تهیه انواع فرمولاسیونهای لیپوزومی پیپراکتام و بررسی اثر ضد میکروبی بر

Pseudomonas aeruginosa

حمیده میرزاخانلو¹، رابعه خوشنویس زاده^2* و شهره زارع کاریزی³

¹ ایران، ورامین-پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد ورامین-پیشوا، دانشکده علوم زیستی، گروه زیست فناوری میکروبی

² ایران، ورامین-پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد ورامین-پیشوا، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوشیمی و بیوفیزیک

³ ایران، ورامین-پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد ورامین-پیشوا، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک

تاریخ دریافت: 09/03/1400          تاریخ پذیرش: 06/07/1400

چکیده

Pseudomonas aeruginosa از باکترهای متداول در عفونتهای بیمارستانی بوده که با مکانیسمهای مختلفی در برابر انواع آنتی بیوتیکها مقاوم می شود. امروزه یکی از راهکارهای افزایش راندمان درمان، بهره گیری از سامانه های دارورسانی مثل لیپوزومهاست. در این مطالعه پیپراکتام، آنتی بیوتیک  مؤثر بر P.aeruginosa در انواع فرمولاسیون لیپوزومی محصور شده و کارآیی آنها با سنجش MIC مورد ارزیابی قرار گرفته است. انواع لیپوزومهای خنثی، کاتیونی و آنیونی از طریق تبخیر فاز حلال تهیه و خواص بیوفیزیکی آنها شامل شکل، اندازه و بار به ترتیب با کمک میکروسکوپ الکترونی، تکنیک DLS و زتا سایزر ارزیابی شد. اثر ضد میکروبی فرمولاسیونهای لیپوزومی و محلول دارویی بر روی دو جدایه بالینی و یک سویه استاندارد(27853)  P.aeruginosa  به روش رقیق سازی سریالی مورد بررسی قرار گرفت و با کمک تکنیک HPLC میزان انکپسولاسیون فرمولاسیونهای مختلف لیپوزومی به دست آمد. میکروسکوپ الکترونی لیپوزومهای کروی شکلی را نمایش داد که نوع خنثی، کاتیونی و آنیونی آن به ترتیب دارای ابعاد8/133، 7/117 و 81/83 نانومتر و بار 56/6- ، 9/26 و 5/23- میلی ولت بوده است. تکنیک HPLC میزان انکپسولاسیون لیپوزوم خنثی، کاتیونی و آنیونی را به ترتیب 5/26، 8/31 و 6/37 درصد ارزیابی کرد. نتایج کمترین غلظت مهارکنندگی بر روی سویه استاندارد و دو جدایه 62 و 60 برای داروی آزاد 40، 8، 8 ، لیپوزوم خنثی 4، 32، 16، لیپوزوم کاتیونی 4، 8، 32 و لیپوزوم آنیونی 1، 2 و 1 میکروگرم بر میلی لیتر به دست آمد. استفاده از تکنیک تبخیر فاز حلال، امکان تشکیل ذرات لیپوزومی را فراهم کرد که دارای ابعاد کوچک و درصد انکپسولاسیون مناسب بود. مقایسه نتایج میکروبی فرمولاسیونهای مختلف با داروی آزاد نشان داد لیپوزوم آنیونی پیپراکتام با چهار برابر کاهش MIC نسبت به داروی آزاد، بهترین فرمولاسیون برای مهار رشد سویه های سودوموناسی مورد مطالعه در این تحقیق بوده است.

واژه های کلیدی: لیپوزوم ، پیپراکتام ، P.aeruginosa ، اثر ضد میکروبی

* نویسنده مسئول، تلفن:   02188261352 ،  آدرس پست الکترونیکی: khoshneviszade@iauvaramin.ac.ir

مقدمه

باکتری گرم منفی P.aeruginosa یکی از عوامل مؤثر در عفونتهای پنومونی، دستگاه ادراری و زخمهای سوختگی است (5). این باکتری عامل یک دهم عفونتهای بیمارستانی بوده و بیشتر در بخشهای سوختگی ، جراحی و  مراقبتهای

ویژه مشاهده می شود (11).

