Document Type : Research Paper
Authors
1 MS.c of Plant Pathology, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Islamic Azad University of Khorramabad. Khorramabad. Iran
2 Assistant Professor, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Islamic Azad University of Khorramabad. Khorramabad. Iran
3 Assistant Professor, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Lorestan University Lorestan.Iran
Abstract
Viral diseases are among the factors limiting potato production in the world. Potato virus Y (PVY; genus Potyvirus, family Potyviridae) is one of the most important viruses infecting potato production. In order to detect the virus, plants with viral symptoms (135 samples) such as: mosaic, dwarf, wavy leaf margin, chlorotic spots and leaf malformation were collected from potato fields of different regions of Lorestan province. Infected plants extract was mechanically inoculated on indicator plants: Nicotiana glutinosa, N. occidentalis and N. debneyi. Ten days after inoculation, symptoms including local yellowing, vein clearing, mottling and mosaic on N. occidentalis, mottling and local necrotic on N. glutinosa were observed. Total RNA was extracted from positive indicator plants and cDNA synthesized with specific primers related to CP and NIb gene using RT-PCR. DNA fragments with the expected size of 1115 bp were obtained and PVY contamination was confirmed. Phylogenetic analysis showed that the studied isolate in this research had 98.74 to 99.48% genetic similarity with other recorded sequences in NCBI. The nucleotide sequence of PVY Lorestan isolate was aligned and compared with the related 17 isolates from NCBI. Results of phylogenetic analyses showed that PVY isolates were grouped in two clusters where the PVY Lorestan isolate was placed in cluster ΙI with isolates from Germany which had belonged to Wilga strain. The determined nucleotide sequence in this study was implemented in NCBI with Accession No. MT655949. This is the first report of PVY contamination of potato fields in Lorestan province using the molecular tests.
Keywords
Main Subjects
ردیابی و تعیین خصوصیات بیولوژیکی و فیلوژنتیکی ویروس Y سیب زمینی (PVY) جدایه استان لرستان
فاطمه رحیمی1، سید حسین وفائی1* و سمیرا پاکباز2
1 ایران، خرم آباد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد خرم آباد، گروه بیماری شناسی گیاهی
2 ایران، خرم آباد، دانشگاه لرستان، دانشکده کشاورزی، گروه گیاهپزشکی
تاریخ دریافت: 08/02/1400 تاریخ پذیرش: 17/07/1400
چکیده
بیماریهای ویروسی از جمله عوامل محدودکننده تولید سیبزمینی در جهان هستند. ویروس Y سیبزمینی (PVY) گونه جنس Potyvirus از خانواده Potyviridae یکی از مهمترین بیماریهای محصول سیبزمینی میباشد. به منظور ردیابی ویروس، تعداد 135 نمونه از گیاهانی که علایم موزائیک، کوتولگی، موجی بودن حاشیه برگ، لکههای کلروتیک و تغییر شکل برگ را نشان میدادند، از مزارع سیبزمینی استان لرستان جمعآوری گردید. عصاره گیاهان مشکوک در مرحله چهار برگی روی گیاهان محکNicotiana glutinosa ، N. occidentalis وN. debneyi مایهزنی گردید. پس از حدود ده روز علایمی نظیر زردی موضعی، رگبرگروشنی و موزائیک روی N. occidentalis و پیسهای شدن و نکروز موضعی روی N. glutinosa مشاهده شد. از گیاهان محک دارای علایم، استخراجRNA کل صورت گرفت و با استفاده از آزمون RT-PCR و آغازگرهای اختصاصی مربوط به بخشی از ناحیه ژنومی ژن CP و NIb ویروسPVY ، باندی در محدوده bp 1115 تکثیر شد و آلودگی نمونهها به ویروس PVY اثبات شد. بررسیهای فیلوژنتیکی نشان داد که جدایه ایرانی مورد مطالعه دارای 48/99-74/98 درصد همسانی ژنتیکی با دیگر توالیهای ثبت شده در این ناحیه درNCBI بود. نتایج تجزیه و تحلیلهای ژنتیکی نشان داد که جدایههای ویروس PVY در دو گروه قرار گرفتند و جدایه ردیابی شده از استان لرستان در گروه II و در کنار جدایههای مربوط به کشور آلمان که متعلق به نژاد Wilga بودند، قرار گرفت. توالی نوکلئوتیدی قطعه مورد نظر درNCBI به شماره دسترسی MT655949 ثبت گردید. این اولین گزارش از آلودگی مزارع سیبزمینی استان لرستان به ویروسPVY به کمک آزمایشات مولکولی میباشد.
