Evaluation of nitrogen fixation activity, nifH gene expression and growth in cyanobacteria Aliinostoc sp., Affected by nitrogen, phosphorus and potassium sources

Document Type : Research Paper

Authors
Maryam Nabipour 1
Mohamad Farsi 2
Ghorban Ali Nematzadeh 3
Amin Mirshamsi Kakhki 4
1 PhD student of Ferdowsi University of Mashhad, Faculty of Agriculture, Department of Biotechnology and Plant Breeding
2 Faculty member of the Department of Biotechnology and Plant Breeding
3 head of Genetic & Agricultural Biotechnologhy Institute of Tabarestan
4 Faculty member of Ferdowsi University of Mashhad, Faculty of Agriculture, Department of Biotechnology and Plant Breeding
Abstract
Cyanobacteria are the oldest oxygenic photoautotrophs on earth with a wide ecological distribution. They increase soil productivity by affecting its physicochemical properties. Increasing the application of chemical fertilizers is harmful. Therefore, it has become necessary to look for alternative renewable resources to meet at least a part of the demand for crops. In this study, aimed at increasing the efficiency of cyanobacterial biofertilizer, the effects of nitrogen, phosphorus and potassium elements in the form of urea, superphosphate and potassium chloride fertilizers were evaluated on nitrogen fixation activity measured by gas chromatography, nifH gene expression and the growth of cyanobacterium Aliinistoc sp. In general, the growth and nitrogen fixation activity of the sample decreased as the concentration of nitrogen and phosphorus sources increased. The most effect of nitrogen source was on nitrogenase activity, and at the end of the experimental period compared to the beginning (before treatment), the amount of nitrogenase activity decreased 50 and 100% in the presence of 10 and 100 mg/L urea, respectively. Phosphorus had a significant effect on the growth of the sample, and at the highest concentration of superphosphate (500 mg/L), growth declined about 80%. On the other hand, potassium especially at the lowest concentration (125 mg/L), significantly increased growth by about 20% and doubled nitrogenase activity. In addition, the evaluation of nifH gene expression confirmed the pattern of nitrogenase activity. In general, the results of this study indicate that the dosage of elements used in combination with cyanobacterial biofertilizers should be considered.

Keywords

Subjects

بررسی فعالیت تثبیت نیتروژن، بیان ژن nifH و رشد در سیانوباکتری Aliinostoc sp.، تحت تاثیرمنابع نیتروژن، فسفر و پتاسیم

مریم نبی­پور1 ، محمد فارسی1*، قربانعلی نعمت­زاده2 و امین میرشمسی کاخکی1

1ایران، مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی و به­نژادی گیاهی

2 ایران، ساری، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری، پژوهشکده ژنتیک و زیست­فناوری کشاورزی طبرستان

تاریخ دریافت: 01/10/1399          تاریخ پذیرش: 11/11/1400

چکیده

سیانوباکتری­ها قدیمی­ترین فتواتوتروف­های اکسیژنی با توزیع اکولوژیکی گسترده­ بر روی زمین هستند. آنها با اثر بر خصوصیات فیزیکوشیمیایی خاک، موجب افزایش حاصلخیزی آن می­شوند. بدلیل مضرات افزایش مصرف کودهای شیمیایی، جستجو برای منابع زیستی که حداقل قسمتی از نیاز محصول را فراهم کند، ضروری است. در این مطالعه با هدف افزایش کارایی کود زیستی سیانوباکتریایی، تاثیر عناصر نیتروژن، فسفر و پتاسیم در قالب کودهای اوره، سوپرفسفات و کلرید پتاسیم، بر فعالیت تثبیت نیتروژن اندازه­گیری شده بوسیله کروماتوگرافی گازی، بیان ژن nifH و رشد در سیانوباکتری Aliinistoc sp.، بررسی شد. بطور کلی افزایش غلظت منابع نیتروژن و فسفر، رشد و فعالیت تثبیت نیتروژن را کاهش دادند. بیشترین اثر منبع نیتروژن بر میزان فعالیت نیتروژناری بود، بطوریکه در انتهای دوره آزمایشی در مقایسه با ابتدای آن (پیش از تیمار)، میزان فعالیت نیتروژنازی در حضور 10 و 100 میلی­گرم در لیتر اوره، بترتیب 50 و 100 درصد کاهش یافت. فسفر اثر قابل­توجهی بر رشد نمونه نشان داد و در بیشترین غلظت مورد استفاده از سوپرفسفات (500 میلی­گرم در لیتر)، کاهش رشد حدود 80 درصدی مشاهده گردید. از طرف دیگر، پتاسیم بویژه در کمترین غلظت مورد استفاده (125 میلی­گرم در لیتر)، موجب افزایش حدود 20 درصدی رشد و افزایش دو برابری فعالیت نیتروژنازی شد. علاوه براین، ارزیابی بیان ژن nifH الگوی فعالیت نیتروژنازی را تایید نمود. در مجموع نتایج این مطالعه بیانگر لزوم توجه به مقدار عناصر مورد استفاده به همراه کود زیستی سیانوباکتریایی می­باشد.

واژه­های کلیدی: سیانوباکتری، کود زیستی، ژن nifH، تثبیت نیتروژن، Real-time RT-PCR

* نویسنده مسئول، تلفن: 38805777-051، پست الکترونیکی: farsi@um.ac.ir

مقدمه

 

افزایش جمعیت جهانی به تقاضای بیشتر برای تولیدات کشاورزی منجر می­شود. شیوه­های سنتی مدیریت کشاورزی که در حال حاضر مورد استفاده می­گیرند، بشدت به کاربرد کودها و سموم شیمیایی و شیوه­هایی مانند خاکورزی شدید متکی هستند که منجر به بهره­برداری بیش از حد از منابع طبیعی و همچنین آلودگی زیست­محیطی می­شود. بنابراین برای اجتناب از گسترش این خسارات نیازمند اتخاذ شیوه­هایی هستیم که نه تنها با محیط زیست سازگار باشند، بلکه مقرون بصرفه بوده و به ما در دستیابی به امنیت غذایی طولانی­مدت کمک کنند. در جستجوی راه حل­های پایدار و سازگار با محیط زیست برای بهبود بهره­وری در کشاورزی، محققان توجه خود را به محصولات زیستی، بخصوص میکروارگانیسم­ها متمرکز نموده­اند (11 و 33).

