه اثر منابع کربنی در محیطهای رسوبی مورد مطالعه قرار گرفت. طبق نتایج آنالیز XRD نیمه کمی مشخص شد که در محیط رسوبی، نمونه­ی حاوی 1 درصد اوره با 94 درصد کلسیت و 4/2 درصد واتریت بهترین نمونه از نظر داشتن خلوص کلسیت بود. نمونه­ی حاوی 2 درصد کلسیم کلرید نیز با داشتن 3/92 درصد کلسیت، 8/2 واتریت و 9/4 درصد واتریت بیشترین میزان خلوص کلسیت و کمترین میزان محصولات جانبی را داشته است. طبق آنالیز ذرات توسط FESEM مشخص شد که ذرات تولید شده در محیط اوره 1 درصد غالبا بین محدوده زیر 100 نانومتر هستند. با افزایش اوره این محدوده بیشتر شد بطوریکه در اوره 2 درصد فراوانی ذرات زیر 100 نانومتر کمتر گردید. آنالیزهای FESEM نشان داد که افزایش کلرید کلسیم موجب کاهش قابل ملاحظه­ایی در درصد ذرات با اندازه 0 تا 50 نانومتر می­شود. این مطلب در مورد اوره نیز صادق بود و مشخص شد اندازه ذرات کریستال­ها در غلطت­های بالای واکنش­گرها افزایش می­یابد. بعلاوه، اثر حضور منابع کربنی در محیط رسوبی در تولید نوع کریستال­های کربنات کلسیم نیز بررسی شد که در مقایسه با عدم حضور آنها در مورد گلوکز و سوکروز تفاوت معنی داری دیده نشد. حضور مالتوز موجب کاهش کلسیت و افزایش دیگر کریستالها­ می­شود.

واژه های کلیدی: محیط رسوبی، کلسیت، اسپوروسارسینا پاستوری، FESEM، XRD، نیمه کمی

* نویسنده مسئول، تلفن: 09122644815، پست الکترونیکی: rghezelbash@scu.ac.ir

مقدمه

 

کربنات کلسیم ماده معدنی فراوانی است که 4% پوسته­ی زمین را تشکیل داده و بواسطه­ی کانی­سازی زیستی (Biomineralization) یون­های کلسیم، توسط میکروارگانیسم­ها تولید می­شود که از اهمیت ویژه ای برخوردار است (5 و 7). کربنات کلسیم سه فرم کریستالی بدون آب به نام­های کلسیت، آراگونیت و واتریت دارد. فرم­های آبدار شامل فرم­های کریستالی مونوهیدروکلسیت و ایکائیت (Ikaite) (کربنات کلسیم شش آبه) و کربنات کلسیم بی­شکل (Amorphous calcium carbonate) (ACC) می­باشد. کلسیت پایدارترین و واتریت ناپایدارترین فرم کریستالی کربنات کلسیم است. کاربرد کربنات کلسیم بستگی به مورفولوژی، اندازه، ساختمان، مساحت سطوح و خلوص که همگی به روش­های آماده­سازی و فرایند تولید بستگی دارد. فرم­های آمورف یا بی­شکل ناپایدارند و تمایل دارند به فرمهای کریستالی تبدیل شوند (7).

سیمان سازی زیستی (Biocementation) فرآیند جدیدی در مهندسی ژئوتکنیک (Geotechnical engineering) است که در آن باکتری­های مولد اوره­آز، اوره را هیدرولیز کرده و در حضور یون­های کلسیم امکان تشکیل کربنات کلسیم کریستالی را فراهم می­سازند. فراوانی و اهمیت میکروارگانیسم­ها در ایجاد رسوب کلسیت باعث شده که این فرایند به مهم­ترین محصول متابولیکی کانی­سازی زیستی تبدیل شود. فرایند تولید میکروبی کلسیت (Microbial induced calcite precipitation (MICP)) یک فناوری موثر و سازگار با محیط زیست است که می تواند برای حل مشکلات مختلف محیطی از جمله اصلاح خاک کاربرد داشته باشند. حضور کلسیت بین ذرات ماسه موجب اتصال آنها با یکدیگر و افزایش مقاومت خاک­های ماسه­ایی می­شود (9 و 16).