واژه های کلیدی: پوشش پروتئینی، توالییابی، خرمآباد، سیبزمینی،Potyvirus .
* نویسنده مسئول، تلفن: 09166634427، پست الکترونیکی: vafaei_h1353@yahoo.com
مقدمه
بیماریهای ویروسی از جمله عوامل محدودکننده تولید سیبزمینی در جهان میباشند. شیوع ویروس Y سیبزمینی Potato virus Y, (PVY) در سراسر جهان برای تولید کارآمد سیبزمینی یک چالش مداوم است. تشخیص دقیق ویروسهایی مانند PVY به دلیل تنوع گسترده بیولوژیکی و ژنتیکی نژادهای آن که طیف وسیعی از علایم و بیماریها را در ارقام مختلف سیبزمینی و گونههای خانواده بادنجانیان ایجاد میکند، ذاتاً چالش برانگیز است (11). خانوادهPotyviridae از مهمترین ویروسهای بیماریزای گیاهی و یکی از بزرگترین آنها است .در میان اعضاء این خانواده، ویروس PVY بهعنوان گونه تیپ در جنس Potyvirus ، یکی از مهمترین عوامل بیماریزای گیاهی در جهان میباشد که روی کیفیت و بازده محصولات خانواده بادنجانیان مانند توتون، سیبزمینی، گوجهفرنگی و فلفل مؤثر است (15). در برخی موارد، با توجه به واریته ویروس، رقم سیبزمینی و شرایط آب و هوایی منطقه، این ویروس میتواند بین 70-40 درصد خسارت وارد نماید (7). این موضوع در مزارع سیبزمینی در ایران نیز بررسی شده وPVY به عنوان مهمترین عامل کاهش بازدهی در سیبزمینی شناخته شده است (6). حداقل 65 گونه شته (جنسهایMacrosiphum و Myzus) به صورت ناپایا قادر به انتقال PVY هستند که در این میان شته Myzus persicae کاراترین آنها میباشد. همچنین انتقال این ویروس توسط غدههای سیبزمینی و شیره گیاهی امکانپذیر است. غدههای آلوده که به عنوان اندام رویشی برای کاشت استفاده میشوند به عنوان منبع اولیه آلودگی به شمار میآیند (8 و 20). ویروس PVY با ژنوم RNA تکرشتهای مثبت و خطی (ssRNA) و اندازه حدود 10 کیلوباز تنها یک چارچوب خوانش باز (ORF) دارد و یک پلی پروتئین کد میکند که توسط سه پروتئاز ویروسی (P1،Pro-HC وNIa ) به ده پروتئین با وظایف مختلف (P1، HC-Pro، P3،6K1، CI، 6K2، NIa،VPG ، Nib وCP) شکسته میشود (12). ژنوم PVY در انتهای '5 خود دارای ساختمان VPg و یک دنباله پلیآدنین در انتهای '3 میباشد(9). ویروس PVY در طبیعت دارای چند واریته مشخص میباشد، بهطوری که پنج واریته PVYO، PVYC ،PVYNTN ، PVYN و PVYWilga تاکنون در دنیا گزارش شده است (10). علایم این ویروس برحسب واریته ویروس و رقم سیبزمینی کاملاً متفاوت میباشد. به طوری که علایم ضعیف تا نکروز برگی شدید و مرگ بوتههای آلوده ممکن است دیده شود (16). واریته PVYO باعث ایجاد علایم موزاییک خفیف تا شدید و ریزش برگها در گیاه سیبزمینی و علایم موزاییک و ابلقی در برگهای توتون می شود. واریته PVYN باعث ایجاد علایم نکروز رگبرگ در توتون، ابلقی خفیف و گاهی نکروز برگها در گیاه سیبزمینی می شود. واریته PVYC باعث ایجاد علایم موزاییک و نکروز در برخی ارقام سیبزمینی میشود (18، 22 و 23). نوترکیبیهای زیادی بین دو گروهO و N در نتیجه حضور همزمان این دو در یک گیاه ظهور کرده است. دو واریته مهم PVYNTN وPVYN-W از نوترکیبی بین دو واریته O و N بوجود آمدهاند (19). Visser (2012) نشان داد که موقعیت و طول قطعههای نوترکیب و تنوع در محل ایجاد نوترکیبی باعث