Document Type : Research Paper
Authors
1 Shahid Bahonar University of Kerman
2 Department of Biology, Shahid Bahonar University of Kerman and Department of Biology, Urmia University, Urmia
3 Department of Biology, Urmia University
4 Department of Biology, Tabriz university, Tabriz, Iran
Abstract
Regulation of flowering time requires the activity of various genes that are controlled by environmental and internal cues. The FLC gene plays a key role in transition to flowering and suppresses flowering as target gene of vernalization pathway. Vernalization is a natural adaptation to ensure flowering after winter so that flowers and seeds can develop in favorable environmental conditions. In this study, identification and expression of FLC gene was investigated in rocket mustard (Sisymbrium irio). Total RNA was extracted from cotyledon leaves and cDNA was made. Specific primers were designed based on tsequence alignment of FLC homogenous genes and used for RT-PCR reaction. The identified 449 nucleotids fragment was recorded as SiFLC with accession number KT156751 in the NCBI database. Sequencing of the coding region and comparison of its putative protein (with 150 amino acids) and FLC orthologues in other plants showed their high similarity. Expression relative rate using the semi-quantitative method, in vegetative stage in young leaves, mature leaves, stems and roots was between 56-86%, which the highest (about 86%) and the lowest (about 56%) levels were observed in young leaves and stems respectively. In the reproductive stage, a decrease in expression was observed in these organs especially in leaves (about one percent). However, expression level was higher in flower buds and reached about 31%. Decreasing leaf expression in the reproductive phase indicates flowering induction. FLC higher levels in flowers, after transition to flowering, allows the next generation to reregulate its rate and respond to winter during vegetative phase
Keywords
Main Subjects
جداسازی، توالییابی و میزان بیان ژن ارتولوگ (FLC) FLOWERING LOCUS C در اندامهای مختلف خاکشیر بدل (Sisymbrium irio)
فرخنده رضانژاد1*، فرزانه نصری1، 2، رضا حیدری2 و زهرا بهمنی3
1 ایران، کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، گروه زیستشناسی
2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، گروه زیستشناسی
3 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، گروه زیستشناسی
تاریخ دریافت: 29/09/1400 تاریخ پذیرش: 26/05/1401
چکیده
تنظیم زمان گلدهی نیازمند فعالیت ژنهای مختلفی است که تحت کنترل فاکتورهای محیطی و درونی میباشند. ژن FLC، نقش کلیدی در گذر به گلدهی دارد و بهعنوان ژن هدف مسیر بهاره شدن، گلدهی را مهار میکند. بهاره شدن یک سازگاری طبیعی برای تضمین گلدهی پس از زمستان است تا گل و دانه در شرایط مطلوب محیطی نمو یابند. دراین مطالعه، شناسایی و بررسی بیان این ژن در خاکشیر بدل بررسی شد. RNA کل از برگهای لپهای استخراج و cDNA ساخته شد. آغازگرهای اختصاصی براساس همراستایی توالی ژنهای همساخت FLC، طراحی و برای واکنش RT-PCR استفاده گردیدند. قطعه مورد نظر به طول 449 نوکلئوتید، شناسایی و با نام SiFLC و شماره دسترسی KT156751 در پایگاه NCBI ثبت شد. مقایسه پروتئین استنباطی با 150 آمینواسید با پروتئینهای همساخت FLC در سایر گیاهان، نشان دهنده شباهت زیاد آنها بود. میزان نسبی بیان با استفاده از روش نیمه کمی، در مرحله رویشی در برگ جوان، برگ بالغ، ساقه و ریشه بین 86-56 درصد بود، بالاترین میزان (86) در برگ جوان و کمترین میزان (حدود 56) در ساقه مشاهده شد. در مرحله زایشی کاهش بیان در این اندامها بویژه در برگ مشاهده شد که میزان بیان آن بسیار ناچیز (حدود یک درصد) اما در غنچههای گل به نسبت بالاتر بود و به حدود 31 درصد رسید. کاهش بیان در برگ در فاز زایشی نشان دهنده تحریک گلدهی و افزایش آن در گل، پس از تحریک گلدهی، می تواند مربوط به تنظیم دوباره آن و آمادگی برای مهار طی فاز رویشی باشد.
