استخراج و شناسایی یک پپتید فعال زیستی جدید حاصل از هیدرولیزات کرم سفید ریشه

عسل خواجه پور زاوه¹، احمد آسوده^2* و حسین نادری منش^1*

¹ ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیست شناسی، گروه بیوفیزیک

² ایران، مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه شیمی

تاریخ دریافت: 15/05/1398          تاریخ پذیرش: 01/07/1398

چکیده

امروزه، پپتیدهای فعال زیستی به دلیل گسترش فراوان، سنتز آسان ، نداشتن عواض جانبی و انباشته نشدن در کلیه‏ها و کبد به عنوان جایگزین مناسب برای داروهای شیمیایی مطرح هستند. حشرات با داشتن تنوع بالا و موفقیت در تمامی زیستگاهها منبع خوبی برای استخراج پپتید های فعال زیستی هستند. این مطالعه با هدف استخراج و خالص سازی پپتید فعال زیستی از هیدرولیزات کرم سفید ریشه انجام شد. پپتیدهای فعال زیستی حاصل از هیدرولیزات کرم سفید ریشه با استفاده از آنزیمهای پاپایین ، پانکراتین ، پروتئیناز K-و تریپسین تولید شدند. نتایج به دست آمده نشان داد که هیدرولیزات پاپاپین در زمان 4 ساعت دارای بیشترین توانایی در حذف رادیکالهای  DPPH است (21 درصد). این هیدرولیزات توسط فاز معکوس کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا جداسازی شدند. فرکشن دارای بیشترین فعالیت آنتی اکسیدانی جداسازی و توسط طیف سنجی جرمی با توالی پپتیدیYPQSLRWRAK  (6/1304 دالتون با نام Po-1)  شناسایی شد. فعالیت حذف رادیکالهای DPPH پپتید سنتتیک در 100 میکرومولار به مقدار 41/54  درصد رسید و مقدار IC₅₀ پپتید در حذف رادیکالهای DPPH، 45/76 میکرومولاربود در حالی که ترکیبات طبیعی ویتامینC و گلوتاتیون احیاء شده دارای مقادیر IC₅₀ به ترتیب برابر با 27/3 و 96/9 میکرومولار بودند. نتایج نشان می­دهد که پپتید فعال زیستی Po-1 دارای خاصیت آنتی اکسیدانی است که می­تواند به عنوان ترکیب طبیعی در طراحی دارو در آینده استفاده شود.

واژه های کلیدی: کرم سفید ریشه؛ پپتید؛ کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

* نویسندگان مسئول، تلفن؛ 38805525 51 98+ ، پست الکترونیکی: naderman@modares.ac.ir ، Asoodeh@um.ac.ir

مقدمه

حشرات اهمیت بسیار زیادی در زندگی انسان‌ها دارند. بشر از بدو خلقت دارای رابطه‌ کاملاً نزدیکی با این موجودات بوده است و از بسیاری جهات نیز زندگی سایر موجودات از جمله انسان‌ها به این جانداران کوچک وابسته است. در واقع حشرات موفق ترین گروه از حیوانات روی کره زمین هستند که دارای اهمیت اقتصادی نیز می‏باشند(6). حشرات در هر منطقه از جهان زندگی می­کنند. آنها می­توانند در هر نوع آب و هوایی، از جنگلهای بارانی گرمسیری تا مناطق قطبی یخی، تا زمانی که بتوانند غذا پیدا کنند، زنده بمانند(9). اقیانوسها، تنها مکانهایی هستند که حشرات کمی در آن جا زندگی می­کنند. از آنجا که این موجودات بسیار کوچک هستند، می­توانند در مناطقی زندگی کنند که سایر حیوانات نمی­توانند زنده بمانند، آنها حتی در غارهای زیرزمینی زندگی می­کنند. قاب‌بالان یا سخت‌بالپوشان یا سوسکها متنوع ترین راسته از حشرات هستند(19). سرگین چرخان با 27800 گونه یکی از سمی­ترین و خطرناک ترین آفتهای گیاهان، درختان جنگلی و گیاهان زینتی می­باشد(20). امروزه استفاده گسترده‌ای از حشرات می‌‌شود به طوری که برای تولید مواد دارویی، رنگ، مواد خوراکی و غیره از آنها بهره می‌برند. حشرات با توجه به تنوع زیاد در طبیعت به عنوان یک گروه پیشگام برای جداسازی و شناسایی ترکیبات فعال زیستی در نظر گرفته می­شوند(19).