ایجاد واریتههای مختلف از جمله زیرگروههایN: O ، Wi-N وNTN شده است (24). در طول دهه گذشته، روشهای مبتنی بر PCR به دلیل حساسیت، اختصاصیت و ظرفیت آنها برای انجام آزمایشهایی با بازدهی بالا، به طور معمول برای تشخیص PVY مورد استفاده قرار گرفتهاند و با استفاده از روشهای مولکولی بخشهای مختلف ژنوم این ویروس ردیابی و تعیین ترادف شده است (11). در حال حاضر تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنوم کامل از جدایههای مختلف این ویروس در دسترس میباشد (14 و 17). در ایران نیز با استفاده از روشهای مولکولی این ویروس ردیابی و برخی بخشهای ژنومی آن تعیین ترادف و در اختیار بانک اطلاعات ژن قرار گرفته است (13). این مطالعه به منظور ردیابی مولکولی ویروس PVY در مزارع سیبزمینی استان لرستان اجرا گردید.
مواد و روشها
نمونهبرداری از مزارع سیبزمینی: به منظور ردیابی ویروس PVY طی بهار و تابستان سال 1398 از مزارع سیبزمینی استان لرستان شامل شهرستانهای خرمآباد (مرکز استان)، الشتر، دورود و بروجرد (شمال استان)، 135 نمونه مشکوک به آلودگی ویروسی جمعآوری شد. شهرستانهای نامبرده به دلیل آب و هوای معتدل، مراکز کشت سیبزمینی در استان میباشند. نمونهبرداری در مزارع از برگهای انتهایی و جوان بوتههای موردنظر بهویژه از گیاهان دارای علایم نکروز، کوتولگی، موزائیک، موجی شدن حاشیه برگ، لکههای کلروتیک و تغییر شکل برگ جمعآوری شدند. نمونهها به تفکیک در داخل کیسه پلاستیکی قرار گرفتند و در کنار یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. به منظور نگهداری طولانی مدت، بخشی از نمونهها پس از انجماد سریع در ازت مایع، به فریزر 70- درجه سانتیگراد منتقل شدند.
بررسی خصوصیات بیولوژیکی ویروس در گلخانه و استخراج RNA کل: باتوجه به ماهیت ویروس Y سیبزمینی (PVY) که دارای قابلیت انتقال مکانیکی از طریق عصاره شیره گیاهی میباشد، به منظور بررسی علایم بیماری بر روی گیاهان محک و نیز برای حفظ ویروس در گیاهان تکثیری، بذر گیاهان محک اختصاصی ویروس PVY، شامل سه رقم توتون occidentalis Nicotiana ، N.debneyi و N.glutinosa (تهیه شده از گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد) در گلخانه کشت و بعد از رسیدن به سن دو تا چهار برگی، مایهزنی عصاره گیاه سیبزمینی مشکوک به آلودگی با استفاده از بافر فسفات پتاسیم (K2HPO4 و KH2PO4) 1/0 مولار با 7pH: روی همه گیاهان محک انجام شد (3). مایهزنیها در دو تکرار انجام پذیرفت. گیاهان تلقیح شده هر روز مورد بررسی قرار گرفته و علایم ایجاد شده از حدود یک هفته پس از مایهزنی ثبت شد. استخراج RNA از گیاهان محک دارای علایم ویروسی با استفاده از کیت غیرستونی Total RNA Isolation (شرکت دنازیست آسیا) طبق دستورالعمل انجام شد. بدین منظور، میزان 50 میلیگرم از بافت گیاهی خرد شده با ازت مایع به میکروتیوب 5/1 میلیلیتری انتقال داده شد و یک میلیلیتر بافر G1به آن اضافه شد. در ادامه، موادی نظیر کلروفرم، ایزوپروپانول، بافر G2 و اتانول 70%، طی مراحل مختلف استخراج به میکروتیوب افزوده شدند و در مرحله نهایی به رسوب تشکیل شده، آب فاقد ریبونوکلئاز اضافه شد و سپس میکروتیوب در فریزر 70- نگهداری شد.