مطالعات آماری درباره شیوع عفونتهای بیمارستانی این باکتری نشان داد در سال 1389 در بیمارستان الزهرا اصفهان عامل 7 درصد عفونتهای پوستی (3) و در سال 1395 در بیمارستان توحید سنندج عامل 24 درصد عفونتهای بخش سوختگی P.aeruginosa بوده است (7) و در یک مطالعه تحلیلی بسیط بین سالهای 1376 تا 1391 میزان شیوع عفونتهای بیمارستانی سودوموناسی، 78/26 درصد  برآورد شده است (1). وجود سویه های مقاوم P.aeruginosa که از طریق مکانیسمهای مختلف مثل غیرفعال سازی آنزیمی دارو ، سیستمهای تراوشی (5) و نفوذپذیری پایین (17) به آنتی بیوتیکها ایجاد شده است موجب مرگ بیماران می گردد.

پیپراکتام که از ترکیب دو آنتی بیوتیک پیپراسیلین و تازوباکتام است از آنتی بیویتکهای مؤثر در درمان عفونتهای سودوموناسی است و اثر باکتریوسیدی خود را به ‌واسطه پیپراسیلین اعمال می‌کند. این آنتی بیوتیک در خانواده بتالاکتامها قرارگرفته و در دسته پنی‌سیلینهای مخصوص سودوموناس است(29).  یکی از راهکارهای افزایش راندمان درمان همراه با کاهش اثرات جانبی آنتی بیوتیک، بهره گیری از سیستمهای دارورسان مثل لیپوزوم است. حاملین دارو می توانند با محصور کردن دارو سمیت آن را در بدن کاهش و نیمه عمر آن را با محافظت از آنزیمهای تجزیه کننده افزایش دهند که به موجب آن، نیاز به دوز کمتری از دارو می باشد (25). زیست سازگاری از ویژگیهای مثبت لیپوزومهاست که می تواند آن را از دیگر سامانه های دارورسان متمایز کند (21).  این سامانه قادر به انتقال دارو به بخشهای عمیق پوست بوده و کاندید مناسبی برای درمانهای موضعی است (10) همچنین با کنترل اندازه ذرات لیپوزومی می توان دارورسانی به بخشهای تحتانی ریه را امکان پذیر کرد (31). لیپوزومهای حامل آنتی بیوتیک، با افزایش نفوذپذیری باکتری به دارو می تواند موجب کاهش MIC شود (15). مطالعات فراوان صورت گرفته بر روی اثرات ضد میکروبی لیپوزومها باعث تولید داروی تجاری با فرمولاسیون لیپوزومی آمفوتریسین B بر علیه پاتوژن لیشمانیا در بیماری سالک با نام آمفولیش شده است، به این ترتیب شکل لیپوزومی دارو برای مقابله با عفونتهای درون سلولی کارآمد است همچنین لیپوزوم قادر به عبور از بیوفیلم باکتریها بوده و برای از بین بردن عفونتهای بیوفیلمی مناسب است (34). خواص لیپوزومها در کاهش MIC، دارورسانی مؤثر به پوست و بخشهای تحتانی ریه باعث شکل گیری مطالعه حاضر شد تا امکان تهیه و اثر انواع فرمولاسیونهای لیپوزومی پیپراکتام بر P.aeruginosa مورد بررسی قرار گیرد.

مواد و روشها

تهیه فرمولاسیون های لیپوزومی: برای تهیه هر سه نوع فرمولاسیون خنثی، آنیونی و کاتیونی لیپوزوم حاوی پیپراکتام از روش تبخیر فاز حلال استفاده شد (37). همه مواد محلول در چربی با کمک کلروفرم در بالون 250 میلی لیتری حل شده و به دستگاه روتاری اوپرویتور (IKA آلمان) متصل شد. این دستگاه با ایجاد خلاء در دمای 40 درجه، کلروفرم را حذف کرده و فیلم خشک فسفولیپیدی بر روی دیواره بالون ته گرد به وجود آمد. در مرحله بعدی، با اضافه کردن 10 میلی لیتر محلول پیپراکتام (شرکت دانا تبریز)  به غلظت 6/22 میلی گرم بر میلی لیتر هیدراتاسیون فیلم خشک فسفولیپیدی انجام شد این مرحله به آهستگی و همراه با ورتکس بود تا محلول همگنی از لیپوزوم ایجاد شود. مواد محلول در چربی در لیپوزومهای مختلف به شرح زیر است:

لیپوزوم خنثی: در تهیه لیپوزوم خنثی 2/33 میلی مولار فسفولیپید G90 (حاوی 90 درصد فسفاتیدیل کولین از شرکت لیپویید) و20 میلی مولار کلسترول (شرکت مرک) بکار رفت.

