اثر قارچ اندوفیت و نانوذره اکسید روی بر برخی شاخصهای رشدی و فیتوشیمیایی گیاه عروسک پشت‌پرده در شرایط درون‌شیشه

صالح شهابی‌وند ^* و نسترن حیدری

ایران، مراغه، دانشگاه مراغه دانشکده علوم پایه، گروه زیست‌شناسی

تاریخ دریافت: 08/03/1400          تاریخ پذیرش: 08/07/1400

چکیده

قارچ اندوفیت ریشه Serendipita indica دارای خصوصیات مفید و منحصر به فردی جهت افزایش رشد، تولید محصول و مقاومت گیاهان به تنش­های زیستی و غیرزیستی است. مطالعات اخیر نشان داده که رشد، فیزیولوژی و تولید مواد فیتوشیمیائی گیاه به‌طور قابل‌توجهی توسط نانو ذرات فلزی تحت تأثیر قرار می‌گیرد. هدف از این پژوهش بررسی تأثیرات قارچ S. indica و نانوذرات اکسید روی بر میزان همزیستی، شاخص‌های رشدی و تولید برخی از مواد فیتوشیمیائی گیاه داروئی عروسک پشت پرده (Physalis alkekengi) در شرایط درون شیشه بود. تیمارها شامل دو سطح قارچ (وجود قارچ و فقدان قارچ) و پنج سطح نانوذره اکسیدروی (0، 5، 10، 15 و 20 میلی­گرم بر لیتر) بودند. با افزایش غلظت نانوذره در محیط کشت، درصد همزیستی و شاخص‌های رشدی گیاه بطور معنی‌داری افزایش یافتند. کاربرد نانوذره در برخی از سطوح، باعث افزایش در میزان فلاونوئید کل، فنل کل، آنتوسیانین و ظرفیت آنتی‌اکسیدان برگ و ساقه نسبت به گیاهان شاهد شد. حضور قارچ اندوفیت، شاخص‌های رشدی، فلاونوئید ساقه، آنتوسیانین برگ و ساقه، فنل کل برگ و ظرفیت آنتی‌اکسیدان برگ و ساقه را بطور معنی‌دار افزایش داد. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که نانوذره اکسید روی، به خصوص در سطح 20 میلی‌گرم،  به عنوان الیسیتور غیرزیستی و قارچ اندوفیت S. indica به عنوان الیسیتور زیستی می‌توانند باعث افزایش رشد و تولید برخی مواد فیتوشیمیائی در گیاه داروئی عروسک پشت‌پرده شوند.

واژه های کلیدی: آنتی‌اکسیدان، عملکرد، قارچ S. indica، نانوذره اکسید روی، گیاه داروئی عروسک پشت پرده

* نویسنده مسئول، تلفن:   04137256458  ،  پست الکترونیکی:  shahabi70@yahoo.com; shahabi@maragheh.ac.ir

مقدمه

قارچ آندوفیت Serendipita indica با ایجاد همزیستی با ریشه‌ گیاهان مهم اقتصادی و داروئی، رشد گیاه را افزایش داده و می‌توان به‌عنوان کود زیستی از آن استفاده کرد (7). S. indica از قارچ‌های بازیدیومیست متعلق به خانواده سباسیناسه (Sebacinaceae) بوده و در بیشتر خصوصیات مشابه قارچ‌های میکوریز آربوسکولار است. این قارچ باعث ایجاد خصوصیات مهم عملکردی در گیاه مانند افزایش زیست‌توده (Biomass)، افزایش مقاومت در برابر تنش‌هایی مانند فلزات سنگین، افزایش دما، نمک و بیماری­های قارچی شده و همچنین به عنوان کود زیستی، تعدیل‌کننده سیستم ایمنی و ابزاری برای تحقیقات پایه­ای، مطرح است (6). این قارچ متابولیت‌های ثانویه گیاهان مختلفی که دارای اهمیت اقتصادی هستند را تغییر داده و باعث افزایش رشد و تولید بذر در گیاهان می‌شود (31).