سنتز رشته مکمل cDNA و واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR): فرایند سنتز cDNA با استفاده از آنزیم نسخهبرداری معکوس و طبق دستورالعمل کیت تجاری شرکت سیناکلون انجام شد. برای این منظور میزان 5 میکروگرم از RNA کل استخراج شده به همراه 10 پیکومولار آغازگر برگشت در حجم 10 میکرولیتر مخلوط واکنش برای مدت پنج دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد حرارت داده شد و سپس بلافاصله به مدت دو دقیقه روی یخ قرارداده شد. سپس به میزان دو میکرولیتر dNTP (mM10)، چهار میکرولیتر 10X Buffer M-MuLV، 20 واحد آنزیم Ribonuclease inhibitor و 200 واحد آنزیم نسخهبردار معکوس M-MuLVبه مخلوط واکنش در حجم نهایی 20 میکرولیتر اضافه و برای مدت یک ساعت در دمای 42 درجه سانتیگراد قرار داد شد. مخلوط واکنش برای توقف فعالیت آنزیم برای مدت پنج دقیقه در 70 درجه سانتیگراد قرار داده شد.
جهت تکثیر cDNA، واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) با استفاده از دو میکرولیتر ازcDNA (50 نانوگرم) و در حضور آغازگرهای اختصاصی رفت و برگشت مربوط به بخشی از ژن پروتئین پوششی (CP) و ژن NIb (PVYF: CAACTCCAGATGGAACAATTG3′′5 و 5′CCATTCATCACAGTTGGC3′ PVYR:) انجام پذیرفت (1). جهت انجام این واکنش از کیت 2x PCRBio Taq Mix Red شرکت systems Bio PCR انگلیس استفاده شد. محلول پایه واکنش شامل همه مواد مورد نیاز برای تکثیر به جز cDNA و آغازگرهای اختصاصی بود. واکنش در حجم نهایی 25 میکرولیتر و غلظت 10 پیکومول از هر آغازگر در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. برنامه PCR متشکل از یک چرخه 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه به منظور واسرشتسازی اولیه و 35 چرخه شامل واسرشت سازی در 95 درجه سانتیگراد به مدت 35 ثانیه، اتصال آغازگرها به رشته الگو به مدت 40 ثانیه در دمای 57 درجه سانتی گراد و گسترش رشته جدید در 72 درجه به مدت 45 ثانیه و به علاوه یک چرخه در دمای 72 درجه به مدت 10 دقیقه برای گسترش نهایی بود. محصولات تکثیر شده در واکنش RT-PCR، برای بررسی اندازه و کیفیت در ژل آگارز یک درصد و بافر TAE با ولتاژ 100 به مدت 45 دقیقه الکتروفورز شدند و از نشانگر یک kb به عنوان استاندارد جهت تعیین اندازه قطعات تکثیر شده استفاده شد.