سیانوباکتری­ها که همچنین جلبک­های سبزـ آبی نامیده می­شوند، قدیمی­ترین فتواتوتروف­های اکسیژنی بر روی زمین هستند. این میکروارگانیسم­ها توزیع اکولوژیکی گسترده­ای داشته و در طیف وسیعی از زیستگاه­ها یافت می­شوند. آنها همچنین منبع مهمی از ترکیبات فعال زیستی مانند ترکیبات فنلی، پلی­ساکاریدها و مواد شبه­هورمونی هستند که می­تواند موجب حاصلخیزی خاک و تحریک رشد گیاهان شود (11، 16 و 40). اثرات مفید تلقیح سیانوباکتریایی در تعدادی زیادی از محصولات مانند برنج، گندم، نخود­فرنگی، جو، سویا، ارزن، جو دوسر، گوجه­فرنگی، تربچه، پنبه، نیشکر، ذرت، فلفل، کاهو و ... و همچنین در بهبود حاصلخیزی خاک در مطالعات مختلف گزارش شده است (1، 5 و 15).

نیتروژن یک ماده مغذی ضروری برای رشد گیاهان است که با وجود فراوانی حضور آن در اتمسفر، گیاهان زراعی قادر به استفاده از آن در شکل عنصر نیتروژن نمی­باشند و باید آن­را از طریق خاک دریافت نمایند. با این حال، علاوه بر نامطلوب بودن استفاده از کودهای شیمیایی از نظر زیست­محیطی، در مزارع برنج کارایی استفاده از کودهای شیمیایی حاوی نیتروژن بدلیل کاهش مقدار آن از طریق روندهایی مانند آبشویی آمونیوم که خود تابعی از عواملی همچون دما و pH است، بسیار پایین می­باشد (18 و 22). بسیاری از گونه­های سیانوباکتریایی توانایی تثبیت نیتروژن را دارند، فرآیندی که در آن نیتروژن اتمسفر را جذب و توسط آنزیم نیتروژناز به آمونیوم تبدیل می­کنند. شناخته شده­ترین آنزیم نیتروژناز، نیتروژناز مولیبدون است که توسط ژن­های ساختاری nifHDK رمزگذاری می­شود و از دو جزء پروتئینی دی­نیتروژناز و دی­نیتروژناز ردوکتاز تشکیل شده است. دی­نیتروژناز یک تترامر با کوفاکتور مولیبدون-آهن (MoFe) است که زیرواحدهای آن توسط ژن­های nifD و nifK کد می­گردند. دی­نیتروژناز با اتصال به دی­نیتروژن اتمسفری، الکترون را به آن منتقل می­کند. دی­نیتروژناز ردوکتاز نیز شامل یک کوفاکتور آهن و متشکل از دو زیرواحد یکسان است که بوسیله ژن nifH کد می­شوند. این زیرواحد مسئول انتقال وابسته به ATP الکترون به تترامر دی­نیتروژناز است. این جزء پروتئینی دارنده بیشترین توالی اسیدهای آمینه حفظ شده در بین پروتئین­های نیتروژناز می­باشد و بنابراین، هنگام جستجوی وجود نیتروژناز در ارگانیسم­ها یا محیط­های مختلف، ژن nifH مناسب­ترین گزینه برای کاوش DNA خواهد بود (4 و 10).

حفظ باروری خاک با منابع تجدیدپذیر اصلی­ترین نیاز کشاورزی پایدار بمنظور کاهش مصرف کودهای شیمیایی است (26). در این راستا و در جهت استفاده از روش­های سازگار با محیط زیست و با توجه به اهمیت جستجو برای یافتن منابع طبیعی بالقوه جهت استفاده بعنوان کود زیستی، آزمایشاتی در پژوهشکده ژنتیک و زیست­فناوری کشاورزی طبرستان بر روی 15 نمونه­ی جداسازی شده از خاک­های شالیزاری استان گلستان انجام شد. این نمونه­ها ابتدا از نظر شاخص­های ریخت­شناختی بررسی و سپس بر اساس توالی ژن­های 16s RrNA و nifH شناسایی شدند (12، 13، 14 و 19). از میان آنها سیانوباکتری Aliinistoc sp. بر اساس آنالیزهای مرتبط با شاخص­های موثر بر عملکرد برنج، بعنوان کود زیستی بالقوه برای استفاده در مزارع برنج برگزیده شد (داده های چاپ نشده). مطالعه پیش رو بر روی این نمونه منتخب بعنوان کود زیستی سیانوباکتریایی بالقوه صورت گرفت. با توجه به اهمیت و کاربرد سه عنصر نیتروژن، فسفر و پتاسیم در کشاورزی، اطلاع از اثر این مواد بر روی رشد و متابولیسم سیانوباکتری­ها، برای کاربردهای کشاورزی و دستیابی به بهترین عملکرد حایز اهمیت است. به همین دلیل، مطالعه حاضر با هدف افزایش کارایی کود زیستی سیانوباکتریایی و بررسی تاثیر این عناصر در قالب کودهای اوره، سوپرفسفات و کلرید پتاسیم، بر روی فعالیت تثبیت نیتروژن، بیان ژن nifH و رشد نمونه منتخب، انجام گرفت.