رادیکالهای آزاد معلول واکنشهای شیمیایی در بدن هستند در بروز بسیاری از ناهنجاریها ازجمله اختلالات عصبی و سرطان نقش دارند. آنتی‏اکسیدانها ترکیباتی هستند که هم در داخل و هم در خارج سلولها یافت می‏شوند و توانایی واکنش با رادیکالهای آزاد و گونه‏های فعال اکسیژن را دارند که در نهایت سبب کاهش و یا جلوگیری از استرس اکسیداتیو می‏شوند. این ترکیبات هم در داخل بدن سنتز می‏شوند و هم از طریق رژیم غذایی قابل دریافت می‏باشند(16 و 17).

 پپتیدهای فعال زیستی به عنوان مولکولهایی با فعالیت شبه هورمونی یا شبه دارویی شناخته می­شوند که در نهایت اعمال فیزیولوژیک را از طریق واکنش با گیرنده­های خاص روی سلولهای هدف تنظیم کرده و منجر به القای پاسخهای فیزیولوژیک می­گردند. این پپتیدها در سلول به صورت پری-پرو پپتیدهای بزرگ سنتز شده و سپس به صورت محصولات فعال برش خورده و تغییر پیدا می­کنند (22). در سالهای اخیر، استفاده از پپتیدها جهت درمان انواع بیماریها بسیار توسعه یافته است. پپتیدهای درمانی دارای چندین مزیت نسبت به پروتئینها و آنتی بادیها می‏باشند. از جمله مهم‏ترین مزیت پپتیدها می‏توان به اندازه کوچکتر آنها، سنتز راحت تر و توانایی نفوذ آنها در غشای سلولی را نام برد. همچنین پپتیدها، دارای تنوع بیولوژیکی و شیمیایی می‏باشند(13). مزیت دیگر استفاده از پپتیدها به عنوان عوامل درمانی این است که آنها در اندامهای خاص مانند کبد و کلیه انباشته نمی‏شوند که این امر منجر به کاهش عوارض جانبی سمی آنها می‏شود. پپتیدها همچنین به راحتی سنتز و تغییر می‏یابند و نسبت به آنتی بادیهای نوترکیب و پروتئینها، ایمنی زایی کمتری ایجاد می‏کنند. پپتید‏های درمانی پتاسیل بسیار بالایی برای درمان بیماریها دارند (2، 13 و 14). امروزه حشرات به دلیل تنوع زیاد می­توانند منبع بسیار مفیدی برای تهیه ترکیبات فعال از منابع طبیعی باشند. پپتیدهای طبیعی کمی از هیدرولیزات حشرات گزارش شده است که تنها می­توان به پپتیدهای حاصل  از هیدولیزات حشرات خوراکی نظیر کرم ابریشم(Bombyx mori) (12) Spodoptera littoralis (23)، Zophobas morio (27) ملخ (Blaptica dubia) (27) اشاره کرد.  با توجه به مطالعات انجام شده تاکنون گزارشی در رابطه با پپتیدهای فعال زیستی حاصل از هیدرولیزات کرم سفید ریشه صورت نگرفته است. بنابراین، هدف از مطالعه حاضر، خالص سازی و شناسایی پپتید فعال زیستی جدید با خاصیت آنتی اکسیدانی از هیدرولیزات کرم سفید با استفاده از کروماتوگرافی با کارایی بالاو طیف سنج جرمی بوده است.