ابتدا آنزیم اوره­آز هیدرولیز اوره را به آمونیوم و کربنات کاتالیز می­کند. در این واکنش، ابتدا یک مول اوره به یک مول آمونیاک و یک مول اسیدکربامیک هیدرولیز می­شود (واکنش 1) که اسیدکربامیک فوق سپس بطور خودبخودی به یک مول آمونیاک و اسید کربنیک تجزیه می­شود (واکنش 2). محصولات فوق (H2CO3, NH3) در آب موجب تشکیل بی­کربنات، دو مول آمونیوم و دو مول یون­های هیدروکسید می­شوند (واکنش 3 و 4). یون­های هیدروکسید منجر به افزایشpH  شده و موجب تشکیل یون های کربنات می­شود (واکنش 5) که در صورت حضور کلسیم با کلسیم رسوب کربنات کلسیم ایجاد می­گردد (واکنش 6). (5).

CO(NH2)2+H2O→NH2COOH+ NH3 (1)

NH2COOH +H2O→ H2CO3+ NH3 (2)

H2CO3→HCO3-+H+ (3)

2NH3 +2H2O→2NH4++2OH- (4)

HCO3-+H++2OH-→CO32-+2H2O (5)

Ca2+ +CO32-→CaCO3 (6)

 اشکال مختلف کربنات کلسیم، به ترکیبات موجود در محیط کشت  و شرایط تولید بستگی دارد. کلسیم کلرید و کلسیم استات به عنوان منابع کلسیم در محیط کشت می­باشند و برخی از باکتری­های شناخته شده مثل باسیلوس (Bacillus) و سودوموناس (Pseudomonas) به عنوان تولید کننده­ی کربنات کلسیم در هر دو شرایط محیط طبیعی و آزمایشگاهی گزارش شدند (19). مقادیر مختلف غلظت­های اوره، مقادیر مختلف کلسیم کلراید و دیگر مواد غذایی بر روی تولید مقادیر مختلف کریستال­های کربنات کلسیم و همین­طور اندازه آنها موثر است. در مطالعه حاضر نیز اثر عوامل مختلفی مانند غلظتهای مختلف اوره، کلسیم کلراید و منابع کربنی در محیط رسوبی به طور کامل طی آنالیزهای XRD نیمه کمی و FESEM مطالعه شدند و اثر واکنش­گرها و حضور دیگر مواد غذایی مانند کربن­ها بر نوع کریستال کربنات کلسیم تولید شده و همین­طور طیف ذرات تولید شده مورد بررسی قرار گرفتند.

مواد و روشها

میکروارگانیسم و مواد شیمیایی: تمام مواد شیمیایی در این مطالعه از شرکت مرک و سامچوئن کره تهیه شد. باکتری مولد کلسیت باکتری اسپوروسارسینا پاستوری (Sporosarcina pasteurii) محموعه کلکسیون­های میکروبی ایران با کد PTCC1645 بود که طبق کاتالوگ در محیط نوترینت آگار حاوی 2 درصد اوره فعال و نگهداری شد.

تولید کلسیت در محیط رسوبی: مواد سازنده محیط رسوبی که برای تولید و رسوب نانوکریستال­های کلسیت استفاده شد شامل (گرم بر لیتر) نورینت براث 3، کلرید کلسیم بی آب 20، اوره 20، بی­کربنات سدیم 12/2، کلرید آمونیوم 10 و آگار-آگار 15 (8 pH=) بود (6). محیط رسوبی فوق بعد از تهیه در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه اتوکلاو شد و اوره توسط فیلتر 45/0 سرسرنگی و کلسیم کلراید توسط اتوکلاو به طور جداگانه استریل و به محیط رسوبی اضافه شد. بمنظور کشت باکتری و تولید کلسیت بر روی این محیط ابتدا باکتری به مدت 24 ساعت بر روی محیط نوترینت آگار حاوی 2 درصد اوره کشت داده شد و سپس در محلول سرم فیزیولوژی استریل غلظت OD600=1 تهیه و 100 مایکرولیتر از محلول فوق در محیط رسوبی کشت چمنی داده شد و به مدت 7 تا 10 روز در دمای 30 درجه گرماگذاری شدند. کلنی­های حاوی رسوبات کریستالی تولید شده بعد از مطالعه توسط میکروسکوپ نوری لنز x10 و اطمینان از تولید کریستال­ها، جمع آوری و سپس شستشو و در دمای اتاق خشک شدند. سپس رسوبات خشک شده طی آنالیزهای مختلف مورد بررسی واقع شد (8 و 9).