تعیین توالی نوکلئوتیدی و ترسیم درخت فیلوژنی: از بین قطعات تکثیرشده ویروس PVY جدایههای استان لرستان، یک جدایه انتخاب و جهت خالصسازی و نیز تعیین ترادف نوکلئوتیدی به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال شد. ترادف توالییابی شده قطعه مورد مطالعه در آغاز با برنامه version 2.13 Chromas, بازبینی شد و جهت تأیید به کمک ابزارBlastn با دیگر ترادفهای ثبت شده از این ناحیه ژنومی در بانک ژن مورد مقایسه قرار گرفت. پس از تأیید صحت ویروس، به منظور مطالعه ناحیه ژنومی شامل بخشی از ژن CP و NIb ویروس PVY و تعیین جایگاه این جدایه ایرانی در مقایسه با سایر جدایههای ثبت شده در بانک ژن، درخت فیلوژنی با استفاده از نرمافزار MEGA7 و با دو روشNeighbor-Joining (NJ) و Maximum-Likelihood (ML) و بر اساس 1000 تکرار در ارزیابی Bootstrap رسم شد. به این منظور از توالیهای ثبت شده مربوط به ناحیه ژنومی مورد مطالعه در بانک ژن که مربوط به میزبانهای مختلف و مناطق جغرافیایی متفاوت بودند، جهت همردیفسازی استفاده شد. همردیفسازی چندگانه توالیهای ژنومی میان جدایه ایرانی با سایر جدایههای ثبت شده در بانک ژن با استفاده از ابزار ClustalW در نرمافزار MEGA7 صورت گرفت. توالیهای نوکلئوتیدی با استفاده از نرمافزار (Open Reading Frame Finder) ORF finder به توالیهای آمینواسیدی ترجمه شدند. همچنین جهت ثبت توالی موردنظر در پایگاه اطلاعاتیNCBI و اختصاص شماره دسترسی از ابزار BankIt کمک گرفته شد.
نتایج و بحث
نتایج آزمایشات گلخانهای: از بین 135 نمونه گیاهی جمعآوری شده از مزارع سیبزمینی استان لرستان که علایم مشکوک به ویروس PVY را نشان می دادند (شکل 1)، بیش از 100 نمونه در مطالعات گلخانهای مثبت ارزیابی شدند (جدول 1).
شکل 1- علایم مشکوک به ویروس PVYدر نمونههای جمعآوری شده از مزارع سیبزمینی استان لرستان. الف) موزائیک و موجی شدن حاشیه بر، ب) موزائیک، زردی و تغییرشکل در برگهای جوان و کوتولگی.
جدول 1- تعداد و محل نمونههای سیب زمینی و میزان آلودگی آنها به PVY در استان لرستان در بهار و تابستان 1398
تعداد نمونههای آلوده |
تعداد نمونههای مورد آزمایش |
محصول |
محل نمونه برداری |
33 |
41 |
سیبزمینی |
خرم آباد |
30 |
39 |
سیبزمینی |
بروجرد |
31 |
40 |
سیبزمینی |
الشتر |
11 |
15 |
سیبزمینی |
دورود |
حدود یک هفته پس از مایهزنی مکانیکی ویروس PVY روی گیاهان محک N.occidentalis علایم موزائیک و رگبرگروشنی ابتدا در برگهای مایهزنی شده و سپس به طور سیستمیک در کل گیاه ظاهر شد. همچنین با گذشت زمان لکههای نکروتیک به صورت نقاط کوچک روی برگها پدیدار شد. علایم روی گیاه N.glutinosa بعد از حدود دو هفته به صورت موزائیک، لکههای نکروتیک و رگبرگروشنی مشاهده شد. مایهزنی مکانیکی روی گیاه N.debneyi حتی پس از حدود یک ماه هیچگونه علایمی ایجاد نکرد (شکل 2).
شکل 2- علایم ایجاد شده روی گیاهان محک در گلخانه پس از مایهزنی مکانیکی با ویروس PVY. الف) علایم سیستمیک رگبرگ روشنی و لکههای نکروتیک روی گیاه N.occidentalis سه هفته بعد از مایهزنی. ب) علایم سیستمیک موزائیک و رگبرگ روشنی روی گیاه N.occidentalis دو هفته بعد از مایهزنی. ج) علایم موزائیک، نکروز، رگبرگ روشنی و تغییرشکل برگ روی گیاه N.glutinosa دو هفته بعد از مایهزنی. د) عدم ظهور علایم روی گیاه N. debneyi دو هفته بعد از مایهزنی.