واژههای کلیدی: برگ جوان، ساقه، گلدهی، تعیین توالی، RT-PCR، Sisymbrium irio
* نویسنده مسئول، تلفن: 03431322090، پست الکترونیکی: frezanejad@uk.ac.ir
مقدمه
تشکیل گل که در مریستم شاخساره رخ میدهد یک رویداد تکوینی و فیزیولوژیکی پیچیده است .آغاز گلدهی مستلزم بروز یکسری تغییرات اساسی در الگوی تمایز جوانههای انتهایی یا کناری است که منجر به تشکیل مریستم گلآذین و ایجاد و توسعه اندامهای گل میگردد. برای انجام این فرایند، ابتدا گیاه باید به بلوغ گلدهی برسد که حداقل رشد رویشی است که گیاه باید انجام دهد تا بتواند وارد دوره زایشی شود. چنین دورههایی در گونههای مختلف گیاهان متفاوت است برای مثال در غلات این دوره بسیار کوتاه میباشد. در گیاهان باغی، معمولاً با روشهای اصلاح نباتات دوره بلوغ گلدهی را به حداقل میرسانند. مرحله دوم کسب استعداد گلدهی است که این ویژگی بخصوص در مناطق معتدله به صورت نیاز سرمایی درآمده است. یعنی اگر به گیاه مقداری سرما داده شود، استعداد گلدهی را کسب خواهد کرد (14، 15و 20). تولیدمثل جنسی موفق و بهدنبال آن نمو میوه و دانهها در گیاهان گلدار به توانایی آنها در نمو گل وابسته است (27). آگاهی از تکوین گل و ژنهای درگیر در نمو آن، برای انجام برنامههای اصلاح نژادی مفید میباشد (10). زمان گلدهی یکی از صفات کلیدی در سازگاری گیاهان است که از این طریق گیاه میتواند در زمان مناسب، گرده افشانی و تولید بذر نماید (6). کنترل زمان گلدهی برای تولید دانههای موثر و کارا و برای کشت تابستانی محصولات دو سالهی برگدار ضروری است. در محصولاتی که هدف از کشتشان برگ یا زیستتوده (بیومس) است تاخیر در زمان گلدهی منجر به رشد رویشی بیشتر میشود (30). تحقیقات ژنتیک مولکولی در گیاه مدل آرابیدوپسیس منجر به کشف تعداد زیادی از ژنها شد که در پاسخ به عوامل محیطی و درونی باعث تنظیم زمان گلدهی میشوند (3و 29). در آرابیدوپسیس و گیاهان مختلف دیگر، ترکیبی از علائم محیطی و درونی مانند دوره نوری روزانه، ساعت زیستی، خودگردان، جیبرلیک اسید، بهاره شدن، دما، میزان قند و سن، موجب میشوند تا سرنوشت مریستم راس شاخساره (SAM) از رویشی به زایشی تغییر کند. شبکهای گسترده از ژنهای تنظیمی، این عوامل درونی و محیطی را درک میکنند و با گذر به گلدهی در مناسبترین زمان ممکن، باعث افزایش سازگاری و تولید مثل موفقتر گیاهان میشوند (4). این ژنهای دخیل در گلدهی بسته به عملکردشان در مسیرهای مختلفی قرارگرفتهاند که در نهایت همه این مسیرها با اثر روی گروهی از ژنها به نام ژنهای یکپارچه کننده مسیرهای گلدهی (Floral pathway integrator genes)، زمان گلدهی را کنترل میکنند. ژنهای یکپارچه کننده مسیرهای گلدهی پس از فعال شدن به نوبه خود ژنهای تعیین هویت مریستم گل (Floral identity genes) را فعال کرده و گلدهی رخ میدهد (1، 3، 21، 28و 40). برخی از این ژنهای یکپارچه کننده گلدهی نظیر CONSTANS (CO)، GIGANTEA (GI)، FLOWERING LOCUS T (FT)، SUPPRESSOR of OVEREXPRESSION of CO1 (SOC1)، LEAFY (LFY)، APETALA1 (AP1)، و SEPALLATA (SEP) باعث تحریک گلدهی و برخی دیگر نظیر TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) و FLOWERING LOCUS C (FLC) مانع از گلدهی میشوند. اطلاعاتی که از مطالعات بر روی فرآیند گلدهی در گیاهان مدل به دست میآید، میتواند باعث فهم بهتر این فرآیند در سایر گیاهان شود (32و 33). پاسخ به نشانههای محیطی، تولید مثل گیاهان پیشرفته را با تغییر فصول همگام مینماید. اساس ژنتیکی این پاسخها بهطور مفصل در Brassicaceae مورد مطالعه قرار گرفته است. FLC که یک فاکتور رونویسی قلمرو MADS را رمز میکند که گلدهی Arabidopsis thaliana را در پاسخ به نشانه های فصلی کنترل میکندFLC ، تا زمانی که رونویسی آن به طور پایدار با قرارگرفتن طولانی مدت در معرض دماهای پایین در پاییز یا زمستان سرکوب شود، گلدهی را سرکوب میکند، یعنی گلدهی را تا بهار محدود میکند. این استراتژی تولیدمثلی که گلدهی را در زمان مناسب پس از زمستان طبیعی ممکن میسازد بهاره کردن (Vernalization) نامیده میشود (19و 25). نیاز به بهاره شدن یک صفت سازشی است که با مهار گذر به گلدهی قبل از زمستان، گلدهی در شرایط مطلوب بهار را موجب میشود. FLC با اتصال (باند) به ژنهایی که فعالکنندههای گلدهی را کد میکنند و سرکوب رونویسی آنها، گذر به گلدهی را مهار میکند. در طول بهارهسازی، سطوحmRNA ی FLC کاهش مییابد و پس از بهارهسازی بهطور پایدار سرکوب میشود و به ژنهای هدف اجازه رونویسی و گلدهی را میدهد میشود (23و 35). بیش از 500 محل اتصال FLC در ژنوم Arabidopsis thaliana وجود دارد نشان