 

مواد و روشها

شرایط رشد و تیمار: سیانوباکتری Aliinostoc sp.، بمنظور تشکیل هتروسیست­ها و فعال شدن روند تثبیت نیتروژن در محیط مایع BG110 (فاقد ترکیبات نیتروژن)، در دمای ۲۷ درجه سانتیگراد، شدت نور ۲۵۰۰ لوکس با دوره روشنایی- خاموشی 16/8 ساعت و جریان هوای ۲۰۰ میلی­لیتر در دقیقه رشد یافت. سلول­ها در فاز لگاریتمی رشد جمع­آوری شدند و برای تلقیح به محیط­های کشت جدید، مورد استفاده قرار گرفتند. کشت­های جدید بعد از یک هفته تحت تیمار مقادیر مختلف نیتروژن، فسفر و پتاسیم، بترتیب در قالب کود اوره (1، 10 و 100 میلی­گرم در لیتر) و کودهای سوپرفسفات و کلرید پتاسیم (هر کدام به مقدار 125، 250 و 500 میلی­گرم در لیتر) قرار گرفتند. در این مطالعه از کودهای تجاری استفاده شد و مقادیر مورد استفاده بر اساس مطالعات مختلف و میزان مورد استفاده رایج این کودها در مزارع برنج انتخاب شدند (3، 26، 28، 29، 31 و 37). آزمایش در سه تکرار انجام پذیرفت و مقایسه فعالیت تثبیت نیتروژن، بیان ژن nifH و میزان رشد بین نمونه­های تحت تیمار و شاهد (فاقد کود) در یک دوره ۶ روزه انجام گرفت.

اندازه­گیری فعالیت تثبیت نیتروژن: توان تثبیت نیتروژن مولکولی در ابتدا و انتهای دوره آزمایشی، با روش احیای استیلن (ARA) (Acetylene reduction assay) اندازه­گیری شد. در این روش میزان گاز اتیلن تولید شده از احیای استیلن بعنوان شاخصی برای تعیین مقدار فعالیت آنزیم نیتروژنازی به کار می­رود. 15 میلی­لیتر از کشت مایع سیانوباکتریایی در لوله­های درپوش­دار قرار داده شد، سپس 10 درصد از هوای درون لوله با حجمی برابر از گاز استیلن جایگزین گشت، لوله­ها در شرایط مشابه با شرایط کشت قرار گرفتند و پس از 2 ساعت، 5/0 میلی­لیتر از گاز داخل لوله به دستگاه کروماتوگرافی GOW-MAC series 816 تزریق شد. در پایان، بر اساس سطح زیر منحنی پیک­های بدست آمده، غلظت اتیلن پدید آمده از احیای استیلن، براساس منحنی­های استاندارد، بر حسب نانومول اتیلن بر میکروگرم کلروفیل در ساعت  (µg ch-1 h-1)برآورد گردید (34).

استخراج RNA: برداشت سلول­ها با سانتریفیوژ )۱۲۰۰۰ دور بر دقیقه و به مدت ۱۰ دقیقه(، پیش از اعمال تیمار و همچنین در روزهای 3 و ۶ انجام گرفت. برای استخراج RNA از کیت RNX-plus شرکت سیناژن استفاده شد. کیفیت RNAی استخراج شده، در ژل آگارز 1 درصد ارزیابی و غلظت نمونه­ها با دستگاه اسپکتروفتومترShimatsu UV 1800 بررسی گشت. سپس نمونه­های RNA با آنزیم DNase I, RNase-free شرکت Thermo Scientific تیمار شد و بعنوان الگوی واکنش RT-PCR مورد استفاده قرار گرفت. پس از یکسان­سازی غلظت نمونه­های RNA، cDNA مربوط به هر نمونه با استفاده از کیت سنتز cDNA شرکت Thermo Scientific به شماره کاتالوگ K1622 سنتز گشت. تمامی مراحل طبق دستورالعمل هر کیت انجام شد.

الگوی بیان ژن­: واکنش PCR در زمان واقعی با استفاده از دستگاه Bio-Rad CFX96 Touch™ Real-Time PCR و با کیت سایبرگرین SYBR Green qPCR Master Mix شرکت Thermo Scientific  طبق دستورالعمل پیشنهادی شرکت انجام شد. هر واکنش  PCRدر حجم 10 میکرولیتر شامل 5 میکرولیتر مخلوط سایبرگرین، 3/0 میکرو مولار از هر آغازگر رفت و برگشت، 100 نانوگرم cDNA الگو و آب عاری از نوکلئاز بود. واکنش زنجیره­ای پلیمراز شامل مرحله واسرشت­سازی اولیه به مدت 10 دقیقه در 95 درجه سانتی­گراد و سپس 40 چرخه (شامل 15 ثانیه در 95 درجه سانتی­گراد و 40 ثانیه در 52 درجه سانتی­گراد) بود. بمنظور استاندارد کردن داده­ها، نمونه­ها با ژن کنترل داخلی rnpB  (Ribonuclease P RNA, subunit B) نرمال گردیدند (توالی پرایمرهای مورد استفاده در جدول 1 آمده است). مقادیر بیان کمی ژن با مقایسه بین میزان بیان ژن در نمونه­ها و کنترل، با استفاده از روش 2-ΔΔCT محاسبه گردید (20). ژن nifH بطور متعارف بعنوان نشانگر در روند تثبیت نیتروژن مورد استفاده قرار می­گیرد.

اندازه­گیری غلظت کلروفیل: برای تعیین میزان رشد، از مقدار رنگدانه کلروفیل­a بعنوان شاخص رشد استفاده شد. میزان کلرفیل نمونه مورد بررسی، پیش از اعمال تیمار و همچنین در روزهای 2، 4 و 6 اندازه­گیری شد. برای این کار، ابتدا عصاره سلولی با استفاده از متانول خالص، بعد از 24 ساعت قرارگیری در دمای 4 درجه سانتیگراد، استخراج و سپس محتوای کلروفیل آنها با استفاده از طیف­سنجی در طول موج 665 نانومتر اندازه­گیری شد (39).