علایم مزرعهای و نتایج آزمایشات گلخانهای در این پژوهش با نتایج به دست آمده از آزمایشات دیگر پژوهشگران روی این ویروس مطابقت دارد. قاسم زاده و همکاران (1391) نمونههایی با علایم موزائیک، ابلقی، موجی شدن حاشیه برگها، کوتولگی، نکروز و مرگ گیاه را از مزارع سیبزمینی استان اردبیل گزارش نمودند. علایم ویروس PVY بر روی گیاه محک توتون بیشتر بهصورت موزائیک و روشن شدن برگها بود (5). در تحقیق گیلانی و همکاران (1395) در مزارع سیبزمینی علایم اولیه شامل نکروز، پیسک، زردی برگچهها، ریزش برگها و در برخی موارد مرگ زودرس بوتههای آلوده بود که به دلیل فاکتورهایی از قبیل واریته ویروس، رقم سیبزمینی، زمان آلودگی و شرایط محیطی بسیار متفاوت بود. نتایج حاصل از تلقیح ویروس روی گیاهان محک توتون نیز علایم کلروز و نکروز بهصورت توأم بود (6).
نتایج نسخه برداری معکوس، واکنش زنجیره ای پلیمراز و تعیین ترادف جدایه های ویروس: در واکنش RT-PCR، آغازگرهای اختصاصی قطعهای به طول 1115 جفت باز از ناحیه ژنومی بخشی از ژن CP و NIb ویروس PVY را در نمونههای دارای علایم تکثیر نمودند(شکل 3).
پس از توالییابی قطعه تکثیر شده، همردیفسازی چندگانه (Multiple sequence alignment) توالی نوکلئوتیدی تعیین شده با استفاده از ابزار Blastn نشان داد که جدایه مورد بررسی بر اساس ترادف نوکلئوتیدی ناحیه مورد مطالعه کاملاً متعلق به ویروس PVY بوده و از قابلیت بررسی فیلوژنتیکی مناسبی با جدایههای ثبت شده در بانک ژن برخوردار میباشد. توالی نوکلئوتیدی قطعه موردنظر به شماره دسترسی MT655949 و با نام جدایهLorestan در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت گردید. جدایه مورد مطالعه به ترتیب دارای 48/99-74/98 و 44/95-89/88 درصد تشابه نوکلئوتیدی و آمینواسیدی با دیگر توالیهای ثبت شده در این ناحیه در NCBI بود. نتایج حاصل از مقایسه جدایه لرستان با سایر جدایههای موجود در بانک ژن، بالاترین درصد تشابه (48/99) در سطح نوکلئوتیدی بین جدایه لرستان و جدایههای ثبت شده از کشور آلمان (AM113988 وKY848023) را نشان داد. جهت تعیین روابط فیلوژنتیکی و مشخص نمودن منشاء تکاملی، درخت فیلوژنتیکی جدایه لرستان به همراه هفده جدایه دیگر از ویروس PVY موجود در بانک ژن از سایر نقاط دنیا (جدول 2)، بر اساس تطابق ترادف نوکلئوتیدی با دو روش Joining-Neighbor و Maximum likelihood با استفاده از نرمافزار MEGA7 و بر اساس 1000 تکرار رسم گردید.
شکل3- الف) الکتروفورز محصول RT-PCR در ژل آگارز 1% رنگ آمیزی شده با Safe Stain، از سمت راست، چاهک اول: مارکر 1kb، چاهک یک تا 7 محصول PCR نمونه های آلوده به PVY سیبزمینی و تکثیر باند در محدوده bp 1115 با استفاده از آغازگرهای اختصاصی و چاهک آخر: شاهد منفی. ب) مارکر 1kb.