دهنده اینکه FLCدر مسیرهای (اعمال) دیگر غیر از بهاره شدن نیز نقش دارد. در تنظیم زمان گلدهی، بهعنوان یک پروتئین مهارکننده عمل میکند و عمدتاً با سرکوب فعالسازی ژنهای مهم تحریک گلدهی مانند FTو SOC1 عمل میکند (16و18). مکانیسمهایی که توسط آنها، بیان FLC به طور پایدار توسط سرما سرکوب می شود اخیراً مورد بررسی قرارگرفته است. سرکوب FLC به تدریج در طول قرارگرفتن در معرض سرما رخ میدهد و قرارگرفتن در معرض طولانی مدت چندین هفتهای که معمول زمستان است برای سرکوب پایدار مورد نیاز است. قرار گرفتن در معرض سرما برای دورههای کوتاهتر میتواند منجر به سرکوب نسبی FLC و پاسخ گلدهی ناقص شود. (23). بهاره شدن منجر به کاهش سطح رونوشت FLC میشود و کاهش در بیان این ژن، پس از بازگشت گیاه به محیط گرمتر نیز حفظ میشود (26). پایداری حالت مهار شدهی FLC و جدایی زمانی بین تیمار سرما و آغاز گلدهی سبب به وجود آمدن این فرضیه شد که، بهاره شدن از طریق کنترل اپیژنتیک بیان FLC عمل میکند (9). مطالعات مولکولی و ژنتیکی نشان داده است که سه سیستم اصلی FLC را تنظیم میکند (بهاره سازی، ژن FRIGIDA (FRI) و مسیر خودمختار) که همگی روی کروماتین FLC تأثیر میگذارند، برای مثال برای فعال سازی بیان این ژن، متیلاسیون و استیلاسیون در هیستون 3 لیزین شماره 4(H3K4)، و برای ممانعت از فعالیت این ژن، تغییراتی مانند داستیلاسیون، دیمتیلاسیون لیزین 27، H3K9 صورت میگیرد (12و 23). ژن FLC در گیاه مدل آرابیدوپسیس با طولی بیش از 5Kb، روی کروموزم شماره 5 و در ناحیهی بالایی آن تعیین موقعیت شده است. این ژن شامل7 اگزون و 6 اینترون است (33). تاکنون در بسیاری از گونههای خانواده شببو ژنهای همساخت FLC شناسایی شدهاند که از جمله آنها میتوان BnFLC در کلزا، BoFLC در کلم (20)،BrFLC در شلغم (20)، RsFLC در تربچه، SaFLC در خردل سفید (7) و BjFLC در خردل هندی را نام برد. بررسیهای مروری انجام شده، هیچ گزارش منتشر شدهای را در مورد شناسایی این ژن در خاکشیر بدل (Sisymbrium irio) از تیره شببو نشان نداد.
مواد و روشها
بذر گیاه خاکشیر بدل (Sisymbrium irio L.) از خانوادهی شببو (Brassicaceae) از دانشگاه شهید باهنر کرمان جمعآوری شد. بذرها در گلدانهای حاوی پرلیت در شرایط گلخانهای با حرارت روز و شب C˚25-23 و دورهی روشنایی 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی کشت داده شده ویک روز در میان محلول غذایی هوگلند داده شدند تا گیاه دوره رویشی 49 روزه خود را بگذراند. برای مطالعات مولکولی از بافتهای تازه در مراحل زیر استفاده شد: برگهای لپهای برای تعیین توالی ژن FLC استفاده شدند. برای مطالعات بیان ژن از برگ ، ساقه و ریشه در دو مرحله رویشی (4روزگی-برگ لپهای) و زایشی (هنگام تشکیل غنچههای گل) و نیز از غنچههای گل (49روزگی-14برگی) استفاده شد. اولین مرحله در شناسایی ژن و مطالعهی بیان آن، طراحی آغازگرهای مناسب و استفاده از آنها در واکنشهای PCR و یا RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) است. از آنجاکه توالی ژن مورد نظر در گیاه مورد مطالعه نامشخص بود، آغازگرها بر اساس توالیهای ژنی موجود از سایر گیاهان هم خانواده، طراحی گردیدند. بدین منظور توالی ژن همساخت FLC در (Accession no: JQ663617) Arabidopsis thaliana، (Accession no: AY306125) Brassica oleraceae، (Accession no: EF542803) Sinapis alba، (Accession no: AB611009) Raphanus sativus، (Accession no: JX901141) Brassica napus، از بانک ژن NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) گرفته شد. همردیفی توالیها با استفاده از نرمافزار ClustalW2 صورت گرفت. براساس نقاط حفاظت شدهی موجود، در ابتدا و انتهای ناحیه کد کنندهی ژن، آغازگرهایی با استفاده از نرمافزار GeneRunner طراحی گردیدند و سپس مناسب بودن آنها به وسیلهی نرمافزار BLAST و DNAMAN مورد بررسی قرار گرفت (2). آغازگرها به طریقی طراحی گردید که بتوان در RT-PCR بیشترین طول ناحیهی کدکنندهی ژن را بهدست آورد و از محصول آنها جهت تعیین توالی استفاده کرد. همچنین آغازگرهایی روی دو اگزون مختلف (آغازگر پیش برنده اگزون 4 و آغازگر برگرداننده اگزون 6) از ژن در نظر گرفته شد تا بتوان از محصول آنها برای بررسی بیان ژن FLC استفاده کرد. همچنین برای اطمینان از صحت انجام کار، ژن GAPDHبهعنوان ژن مرجع استفاده شد. در شکل 1، طرح شماتیک ژن FLC و محل تقریبی قرار گرفتن آغازگرهای پیشبرنده و برگرداننده نشان داده شده است (33). همچنین نام و توالی آغازگرها در جدول 1 آمده است. سنتز آغازگرهای طراحی شده توسط شرکت تکاپوزیست صورت گرفت.