 

 

جدول 1- جفت آغازگرهای اختصاصی استفاده­شده برای ژن­های nifH و rnpB

ژن

5)′→ 3′توالی (

اندازه قطعه تکثیرشده (bp)

منبع

nifH

F: CCT ACG ACG TAT TGG GTG AC

170

Ermakova et al., 2013

 

R: TAA ACG TAC ACC ACC GGA GT

 

 

rnpB

F: TAG GGA GAG AGT AGG CGT TG

130

Pinto et al., 2012

 

R: TTC TGT GGC ACT ATC CTC AC

 

 
         

 

 

نتایج و بحث

در این مطالعه تاثیر مقادیر مختلف نیتروژن، فسفر و پتاسیم، بترتیب در قالب کودهای اوره، سوپرفسفات و کلرید پتاسیم که بطور متداول در مزارع برنج مورد استفاده قرار می­گیرند، روی میزان فعالیت نیتروژنازی، بیان ژن nifH و رشد در سیانوباکتری Aliinostoc sp.، بعنوان کاندیدی برای استفاده بعنوان کود زیستی، در یک دوره رشدی شش روزه مورد بررسی قرار گرفت.

فعالیت تثبیت نیتروژن: نیتروژن آمونیومی موجود در اوره، کاهش قابل ملاحظه‌ای در میزان فعالیت آنزیم نیتروژناز ایجاد نمود و مقایسه تولید گاز اتیلن حاصل از احیای استیلن بین ابتدا و انتهای دوره آزمایشی، نشان داد که غلظت­های ۱، ۱۰ و ۱۰۰ میلی­گرم در لیتر اوره، بترتیب موجب کاهش ۱۵، ۵۰ و ۱۰۰ درصدی در فعالیت نیتروژنازی نمونه مورد بررسی شدند (شکل 1، الف). فسفر نیز باعث کاهش روند تثبیت نیتروژن نمونه شد و اختلاف قابل توجهی در تاثیر غلظت­های مختلف آن وجود داشت. با وجود این­که در غلظت­های ۱۲۵ و ۲۵۰ میلی­گرم در لیتر سوپرفسفات، کاهش اندکی در میزان فعالیت نیتروژنازی رخ داد (بترتیب حدود ۶ و ۱۵ درصد)، در بالاترین غلظت مورد استفاده (۵۰۰ میلی­گرم در لیتر)، میزان فعالیت نیتروژنازی بشدت کاهش یافت و فعالیتی که توسط کروماتوگرافی گازی قابل ردیابی باشد، مشاهده نشد (شکل 1، ب). از طرف دیگر، پتاسیم با اختلاف معنی­داری نسبت به نمونه شاهد، در هر سه غلظت مورد استفاده، موجب افزایش فرآیند تثبیت نیتروژن در سیانوباکتری مورد بررسی شد. البته با افزایش آن، از مقدار این روند افزایشی کاسته شد و در حالی که در غلظت ۱۲۵ میلی­گرم در لیتر کلرید پتاسیم مقدار گاز اتیلن تولید شده بیش از ۸۰ درصد افزایش یافت، افزایش حدود ۲5 درصدی در غلظت ۵۰۰ میلی­گرم در لیتر مشاهده شد (شکل 1، ج).

الگوی بیان ژن­: در تمام تیمارهای مورد بررسی، نتایج Real-Time RT-PCR نشان داد که میزان نسبی بیان ژن nifH متناسب و تایید کننده الگوی فعالیت تثبیت نیتروژن آنها می­باشد. یون آمونیوم موجب کاهش بیان ژن nifH شد و این کاهش شدید از روز سوم قابل مشاهده بود.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1- فعالیت نیتروژنای سیانوباکتری Aliinostoc sp.، اندازه­گیری شده با روش احیای استیلن، تحت تیمار (الف) اوره (1، 10 و 100 میلی­گرم در لیتر)، (ب) سوپرفسفات (125، 250 و 500 میلی­گرم در لیتر) و (ج) کلرید پتاسیم (125، 250 و 500 میلی­گرم در لیتر). مقادیر، میانگین سه تکرار می­باشد. مقایسه میانگین­ها بر اساس آزمون LSD  و در سطح حداقل اختلاف معنی­دار پنج درصد انجام شده است.

 

 

این نتیجه بیانگر تاثیر زود هنگام منبع ازت مورد استفاده بر روی روند تثبیت نیتروژن می­باشد. با افزایش غلظت آن، روند کاهش بیان ژن شدت یافت و کاهش حدود ۴۰، ۶۰ و ۹۰ درصدی، بترتیب در غلظت­های ۱، ۱۰ و ۱۰۰ میلی­گرم در لیتر اوره مشاهده شد. در بیشترین مقدار مورد استفاده از این کود، با وجود اینکه فعالیت نیتروژنازی قابل ردیابی نبود، ژن nifH به مقدار کمی (حدود ۸ درصد) بیان شد (شکل 2، الف). فسفر نیز موجب کاهش بیان ژن nifH شد. در مقادیر ۱۲۵ و ۲۵۰ میلی­گرم در لیتر سوپرفسفات، کاهش بیان حدود ۳۰ و ۴۰ درصدی در طول دوره آزمایش اتفاق افتاد، اما بالاترین غلظت مورد استفاده از آن (500 میلی­گرم در لیتر)، با کاهش شدیدتر بیان ژن در روز سوم آزمایش همراه بود (حدود ۷۵ درصد) (شکل 2، ب).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2- الگوی بیانی ژن nifH در سیانوباکتری Aliinostoc sp.، اندازه­گیری شده بوسیله real-time RT-PCR، تحت تیمار (الف) اوره (1، 10 و 100 میلی­گرم در لیتر)، (ب) سوپرفسفات (125، 250 و 500 میلی­گرم در لیتر) و (ج) کلرید پتاسیم (125، 250 و 500 میلی­گرم در لیتر). مقادیر، میانگین سه تکرار می­باشد. مقایسه میانگین­ها بر اساس آزمون LSD  و در سطح حداقل اختلاف معنی­دار پنج درصد انجام شده است.