لیپوزومی کاتیونی: 2/33 میلی مولار فسفولیپید G90 به همراه 20 میلی مولار کلسترول و 12 میلی مولار استئاریل آمین (شرکت مرک) در کلروفرم حل شد.

لیپوزومی  آنیونی: 2/33  میلی  مولار  فسفولیپید  G90  به

همراه 20 میلی مولار کلسترول و 20 میلی مولار دی ستیل فسفات (شرکت سیگما) مورد استفاده قرار گرفت.

آزمون میکروسکوپ الکترونی: جهت ارزیابی شکل گیری ساختارهای کروی لیپوزومی، یک قطره از فرمولاسیون لیپوزوم خنثی بر روی گرید قرار داده شد و پس از خشک شدن، شکل فرمولاسیون با بزرگنمایی 50000 برابر توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی FE-SEM محصول ZEISS آلمان (در شرکت دی پترونیک) مورد بررسی قرار گرفت (16).

سنجش بار و اندازه: برای اندازه گیری بار، 50 میکرو لیتر از نمونه با 950 میکرو لیتر از NaCl 10میلی مولار رقیق‌ و توسط دستگاه زتا سایزر Malvern سری 6 ارزیابی شد. اندازه ذرات هرفرمولاسیون پس از رقیق سازی با آب مقطر از طریق تکنیک  DLSبا کمک دستگاه Malvern (در شرکت دی پترونیک) اندازه گیری شد (24).

اندازه گیری درصد انکپسولاسیون: ارزیابی درصد انکپسولاسیون از روش غیرمستقیم بود. در این روش ابتدا جداسازی بخش لیپوزومی از فاز پیوسته اطراف آن با کمک دستگاه سانتریفیوژ(HANIL کره جنوبی مدل Micro17tr) در مدت یکساعت در دمای 10 درجه و سرعت 17000دور در دقیقه صورت گرفت. سپس با دقت فاز شفاف رویی (سوپرناتانت) برداشته شد تا برای اندازه گیری مقدار داروی کپسوله نشده به دستگاه  HPLCساخت شرکتWaters آمریکا (در دانشگاه بقیه الله) تزریق شود. روش اندازه گیری غلظت پیپراکتام با کمک تکنیک HPLC، به روش ایزوکراتیک بوده و شرایط آن شامل بهره گیری از ستون C18، فاز متحرک شامل متانول 30 درصد، ارتوفسفریک اسید به نسبت 20درصد و استنونیتریل به نسبت 50 درصد می باشد، دتکتور به کار رفته در این روش، اسپکتروفتومتری در طول موج 226نانومتر است و دما و حجم تزریق به ترتیب 37 درجه سانتی گراد و 20میکرولیتر می باشد (40). برای اندازه گیری درصد انکپسولاسیون علاوه بر تزریق محلولهای سوپرناتانت حاصل از هر فرمولاسیون، یک محلول دارویی پیپراکتام نیز به عنوان شاخص اندازه گیری به دستگاه تزریق شد سپس از مقایسه سطح زیر منحنی انواع سوپرناتانتها با محلول دارویی پیپراکتام ، غلظت داروی انکپسوله نشده محاسبه شد و در نهایت با کمک فرمول زیر(19)، درصد انکپسولاسیون به دست آمد.

شناسایی و جداسازی سویه های بالینی P.aeruginosa: نمونه های میکروبی مورد استفاده در این تحقیق از کشت ادرار بیماران بستری در بیمارستان میلاد تهران به دست آمد. تولید پیگمان سبز-آبی قابل انتشار در محیط کشت علامت  اولیه در تشخیص P.aeruginosa بود. برای کشت و جداسازی P.aeruginosa از سایر باکتریها و قارچها از محیط انتخابی مانند آگار حاوی استیل تری آمونیم بروماید و برای تایید از تستهای بیوشیمیایی مختلف استفاده شد که شامل محیط مک کانگی آگار، تست اکسیداز، محیط کشت TSI، بررسی تحرک و رشد در 42 درجه سانتی گراد و تولید پیوسیانین در محیط مولرهینتون آگار، تست کاتالاز، سیمون سیترات، MR  و VP بود (6 و 38).