مواد و روشها

ترکیبات و مواد شیمیایی: لاروهای تازه کرم سفید ریشه (Polyphylla adspersa) از منطقه­ای در تربت حیدریه ، (استان خراسان رضوی ، ایران) جمع آوری شد. تریپسین ، پانکراتین (از لوزالمعده گاو ، نوع2)، پاپایین (از شیره پنجه پا) و پروتئیناز K- از سیگما (سنت لوئیس ، مونیا ، ایالات متحده) خریداری شد. غشای اولترافیلتراسیون با محدودیت وزن مولکولی 3 کیلو دالتونی از Millipore تهیه شد( بردفورد ، ایالات متحده). 1،1-دی فنیل-2-پیکریل-هیدرازیل (DPPH)و تری فلوئور استیک اسید (TFA) از شرکت مرک(آلمان) تهیه شد.

تهیه عصاره: پنجاه لارو بالغ P. adspersa جمع آوری و هویت لاروها در آزمایشگاه بیوکنترل و آسیب شناسی حشرات (دانشگاه فردوسی مشهد) تأیید شد. پس از انجماد لاروها توسط نیتروژن مایع، نمونه­ها توسط هاون چینی در 20 میلی لیتر بافر فسفات (pH 7) خرد شدند. عصاره حاصل به مدت 20 دقیقه در 10،000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سولفات آمونیوم (85 درصد) به ماده رویی اضافه شد. پس از 8 ساعت ، با استفاده از20 میلی لیتر بافر فسفات (pH 7) دیالیز شدند و در نهایت برای تجزیه و تحلیلهای بعدی لیوفیلیزه شدند.

تهیه هیدرولیز کرم سفید: عصاره پروتئینهای کرم سفید ریشه با استفاده از آنزیمهای مختلف پاپایین، پانکراتین، پروتئیناز K-و تریپسین هیدرولیز شد. 100 میلی گرم عصاره در 5 میلی لیتر از بافر فسفات20 میلی مولار(pH 7)  حاوی CaCl₂  یک میلی مولار، حل شد. 7/6 میلی گرم پروتئاز به محلول عصاره اضافه شد و در دمای 37 درجه سانتی گراد و در زمانهای مختلف هیدرولیز شد (0 ، 5/0، 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 و 7 ساعت). برای غیرفعال کردن آنزیمها ، هیدرولیزات به مدت 15 دقیقه جوشانده شدند و سپس هریک از آنها به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ گردیدند و محلول رویی آن جمع آوری شد سپس از غشای آمیکون با محدودیت وزن مولکولی 3 کیلو دالتون ( لوییس، ایالات متحده) عبور داده شدند. محلول تصفیه شده متشکل از پپتیدهایی با وزن مولکولی پایین تر از 3 کیلو دالتون بود که لیوفیلیزه و برای مراحل بعدی مورد استفاده قرار گرفت.

الکتروفورز: به منظور بررسی هیدرولیزات از روش تریسین SDS-PAGE –استفاده شد (21). این ژل شامل ژل متراکم 5 درصد (w/v) و ژل جداکننده 5/12 درصد (w/v) بود. هر نمونه با 20 میکروگرم پروتئین آماده شد. نمونه ها با بافر نمونه به نسبت 1: 4 ، v/v  (بیو-راد ، کالیفرنیا ، ایالات متحده) مخلوط شدند و در دمای 100 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه قبل از انجام الکتروفورز جوشانده شدند. الکتروفورز برای ژل متراکم در 80 ولت (5/0 ساعت) و برای ژل جداکننده در120 ولت (5 ساعت) اجرا شد. ژلها با کوماسی برلیانت بلو و نیترات نقره رنگ آمیزی شدند. دو نشانگر وزن مولکولی به عنوان استاندارد در محدوده 135-6/2 کیلو دالتون استفاده شد.

کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس: در ابتدا ، 78 میلی گرم از هیدرولیزات پاپاپین فیلتر شده توسط غشاء با محدودیت وزن مولکولی 3 کیلو دالتون در 3 میلی لیتر حلال A (1/0درصد TFA  در آب مقطر) حل شد، 1 میلی لیتر از نمونه به ستون آنالیتیکال C₁₈ دستگاه کروماتوگرافی فاز معکوس (شرکت Knauer آلمان با Smart line manager 5000 Model E4320V2، پمپ مدل EA4800 و ردیاب UV2500 Model E4310 )تزریق شد. فازهای متحرک شامل حلال A (1/0درصد TFA در آب مقطر) و B (098/0درصد TFAدر استونیتریل) بودند. برای تفکیک سازی، شیب خطی 55-5 درصد حلال B با سرعت جریان ml/min2 برای مدت 60 دقیقه استفاده شد. جذب پیکها در طول موج nm214 اندازه‌گیری شد. پیکهای مهم جمع‌آوری و توسط دستگاه فریز درایر مدل Ilshin Korea خشک گردیدند.

شناسایی و سنتز پپتید: تعیین توالی De Novo پپتیدهای یک پیک اصلی حاصل از کروماتوگرافی توسط دستگاه اسپکتروسکوپی جرمی (MALDI-TOF) در مؤسسه بین المللی پروتئومیکس (Pty Ltd)  واقع در غرب استرالیا انجام شد. سپس توالی شناسایی شده پپتید مورد نظر به منظور سنتز به مؤسسه Gl Biochem واقع در شهر شانگهای چین فرستاده شد. توالی پپتید شناسایی شده با توالیهای گزارش شده موجود در پایگاه داده مقایسه گردید.

سنجش فعالیت پپتید در حذف رادیکالهای DPPH : DPPH به عنوان یک ترکیب شیمیایی به منظور تعیین میزان رادیکالهای آزاد انواع مختلف سیستمها معرفی می‏شود. DPPH، ترکیبی پودری و دارای رنگ تیره (بنفش مایل به سیاه) با وزن مولکولی 32/394 گرم در مول است و در دمای اتاق دارای پایداری خوبی است. این ترکیب با گرفتن یک اتم هیدروژن یا به طور کلی یک الکترون به پایداری بیشتری می‏رسد. DPPH، پس از حل شدن در اتانول به شکل رادیکالی خود در می‏آید و در طول موج 517 نانومتر دارای بیشترین جذب است (11). این رادیکال تولید شده پس از واکنش با ترکیبی که دارای فعالیت آنتی‏اکسیدانی است حذف شده و جذب آن در طول موج 517 نانومتر کاهش می‏یابد. به منظور بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی در حذف رادیکالهای DPPH از روش Göçer و همکاران استفاده گردید (7). برای تهیه محلول بنفش رنگ DPPH (15/0 میلی مولار) 1 میلی‏گرم از DPPH در 17 میلی‏لیتر اتانل حل شد. به منظور سنجش حذف رادیکال DPPH، 100 میکرولیتر از غلظتهای نهایی مختلف پپتید (12/3، 25/6، 5/12، 25، 50 و 100میکرو‏مولار) به 400 میکرولیتر از محلول DPPH افزوده و محلول تهیه شده به شدت تکان داده شد و به مدت 30 دقیقه در دمای محیط و در تاریکی نگهداری شد. در نهایت جذب نمونه‏ها در 517 نانومتر خوانده شد. برای نمونه کنترل 100 میکرولیتر آب مقطر به جای پپتید به کار برده شد. میزان فعالیت پپتید در حذف رادیکالهای DPPH توسط معادله زیر ارزیابی شد:

DPPH  (%) مهار رادیکال= [(جذب نمونه کنترل –جذب نمونه /جذب نمونه کنترل)] × 100           معادله  1