 

 

در تیمار پتاسیم، همانند شاهد، بیان ژن nifH افزایش یافت. افزایش غلظت مورد استفاده از آن موجب کاهش این اثر فزاینده شد، بطوریکه در حضور ۱۲۵ میلی­گرم در لیتر کلرید پتاسیم، بیان ژن nifH بیش از دو برابر افزایش یافت ولی این مقدار در غلظت 500 میلی­گرم در لیتر، به افزایش حدود ۵۰ درصدی کاهش پیدا کرد (شکل 2، ج).

الگوی رشد: در حالی­که نمونه شاهد از رشد تدریجی حدود ۱۰ درصدی در طول دوره آزمایشی برخوردار بود، نیتروژن آمونیومی در هر سه غلظت مورد استفاده، رشد نمونه مورد نظر را کاهش داد. این کاهش بطور یکنواخت در طول دوره آزمایشی اتفاق افتاد. برای نمونه، در غلظت ۱۰ میلی­گرم در لیتر اوره نسبت به زمان پیش از اعمال تیمار، کاهش رشد حدود ۵، ۱۳ و ۲۱ درصدی، بترتیب در روزهای ۲، ۴ و ۶ مشاهده شد. با افزایش غلظت نیتروژن، کاهش رشد شدیدتری اتفاق افتاد و در حالی­که در روز ۶، در مقایسه با روز نخست، در غلظت یک میلی­گرم در لیتر اوره کاهش رشد حدود ۱۰ درصدی مشاهده شد، رشد در حضور ۱۰۰ میلی­گرم در لیتر اوره تقریباً به نصف کاهش یافت (شکل 3، الف). فسفر در بالاترین غلظت مورد استفاده، کاهش شدیدی در رشد نمونه مورد نظر ایجاد نمود و در حالی­که اختلاف رشد ابتدا و انتهای دوره آزمایشی در تیمارهای ۱۲۵ و ۲۵۰ میلی­گرم در لیتر سوپرفسفات، بترتیب حدود ۲۰ و ۳۰ درصد بود، در حضور ۵۰۰ میلی­گرم در لیتر از این کود، کاهش رشد حدود ۸۰ درصدی مشاهده شد (شکل 3، ب). برخلاف نیتروژن و فسفر، پتاسیم اثر افزایشی بر روی رشد سیانوباکتری مورد مطالعه داشت. کمترین غلظت آن، موجب بیشترین رشد در نمونه مورد نظر شد و با افزایش غلظت، افزایش رشد کمتری اتفاق افتاد (افزایش رشد حدود ۵۰ درصدی در حضور ۱۲۵ میلی­گرم در لیتر، در مقایسه با افزایش حدود 20 درصدی در حضور ۵۰۰ میلی­گرم در لیتر کلرید پتاسیم) (شکل 3، ج).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3- غلظت کلرفیل a در سیانوباکتر Aliinostoc sp.، تحت تیمار (الف) اوره (1، 10 و 100 میلی­گرم در لیتر)، (ب) سوپرفسفات (125، 250 و 500 میلی­گرم در لیتر) و (ج) کلرید پتاسیم (125، 250 و 500 میلی­گرم در لیتر). مقادیر، میانگین سه تکرار می­باشد. مقایسه میانگین­ها بر اساس آزمون LSD  و در سطح حداقل اختلاف معنی­دار پنج درصد انجام شده است.

 

 

سیانوباکتری­ها می­توانند منابع مختلف نیتروژن مانند نیترات، آمونیوم، اوره و دی­نیتروژن اتمسفری را مورد استفاده قرار دهند. سیانوباکتری­ها نیتروژن اتمسفری را تنها در شرایط کمبود نیتروژن تثبیت می­کنند و در حضور منابع خارجی نیتروژن، آنزیم نیتروژناز مهار خواهد شد (18 و 36). در این مطالعه، در مجموع فعالیت تثبیت نیتروژن و رشد سیانوباکتری Aliinostoc sp. درحضور منبع نیتروژن کاهش یافت. کاهش تدریجی رشد از ابتدای دوره آزمایشی آغاز شد و با افزایش غلظت نیتروژن، کاهش رشد بیشتری اتفاق افتاد. کاهش رشد سیانوباکتری­ها در حضور منابع خارجی نیتروژن در مطالعات مختلف گزارش شده است، برای نمونه کبیر و ال­شهاوی (2012) که اثر آمونیوم و نیترات را روی رشد و تثبیت نیتروژن سویه­های مختلف Nodularia spumigena بررسی کردند، کاهش رشد برخی از سویه­های مورد آزمایش را از روز سوم مشاهده نمودند. همچنین در مطالعه­ی دیگری روی نمونه­ی مشابه، کاهش رشد در حضور آمونیوم، از روز ششم گزارش شد (36).

فعالیت تثبیت نیتروژن نیز بشدت تحت تاثیر نیتروژن قرار گرفت. با افزایش مقدار آن کاهش شدیدی در روند تثبیت نیتروژن مشاهده شد، بطوریکه در غلظت ۱۰۰ میلی­گرم در لیتر کود اوره، فعالیت نیتروژنازی قابل مشاهده نبود. متناسب با این نتیجه، بیان ژن nifH نیز در حضور نیتروژن، از روز سوم آزمایش بشدت کاهش یافت. مطالعات مختلفی با این نتایج مطابقت دارد. کبیر و ال­شهاوی (2012) و وینتیال و ال­شهاوی (2007)، کاهش شدید فعالیت نیتروژنازی و بیان ژن nifH سیانوباکتری Nodularia spumigena را در حضور مقادیر مختلف آمونیوم مشاهده نمودند. همچنین تاثیر منفی آمونیوم بر روی بیان ژن nifH و فعالیت تثبیت نیتروژن در سیانوباکتریTrichodesmium erythraeum نیز گزارش شده است (7). مهار فعالیت تثبیت نیتروژن در حضور منابع خارجی نیتروژن در جنس­های Anabaena و Nostoc نیز در مطالعات گوناگون مشاهده شده است (6، 16 و 23).