تهیه آنتی بیوگرام: آنتی بیوگرام دو جدایه بالینی 60 و62، و یک سویه استاندارد  ATCC27853 به روش انتشار در آگار با کمک دیسکهای آنتی بیوتیک جنتامایسین، مروپنم، سفتازیدیم، سیپروفلوکساسین، توبرامایسین و لوفلوکساسین انجام شد.

اندازه گیری کمترین غلظت مهارکنندگی: نمونه های میکروبی مورد بررسی شامل جدایه های60 و62 و نمونه کددار ATCC27853 P.aeruginosa بود.MIC  فرمولاسیونهای مختلف لیپوزومی شامل خنثی، آنیونی، کاتیونی حاوی پیپراکتام و بدون پیپراکتام، و همچنین محلول پیپراکتام مورد بررسی قرار گرفت. طبق CLSI 2020 از روش رقیق سازی مایع برای اندازه گیری کمترین غلظت مهارکنندگی استفاده شد. برای این منظور محیط کشت مولر هینتون براث، فرمولاسیون دارویی و سوسپانسیون میکروب مورد نظر با سه بار تکرار به چاهک های پلیت 96 خانه اضافه شد و غلظت فرمولاسیون ها از چاهک اول تا انتها با رقیق سازی سریالی کاهش یافت بطوریکه هر فرمولاسیون ابتدا توسط بافر تا غلظت 048/2 میلی گرم بر میلی لیتر رقیق شده سپس رقیق سازی سریالی با کمک محیط کشت انجام گرفت، پس از اضافه شدن سوسپانسیون میکروبی با رقت یک صدم نیم مک فارلند به هر چاهک، پلیتها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. در ادامه محلول نمک تترازولیوم به چاهکها اضافه شد که مشاهده رنگ قرمز نشان دهنده رشد باکتری بوده است و کمترین غلظت فرمولاسیون که در آن باکتری رشد نکرده بود به عنوان کمترین غلظت مهارکنندگی در نظر گرفته شد.

نتایج

برای اطمینان از تشکیل ذرات کروی لیپوزومی توسط تکنیک به کار گرفته شده، از فرمولاسیون لیپوزومی خنثی برای تهیه تصویر استفاده شد. تصویر حاصل از این فرمولاسیون به روشنی حضور ذرات کروی را تأیید می کند و به این ترتیب روش ساخت فرمولاسیون لیپوزومی تأیید می شود. قطر چند ذره لیپوزومی که در محدوده تصویربرداری میکروسکوپ قرار داشتند نشان از شکل گیری ذرات کوچکتر از 150 نانومتر بوده است (شکل1).

پس از حصول اطمینان از تشکیل ذرات کروی، بررسی اندازه ذرات برای انواع فرمولاسیونهای خنثی، کاتیونی و آنیونی انجام شد. میانگین اندازه ذرات محاسبه شده توسط تکنیک DLS، نشان داد فرمولاسیون آنیونی با میانگین 81/83 نانومتر کوچکترین اندازه ذرات را به خود اختصاص داده است سپس فرمولاسیون کاتیونی با میانگین 7/117 نانومتر کوچکتر از ذرات فرمولاسیون خنثی با مقدار 8/133 نانومتر بوده است.