شکل 1- طرح شماتیک ژن FLC و محل قرار گرفتن آغازگرهای پیشبرنده و برگرداننده روی آن (برگرفته از Schranz et al., 2002)
جدول 1- نام، توالی و کاربرد آغازگرهای مورد استفاده
کاربرد |
توالی (5'→3') |
نام آغازگر |
آغازگر پیشبرنده ژن FLC درRT-PCR |
CCATGRGGAGGAAGAAAC |
FrFLC |
آغازگر برگرداننده ژن FLC درRT-PCR |
CTAATWAAGTAGTGGGAGCGT |
RvFLC |
آغازگر پیشبرنده بیان ژن درRT-PCR |
TAATGTAAGTGTCGGTTCCCTC |
Ex-frFLC |
آغازگر برگرداننده بیان ژن FLCدرRT-PCR |
CTCCTCTTCCAGTAATTTCTCC |
Ex-rvFLC |
آغازگر پیشبرنده ژن FLCمرجع |
CAAGGACTGGAGAG GTGG |
Fr-GAPDH |
آغازگر برگرداننده ژن مرجع |
TTCACTCGTTGTCGTACC |
Rv-GAPDH |
برای شناسایی و جداسازی ژن همساخت FLC، از RT-PCR استفاده گردید. در این روش ابتدا RNA کل، از برگهای لپهای (2برگی، 4روزگی) در مرحلهی رشد رویشی با استفاده از کیت استخراج RNA (Qiagene, RNeasy Plant Mini Kit, Germany) بر طبق روش ذکر شده در کیت استخراج شد. برای بررسی حضور و ارزیابی خلوص و تعیین غلظت RNA از روشهای اسپکتوفتومتری در طول موجهای 260 و 280 نانومتر و الکتروفورز افقی روی ژل آگارز 1 درصد استفاده شد (13). سپس از روی mRNA های موجود، DNA مکمل (cDNA) ، با استفاده از کیت ساخت cDNA شرکت فرمنتاز (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)، طبق روش ذکر در کیت، تهیه و از آن در PCR بعنوان DNA الگو استفاده شد. از این DNA الگو بههمراه آغازگرهای Fr-FLC و Rv-FLC در واکنش PCR، برای شناسایی ژن هدف (FLC) استفاده گردید. بهاین منظور 2 میکرولیتر cDNA، 1میکرولیتر آغازگر پیشبرنده و 1 میکرولیتر آغازگر برگرداننده، درون لوله لیوفیلیزه PCR (BIONEER, AccuPowerR PCR PreMix, Korea) ریخته و با آب دوبار تقطیر استریل (مخصوص تزریق) به حجم 20 میکرولیتر رسانده و برنامه PCR توسط ترموسایکلر مدل PTC (1148 MJ Mini Personal Termal Cycler BioRad, USA) و با مرحله واسرشتگی اولیه بهمدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد آغاز گردید و با انجام 37 چرخه با دمای واسرشتگی 94 درجه سانتیگراد بهمدت 45 ثانیه، دمای اتصال 52 درجه سانتیگراد بهمدت 1 دقیقه و دمای طویل شدن، 72 درجه سانتیگراد بهمدت 1 دقیقه ادامه یافت و با مرحله طویل شدن نهایی بهمدت 10 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد به اتمام رسید. پس از انجام PCR، کیفیت محصول برروی ژل آگارز 1 درصد بررسی شد. پس از انجام PCR، حضور و کیفیت محصول روی ژل آگارز1 درصد بررسی شد. به منظور تخلیص و تعیین توالی قطعهی تکثیر شدهی ژن از طریق PCR، 30 میکرولیتر از محصول PCR به همراه 20 میکرولیتر از هریک از آغازگرهای پیشبرنده و برگرداننده به شرکت تکاپوزیست فرستاده شد (34). نتایج حاصل از تعیین توالی ابتدا با نرمافزارهای BLAST و ClustalW همردیف شده وسپس توالی اسید آمینهای استنباطی و توالیهای برخی از ارتولوگهای FLC موجود در بانک ژن NCBI با استفاده از نرمافزار MEGA 6.06 (6140226) با روش Parsimony Tree مقایسه و میزان شباهت آنها بررسی شد. برای مطالعه بیان ژن، RNA کل از برگ، ریشه و ساقه در مراحل رویشی (2 برگی، 4 روزگی) و زایشی (14 برگی، 49 روزگی) و همچنین از گل با استفاده از محلول استخراج RNA (GeneAll, RiboEx, Total RNA isolation solution, Korea) و براساس دستورالعمل استفاده از این محلول استخراج شد. کیفیت و کمیت استخراج شده مورد بررسی قرار گرفت. سپس ساخت cDNA انجام و با استفاده از آغازگرهای بیان، واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام شد. واکنش PCR دیگری که در آن از cDNA بهعنوان الگو و آغازگرهای Fr-GAPDH و Rv-GAPDH و برنامه بیان (Expression) استفاده شد انجام شد تا صحت انجام آزمایش را تایید کند. به منظور مشخص شدن بیان ژن ارتولوگ FLC، از الکتروفورز با ژل آگارز یک درصد استفاده شد. .