جدول 2- ویژگی جدایه های PVY موجود در بانک اطلاعاتی ژن استفاده شده در تحلیل تبارزائی
Nucleotide identity (%) |
Host |
Country |
Accession number |
Strain/Isolate |
99.48 |
Potato |
Germany |
KY848023 |
Strain N-Wilga Isolate Pondo4-261-4 |
99.48 |
Potato |
Germany |
AM113988 |
Strain Wilga Isolate 261-4 |
99.16 |
Nicotiana tabacum cv.Samsun |
Poland |
JF927762 |
IUNG-14 |
99.06 |
Potato |
USA |
MF624286 |
Isolate Oth15-41 |
99.06 |
Potato |
Brazil |
JQ924286 |
Strain N-Wi |
99.06 |
Potato |
Ireland |
MT264733 |
Isolate P099 |
98.95 |
Nicotiana tabacum cv. Samsun |
Syria |
AB461489 |
Isolate Bu3 |
98.95 |
Potato |
Kenya |
MN689502 |
Isolate 18-1048 |
98.95 |
Nicotiana tabacum |
China |
KX650858 |
Isolate Xch-1 |
98.95 |
Nicotiana tabacum |
China |
MH933741 |
Isolate Harbin |
98.95 |
Tomato |
Slovakia |
KX713170 |
Isolate SL16 |
98.95 |
Potato |
Egypt |
KY863548 |
Isolate Egypt11 |
98.95 |
Potato |
Belgium |
JQ969039 |
Strain N Wi |
98.95 |
Potato |
Canada |
AY745492 |
Isolate N:O-L56 |
98.85 |
Potato |
United Kingdom |
AJ584851 |
Strain N Isolate SASA.207 |
98.85 |
Potato |
India |
JN034046 |
Isolate Del-66 |
98.74 |
Potato |
Switzerland |
MF422610 |
Isolate CH |
نتایج نشاندهنده یکسان بودن توپولوژی دندروگرام رسم شده در هر دو روش NJ و ML بود. به همین دلیل تنها درخت فیلوژنتیکی رسم شده به روش NJنمایش داده شد که بر اساس آن جدایههای مورد بررسی PVY در دو گروه اصلی (II وI) قرار میگیرند. گروه I با چهار زیرگروه شامل جدایههایی از کشورهای کانادا، آمریکا، برزیل، کنیا، مصر، چین، سوریه و چندین کشور از اتحادیه اروپا نظیر انگلیس، سوئیس و لهستان میباشد. این گروه از نظر جغرافیایی یک گروه نامتجانس را تشکیل میدهد. همچنین جدایههای واقع در گروه I از میزبانهای متفاوت مانند سیبزمینی، گوجهفرنگی و یا توتون جدا شده بودند. جدایه ردیابی شده از استان لرستان جدا شده از سیبزمینی در یک گروه مجزا (گروه II) و در کنار جدایههای مربوط به کشور آلمان (AM113988 و KY848023) جدا شده از میزبان سیبزمینی قرار گرفت که بیانگر رابطه ژنتیکی بالای این جدایهها با یکدیگر میباشد (شکل 4).
شکل 4- درخت فیلوژنتیکی رسم شده بر پایه مقایسه توالی بخشی از ناحیه ژن CP و NIb ویروس PVY به کمک نرمافزار Mega7 با روش Joining-Neighbor و بر اساس 1000 تکرار در ارزیابی Bootstrap.