شکل1- تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی از فرمولاسیون خنثی لیپوزومی

بررسی شاخص پراکندگی اندازه ذرات (PDI) نشان می دهد که فرمولاسیون آنیونی با مقدار عددی 361/0 دارای کمترین پراکندگی اندازه ذرات در میان سه نوع فرمولاسیون بوده است. هر چه شاخص پراکندگی مقدار عددی کوچکتری داشته باشد نشان دهنده تشکیل فرمولاسیون بهینه تری می باشد که به این ترتیب در این مطالعه فرمولاسیون آنیونی از نظر اندازه و شاخص پراکندگی نسبت به دو فرمولاسیون دیگر بهتر است (جدول 1). بار ذرات لیپوزومی از دیگر ویژگی های بیوفیزیکی است که برای القا بار مثبت از استئاریل امین و بار منفی از دی ستیل فسفات استفاده شد که به ترتیب بار فرمولاسیونهای کاتیونی و آنیونی 9/26 و 5/23- میلی ولت به دست آمد. مقدار بار  فرمولاسیون خنثی نیز 56/6- میلی ولت ارزیابی شد که در محدوده بار خنثی می باشد. نتایج حاصل از اندازه گیری بار انواع فرمولاسیونهای نشان داد (جدول 1) درصد مواد بکار گرفته شده جهت القاء بار مورد نظر در ذرات لیپوزومی به شکل موفقیت آمیزی انجام شده است.

برای اندازه گیری درصد انکپسولاسیون، غلظت معینی از پیپراکتام را به دستگاه HPLC تزریق کرده سپس با مقایسه سطح زیر منحنی پیک اصلی محلول دارویی پیپراکتام با سطح زیر منحنی محلولهای سوپرناتانت انواع فرمولاسیونهای لیپوزومی، درصد انکپسولاسیون فرمولاسیون خنثی 5/26، کاتیونی 8/31 و آنیونی 6/37 درصد به دست آمد (جدول 2).

جدول1- اندازه و بار ذرات لیپوزوم

پس از جداسازی و انجام تستهای بیوشیمیایی بر روی نمونه های بالینی (جدول 3)، دو جدایه 60 و 62 به نمایندگی انتخاب شد و تستهای آنتی بیوگرام بر روی آنها و نمونه استاندارد انجام گرفت که نتایج آن در جدول 4 آمده است.

MIC انواع فرمولاسیونها در برابر دو جدایه بالینی و نمونه استاندارد P.aeruginosa که به روش رقیق سازی سریالی بدست آمد در جدول 5 درج شده است. در بررسی MIC همه تکرارها نتیجه یکسانی را نشان داد.

بحث

P.aeruginosa به ‌عنوان یکی از عوامل مهم عفونتهای بیمارستانی بوده (4) که برای مقابله با آن از ترکیب چند خانواده آنتی بیوتیکی استفاده می شود (18). به موازات ظهور آنتی بیوتیکهای جدید، مکانیسمهای مقاومتی در باکتریها نیز توسعه یافته و سویه های مقاوم شکل می گیرند؛ از این رو استفاده مکرر از آنتی بیوتیکها پس از مدتی اثر درمانی خود را از دست داده و فقط عوارض جانبی آن باقی می ماند.