پس از اتمام واکنشPCR ، محصولPCR روی ژل بارگیری و از این ژل زیر نور UV با استفاده از دستگاه UV-transiluminator عکس گرفته شد. سپس با استفاده از نرمافزار Image J، و استفاده از ژن خانه نگهدار میزان بیان ژن بطور نسبی کمی شد. برای سنجش نیمه کمی میزان شدت باندهای بیان ژن مد نظر و نرمالسازی آنها با کنترل داخلی با استفاده از ImageJ، شدت باندهای ژن مورد مطالعه و کنترل داخلی با نرم افزار محاسبه شد. پس از انجام پردازش بر روی دادههای مورد مطالعه نسبت به کنترل داخلی، آنالیز آماری با استفاده از آزمون دانکن توسط نرم افزار SPSSو با ضریب اطمینان 95درصد مورد مقایسه قرار گرفت و نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel 2007 رسم شدند. در آزمایشات RT-PCR سه تکرار در نظر گرفته شد (13).
نتایج
نتایج نشان داد که حضور سه باند پررنگ مربوط به RNA های ریبوزومی، نشان دهندهی کیفیت مطلوب RNA استخراج شده برای انجام RT-PCR است (شکل 2).
شکل2- نیمرخ الکتروفورزی RNA کل استخراج شده از برگهای لپهای (S. irio L.) در مرحلهی رویشی. 1: RNA کل دارای سه باند واضح RNAهای ریبوزومی 28s، 18s و 5.8s. M: نشانگر مولکولی DNA 1kb (Fermentase)
پس از استخراج RNA کل از آن در RT-PCR استفاده گردید. واکنش PCR که در آن از cDNA بهعنوان الگو و آغازگرهای Fr-FLC و Rv-FLC و برنامه Complete CDS استفاده گردید، منجر به تکثیر تک باند اختصاصی شد که در محدوده حدود 500 نوکلئوتید میباشد (شکل3). وجود تک باند اختصاصی نشان دهنده طراحی مناسب پرایمرها و اختصاصی بودن آنها است. با وجود ظاهر ساده، گاهی طراحی یک پرایمر مناسب میتواند بسیار چالش آفرین باشد؛ زیرا زمانی که یک ژن برای نخستین بار شناسایی میشود، وجود حتی یک باز نامناسب در ناحیه 3′ میتواند باعث عدم موفقیت PCR گردد.
برای بررسی صحت خوانش هر یک از توالیهای خوانده شده توسط آغازگرهای پیشبرنده و برگرداننده، همردیفی این دو توالی با استفاده از نرم افزار BLAST انجام گرفت که نتیجهی آن در شکل 4 آمده است. نتایج همردیفی، نشاندهنده شباهت 87 درصدی رشتههای خوانده شده توسط آغازگرهای پیشبرنده و برگرداننده بود.
در نهایت، پس از بررسی دو رشتهی پیشبرنده و برگرداننده و اصلاح بعضی نقاط رشتهی پیشبرنده بر اساس رشتهی برگرداننده، رشتهی پیشبرنده که جهت آن بهصورت 5'→3' است، برای ثبت در پایگاه دادهها (NCBI) آماده شد که در شکل 5 آمده است. توالی خوانده شده (449 نوکلئوتید) مربوط به توالی هر هفت اگزون است .
نتایج حاصل از BLAST، شباهت بسیار بالای این توالی را با سایر ژنهای ارتولوگ (همساخت) FLC در گیاهان دیگر نشان داد. میزان شباهت این قطعه با همساختهایش در خانوادهی شب بو به این شرح است: Brassica rapa و Brassica napus 89%، Sinapis alba 88%، Eutrema salsugineum 87%، Arabidopsis lyrata 86%، Arabidopsis halleri 85%. بنابراین این توالی مربوط به ژن همساخت FLC در گیاه خاکشیر بدل (Sisymbrium irio) است.
شکل 3- نیمرخ الکتروفورزی محصول RT-PCR، نشان دهندهی تکثیر ناحیهی مورد نظر از ژنSiFLC. 1: باند حدود 450 نوکلوئیدی سنتزشده با استفاده از آغازگرهای پیشبرنده FrFLC و برگرداننده RvFLC و برنامه cDNA-Conserve. M: نشانگر مولکولی DNA 1kb (Fermentase).