مطالعات اخیر نشان داده است که رشد و فیزیولوژی گیاهان به‌طور قابل‌توجهی توسط نانو ذرات فلزی تحت تأثیر قرار می‌گیرد (21). گیاهان نقش مهمی در جذب و ذخیره سازی نانوذرات در زنجیره‌های غذایی محیط زیست دارند (19). ویژگی‌های سطحی ذرات نانو آن­ها را واجد خصوصیات فوق‌العاده و منحصربه‌فردی می‌کند به طوریکه با افزایش تعداد اتم‌ها در سطح، انرژی آزاد درمجموع افزایش می‌یابد و منجر به تغییر ویژگی‌های مواد می‌شود. . اخیراً در بیوتکنولوژی گیاهی از نانو ذرات به‌عنوان عامل مؤثر در افزایش تولید متابولیت‌های ثانویه استفاده کرده‌اند (13).

عنصـر روی یکی از عناصـر کم‌مصرف ضـروری بـرای رشـد گیاه بوده و نقش مهمی در ساختار ۲۰۰ نوع آنزیم و پروتئین دارد. یون روی به‌عنوان کوفاکتور در برخی آنزیم­ها مانند اکسیدازها، دهیدروژنازها و پراکسیدازها عمل می‌کند و نقش تنظیمی در سنتز اکسین، متابولیسم نیتروژن و تقسیم سلولی دارد (33).

گیاه داروئی عروسک پشت پرده (Physalis alkekengi) از تیره سیب­زمینی (Solanaceae) است. اثرات درمانیP. alkekengi  می‌تواند به دلیل ترکیبات آنتی‌اکسیدانی ‌باشد. موادی مانند استروئیدها، فلاونوئیدها، فنیل‌پروپانوئیدها و آلکالوئیدها از قسمت‌های مختلف گیاه جداشده‌اند (20). این گیاه می‌تواند دفع اسید اوریک را افزایش دهد و برای بیماری‌های کلیوی و ادراری، نقرس و روماتیسم استفاده می‌شود. سایر خواص این گیاه عبارتند از: اثرات ضدالتهاب، ضد باکتری، ضد درد، ملین، دیورتیک و ضد مالاریا. علاوه بر این، تحقیقات پزشکی مدرن نشان داد که P.alkekengi بر روی سیستم ایمنی بدن، سلول­های سرطانی، هورمون‌های تیروئید، آنزیم‌های کبدی و هورمون‌های جنسی و تولید مثل مؤثر است (8).

با توجه به نتایج تحقیقات قبلی در ارتباط با اثرات مثبت قارچ S. indica در افزایش شاخص‌های رشدی (7 و 31) و برخی ترکیبات فیتوشیمیائی (3 و 33) و از طرف دیگر تاثیر تعدیل‌کنندگی نانوذره اکسید روی بر رشد (1 و 2) و ترکیبات شیمیایی (3، 10 و 28) گیاهان مختلف، هدف از تحقیق حاضر بررسی تاثیر میکروارگانیسم خاکزی S. indica بعنوان الیسیتور زیستی و نانوذرات اکسید روی بعنوان نانوالیسیتور غیرزیستی روی رشد و برخی مواد فیتوشیمیائی در گیاه دارویی عروسک پشت پرده (Physalis alkekengi) می­باشد.

مواد و روشها

نمونه­های بذر گیاه از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه شد. برای ضدعفونی، بذرها 5 دقیقه در محلول سفید کننده تجاری (هیپوکلریت سدیم) 5% قرار گرفتند و سپس دو بار با آب مقطر شستشو شده و در نهایت به زیر هود انتقال یافتند و سه بار با آب مقطر اتوکلاو شده، شستشو داده شدند. پس از ضدعفونی، بذرها به پلیت‌های استریل حاوی کاغذ صافی اتوکلاو شده، منتقل شدند. در هر پلیت شیشه‌ای، 5 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه شد تا رطوبت موردنیاز بذر تأمین گردد. سپس پلیت‌ها درون دستگاه فیتوترون با دمای 5/0± 25 درجه سانتی‌گراد و دوره 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. در این تحقیق از کشت درون شیشه استفاده شد. محیط کشت مورد استفاده جهت رشد گیاه عروسک پشت‌پرده محیط نیم هوگلند جامد (18) بود که به میزان 10 گرم بر لیتر آگار به محیط مایع هوگلند اضافه شد.