جدول2-نتایج درصد انکپسولاسیون فرمولاسیون مختلف

جدول3- نتایج تست بیوشیمیایی

جدول4-آنتیبیوگرام سویه‌های باکتری

جدول5- کمترین غلظت مهارکنندگی فرمولاسیون های مختلف لیپوزومی

• همه غلظت ها بر حسب میکروگرم بر میلی لیتر است

وجود این نقایص محققین را به سمت تولید سامانه های دارورسان با ابعاد نانو مثل لیپوزوم، کیتوزان، آلژینات، میسلهای پلیمری، دندریمرها، نانوکریستالها و ... سوق داده است (2 و 28). لیپوزومها علی رغم گران قیمت بودن و مشکلاتی که در مسیر تهیه آن وجود دارد، قادر به ﺗـﺄﺧﻴﺮ  ﻛﻠﻴﺮﺍﻧﺲ ﺩﺍﺭﻭ بوده و می تواند باعث ﻛﻨﺪ ﻛﺮﺩﻥ ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺴﻢ ﺩﺍﺭﻭ، ﻛﺎﻫﺶ ﺣﺠﻢ ﺗﻮﺯﻳﻊ ﺩﺍﺭﻭ ﻭ ﺗﻐﻴﻴﺮ ﺗﻮﺯﻳﻊ ﺑﻪ ﺳﻤﺖ ﺑﺎﻓﺖ هدف شود که ﺑﺪین­ ترتیب شاخص درمانی دارو بهبود می یابد (8). همچنین فرمولاسیونهای لیپوزومی حاوی آنتی بیوتیک از جنبه‌های مختلفی مثل انتقال بهتر دارو به سطوح پایین پوست (23)، ارسال دارو به بخشهای پایین ریه(15) ،افزایش عمر داروهای ناپایدار (15)، کاهش عوارض جانبی دارو (39) و افزایش قدرت ضدمیکروبی بررسی شدند (26). پیپراکتام در دسته پنی‌سیلینهای مخصوص سودوموناس بوده (29) و برای رسیدن به محل اثر خود از پورینها (omp) که در غشای خارجی باکتریهای گرم منفی قرارگرفته‌اند عبور کرده سپس وارد فضای پری پلاسمی می شود. در فضای پری پلاسم واحدهای پپتید و گلیکانی (مولکولهای  -Nاستیل گلوکز آمین و N- استیل مورامیک اسید) به یکدیگر متصل شده اند. جهت اتصال عرضی ردیفها، آنزیمی به نام ترانس پپتیداز فعالیت کرده تا در نهایت بخشی از دیواره سلولی بنا شود، حال آنتی بیوتیکهای پنی‌سیلین- مانند پس از ورود به فضای پری پلاسمی به آنزیم ترانس پپتیداز متصل شده و فعالیت آن را مهار می کند که متعاقباً یکپارچگی ساختار پری پلاسم و سلول به ‌هم ‌ریخته و مرگ باکتری را به دنبال دارد (14 و 41). نفوذپذیری پایین غشای سودوموناس، که باعث مقاومت این باکتری در برابر بسیاری از آنتی بیوتیکها شده است از جمعیت کم پورینها، کنفورماسیون بسته آنها و حضور پمپهای تراوشی نشات گرفته است (41). طبق استانداردهای2020 CLSI (12)، میکروارگانیسم‌هایی که MIC آن‌ها در حضور پیپراکتام بیشتر از 16 میکروگرم بر میلی‌لیتر باشد مقاوم تلقی می‌شوند. پیپراکتام که دارویی هیدروفیل می باشد با کمک تکنیک ساده تبخیر فاز حلال، در ساختار لیپوزومی کپسوله می شود. عکس میکروسکوپ الکترونی از فرمولاسیون لیپوزومی بر حضور ذرات کروی که نشان دهنده شکل گیری لیپوزوم بود دلالت داشت. اندازه ذرات در همه فرمولاسیونها کمتر از 150 نانومتر بوده که با توجه به عدم استفاده از تکنیکهای کوچک سازی مثل اکسترودر، سونیکاسیون و ... امکان تهیه لپیوزوم در ابعاد نانو میسر شده است. پتانسیل زتا فرمولاسیونها نیز با توجه به مواد بکار رفته در تهیه آنها در سه حالت خنثی 56/6- ،کاتیونی9/26 و آنیونی 5/23- میلی ولت حاصل شد. درصد انکپسولاسیون دارو درون لیپوزومهای خنثی، کاتیونی و آنیونی به ترتیب 26، 31 و 37 درصد بوده است. این مقادیر درصد انکپسولاسیون با توجه به ویژگی هیدروفیلی داروی پیپراکتام مناسب می باشد به طوری که در مطالعات مشابه، درصد انکپسولاسیون داروی جنتامایسین (33) و آزیترومایسین ، به ترتیب 5/4 و 23 درصد و در بهترین حالت برای کلاریترومایسین 30 درصد به دست آمده است (9). دلیل درصد انکپسولاسیون  پایین داروهای محلول در آب که از روش تبخیر فاز حلال تهیه ‌شده اند، محدودیت فضای داخلی لیپوزوم است که با دیگر لایه های فسفولیپیدی پر شده و فضای کافی برای محلول دارویی موجود نیست (30).