شکل4- نتایج همردیفی دو توالی پیشبرنده و برگرداننده خواندهشده توسط آغازگرهای Fr-FLC و Rv-FLCتوسط برنامهی BLAST
5ʹCTCGTCCGCTTTCCCGACGCTGTGACGCATCCATCGCTCTTCTAGTCGTCTCTGCCTCGGGAAAGCTATACAGCTTCTCGTCCGGGGATAACCTGGGCAAGATCCTTGATCGGTATTTAAAACAACATGCTGATGATTTTAAAGCCTTGGATCGTCAGTCAAAAGGTCTGAACTACGGTTTACACCCTGAGCTACTGGAAATTGTGGAAAGCAAGCTTTTGGAATCAAATGTTGGTAATGTAAGTGTCGATTCCGTCATTCAGCTGGAGGATCACCTTGATAACGCCCTCTCCGTAATTAGAGCTAGGAAGACAGAACTGATGTTGAAGCTTGTCGAGAACCTTAAAGAAAAGGAGAAATTGCTGAAAGAGGAGAACCAGGTTTTGGCTAGCCAGATGGAGAAAAATAATCTCGTCAGAGCCGAAGCTGATAATATGGAGATTCACCCG-3ʹ
شکل5- توالی ثبت شده از ژن همساخت FLCدر گیاه خاکشیر بدل (S. Irio L.) در پایگاه NCBI.
شباهت 89 درصدی آن با Brassica rapa بیشترین شباهت توالی این ناحیه از دو ژن است. این ژن در بانک ژن NCBI با نام SiFLC و شمارهی دسترسی (Accession Number) KT16751 ثبت گردید. باتوجه به اینکه این ناحیه از ژن بهطور تقریبی مربوط به هر 7 اگزون است (توالی اگزون 1 و 7 به طور ناقص مشاهده میشوند) ، میتوان توالی پروتئین کد شده بهوسیله این قطعه از ژن را بهدست آورد. از این توالی پروتئین استنباطی که دارای 150 اسید آمینه است در مراحل بعدی جهت بررسی شباهت آن با سایر پروتئینهای همساخت SiFLC استفاده گردید (شکل 6)
بهمنظور بررسی نواحی حفاظت شده و همچنین میزان شباهت محصول ژن SiFLC با سایر همساختهای FLC، توالی پروتئین استنباطی آن با توالی سایر همساختها در گونههای دیگر، توالی پروتئین برخی از همساختهای FLC از سایت NCBI دریافت شد و پس از همردیفی بهوسیلهی برنامهی Clustalw2 نقاط مشترک آنها با توالی پروتئین استنباطی SiFLC مشخص و مقایسه گردید (شکل 7). نتیجهی BLAST پروتئین SiFLC با همساخت آن در Brassica rapa شباهت 81 درصدی نشان داد که نشان دهنده بالاترین شباهت است. همچنین درخت فیلوژنتیکی مربوط به شباهت (همولوژی) این پروتئینها با استفاده از نرم افزار MEGA 6 به روش Parsimony Tree رسم شد (شکل 8).
بیان SiFLC در اندامهای مختلف گیاهان در مراحل نموی رویشی (4 روزگی) و زایشی ( 49 روزگی) بررسی گردید. نتایج حاصل از RT-PCR تکثیر قطعهی 119 نوکلئوتیدی را برای ژن SiFLC در برخی از اندامها و قطعهی 377 نوکلئوتیدی را برای ژن مرجع GAPDH در تمامی اندامها، نشان داد که نشان دهنده صحت انجام آزمایش است. نتایج نشان داد که . نتایج نشان داد که میزان نسبی بیان ژن مرجع در اندامهای مورد مطالعه در هر دو مرحلهی رشد رویشی و زایشی یکسان بود. میزان نسبی بیان در اندامهای مختلف نشان داد که میزان بیان ژن FLC، در برگ، ساقه و ریشه در مرحله رویشی بیشتر از میزان بیان همین اندامها در مرحله زایشی است. که میزان بیان ژن مرجع در اندامهای هر دو مرحلهی رشد رویشی و زایشی یکسان بود. میزان نسبی بیان در اندامهای مختلف نشان داد که میزان بیان ژن FLC، در برگ، ساقه و ریشه در مرحله رویشی بیشتر از میزان بیان همین اندامها در مرحله زایشی است. در مرحله رویشی نیز، میزان نسبی بیان در برگ (بویژه در برگ جوان) و ریشه نسبت به ساقه بالاتر مشاهده شد (شکلهای 9 و 10).
شکل 7- مقایسه توالی پروتئین استنباطی SiFLC در S. Irio و برخی از پروتئینهای همساخت FLC در گونههای دیگر با استفاده از برنامه Clustalw2. علائم (*)، (:) و (.) در زیر هر ستون، بهترتیب نشان دهنده ریشههای آمینواسیدی مشابه هم، حفاظت شده (هم خانواده) و نیمه حفاظت شده در تمام توالیهای همردیف شده، میباشد.
شکل 9- بررسی بیان ژن SiFLC در اندامهای مختلف طی دو مرحلهی نموی رویشی و زایشی در خاکشیر بدل. شمارهها بهترتیب عبارتند از: 1: برگ زایشی، 2: برگ جوان رویشی، 3: برگ بالغ رویشی،. 4: ساقه زایشی، 5 : ساقه رویشی، 6: گل، 7: ریشه زایشی، 8: ریشه رویشی. در تمامی واکنشها بیان ژن GAPDH بهعنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شده است.