جهت تکثیر قارچ S. indica از محیط تغییر یافته آسپرژیلوس (17) استفاده شد. این محیط دارای عناصر ماکرو، عناصر میکرو، پپتون، گلوکز، عصاره مخمر و ویتامین­ها می­باشد. پلیت­ها پس از کشت در انکوباتور با دمای 1±29 درجه سانتی‌گراد قرارگرفتند. در ادامه هر سه هفته یک‌بار قارچ­ها واکشت شدند.

نانوذره اکسیدروی در آزمایشگاه شیمی آلی دانشگاه مراغه سنتز شد. به طور خلاصه، استات روی و اسید سیتریک به نسبت مولی 1:1 مخلوط شده و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق آسیاب شدند. پودر آسیاب شده در دمای 530 درجه سانتی گراد به مدت 10 ساعت قرار گرفت تا نانوذرات اکسید روی بدست آمد (35). پراش اشعه ایکس تهیه نانوذرات روی را تایید کرده و تصویر میکروسکوپ الکترونی روبشی یا SEM دانه‌بندی کروی و اندازه نانوذره در حدود 80 نانومتر را نشان داد (شکل 1).

شکل 1- الگوی پراش اشعه ایکس  (الف) و تصویر SEM نانوذره روی (ب)

تیمارها شامل دو سطح قارچ (وجود و فقدان قارچ) و پنج سطح نانوذره اکسید روی (0، 5، 10، 15 و 20 میلی‌گرم بر لیتر) بودند و برای هر تیمار 3 تکرار در نظر گرفته شد. برای اعمال تیمار قارچی، یک قطعه به ابعاد 1×1 سانتی‌متر از محیط کشت قارچ برداشته و در مرکز ظرف شیشه‌ای حاوی محیط کشت گیاه به‌صورت برعکس قرار داده شد. برای تهیه سطوح مختلف نانوذره روی، ابتدا برای تهیه محلول استوک (مادر)، 200 میلی‌گرم از نانوذره به حجم 200 میلی‌لیتر رسید. برای افزابش حلالیت نانوذره، محلول روی همزن مغناطیسی با حرارت 100 درجه کاملاً حل شد. سپس برای تهیه غلظت 20 میلی‌گرم بر لیتر نانوذره، 2 میلی‌لیتر از محلول استوک، برای تهیه غلظت 10 میلی‌گرم بر لیتر نانوذره، 5/1 میلی‌لیتر از محلول استوک، برای تهیه غلظت 10 میلی‌گرم نانوذره، 1 میلی‌لیتر از استوک و برای تهیه غلظت 5 میلی‌گرم بر لیتر نانوذره، 5/0 میلی‌لیتر از محلول استوک به حجم 100 میلی‌لیتر رسید.

پس از اعمال تیمارها گیاهچه­ها درون دستگاه فیتوترون با دمای 5/0± 25 درجه سانتی‌گراد و دوره 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی به مدت ده هفته قرار گرفتند.

بررسی میزان همزیستی: جهت اطمینان از ایجاد همزیستی بین قارچ و گیاه و تعیین درصد همزیستی از روش خطوط متقاطع (15) استفاده شد. ابتدا چندین قطعه­ی نازک با طول مشخص از ریشه­ی اصلی گیاه انتخاب و با آب شسته شد. رنگ‌آمیزی با روش فیلیپس و هیمن انجام شد (24). نمونه­های ریشه به مدت 5 دقیقه در KOH 10% گرم شده (50 درجه سانتی‌گراد) و در ادامه داخل محلول اسیدی رقیق HCl 1% قرار داده شدند. در نهایت از رنگ تریپان بلو 20% از قبل گرم شده (50 درجه سانتی‌گراد) به مدت 5 دقیقه استفاده شد؛ به این طریق فقط ریشه­های دارای همزیستی میکوریزی رنگ گرفتند. ریشه­ها در پلیتی که از قبل به مربع‌های cm 5/0 ×  cm 5/0 تقسیم‌شده بود، پخش شدند. سپس نقاطی از خطوط افقی و عمودی مربع‌ها که ریشه­های دارای همزیستی میکوریزی (با رنگ آبی) قطع کرده بودند، شمارش گردید. درصد همزیستی از تقسیم نقاطی که دارای همزیستی قارچی‌ بودند بر تعداد کل نقاط، ضرب در 100، محاسبه شد.