در بخش میکروبی، دو جدایه بالینی با کدهای 60 و 62، و یک‌سویه استاندارد (ATCC 27853)  P.aeruginosa برای مطالعه اثرات فرمولاسیونها در نظر گرفته شدند. طبق آنتی بیوگرام، رفتار مشابهی از نظر مقاومت و حساسیت در هر سه سویه مورد مطالعه دیده شد این سویه‌ها از یک‌سو به مکانیسم مهار سنتز پروتئین توسط توبرامایسین مقاوم بوده و از سوی دیگر در برابر همین مکانیسم اعمال‌شده از طرف آنتی بیوتیک جنتامایسین حساس بودند؛ همچنین سیپروفلوکساسین قادر به توقف سنتز DNA در هر سه سویه بوده اما لووفلوکساسین اثر نامبرده را نمی‌توانست اعمال کند. درنهایت این سویه‌ها در مجاورت سفتازیدیم و یا مروپنم به دلیل مهار سنتز دیواره سلولی‌ (14) از بین رفته و اثرات باکتری کشی این آنتی بیوتیکها بر سویه‌های مذکور مشاهده شد.

اما رفتار این سویه ها در مجاورت فرمولاسیونهای مختلف شامل داروی آزاد، لیپوزوم خالی، لیپوزومهای خنثی، کاتیونی، آنیونی حاوی پیپراکتام پاسخهای همسانی در برنداشت به طوری که MIC داروی آزاد پیپراکتام بر روی سویه استاندارد 4 و برای هر دو جدایه (کدهای 60 و 62) 8 میکروگرم بر میلی لیتر بود که بر اساس تعریف2020  CLSI(12) همگی به پیپراکتام حساس بودند. اما غلظت باکتریوسیدی جدایه ها دو برابر سویه استاندارد بوده است. عدم اثرگذاری لیپوزوم بدون دارو  بر مهار رشد باکتری دلالت بر این امر دارد که بین ذرات لیپوزومی و باکتری برهمکنشی رخ نداده است (27) و اما مقایسه نتایج کمترین غلظت مهارکنندگی فرمولاسیونهای لیپوزومی با داروی آزاد سه نوع پاسخ را نشان می دهد.

الف) افزایش MIC: در تیمار جدایه های 62 و 60 به ترتیب با لیپوزومهای خنثی و کاتیونی چهار برابر قدرت ضد میکروبی در مقایسه با داروی آزاد کاهش یافته است. در بررسیهای  Omriو همکارانش در سنجش قدرت ضد میکروبی لیپوزوم آنتی بیوتیکهای توبرامایسن، متی سیلین وآمیکاسین بر سودوموناس، 4 تا 8 برابر افزایش MIC نسبت به داروی آزاد گزارش شد (27)؛ چنین نتیجه ای در مطالعه McAllister  و همکاران از اثر انواع فرمولاسیونهای لیپوزومی پلی میکسین بر سودوموناس نیز به دست آمد (22).

ب) MIC همسان: پیپراکتام آزاد و محصور شده در لیپوزومهای خنثی و کاتیونی تغییری بر MIC سویه استاندارد نشان نمی دهد. لیپوزوم کاتیونی نیز در غلظتی مشابه با داروی آزاد، قادر به مهار رشد جدایه 62 است. Yang Li و همکارانش در بررسی قدرت ضد میکروبی لیپوزوم کلیستین بر استافیلوکوکوس ارئوس MIC همانند داروی آزاد به دست آوردند (20).

ج) کاهش MIC: کمترین غلظت مهارکنندگی لیپوزوم آنیونی پیپراکتام بر روی هر سه سویه کمتر از داروی آزاد بوده و بین 4 تا 8 برابر قدرت ضدمیکروبی آنها بیشتر است.  در مطالعه Derbali و همکارانش که به تهیه و اثر فرمولاسیونهای لیپوزوم آنیونی، کاتیونی و پلیمری حاوی لووفلوکساسین برای درمان عفونتهای P.aeruginosa در بیماران سیستک فیبروزیس پرداخته اند لیپوزوم آنیونی کارآمدترین فرمولاسیون معرفی شده است (13). Omri و همکاران نیز MIC  لیپوزوم آنیونی حاوی متی سیلین را نصف داروی آزاد ارزیابی کردند  (27). کاهش MIC آنتی بیوتیک های محصور شده در فرمولاسیونهای لیپوزومی به دلیل افزایش نفوذ پذیری غشای باکتریها در مجاورت ساختارهای لیپوزومی است که با مکانیسمهای مختلفی انجام می شود. لیپوزومهای کاتیونی با ایجاد منفذ در دیواره باکتری شانس ورود دارو را افزایش می دهند. در غشای خارجی باکتریها فسفولیپیدهای آنیونی و فسفاتیدیل اتانول آمین دیده می‌شود که در مجاورت لیپوزومهای کاتیونی آرایش آنها تغییر کرده و در اثر بازآرایی مرزهای معیوبی با دیگر فسفولیپیدها ایجاد می‌کند. همین مسئله باعث شکل‌گیری منفذ در ساختار غشای باکتری شده و آنتی بیوتیک بیشتری وارد باکتری می‌شود (15). درمکانیسم دیگری که در مواجهه لیپوزومهای فزوژنیک با غشا باکتریها مشاهده می شود لیپوزوم با غشای باکتری ممزوج شده سپس دارو به درون باکتری آزاد می شود (30). در ساخت لیپوزومهای فزوژنیک حضور فسفولیپیدهای اتانول آمین ضروری است (36).  