بهینه سازی محیط رسوبی: در این مطالعه اوره در سطوح 1 تا 4 وزنی حجمی (1، 2، 3 و 4) درصد به صورت یک فاکتور در یک زمان ابتدا بهینه شد. سپس بعد از انتخاب بهترین غلظت اوره مقادیر کلسیم کلراید در غلظتهای 5/1 تا 3 (5/1، 2، 5/2 و 3) درصد بهینه شد. pH تمام محیطهای فوق قبل از اتوکلاو بر روی 8 تنظیم شد.

اثر منابع کربنی مختلف بر روی تولید کلسیت: محیط رسوبی فوق در حالتهای فاقد منبع کربنی اضافی و دارای منبع کربن اضافه در سه نوع گلوکز، مالتوز و سوکروز در دو سطح 5/0 و 1 درصد بهینه شدند. بعبارت دیگر اثر حضور منابع کربنی در محیط رسوبی مورد مطالعه قرار گرفت.

آنالیزها: در این بررسی کلنی­ها بعد از جمع­آوری و خشک سازی توسط XRD نیمه کمی و PSA مطالعه شدند. ابتدا کلنی­های خشک شده بمنظور بررسی شکل شناسی نانو ذرات از دستگاه طیف نگار پرتوایکس D8 advance ساخت شرکت Bruker آلمان با تشعشع  CuKα تحت شرایط kV 40 و mA 40 استفاده گردید. پرتودهی نمونه­ها توسط XRD در زاویه­ی 80-5 درجه و width step 05/0 درجه و scan time 1-2 ثانیه انجام شد (8). آنالیزهای XRD نیمه کمی توسط آزمایشگاه مرکزی دانشگاه اصفهان و اندازه ذرات توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی گیسل میدانی (Field emission scanning electron microscopy) (FESEM) مدل MIRA3 ساخت شرکت TESCAN کشور جمهوری چک توسط شرکت آریا الکترون اپتیک تهران تعین شد. آنالیز شکل شناسی کریستال­ها نیز توسط FESEM شرکت آریا الکترون اپتیک انجام شد. نمونه­ها بمنظور تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی و آنالیز ذرات با استفاده از دستگاه FESEM با استفاده از چسب مس بر روی استاب­های (نگهدارنده نمونه SEM) فلزی تثبیت شدند و سپس با طلا پوشش­دهی شدند. آنالیزهای آماری نتایج نیز توسط آزمون تحلیل واریانس یک طرفه در سطح معنی داری p˂0.01 و آزمون تعقیبی توکی صورت گرفت.

نتایج

آنالیز XRD رسوبات کلسیت تولید شده در محیط رسوبی با غلظت­های مختلف اوره: نتایج XRD نیمه کمی نشان داد که اوره 1 درصد یا 2 درصد  تفاوت چندانی ندارند اما با افزایش اوره درصد دیگر کریستالهای جانبی افزایش می­یابد (جدول 1). طبق این نتایج مشخص شد که محیط رسوبی حاوی 1 یا 2 درصد اوره با تشکیل میزان94 و 5/93 درصد رسوب کلسیت و بدلیل داشتن محصولات جانبی کمتر به عنوان غلطتهای بهتری نسبت به سایر  غلظت­های اوره بودند. شکل 1 و 2  طیف XRD رسوب تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی بترتیب با اوره 1 و 2 درصد و غلظت ثابت کلسیم 2 درصد را نشان می­دهد. تصاویر مربوط به آنالیز XRD غلطتهای 3 و 4 درصد اوره در قسمت ضمیمه آمده است. مقادیر درصدی کلسیت، آراگونیت و واتریت در غلظت­های مختلف اوره به لحاظ آنالیز آماری تفاوت معنی­داری را نشان ندادند. همانطور که در جدول 1 مشاهده می­شود تفاوت قابل ملاحظه­ایی بین 1 و 2 درصد اوره نیز به لحاظ مقادیر کریستال­ها وجود ندارد. لذا وقتی تفاوتی بین غلظتهای اوره به لحاظ نسبت کریستالی تفاوتی قابل ملاحظه­ایی نیست باید برای انتخاب بهترین غلظت اوره جدا از نسبت کریستالهای تولید شده به اندازه کریستال­ها نیز نگاهی داشت که در ادامه به آن پرداخته شده است.