نتایج و بحث

آماده سازی هیدرولیزات: سنجش فعالیت آنتی اکسیدانی هیدرولیزات آنزیمی کرم سفید ریشه مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج در شکل- 1نشان داده شده است. همان طور که مشاهده می­شود به مرور زمان تولید پپتیدهای آنتی اکسیدانی برای همه هیدرولیزها به حداکثر مقدار می­رسد. بهترین زمان برای تولید پپتیدهای آنتی اکسیدانی در هیدرولیزات پاپین 4 ساعته بود ، در حالی که این مقدار برای هیدرولیزهای پانکراتین ، تریپسین و ، پروتئیناز K- ، 5 ساعت بود. همچنین هیدرولیزات به دست آمده توسط پاپایین، خاصیت آنتی اکسیدانی بالاتری را نشان دادند (شکل -1). مقادیر مهار رادیکال DPPH برای هیدرولیز 4 ساعت –پاپین، 21 درصد بود ، در حالی که مقادیر مربوط به پانکراتین (15 درصد) ، تریپسین (7/14 درصد) و هیدرولیزات پروتئیناز K- (3/14 درصد) بود که همگی دارای مقادیر پایین تر از هیدرولیزات پاپین داشتند. برای بررسی فرایند هیدرولیز، عصاره­های هضم شده آنزیمی با استفاده از الکتروفورزSDS-PAGE مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج الکتروفورز نشان داد که هیدرولیزات پاپایین دارای نوار اسمیر مانند هستند که الیگوپپتیدهایی با وزن مولکولی کم را نشان می­دهد(شکل -2).

شکل 1- سنجش فعالیت آنتی اکسیدانی هیدرولیزات کرم سفید ریشه در حذف رادیکالهای DPPH

شکل 2- الگوی الکتروفورزی (SDS-PAGE) هیدرولیزات کرم سفید ریشه. هرکدام از هیدرولیزات در دو چاهک مورد بررسی قرار گرفتنند. B2R، پپتید بروینین 2R- با وزن مولکولی 6/2 کیلو دالتون است. فلش موقعیت الیگوپپتیدهای با وزن مولکولی کم را نشان می دهد.

به دلیل تأثیر پاپایین که می­تواند پیوندهای پپتیدی را در محل اسید آمینه­های آبگریز هضم کند ، الیگوپپتیدهایی با وزن مولکولی پایین در هیدرولیزات پاپایین مشاهده شد. در مطالعه انجام شده توسط یو و همکاران (26) از پاپایین برای هیدرولیز کردن Loach (Misgurnus anguillicaudatus) استفاده شد و نتایج آنها نشان داد که هیدرولیزات قادر به حذف رادیکالهای DPPH (45/0 ±0/17= IC₅₀ میلی گرم بر میلی لیتر) و رادیکالهای هیدروکسیل (29/0 ±64/2= IC₅₀ میلی گرم بر میلی لیتر) هستند. کیو و همکاران (18) ، پروتئین Mytilus edulis را با پاپایین 1 درصد هیدرولیز کردند که در آن بالاترین فعالیت حذف رادیکالها در هیدرولیزات 3 ساعته به میزان 74/28 درصد نشان داده شد. مشابه این مطالعات ، نتایج تحقیق حاضر نشان داد که هیدرولیزات 4 ساعته پاپایین بیشترین فعالیت را برای حذف رادیکالهای DPPH نشان می دهد.

کروماتوگرافی با فاز معکوس و تعیین توالی: مطالعات نشان داده­اند که پپتیدها با وزن مولکولی کمتر از 3 کیلو دالتون فعالیت آنتی اکسیدانی بالایی دارند. بنابراین، هیدرولیزات 4 ساعته پاپایین عبورداده شده از غشای با محدودیت وزن مولکولی 3 کیلو دالتون برای به دست آوردن پپتیدهای مولکولی کوچک انتخاب شدند. هیدرولیزات پاپاپین فیلتر شده به ستون C₁₈ کروماتوگرافی فاز معکوس تزریق شدند. همان طور که در شکل-3  و 4 نشان داده شده است هیدرولیزات به 11 پیک اصلی جداسازی شدند. فرکشنها به طور متوالی شماره­گذاری شدند. پس از تکرارچندین مرحله کروماتوگرافی ، نمونه­های کافی به دست آمد و سپس فعالیت حذف رادیکالهای DPPH  فرکشنهای جدا شده بررسی شد. نتایج نشان داد که فرکشن 5 با زمان خروج 5/45 و فعالیت 41 درصد خاصیت آنتی اکسیدانی بالاتری داشت. سایرفرکشنها همگی فعالیتی در محدوده 20 درصد یا کمتر نشان دادند. این فرکشن برای شناسایی توسط طیف سنجی جرمی MALDI-TOF / TOF انتخاب شد. نتایج حاصل از طیف سنجی نشان داد که فرکشن 5، دارای توالی پپتیدیYPQSLRWRAK  (6/1304 دالتون) می­باشد که Po-1  نامگذاری شد( شکل-5). تجزیه و تحلیل با استفاده از ابزار ExPASypI / MW (http://wwwexpasy.ch/tools/ pi_tool.html ) برای این پپتید نقطه ایزوالکتریک 19/6 را پیش بینی کرد.