شکل 8- درخت فیلوژنی (شجره نامه) پروتئینهای همساخت FLC در گونههای مختلف با استفاده از نرم افزار MEGA 6 به روش Parsimony Tree. در این شکل علامت پیکان ژن SiFLC در S. Irio را نشان میدهد
شکل10- شدت نسبی بیان ژن SiFLC در اندامهای مختلف در S. Irio با استفاده از نرمافزار Imagej و آزمون دانکن (P<0.05). حروف متفاوت نشانه معنیدار بودن است. شمارهها بهترتیب عبارتند از: 1- برگ در مرحله زایشی، 2- برگ جوان در مرحله رویشی،3- برگ بالغ مرحله رویشی، 4- ساقه مرحله زایشی، 5- ساقه مرحله رویشی، 6- گل، 7- ریشه مرحله زایشی، 8- ریشه مرحله رویشی.
بحث و نتیجه گیری
این سوال به ذهن میرسد که سیگنالهای متفاوت مسیرهای عمده گلدهی که با هم همپوشانی دارند چگونه ادغام میشوند تا یک تصمیم نموی واحد اتخاذ شود؟ در حالی که صدها ژن ممکن است روی گذر به گلدهی تاثیر بگذارند اما تصمیم زمان ایجاد گل به مقدار نهایی بیان FT و دو ژن کلیدی دیگر ، SOC1 (AGL20) و LFY بستگی دارد. روی هم رفته به این سه ژن، ژن های یک پارچه ساز مسیر گلی میگویند (39) مسیرهای مختلف به روشهای متفاوتی یک پارچه سازی گلی را کنترل میکنند (10). گذر به گلدهی یک تغییر نموی مهم برای به حداکثر رساندن موفقیت تولید مثل جنسی در چرخهی زندگی نهاندانگان است. ژنهای بسیاری در مسیرهای ژنتیکی مختلف، فرآیند گذر به گلدهی را کنترل میکنند. از بین آنها ژن FLC از خانواده فاکتورهای رونویسی MADS-box، نقش مهمی را در مهار گلدهی ایفا میکند. بخش اعظم اختلاف در آغاز گلدهی، بهوسیلهی تنوع آللی در دو لوکوس FRI و FLC ایجاد میشود. از آنجا که تنوع آللی FRI و FLC در اکوتیپهای مختلف آرابیدوپسیس بسیار معمول است، همساختهای آنها لوکوسهای اثرگذار بر زمان گلدهی، در سایر گیاهان درنظر گرفته شدهاند (12و 36) متضاد با نقش این ژنها در مهار گذر به گلدهی، بهارهشدن به میزان زیادی تاخیر در آغاز گلدهی را از بین میبرد (38). بنابراین بهاره شدن بهعنوان اولین قدم در ایجاد توانایی برای گلدهی عمل میکند (7). تک باند اختصاصی حاصل از RT-PCR روی ژل آگارز در درجهی اول بیانگر طراحی و عملکرد صحیح آغازگرها و مناسب بودن غلظت مواد بکار رفته در PCR است. همچنین برنامهی PCR مناسب (بخصوص دمای اتصال) از جمله عوامل موفقیت در کسب تک باند اختصاصی است (31). واکنش RT-PCR با استفاده از RNA استخراجی از برگ لپهای، وجود قطعهی تکثیر شده با طول 449 نوکلئوتید، بعنوان ژن FLC خاکشیر بدل با شماره دسترسی KT156751 با نام SiFLC در بانک ژن ثبت شد. طول این قسمت از ناحیهی کد کنندهی ژن ارتولوگ یا همساخت FLC، در آرابیدوپسیس تالیانا (8)، آرابیدوپسیس هالری (32)، کلزا (37)، خردل سفید (7) ، کلم (22)، شلغم، خردل سیاه، خردل زرد و خردل هندی (24)، 449 نوکلئوتید گزارش شده است. این قطعهی توالییابی شده همساخت FLC ، مربوط به هر 7 اگزون در خاکشیر بدل میباشد. نزدیکترین توالی نوکلئوتیدی به SiFLC ، مربوط به گیاه Brassica rapa میباشد که 89 درصد با آن مشابهت دارد. پروتئین استنباطی این قطعه از ژن SiFLC، دارای 150 آمینواسید است که 81 درصد یکسانی را با توالی آمینواسیدی B. rapa نشان میدهد. طول این قطعه از پروتئین SiFLC، با طول سایر همساختهای FLC در خانوادهی شب بو برابر است. طول کامل پروتئین FLC در اکثر توالیهای پروتئینی ثبت شده از این ژن در سایت NCBI که متعلق به خانوادهی شب بو میباشند، تقریباً 196 آمینواسید است. تاکنون در بسیاری از جنسهای خانوادههای مختلف، ژنهای همساخت FLC شناسایی شده اند. برای مثال de Oliveria و همکاران (2014) ناحیه کد کننده این ژن را در قهوه (Coffea arabica L.) توالییابی کردهاند (8). تعداد نسخههای این ژن در جنسهای مختلف خانواده شببو متفاوت است، در ژنوم آرابیدوپسیس