فسفر، عنصر مورد نیاز برای رشد نرمال سیانوباکتری­ها و دارای نقشی مهم در بسیاری از مراحل سنتز سلولی و انتقال انرژی آنها می‌باشد (2). همچنین فسفر برای تثبیت بیولوژیکی نیتروژن در سیانوباکتری­ها ضروری است و محدودیت آن موجب کاهش شدید فتوسنتز اکسیژنی، کاهش فعالیت نیتروژناز و سایر آنزیم­های فعال مرتبط با متابولیسم نیتروژن می­شود (38). نتایج گوناگونی در مورد اثر فسفر بر روی رشد سیانوباکتری­ها، با توجه به مقدار فسفر و نمونه­ی مورد مطالعه، گزارش شده است. مصرف مقادیر کم فسفر می‌تواند افزایش رشد سیانوباکتری­ها را به دنبال داشته باشد، برای نمونه افزودن ۳ میلی­گرم برلیتر فسفر موجب رشد جنس­هایAnabaena  و Oscillatoria شد (31). در سیانوباکترهای Anabaena variabilis و Westiellopsis prolifica نیز افزایش رشد در حضور ۳۰ میلی­گرم فسفر صورت پذیرفت (38). همچنین در مطالعه­ای که بمنظور بررسی اثر فسفر (2/0 میلی­مول)، آهن (2 نانومول) و نیتروژن (۱ میلی­مول) بر روی سیانوباکترهای تک­سلولی و رشته­ای تثبیت کننده نیتروژن در اقیانوس اطلس شمالی صورت گرفت، بیشترین مقدار رشد زمانی اتفاق افتاد که فسفر و نیتروژن بطور همزمان به محیط اضافه شدند. علاوه بر این افزودن فسفر به تنهایی، بر روی نرخ تثبیت نیتروژن بی­اثر بود و افزایش فعالیت تثبیت نیتروژن و بیان ژن nifH تنها زمانی اتفاق افتاد که فسفر به همراه آهن مورد استفاده قرار گرفت (24).

از طرف دیگر حضور غلظت­های بالای فسفر می‌تواند موجب کاهش رشد سیانوباکتری­ها شود. در این راستا مطالعه­ی بررسی غلظت­های مختلف فسفات و نیترات بر روی دو سویه از سیانوباکتری Synechococcus sp. قابل ذکر است که غلظت پایین فسفات (3/0 میلی­گرم در لیتر) تاثیری بر روی رشد نداشت و غلظت بالای آن (۲۰۰ میلی­گرم در لیتر) موجب تأخیر و کاهش رشد در هر دو سویه مورد مطالعه شد (9). در مطالعه­ی حاضر نیز فسفر اثر منفی بر روی رشد و فعالیت تثبیت نیتروژن نمونه­ی مورد بررسی داشت، بطوری­که در حضور ۵۰۰ میلی­گرم در لیتر سوپرفسفات، کاهش رشد از ابتدای دوره آزمایش کاملاً مشهود بود، اما در حضور مقادیر کمتر فسفر، کاهش رشد به مقدار کمتر و بصورت تدریجی اتفاق افتاد. فسفر روند تثبیت نیتروژن و بیان ژن nifH را نیز در سیانوباکتری Aliinostoc sp.  کاهش داد. در حالی­که در غلظت‌های کمتر سوپرفسفات (۱۲۵ و ۲۵۰ میلی­گرم در لیتر) فرآیند تثبیت نیتروژن و بیان ژن nifH متناسب با آن، روند کاهشی اندک و تدریجی داشت، در غلظت بالای آن (۵۰۰ میلی­گرم در لیتر) مهار کامل فعالیت نیتروژنازی صورت پذیرفت.

پتاسیم دارای نقش­های حیاتی در رشد و متابولیسم سیانوباکتری­هاست. علاوه بر نقش آن بر pH درون سلولی و آماس سلولی، پتاسیم بر روی روند فتوسنتز و تثبیت نیتروژن سیانوباکتری­ها نیز موثر است. پاسخ سیانوباکتری­ها به حضور مقادیر مختلف پتاسیم متفاوت است. در مطالعه‌ای بر روی سیانوباکتری Anabaena torulosa، حذف پتاسیم از محیط کشت موجب اختلالات متابولیکی متعدد شد، بطوریکه کاهش رشد، کم شدن محتوای رنگدانه­های فتوسنتزی و مهار فعالیت نیتروژنازی از پیامدهای فقدان پتاسیم در این سیانوباکتری هتروسیست­دار بود. حال آنکه، تیمار این نمونه با ۲۰۰ میلی­گرم در لیتر پتاسیم (بصورت کلرید پتاسیم) در محیط BG11 موجب افزایش رشد آن شد (3 و 30). از طرف دیگر افزودن پتاسیم به محیط Microcystis sp. موجب کاهش رشد آن گشت، اما میزان تحمل سویه­های مختلف آن به مقدار پتاسیم بسیار متفاوت بود. در حالی­که در مطالعه‌ای افزودن حدود ۲۰۰ میلی­گرم در لیتر پتاسیم موجب کاهش شدید رشد این سیانوباکتری شد (32)، در مطالعه­ی دیگر افزایش پتاسیم تا ۵۰۰ میلی­گرم در لیتر تاثیری بر روی برخی از سویه­ها نداشت (30). حتی سویه­هایی از این جنس گزارش شده‌اند که می‌توانند رشد زیادی در غلظت نمکی ۱۰ گرم در لیتر داشته باشند (35). در مطالعه­ی حاضر پتاسیم موجب افزایش رشد و فعالیت تثبیت نیتروژن در نمونه مورد بررسی شد. البته این روند حالت کاهشی داشت و با افزایش مقدار پتاسیم، از میزان اثر افزایشی آن کاسته شد. بیشترین افزایش در رشد، در کمترین مقدار مورد استفاده (۱۲۵ میلی­گرم در لیتر کلرید پتاسیم) اتفاق افتاد که مقدار کلروفیل آن در انتهای دوره آزمایشی در مقایسه با ابتدای دوره، تقریباً ۵۰ درصد افزایش یافته بود. این افزایش در تیمار ۵۰۰ میلی­گرم در لیتر کلرید پتاسیم، حدود 20 درصد بود. بیشترین مقدار گاز اتیلن تولید شده ناشی از فعالیت نیتروژناز ردوکتاز نیز در کمترین مقدار پتاسیم مورد استفاده بدست آمد، بیش از 80  درصد افزایش در مقایسه با حدود 25 درصد افزایش در حضور ۵۰۰ میلی­گرم در لیتر کلرید پتاسیم. در همین راستا بیان ژن nifH نیز افزایش قابل ملاحظه­ای در حضور ۱۲۵ میلی­گرم در لیتر کلرید پتاسیم نشان داد و مقدار آن در روز ۶ تقریباً دو برابر شد.