شکل 3- کروماتوگرام RP-HPLC عصاره زیر غشاء هیدرولیزات پاپایین P. adspersa. .

شکل 4- کروماتوگرام RP-HPLC. پیک 5 خالص شده با کمک ستون C₁₈.

شکل5- کروماتوگرام و تفسیر نتایج طیف سنجی جرمی

نتایج آنالیز توالی  نشان داد که پپتید Po-1 ، بیشترین شباهت را به DNA-targeting ADP-ribosyltransferase pierisin-1 در پروانه سفید کلم( Pieris rapae)  با شماره  دسترسی (5H6N_A) دارد. در واقع باقی مانده­های 8-5 در این پپتید دارای شباهت 100 درصد به این آنزیم در محدوده باقی مانده­های 57-45 است. در مطالعه­ای که توسط دانشمند و همکاران انجام شد، به کمک روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا پپتید 31 آمینو اسیدی با فعالیت ضد میکروبی از گیاه عناب (Ziziphus Jujuba) ، استخراج شد. بررسی همردیفی این پپتید در پایگاه داده­ نشان داد که این پپتید بیشترین شباهت را به Snakin-2 دارد؛ ولی با هیچیک از پپتیدهای کشف شده همسانی کامل ندارد (1).

بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی: DPPH یک رادیکال آزاد حاوی نیتروژن پایدار است ، که دارای جذب قوی در 517 نانومتر (رنگ بنفش) در محلول اتانولی است. این ماده به طور گسترده­ای برای اندازه گیری فعالیت اهداکنندگی هیدروژن یا فعالیت رادیکال آزاد ترکیبات آنتی اکسیدانی مورد استفاده قرار گرفته است(10). نتایج نشان داد که درصد فعالیت پپتید در حذف رادیکال DPPH همراه با افزایش غلظت پپتید، به طور معنی­داری ((P≤ 0.01 افزایش یافت (شکل-6) میزان فعالیت آنتی اکسیدانی پپتید در غلظت 100 میکرومولار، به 41/54 درصد رسید. همچنین مقادیر IC₅₀ برای ویتامین C- و  گلوتاتیون احیاء شده( GSH) به عنوان استاندارد و پپتید Po-1 به ترتیب 27/3 ، 96/9 و 45/76 میکرومولار) به دست آمد. وانگ و همکاران در سال2012 گزارش کردند که میزان IC₅₀ پپتیدهای WDR و PYFNK مشتق شده از هیدرولیزات عضله Sphyrna lewini ، در حذف رادیکالهای ABTS به ترتیب، 34/0 و 12/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر است (24). مطالعات متعددی تأکید کرده‏اند که ترکیب و توالی اسید آمینه بر فعالیت آنتی اکسیدانی پپتیدها تأثیر می­گذارد(8).

شکل 6- فعالیت‌ آنتی‌اکسیدانی پپتید Po-1در حذف رادیکال DPPH.  از ویتامین C- و گلوتاتیون احیاء شده( GSH) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