تنها یک نسخه از این ژن (AtFLC) وجود دارد. در حالی که اعضای دیپلوئید جنس Brassica چندین نسخه از این ژن را شامل میشوند، این همساختهای چندتایی با اختلاف در آغاز گلدهی ارتباط دارند (41). مقایسهی توالی پروتئین استنباطی SiFLCبا 150 آمینواسید و دیگر همساختهای FLC، نشاندهندهی شباهت زیاد آنها بود. ژنهای همساختهای FLC در خانواده شببو، پروتئینهایی با تفاوت اندک در تعداد و نوع اسید آمینه کد میکنند. پروتئین استنباطی FLCدر خردل سفید (197)، تربچه (197)، کلم (197)، کلزا (196)، شلغم (197)، آرابیدوپیس تالیانا (196)، خردل هندی (197) و یوترما (197) آمینو اسید دارد. توالی کامل ناحیه کد کنندهی این ژن، در گیاهان خانوادههای دیگر نسبت به شب بو، به میزان کمتر شناسایی شده است. برای مثال پروتئینهای همساخت FLC در قهوه 206، پرتقال 204، انگور 210، کاکائو 199، غان 208 و گردو 203 آمینواسید دارد. با توجه به توالی یابی کامل ناحیه کد کننده و شباهت بالای آن با سایر همساختهای FLC میتوان نتیجه گرفت که ناحیه N ترمینال این پروتئین، بیش از سایر مناطق آن حفاظت شده است. بررسی نحوهی قرارگیری گونههای گیاهی مختلف در درخت فیلوژنی رسم شده، نشان میدهد که گیاهان همخانوادهی Sisymbrium irio، همگی در شاخههای مجاور این گیاه قرار گرفتهاند و این مطلب، تأییدی بر صحت توالی خوانده شده برای ژن FLC در این گیاه میباشد. باتوجه به نتایج حاصل از BLAST، پروتئین SiFLC با SaFLC (Sinapis alba) و BrFLC (Brassica rapa) (همساخت FLC در خردل سفید) در درخت فیلوژنی رسم شده، در یک شاخه قرار گرفتهاند، که با شباهت بالای توالیهای نوکلئوتیدی و پروتئینی این دو گیاه مطابقت دارد. همچنین در درخت فیلوژنی رسم شده، گیاهان خانواده شببو از سایر گیاهان متعلق به خانوادههای مختلف جدا شدهاند. بیان ژن SiFLC در خاکشیر بدل، در فاز رویشی در برگ، ریشه و ساقه بطور قابل توجهی مشاهده شد، اما بیان آن در برگ، ساقه و ریشه در مرحلهی زایشی کاهش نشان داد و حتی در برگ دیده نشد. میزان بالاتر بیان آن در فاز رویشی، صحت نقش این ژن در مهار گلدهی را تأیید می کند و باتوجه به نقش آن در مهار گلدهی، بدیهی است که میزان آن در مرحله زایشی کاهش یابد که گلدهی تحریک شود. بهرحال، میزان آن در گل (غنچه های گل) مقداری افزایش نشان داد که از برگ، ساقه و ریشه در مرحله رویشی کمتر بود. گزارش شده است که FLC در نسل بعدی، از سرکوب رها میشود و به نتایج (فرزندان) یک گیاه بهاره شده اجازه می دهد تا به زمستان پاسخ دهد. فعالسازی FLC در این نسل، تنظیم مجدد نامیده میشود تا بازیابی حالت پیش بهاره شده را به فرزندان یک گیاه بهار شده اهدا نماید. مطالعات نشان است که ژن FLC به میزان زیادی در اکثر بافتهای گیاه و در سراسر مراحل نمو آن، از جمله ابتداییترین مرحله نمو رویان در دانههای در حال بلوغ بیان میشود. فعالیت پروتئین FLC در تمامی مراحل نمو رویان، برای کنترل موثر آغاز گلدهی و بهخصوص مهار آن مورد نیاز است. تصور میشود که تنظیم دوباره سبب حذف H3K27me3 و فعالسازی رونویسیFLC میشود که ممکن است قبل یا طی تشکیل گامت یا پس از لقاح در رویان در حال نمو رخ دهد (12). بنابراین بیان دوباره این ژن در گل، پس از کاهش آن در فاز زایشی میتواند(که سبب گل دهی میشود)، می تواند مربوط به تنظیم دوباره آن و آمادگی برای مهار طی فاز رویشی باشد. همچنین مطالعات نشان داده است که سرکوب پیشرونده FLC در یک بافت به دلیل یک مکانیسم خودگردان سلولی است که در آن FLC به طور کامل و پایدار در برخی سلولها سرکوب میشود اما در برخی دیگر اصلا سرکوب نمیشود. پیامد این سرکوب پیشرونده خودگردان سلولی فعالیت FLC برای فعالیت ژن هدف، بهاحتمال برای ژنها و بافتهای مختلف متفاوت است (23).