نتایج کلی این مطالعه نشان دهنده تاثیر قابل ملاحضه عناصر مختلف بر رشد و روند تثبیت نیتروژن سیانوباکتری­هاست. بطوریکه منبع ازته اوره، حتی در مقادیر کم، ‌توانست موجب کاهش شدید روند تثبیت نیتروژن گردد (کاهش ۵۰ درصدی و توقف فعالیت نیتروژنازی بترتیب در ۱۰ و ۱۰۰ میلی­گرم در لیتر اوره در این مطالعه). در مصرف منابع حاوی فسفر و پتاسیم هم باید توجه لازم صورت گیرد، چراکه سوپرفسفات، متناسب با غلظت مورد استفاده، می­تواند موجب اثر بازدارندگی محدود و یا گسترده بر رشد و روند تثبیت نیتروژن سیانوباکتری­ها شود (مشاهده ۲۰ تا ۸۰ درصد کاهش رشد در حضور مقادیر ۱۲۵ تا ۵۰۰ میلی­گرم در لیتر سوپرفسفات در این مطالعه). علاوه بر این، با وجود اینکه استفاده از کلرید پتاسیم تا ۵۰۰ میلی­گرم در لیتر موجب افزایش معنی­دار رشد و روند تثبیت نیتروژن در مطالعه حاضر شد، بدلیل روند کاهشی این اثر مهیج با افزایش مقدار این منبع پتاسه، استفاده از غلظت­های بیشتر مطلوب نخواهد بود. هر چند، انجام مطالعات بیشتر جهت بررسی اثرات متقابل احتمالی استفاده هم­زمان چندین کود مختلف بر روی سیانوباکتری­ها و همچنین مطالعه اثر آنها بر سایر مسیرهای مهم متابولیسمی، بمنظور دستیابی به مقادیر کودی مناسبی که بتواند با کمترین تأثیر نامطلوب بر کود سیانوباکتریایی و محیط، موجب دستیابی به بهترین عملکرد ممکن شود، ضروری بنظر می‌رسد.

1- سعادت نیا، ه. ریاحی، ح. فخاری، ج. 1389. استفاده از جلبک­های سبز-آبی جداشده از یک شالیزار در استان گیلان بعنوان کود زیستی در گیاه برنج (oryza sativa). مجله زیست­شناسی ایران، 23(6): 816-824.
2- نوروزی، ب. احمدی‌مقدم، ع. 1386. گزارش جدیدی از روابط بین ماکروالمانهای خاک و پراکنش سیانوباکتری­های هتروسیست­دار در شالیزار، گندم زار و جنگل استان گلستان. مجله زیست­شناسی ایران، 20(1): 89-98.
 
3-Alahari, A. and Apte, S.K. 1998. Pleiotropic effects of potassium deficiency in a heterocystous, nitrogen-fixing cyanobacterium, Anabaena torulosa, Microbiology. 144: 1557-1563.
5-Chittora, D., Meena, M., Barupal, T., Swapnil, P. and Sharma, K. 2020. Cyanobacteria as a source of biofertilizers for sustainable agriculture. Biochemistry and biophysics reports, 22: 100737.
6-Dittmann, E., Wiegand, C. 2006. Cyanobacterial toxins–occurrence, biosynthesis and impact on human affairs. Molecular Nutrition & Food Research, 50: 7–17.
7-El-Shehawy, R., Lugomela, C., Ernst, A. and Bergman, B. 2003. Diurnal expression of hetR and diazocyte development in the filamentous non-heterocystous cyanobacterium Trichodesmium erythraeum. Microbiology, 149: 1139-1146.
8-Ermakova, M., Battchikova, N., Allahverdiyeva, Y. and Aro, E.M. 2013. Novel heterocyst‐specific flavodiiron proteins in Anabaena sp. PCC 7120. FEBS letters, 587: 82-87.
9-Ernst, A., Deicher, M., Herman, P.M. and Wollenzien, U.I. 2005. Nitrate and phosphate affect cultivability of cyanobacteria from environments with low nutrient levels. Applied and Environmental Microbiology, 71: 3379-3383.
10-Flores, E. and Herrero, A. 2005. Nitrogen assimilation and nitrogen control in cyanobacteria. Biochemical Society Transactions, 33: 164-167
11-Gonçalves, A.L. 2021. The use of microalgae and cyanobacteria in the improvement of agricultural practices: a review on their biofertilising, biostimulating and biopesticide roles. Applied Sciences. 11(2): 871.
12-Green, S.J., Blackford, C., Bucki, P., Jahnke, L.L. and Prufert-Bebout, L. 2008. A salinity and sulfate manipulation of hypersaline microbial mats reveals stasis in the cyanobacterial community structure. The International Society for Microbial Ecology journal, 2(5): 457-470.
13-Gugger, M., Lyra, C., Henriksen, P., Coute, A., Humbert, J.F. and Sivonen, K. 2002. Phylogenetic comparison of the cyanobacterial genera Anabaena and Aphanizomenon. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52(5): 1867-1880.
14-Gugger, M., Molica, R., Le Berre, B., Dufour, P., Bernard, C. and Humbert, J.F. 2005. Genetic diversity of Cylindrospermopsis strains (Cyanobacteria) isolated from four continents. Applied and Environmental Microbiology, 71(2): 1097-1100.
15-Hashtroudi, M.S., Ghassempour, A., Riahi, H., Shariatmadari, Z. and Khanjir, M. 2013. Endogenous auxins in plant growth-promoting Cyanobacteria—Anabaena vaginicola and Nostoc calcicola. Journal of applied phycology, 25: 379-386.
16-Herrero A., Muro-Pastor A., Flores E. 2001. Nitrogen control in cyanobacteria. Journal of Bacteriology, 183: 411–425.
17-Kabir, A.H. and El-Shehawy, R. 2012. Expression of nifH, hetR, and ndaF genes in Nodularia spumigena under nitrogen sources. Plant Biosystems, 146: 992-1000.