 

 

جدول 1- نتایج آنالیز XRD برای رسوبات کلسیت تولید شده در محیط رسوبی جامد با غلظت های مختلف اوره: غلظت کلسیم: 2 درصد

نمونه / درصد اوره

1 درصد

2  درصد

3 درصد

4 درصد

درصد کلسیت

94

5/93

94

5/93

درصد کوارتز

_

_

5/2

4/2

درصد واتریت

4/2

2/2

1/3

1/4

 

شکل 1- طیف XRD رسوب تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی با اوره 1 درصد و غلظت کلسیم 2 درصد. C: کلسیت،V: واتریت، Q: کوارتز

 

شکل 2- طیف XRD رسوب تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی با اوره 2 درصد و غلظت کلسیم 2 درصد. C: کلسیت،V: واتریت، Q: کوارتز

 

آنالیز XRD رسوبات کلسیت تولید شده در محیط رسوبی با غلظتهای مختلف کلسیم کلرید: نتایج XRD نیمه کمی نشان داد که کلسیم 2 درصد  بهترین نتایج را به لحاظ مقدار کلسیت و محصولات جانبی نشان می­دهد (جدول2). طبق این نتایج مشخص شد که محیط رسوبی حاوی 2 درصد کلسیم  با تشکیل میزان  3/92 درصد رسوب کلسیت و بدلیل داشتن محصولات جانبی کمتر به عنوان بهترین نمونه نسبت به سایر غلظتهای کلسیم را میتوان انتخاب کرد. این نتایج تفاوت مشخصی بین خصوصیات کریستال تولید شده 5/1 و 2 درصد کلسیم را  نشان می­دهد. اثر مقادیر کلسیم کلراید بر مقادیر نسبی تولید کوارتز، واتریت و کلسیت طبق آنالیز آمری معنی­دار بود (p˂0.01). شکل 3 طیف XRD رسوب تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی با کلسیم کلراید 2 درصد و اوره 1 درصد را نشان می­دهد. نتایج دیگر مقادیر کلسیم کلراید در ضمیمه آمده است.

 

 

جدول 2- نتایج آنالیز XRD برای رسوبات کلسیت تولید شده در محیط  رسوبی با غلظتهای مختلف کلسیم کلرید و غلظت اوره 1 درصد

نمونه / درصد کلسیم کلراید

5/1 درصد

2 درصد

5/2 درصد

3 درصد

درصد کلسیت

9/78

3/92

6/90

3/89

درصد کوارتز

_

8/2

6/2

8/3

درصد واتریت

1/2

9/4

9/6

9/6

 

 

شکل 3- طیف XRD رسوب تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی با کلسیم کلراید 2 درصد و اوره 1 درصد. C: کلسیت،V: واتریت، Q: کوارتز

 