در واقع فعالیت آنتی اکسیدانی در پپتیدها، می­تواند به دلایل کانفورماسیون، نوع، فراوانی و موقعیت اسیدهای آمینه درتوالی پپتیدی متغیر باشد (5). وجود اسیدهای آمینه آبگریز از جمله گلایسن، آلانین، والین، لوسین، ایزولوسین، پرولین، فنیل آلانین، متیونین و تریپتوفان بیانگر ظرفیت آنتی اکسیدانی بالاتری است(3). زهانگ و همکاران (2010) گزارش کردند که درصد حذف رادیکال DPPH پپتیدهای حاصل از هیدرولیزات پروتئین برنج توسط آنزیمهای پاپایین و کیمو تریپسین در غلظت 5/1 میلی گرم بر میلی لیتر، برابر 31/44 درصد و 26/35 درصد بود. نتایج این محققین نشان داد که علت بالا بودن میزان حذف رادیکال آزاد DPPH پپتیدهای مورد بررسی، در ارتباط با محتوای بالای اسیدهای­آمینه هیدروفوبی در توالی آنهاست(28). مندیس و همکاران (2005)، دریافتند که فعالیت آنتی­اکسیدانی ژلاتین پوست ماهی مرکب، می­تواند به دلیل نسبت بالای آب­گریز به آبدوستی در توالی پپتیدی باشد(15). کای و همکاران(4) سه پپتید از هیدرولیزات پوست ماهی کپور (Ctenopharyngodon idella) با توالیهای (PYSFK ، GFGPQL و VGGAP)، به دست آوردند که فعالیت  آنتی اکسیدان قوی (ABTS ، DPPH و رادیکال سوپر اکسید) به نمایش گذاشتند که به دلیل وزن مولکولی پایین و حضور آمینو اسیدهای آبگریز و معطر در توالی آنها بود. اسیدهای آمینه آروماتیک، سبب رساندن پروتونها به رادیکالهایی با کمبود الکترون شده و بدین ترتیب خاصیت حذف رادیکال توسط این قبیل اسیدهای­آمینه افزایش می­یابد (15). در مطالعه حاضر، فعالیت آنتی­اکسیدانی پپتید، می­تواند به دلیل توانایی دهندگی پروتون حلقه ایندول دو اسید آمینه تریپتوفان و تیروزین در توالی آن باشد. از سوی دیگر، وجود مقادیر بالای اسیدهای آمینه آبگریز در توالی، دلالت بر فعالیت آنتی­اکسیدانی پپتیدPo-1 دارد. داوالوس(5) و یانگ( 25)  نشان دادند که آمینو اسید پرولین تمایل به قطع و تغییر ساختار ثانویه مولکول پپتید دارد. این امر ممکن است در دسترس بودن اسیدهای آمینه توالیهای پپتید را افزایش دهد تا به عنوان ترکیب آنتی اکسیدان عمل کند. همچنین  داوالوس گزارش داد که موتیفها و توالیهای لوسین/ سرین-لوسین/ ترئونین-لوسین و پرولین-لوسین ، به ویژه در پایانه های N- و C- ، فعالیت آنتی اکسیدانی بالاتری از خود نشان می­دهند (5). در مطالعه حاضر ، به نظر می­رسد وجود اسیدهای آمینه آبگریز لوسین، آرژنین و پرولین  در توالی پپتید جدا شده به بهبود توانایی حذف رادیکال DPPH و فعالیت آنتی اکسیدانی پپتید کمک شایانی می­کند. علاوه بر این ، وجود باقیمانده Pro می­تواند فعالیت آنتی اکسیدانی این پپتید را تأیید کند.

نتیجه ­گیری

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که پپتیدPo-1  استخراجی از هیدرولیزات کرم سفید ریشه P. adspersa ، با توالی YPQSLRWRAK دارای فعالیت حذف کنندگی رادیکالهای DPPH و خاصیت آنتی اکسیدانی است که می­تواند به عنوان عوامل محافظت کننده سلول از آسیبهای آنتی‌اکسیدان استفاده شود. بنابراین، پپتید po-1 می­تواند به عنوان ترکیب طبیعی در طراحی دارو در آینده استفاده شود.

قدردانی و تشکر

نویسندگان از حمایتهای ارائه شده توسط شورای تحقیق و فناوری دانشگاه تربیت مدرس و دانشگاه فردوسی مشهد ، ایران (مورخه22/03/1395) قدردانی می­کنند.