18-Kaushik, B.D., 2014. Developments in cyanobacterial biofertilizer. Proceedings of the Indian National Science Academy, 80: 379-388.

19-Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J. and Johansen, J.R. 2014. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera), using a polyphasic approach. Preslia, 86(4): 295-335.
20-Livak, K.J. and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2− ΔΔCT method. Methods, 25(4): 402-408.
22-Mandal, B., Vlek, P.L.G. and Mandal, L.N. 1999. Beneficial effects of blue-green algae and Azolla, excluding supplying nitrogen, on wetland rice fields: a review. Biology and Fertility of Soils, 28: 329-342.
23-Meeks, JC., Elhai J. 2002. Regulation of cellular differentiation in filamentous cyanobacteria in free-living and plant-associated symbiotic growth states. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66: 94–121.
24-Mills, M.M., Ridame, C., Davey, M., La Roche, J. and Geider, R.J. 2004. Iron and phosphorus co-limit nitrogen fixation in the eastern tropical North Atlantic. Nature, 429: 292-296.
25-Mulligan, M.E. and Haselkorn, R., 1989. Nitrogen fixation (nif) genes of the cyanobacterium Anabaena species strain PCC 7120. The nifB-fdxN-nifS-nifU operon. Journal of Biological Chemistry, 264: 19200-19207.
26-Pathak, J., Maurya, P.K., Singh, S.P., Häder, D.P. and Sinha, R.P. 2018. Cyanobacterial farming for environment friendly sustainable agriculture practices: innovations and perspectives. Frontiers in Environmental Science, 6 (7).
27-Pimentel, J.S. and Giani, A. 2014. Microcystin production and regulation under nutrient stress conditions in toxic Microcystis strains. Applied and environmental microbiology, 80(18): 5836-5843.
28-Pinto, F., Pacheco, C.C., Ferreira, D., Moradas-Ferreira, P. and Tamagnini, P. 2012. Selection of suitable reference genes for RT-qPCR analyses in cyanobacteria. PloS one, 7(4): e34983.
29-Repka, S., Koivula, M., Harjunpä, V., Rouhiainen, L. and Sivonen, K. 2004. Effects of phosphate and light on growth of and bioactive peptide production by the cyanobacterium Anabaena strain 90 and its anabaenopeptilide mutant. Applied and environmental microbiology, 70(8): 4551-4560.
30-Sandrini, G., Huisman, J. and Matthijs, H.C. 2015. Potassium sensitivity differs among strains of the harmful cyanobacterium Microcystis and correlates with the presence of salt tolerance genes. FEMS microbiology letters, 362: 121-128.
31-Seale, D.B., Boraas, M.E. and Warren, G.J. 1987. Effects of sodium and phosphate on growth of cyanobacteria. Water research, 21: 625-631.
32-Shukla, B., and Rai, L.C. 2007. Potassium-induced inhibition of nitrogen and phosphorus metabolism as a strategy of controlling Microcystis blooms. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 23: 317-322.
33-Singh, J.S., Kumar, A., Rai, A.N. and Singh, D.P. 2016. Cyanobacteria: a precious bio-resource in agriculture, ecosystem, and environmental sustainability. Frontiers in microbiology, 7: 529.
34-Soltani, N., Khavari-Nejad, R.A., Yazdi, M.T., Shokravi, S. and Fernández-Valiente, E. 2006. Variation of nitrogenase activity, photosynthesis and pigmentation of the cyanobacterium Fischerella ambigua strain FS18 under different irradiance and pH values. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22: 571-576.  
35-Tonk, L., Bosch, K., Visser, P.M. and Huisman, J. 2007. Salt tolerance of the harmful cyanobacterium Microcystis aeruginosa. Aquatic Microbial Ecology, 46: 117-123.
36-Vintila, S. and El-Shehawy, R. 2007. Ammonium ions inhibit nitrogen fixation but do not affect heterocyst frequency in the bloom-forming cyanobacterium Nodularia spumigena strain AV1. Microbiology, 153: 3704-3712.
37-Vonshak, A. 1986. Laboratory techniques for the cultivation of microalgae. In Handbook of Microalgal Mass Culture, ed. Richmond A. (pp. 117–147). Florida: CRC Press.
38-Yandigeri, M.S., Yadav, A.K., Meena, K.K. and Pabbi, S. 2010. Effect of mineral phosphates on growth and nitrogen fixation of diazotrophic cyanobacteria Anabaena variabilis and Westiellopsis prolifica. Antonie van Leeuwenhoek, 97: 297-306.
39-Zavřel, T., Sinetova, M.A. and Červený, J. 2015. Measurement of chlorophyll a and carotenoids concentration in cyanobacteria. Journal of Biotechnology, 5: 9.
40-Zutshi, S. and Fatma, T. 2015. Cyanobacteria. In The Algae World (pp. 57-89). Springer, Dordrecht.
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 36, Issue 1
Winter 2023
Pages 78-97

  • Receive Date 21 December 2020
  • Revise Date 11 September 2021
  • Accept Date 31 January 2022