آنالیز XRD رسوبات کلسیت تولید شده در محیط  رسوبی با غلظت های مختلف سوکروز، مالتوز و گلوکز: طبق این نتایج مشخص شد که  محیط حاوی  5/0 درصد سوکروز با تشکیل 6/93 درصد رسوب کلسیت و داشتن محصولات جانبی کمتر نسبت به سایرین، بهترین نمونه برای تشکیل کریستال کلسیت است. با افزایش غلظت  1 درصدی سوکروز درصد خلوص کلسیت با 3/91 کاهش و درصد واتریت به عنوان محصول جانبی با غلظت 5/1 درصد افزایش یافت. مالتوز 5/0 و 1 درصد نیز بترتیب دارای 2/90 و 7/84 درصد و گلوکز 5/0 و 1 درصد نیز بترتیب داری 3/92 و  5/93 درصد  کلسیت می­باشد. نمونه­ی حاوی 0 درصد منبع کربن نیز دارای 6/93 درصد کلسیت و 8/1 درصد واتریت و 1/1 درصد کوارتز بود. طبق آنالیز آماری نتایج مقادیر کریستال تولید شده در دو قند گلوکز و سوکروز در مقایسه با عدم حضور آنها معنی دار نبود. تفاوت معنی داری در بین محیط رسوبی حاوی قند مالتوز در مقایسه با محیط رسوبی فاقد قند مشاهده شد (p˂0.01). نتایج نشان داد حضور و افزایش درصد برخی قندها مانند مالتوز در محیط رسوبی اسپوروسارسینا پاستوری در تولید کریستال­های تولید شده اثر دارد و با افزایش آن درصد کلسیت کم و درصد واتریت افزایش می­یابد. شکل 4 طیف XRD رسوب تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی با اوره 1 درصد، کلسیم کلراید 2 درصد و سوکروز 5/0 را نشان می­دهد. شکل 5 نیز طیف XRD رسوب تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی با اوره 1 درصد، کلسیم کلراید 2 درصد و فاقد قند را نشان می­دهد.

 

 

جدول 3- نتایج آنالیز XRD رسوبات کلسیت تولید شده در محیط  رسوبی با غلظت های مختلف از سوکروز، مالتوز و گلوکز: غلظت اوره 1 درصد، غلظت کلسیم کلراید 2 درصد

نمونه

درصد کلسیت

درصد واتریت

درصد کوارتز

سوکروز 5/0 درصد

6/93

6/2

8/3

سوکروز 1 درصد

3/91

1/5

6/3

مالتوز 5/0 درصد

2/90

7/6

1/3

مالتوز 1درصد

7/84

4/11

9/3

گلوکز 5/0درصد   

3/92

3/4

4/3

گلوکز 1 درصد

5/93

8/2

7/3

فاقد قند

6/93

8/1

1/1

 

 

 

شکل 4- طیف XRD رسوب تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی با اوره 1 درصد، کلسیم کلراید 2 درصد و سوکروز 5/0 درصد. C: کلسیت،V : واتریت، Q: کوارتز

 

شکل 5- طیف XRD رسوب تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی با اوره 1 درصد، کلسیم کلراید 2 درصد و فاقد قند. C: کلسیت،V : واتریت، Q: کوارتز

 

 

آنالیز اندازه ذرات و میکروسکوپ الکترونی: طبق آنالیز ذرات توسط FESEM میتوان به این نتیجه رسید که ذرات تولید شده در محیط اوره 1 درصد غالبا بین محدوده زیر 100 نانومتر بودند (شکل 6). با افزایش اوره این محدوده بیشتر می­شود بطوریکه در اوره 2 درصد فراوانی ذرات زیر 100 نانومتر کمتر می­گردد (شکل 7). طبق جدول 2 مشخص شد که غلظت 2 درصد کلسیم کلراید بهترین مقدار بمنظور بیشترین تولید کریستال کلسیت است. این درصد کلسیم کلراید در مقایسه با دیگر مقادیر کلسیم کلراید به لحاظ طیف ذرات نتایج قابل ملاحظه­ایی داشت. بطوریکه همانطور طیف هیستوگرام اندازه ذرات نشان می­دهد پراکنش اندازه ذرات در غلظت 2 درصد کلسیم کلراید در زیر 100 نانومتر فراوانی قابل ملاحظه­ایی دارد (شکل 8). نتایج آنالیز ذرات نشان داد که با افزایش کلسیم کلراید درصد اندازه ذرات 0 تا 50 نانومتر به طور قابل ملاحطه­ایی کم می­شود (پیوست). شکل 9 ظاهر کریستال­ها در میکروسکوپ FESEM را نشان می­دهد.

 

 

شکل 6- آنالیز طیف ذرات کلسیت تولید شده در محیط رسوبی حاوی اوره 1 درصد و کلسیم کلراید 2 درصد

 

 

شکل 7- آنالیز طیف ذرات کلسیت تولید شده در محیط رسوبی حاوی اوره 2 درصد و کلسیم کلراید 2 درصد

 

 

شکل 8- آنالیز طیف ذرات کلسیت تولید شده در محیط رسوبی حاوی کلسیم کراید 2 درصد و اوره 1 درصد

 

 

شکل 9- تصویر الکترونی کریستال­های تولید شده توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط رسوبی حاوی اوره 1 و کلسیم کلراید 2 درصد: برخی از باکتری­ها در تصاویر مشخص است.