با توجه به اینکه گروه I در برگیرنده جدایههایی از سه میزبان سیبزمینی، گوجهفرنگی و توتون میباشد، جدایی میزبانی با گروهبندی فیلوژنتیکی ایجاد شده همخوانی ندارد. همچنین همگروه شدن برخی از جدایهها از مناطق مختلف جهان با یکدیگر که انطباقی با قرابت جغرافیایی ندارند، نشان میدهد که انتشار گسترده و جهانی PVY نمیتواند تنها به وسیله ناقلین شتهای صورت گیرد و احتمال نقش صادرات و واردات این محصول در جهان از طریق بذر و غده تقویت میشود .در تحقیقی که توسط قاسم زاده و همکاران (1391) صورت گرفت از آغازگرهای عمومی جنس Potyvirus برای ردیابی استفاده شد و بخشی از منطقه ژنومی NIb به اندازه 350 نوکلئوتید تعیین ترادف شد. نتایج بررسی آنها نشان داد که جدایههای استان اردبیل در بررسی تبارزایی در کنار جدایههایی از آمریکا، کانادا، انگلیس، فرانسه و لهستان قرار گرفتند. در بیشتر گزارشات قبلی که بر اساس دیگر نواحی ژنومی ویروس PVY بود، جدایههای ایرانی با جدایههای اروپایی همگروه شدند که این شباهت را احتمالاً ناشی از انتقال بذر به داخل ایران از این مناطق میدانند (3). بغدادی و همکاران (1394) با استفاده از آزمون RT-PCR و ترادف نوکلئوتیدی ژن CP و NIb، نژادهای ویروس PVY را در مزارع سیبزمینی استان گلستان ردیابی کردند. مقایسه نتایج ردیابی مولکولی نشان داد که بین جدایههای ایرانی و خارجی تفاوت ژنتیکی زیادی وجود داشت و ترسیم درخت فیلوژنی، جدایههای ایرانی را در کنار جدایههای برزیل قرار داد (1).
حصول نتایج متفاوت در درختهای تبارزایی مربوط به جدایه های ایرانی ویروس Y سیبزمینی (PVY) در این مطالعات نشاندهنده تفاوت جدایهها در مناطق مختلف ایران است و احتمال افزایش وقوع نوترکیبی ژنتیکی در بخشهای مختلف ایران وجود دارد. نوترکیبی ژنتیکی نقش مهمی در تکامل ویروسها دارد. احتمال دیگر برای تفاوت ژنتیکی جدایههای ایرانی میتواند ناشی از فشار انتخابی ارقام سیبزمینی کاشته شده در ایران باشد که به دلیل تفاوت این ارقام در کیفیت واکنش به ویروس، میتوانند باعث ایجاد فشار انتخابی روی جمعیت ویروس، حذف برخی جدایهها و تکامل و بقاء جدایههای دیگری شود (21). در مطالعه حاضر نیز جدایههای گزارش شده از سایر نقاط ایران به دلیل تفاوتهای ژنتیکی و نیز عدم مطابقت کامل توالی مبتنی بر ناحیه ژنومی مورد مطالعه در جدایه لرستان با توالی دیگر جدایههای ایرانی، در ترسیم درخت فیلوژنتیکی و تجزیه و تحلیل همسانی و میزان شباهت استفاده نشدند.
بر اساس نتایج بهدست آمده از آغازگرهای اختصاصی و بررسی نواحی ژنومی توالییابی شده، جدایه مورد بررسی متعلق به خانواده Potyviridae، جنسPVY و به احتمال زیاد نژاد Wilga میباشد. برای اطمینان بیشتر و قاطعیت در مورد نژاد ویروس باید نواحی بیشتری از ژنوم جدایه لرستان توالییابی شود. در پژوهشی که در سال 1396 روی جدایههای استان خوزستان مربوط به ویروس PVY انجام شد، مشخص شد که جدایههای PVY ردیابی شده از کشتزارهای شلغم از نظر توالی ناحیه CPهمسان جدایههای کشورهای چین و سوریه متعلق به نژاد NTN و یا Wilgaمیباشند (3). این اولین گزارش از ردیابی ویروس PVY در مزارع سیبزمینی استان لرستان بر اساس آزمایشات مولکولی و تعیین توالی نوکلئوتیدی مربوط به جدایه گزارش شده از این استان میباشد. ویروسهای گیاهی از عوامل محدود کننده در کشاورزی هستند و استفاده از ارقام مقاوم استراتژی مناسبی جهت مدیریت این عوامل می باشد. مقاومت وابسته به بیمارگر یکی از روشهای ایجاد ارقام مقاوم است که از بخشی از مواد ژنتیکی ویروس از جمله ژن CP و ژنهای دیگر استفاده میشود (2 و 4). جهت جلوگیری از خسارت ویروس، ردیابی ویروس از روی سایر میزبانهای اقتصادی و علفهای هرز به عنوان منبع زمستانگذران و ردیابی و تعیین نژادهای ویروس پیشنهاد میشود.