رهایش دارو از ذرات لیپوزومی در مجاورت غشای باکتری، باعث افزایش شیب غلظت دارو به درون باکتری شده و شانس ورود مولکولهای دارو را افزایش می دهد. این متداول ترین مکانیسم لیپوزوم برای افزایش نفوذپذیری غشای باکتری است که تحت تأثیر عوامل متعددی همانند ترکیب فسفولیپیدی لیپوزوم، بار لیپوزوم، درصد انکپسولاسیون، پروفایل آزادسازی دارو از لیپوزوم و تعداد ذرات لیپوزوم قرار دارد(22).

در اکثر مطالعات لیپوزومی به دلیل وجود بار منفی در غشای باکتری (P.aeruginosa 26- میلی ولت) شکل‌گیری منفذها در حضور لیپوزومهای کاتیونی محتمل بوده که موجب کاهش MIC می شود اما در پژوهش حاضر لیپوزومهای آنیونی اثرگذاری بیشتری نسبت به کاتیونی دارند که با توجه به درصد انکپسولاسیون تقریباً مشابه، پروفایل آزادسازی دارو می تواند دلیل MIC پایین تر این فرمولاسیون ‌باشد؛ یعنی لیپوزوم آنیونی بهتراز نوع کاتیونی توانسته است دارو را در مجاورت باکتری آزاد کرده و راندمان بالاتری در انتقال دارو به باکتری داشته باشد. در مطالعه Robinson و همکارانش که به مهار رشد فاز بیوفیلمی استرپتوکوکوس سالیواریوس با کمک انواع لیپوزومهای تریکلوزان پرداختند، لیپوزوم آنیونی تریکلوزان را مؤثرتر از کاتیونی گزارش کردند (32). مطالعه Derbali و همکارانش نیز از علل کارآمدی لیپوزوم آنیونی نسبت به کاتیونی، پروفایل آزادسازی لوفلوکساسین معرفی کرده است (13). در این تحقیق نیز لیپوزوم آنیونی با کاهشMIC  پیپراکتام بهترین فرمولاسیون لیپوزومی بوده و قدرت ضد میکروبی پیپراکتام را افزایش داده است.

نتیجه‌گیری کلی

برای درمان عفونتهای بیمارستانی حاصل از P.aeruginosa نیاز به توسعه فرمولاسیونهای دارویی است که افزایش راندمان درمان را به دنبال داشته باشد. لیپوزومها به عنوان سامانه های دارورسان زیست سازگار و تقویت کننده اثر آنتی بیوتیکها در انواع فرمولاسیونهای خنثی، کاتیونی و آنیونی حاوی پیپراکتام تهیه شدند. لیپوزوم نوع آنیونی پیپراکتام قدرت ضد میکروبی بیشتری نسبت به داروی آزاد، لیپوزومهای کاتیونی و خنثی نشان داد که احتمالاً به دلیل پروفایل آزادسازی دارو می‌باشد. این فرمولاسیون که از درصد انکپسولاسیون قابل‌قبول، اندازه کوچک، بار منفی (که برای سلولهای بدن سمی نیست) و پایداری فیزیکی خوبی برخوردار بوده است می‌تواند گام اولیه جهت توسعه لیپوزوم پیپراکتام باشد.

تشکر و قدر دانی

از همکاری کارکنان آزمایشگاههای دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین – پیشوا در پیشبرد این مطالعه تشکر و قدردانی می شود.