 

بحث

مطالعه حاضر به بهینه سازی ترکیبات اصلی محیط رسوبی بمنظور تولید کلسیت می­پردازد. از آنجائیکه کلسیت یک ماده پر کاربرد در مهندسی است و از باکتری­های مختلف مولد اوره­آز بهمراه محیط کشت بعنوان عامل مولد کلسیت استفاده می­شود. در بیشتر موارد الگوی محیط رسوبی در تهیه محیط مایع حاوی باکتری تزریقی به خاک استفاده می­شود. برای مثال استاکس فیشر و همکاران ( 1999) (17) و Al Qabany   ( 2011 و 2013) (2 و 4) به این نتیجه رسیدند که غلظت 3 گرم بر لیتر نوترینت براث یا عصاره­ی مخمر در محلول به­سازی شده جهت رسیدن به رشد و دوام کافی باکتریهای مولد اوره­آز بهترین مقدار این ترکیب است. بعلاوه به میزان 10 گرم بر لیتر کلرید آمونیوم و 12/2 گرم بر لیتر NaHCO3. نیز استفاده شده است که دقیقا مشابه مقادیر محیط رسوبی­ست. نکته مهم این است که برخی مطالعات بجای نوترینت براث از عصاره مخمر استفاده کرده­اند و اگر هر دو به­طور همزمان به­کار برده شود غلظت مجموع نهایی باید رعایت شود (17). مطالعات نشان داده که کلرید آمونیوم بمنظور کند کردن فعالیت تولید کلسیت افزوده می­شود. تندی واکنش یا افزایش اوره موجب تشکیل سریع و کلسیته شدن باکتری­ها میشود که از طرفی نیز موجب افزایش اندازه ذرات کلسیت نیز می­شود (18).

محققان زیادی از محیط رسوبی بکار رفته در این تحقیق بمنظور جداسازی باکتری­های مولد کلسیت یا مطالعه تولید کلسیت توسط یک باکتری خاص استفاده کرده­اند (6 و 10). نکته مهم تغییر مقادیر برخی موارد مانند کلسیم و اوره است که در مقالات با هدف غربالگری می­توان این تغییرات را چشم پوشی کرد. بعبارت دیگر اگر هدف مطالعه اثر مواد غذایی بر روی نوع و اندازه کریستال­ها باشد باید به این جزئیات دقت گردد. چراکه غلظت کلسیم و اوره بر درصد انواع کریستالهای کربینات کلسیم و همینطور اندازه آنها اثر دارد.

مُبلی و همکاران (1989) (11) گزارش کردند که میکروارگانیسم­ها از اوره بعنوان منبع نیتروژن و انرژی استفاده می­کنند. با این حال در این فرایندها آمونیوم و کربنات تولید می­شود و در صورت وجود یون­های کلسیم، کربنات کلسیم رسوب می کند. طبق گفته­ی استاکس فیشر (1999 ) (17) سطح سلول­های باکتری دارای بار منفی است و سطح سلول­های باکتری به­عنوان محل­های یون کلسیم یا هسته گذاری عمل می­کنند. مقالات متعددی تایید کردند که در باکتری اسپوروسارسینا پاستوری وقتی غلظت اوره و کلسیم بالا باشد بازده رسوب کلسیت کاهش می یابد و بر عکس با مقادیر کم این ترکیبات ( 5 0/0تا 25/0 مول) این کارایی افزایش می­یابد. بعبارتی سرعت هیدرولیز اوره و سرعت تولید محصولات آن بر روی نوع کریستال تولیدی به لحاظ اندازه و خلوص اثرگذار است.