اندازه‌گیری پارامترهای رشد: به‌طور تصادفی از هر پلیت آزمایشی یک گیاه برداشت گردید. ارتفاع گیاه و طول ریشه و اندام هوایی با استفاده از خط‌کش تعیین و پس از جدا نمودن قسمت­های ریشه و اندام هوایی، وزن‌تر برای کلیه تیمارها محاسبه گردید. سپس نمونه­ها در درون پاکت کاغذی و به مدت 48 ساعت در دمای 50 درجه سانتی‌گراد در دستگاه آون قرار داده شدند تا وزن خشک آن‌ها تعیین گردد. وزن‌ تر و خشک به‌وسیله ترازوی دیجیتالی با دقت 001/0 تعیین شد.

اندازه‌گیری میزان فلاونوئید کل: محتوی فلاونوئید کل بر اساس روش چنگ و همکاران (9) با اسـتفاده از معرف آلومینیم کلراید اندازه‌گیری شد. مخلوط آزمایشی دارای 20 میکرولیتر از عصاره متانولی، 600 میکرولیتر متانول 95 درصد اسیدی، 40 میکرولیتر محلـول کلراید آلومینیم 10 درصد، 40 میکرولیتر محلول استات پتاسیم یک مولار و 120/1میلی‌لیتر آب مقطر بود. جذب مخلوط 40 دقیقه بعد از نگهـداری در دمـای اتـاق، در طول‌موج 415 نانومتر در مقابـل شاهد توسط اسپکتروفتومتر (Shimadzu, UV-1800) قرائـت شـد. شاهد محتوی تمام مواد بالا به‌جز عصاره گیاه بود و به همان میزانی که از عصاره گیاه برداشته شد، آب مقطر اضافه شد. از کوئرستین به‌عنوان اسـتاندارد بـرای رسـم منحنی کالیبراسیون استفاده شد. میزان فلاونوئیـد بـر اسـاس میـزان معادل "میلی‌گرم کوئرستین در گرم عصـاره" گـزارش گردید. اصول رنگ سنجی آلومینیوم کلراید ، تشکیل کمپلکس­های­ اسیدی آلومینیوم کلراید با گروه کتون و یا هیدروکسیل فلاونوئیدها است که این ترکیبات بیشترین جذب را در طول‌موج 415 نانومتر دارند (9).

اندازه‌گیری ­آنتوسیانین: برای سنجش میزان آنتوسیانین کل، مقدار 02/0گرم از بافت خشک گیاهی با 4 میلی­لیتر محلول متانول اسیدی (متانول 99 درصد به‌علاوه اسیدکلریدریک 1 درصد به نسبت 99 به 1) در یک هاون چینی ساییده و محلول حاصل به مدت 24 ساعت در یخچال نگهداری شد. سپس محلول به مدت 10 دقیقه و در rpm13000 سانتریفیوژ گردید. فاز رویی را برداشته و جذب محلول‌ها در طول‌موج 530 و 675 نانومتر نسبت به شاهد قرائت شد. از محلول متانول اسیدی به‌عنوان شاهد استفاده گردید. مقدار آنتوسیانین از فرمول روبه‌رو محاسبه گردید (22): C = A530 – (0.25 × A675)