نوع باکتری، مقدار باکتری، غلظت اوره، غلظت کلسیم، pH اولیه محیط و قدرت یونی محیط از عوامل موثر در فعالیت اوره­آزی ست که خود می­تواند تولید کلسیت را کنترل کند. فعالیت اوره­آزی با مقدار باکتری افزایش ­می­یابد که طبق بسیاری از مقالات افزایش کلسیم نیز موجب افزایش رسوب کربنات کلسیم می­شود. مطالعه اوکاوا نشان داد که افزایش یون کلسیم از 25 میلی مولار به 250 میلی مولار رسوب کربنات کلسیم را 10 درصد افزایش می­دهد (14). مطالعات نشان داده که افزایش غلظت کلسیم و اوره در محلول تزریقی به خاک بمنظور بهبود خاک موجب پراکنش ناهمگن آنها بر روی ذرات ماسه می­شود. لذا آنها بمنظور سیمانی شدن یکنواخت ذرات پیشنهاد می­دهند که غلظت مواد را کم و تعداد دفعات تزریق بیشتر گردد (3). اندازه ذرات کریستال­ها در غلطت­های بالای واکنش­گر افزایش می­یابد. غلظتهای کم واکنش­گر هم موجب پراکنش بهتر کریستال­ها و کوچک شدن اندازه ذرات می­شود (4 و 12). نتایج FESEM این تحقیق اثبات کرد که اندازه ذرات کریستال­ها در غلطت­های بالای واکنشگرها افزایش می­یابد.

حضور کربن­های مختلف در محیط­های طبیعی یا استفاده منابع کربنی ارزان قیمت بمنظور تولید نانوکریستال­های کربنات کلسیم بحث دیگری ست که نقش منابع کربنی در تولید این کریستال­ها را با اهمیت جلوه می­دهد. آچال و همکاران (1) اثبات کردند که تولید کلسیت توسط اسپوروسارسینا پاستوری در محیط لیکور ذرت تفاوت خاصی با محیطهای نوترینت براث و عصاره مخمر ندارد. نتایج این تحقیق نشان داد افزودن منابع کربنی مانند گلوکز و سوکروز در محیط رسوبی اثر کاهشی معنی­داری در تولید کریستال­ها ندارد اما اثر مالتوز در تولید کلسیت و محصولات جانبی معنی دار (p˂0.01) بود. حضور منابع کربنی مختلف در طبیعت و خاک­ها امری اجتناب ناپذیر است و بعلاوه اکثر محققان اثر مواد غذایی اصلی را در تولید کلسیت در بتن­ها و خاکها مطالعه می­کنند و به نقش منابع کربنی موجود در طبیعت یا افزوده شده به صورت مصنوعی نمی­پردازند. آچال و همکاران با مطالعه رشد و فعالیت آنزیمی اسپوروسارسینا پاستوری در محیط لیکور ذرت و عصاره مخمر و نوترینت براث دقیقا اثبات کردند که رشد و فعالیت آنزیمی در لیکور ذرت در مقایسه با محیطهای استاندارد تفاوت خاصی ندارد. هر چند مطالعه آچال و همکاران به مقادیر و نسبت کریستال­ها نپرداختند. نکته مهم این است که محیط­های غذایی جدا از نقش در مقدار تولید بر روی درصد کریستال­ها هم نقش بازی می­کنند. محققین امروزه از ملاس یا لاکتوز بعنوان تحریک کننده باکتری­های خاک و تولید کلسیت استفاده کردند که مقاومت ایجاد شده در خاک اهمیت استفاده از ملاس یا لاکتوز را بعنوان منبع کربن ارزان قیمت نشان می­دهد (13 و 15). مطلب مهمی که این مطالعه به آن تاکید دارد این است که مواد غذایی محیط­های رسوبی یا مواد غذایی که به محیط­های طبیعی بهمراه باکتری بمنظور تولید کلسیت استفاده می­شوند به نظر میرسد در نسبت مقادیر تولید شده کریستال­های کربنات کلسیم مانند کلسیت، واتریت و آراگونیت مهم باشند. در این تحقیق جدا از مطالعه مقادیر اوره و کلسیم کلراید بعنوان واکنش­گرها، اثر منابع کربنی در تنوع کریستاله­ای کربنات کلسیم نیز مطالعه شد و مشخص شد اثر همه قندها در مقادیر تولید شده کریستال­ها یکسان نیست.

 تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید چمران اهواز به دلیل حمایت مالی این پایان نامه تشکر می­نمایند. بعلاوه از جناب دکتر ولی اله نوبخت عضو هیات علمی گروه شیمی دانشگاه شهید چمران اهواز به علت کمک در آنالیزهای XRD و FESEM تقدیر و تشکر می­شود.

  • Achal V, Mukherjee A, Basu PC, Reddy MS. 2009. Lactose mother liquor as an alternative nutrient source for microbial concrete production by Sporosarcina pasteurii. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 36(3):433-8.
  • Al Qabany A, Mortensen B, Martinez B, Soga K, Dejong J. 2011. Microbial carbonate precipitation: correlation of S-wave velocity with calcite precipitation. In Geo-Frontiers; Advances in Geotechnical Engineering. 3993-4001.
  • Al Qabany A, Soga K, Santamarina C. 2012. Factors affecting efficiency of microbially induced calcite precipitation. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138(8):992-1001.
  • Al Qabany A, Soga K. 2013. Effect of chemical treatment used in MICP on engineering properties of cemented soils. Géotechnique 63 (4): 331-339.
  • Anbu, P, Kang, CH, Shin, YJ and So, JS. 2016. Formations of calcium carbonate minerals by bacteria and its multiple applications. Springerplus, 5(1), pp.1-26.
  • Chahal N, Rajor A, Siddique R. 2011. Calcium carbonate precipitation by different bacterial strains. African Journal of Biotechnology. 10(42):8359-72.
  • Galván-Ruiz M, Hernández J, Baños L, Noriega-Montes J, Rodríguez-García ME. 2009. Characterization of calcium carbonate, calcium oxide, and calcium hydroxide as starting point to the improvement of lime for their use in construction. Journal of Materials in Civil Engineering. 21(11):694-8.
  • Ghezelbash GR, Haddadi M. 2018. Production of nanocalcite crystal by a urease producing halophilic strain of Staphylococcus saprophyticus and analysis of its properties by XRD and SEM. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 34(12):1-0.
  • Ghosh T, Bhaduri S, Montemagno C, Kumar A. 2019. Sporosarcina pasteurii can form nanoscale calcium carbonate crystals on cell surface. PloS One. 14(1):e0210339.
  • Hammes F, Boon N, de Villiers J, Verstraete W, Siciliano SD. 2003. Strain-specific ureolytic microbial calcium carbonate precipitation. Applied and Environmental Microbiology. 69(8):4901-9.
  • Mobley, H, and Hausinger, R. 1989. Microbial ureases: significance, regulation and molecular characterisation. Microbiological Reviews, 52(1), 85-108.
  • Mori D, Uday KV. 2021. A review on qualitative interaction among the parameters affecting ureolytic microbial-induced calcite precipitation. Environmental Earth Sciences. 80(8):1-20.
  • Nikseresht F, Landi A, Sayyad G, Ghezelbash GR, Schulin R. 2020. Sugarecane molasse and vinasse added as microbial growth substrates increase calcium carbonate content, surface stability and resistance against wind erosion of desert soils. Journal of Environmental Management. 268:110639.
  • Okwadha GD, Li J. 2010. Optimum conditions for microbial carbonate precipitation. Chemosphere. 81(9):1143-8.
  • Pakbaz MS, Ghezelbash GR, Afzal A. 2020. Sugarcane molasses: a cheap carbon source for calcite production in different class of soils using stimulation of indigenous urease-producing bacteria. Geomicrobiology Journal. 37(3):213-29.
  • Shraddha G, Darshan M. 2019. Microbially induced calcite precipitation through urolytic organisms—a review. International Journal of Life Sciences. 7:133-9.
  • Stocks-Fischer S, Galinat JK, Bang SS. 1999. Microbiological precipitation of CaCO3. Soil Biology and Biochemistry. 31(11):1563-71.
  • Whiffin VS, Van Paassen LA, Harkes MP. 2007. Microbial carbonate precipitation as a soil improvement technique. Geomicrobiology Journal. 24(5):417-23.
  • Zhu T, Dittrich M. 2016. Carbonate precipitation through microbial activities in natural environment, and their potential in biotechnology: a review. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4:4.
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 37, Issue 1
Winter 2024
Pages 30-44

  • Receive Date 18 February 2022
  • Revise Date 29 March 2022
  • Accept Date 01 June 2022