اندازه‌گیری فنل کل: برای سنجش میزان فنل کل مقدار 02/0گرم از بافت گیاهی با 4 میلی­لیتر محلول متانول اسیدی (متانول  99 درصد به علاوه اسید کلریدریک 1 درصد به نسبت 99 به 1) در یک هاون چینی ساییده شد. محلول حاصل به مدت 24 ساعت در یخچال نگهداری شد، سپس محلول به مدت 10 دقیقه و در 13000 دور سانتریفیوژ گردید. فاز رویی را برداشته و جذب محلول­ها در طول موج 280 نانومتر نسبت به شاهد قرائت شد (12). از محلول متانول اسیدی به عنوان شاهد استفاده گردید. از اسید گالیک بـه عنـوان اسـتاندارد بـرای رسـم منحنـی کالیبراسیون استفاده شد.

اندازه گیری ظرفیت آنتی اکسیدانی (درصد مهار پراکسید هیدروژن): محلول پراکسید هیدروژن 40 میلی­مولار در بافر فسفات (50 میلی مولار و 4/7 (pH:تهیه شد. 6/1 میلی­لیتر از نمونه با 6/0 میلی­لیتر محلول پراکسید هیدروژن مخلوط شده و پس از ده دقیقه، میزان جذب در طول موج 230 نانومتر در برابر بلانک (بافر فسفات) قرائت شد (16). درصد مهار پراکسید هیدروژن با فرمول روبه‌رو محاسبه ­شد: (%) = (A_max - A_t/A_max) × 100

=A_maxجذب ماکزیمم و =Atجذب نمونه. جذب ماکزیمم برای محلولی است که حاوی پراکسید هیدروژن بوده اما فاقد عصاره یا نمونه مورد نظر است.

آنالیز آماری: داده­های این مقاله بصورت فاکتوریل در قالب بلوک­های کاملا تصادفی با سه تکرار بررسی شده و با استفاده از نرم افزار SPSS   نسخه 20 مورد تجزیه قرار گرفتند. مقایسه میانگین‌ها با آزمون دانکن و در سطح احتمال 5 درصد انجام گرفت.

نتایج

بررسی همزیستی گیاه عروسک پشت‌پرده با قارچ S. indica: نتایج نمودار 1 نشان داد که در گیاهان تیمار شده با قارچ اندوفیت همزیستی بین گیاه و قارچ انجام گرفت. با افزایش مقدار نانوذره در محیط کشت، میزان همزیستی بیشتر شد، هرچند که در بالاترین سطح نانوذره درصد همزیستی اندکی نسبت به سطح قبلی کاهش یافت ولی این کاهش معنی‌دار نبود (نمودار 1(.

نمودار 1- اثر سطوح مختلف تیمار نانوذره اکسید روی بر میزان همزیستی (%) ریشه گیاه عروسک پشت پرده. حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد است.

تاثیر تیمارها بر پارامترهای رشدی گیاه عروسک پشت پرده: طبق جدول 1، تیمار نانوذره اکسید روی اثر مثبت بر شاخص‌های رشدی گیاه تره‌تیزک داشت، بطوریکه با افزایش غلظت نانوذره در محیط کشت، طول اندام هوایی و ریشه و نیز وزن تر و خشک ریشه و اندام هوایی افزایش یافت. البته در برخی سطوح نانوذره، این افزایش نسبت به سطح صفر نانوذره (شاهد) و نسبت به سطح قبلی، معنی‌دار نبود (جدول 1). بیشترین مقدار مربوط به شاخص‌های طول اندام هوایی و ریشه و وزن تر و خشک اندام هوایی و ریشه در سطح 20 میلی‌گرم نانوذره دیده شد.

بر طبق جدول 2، قارچ S. indica اثر مثبت بر پارامترهای رشدی گیاه P. alkekengi داشت بطوریکه باعث افزایش معنی‌دار در کلیه پارامترهای رشدی گیاه یعنی طول اندام هوایی و ریشه و نیز وزن تر و خشک اندام هوایی و ریشه شد.

طبق جدول 3، تیمار نانوذره روی با غلظت­های 5، 10 و 15 میلی‌گرم، نسبت به شاهد، تغییر معنی­داری بر میزان فلاونوئید برگ گیاه P. alkekengi نداشت ولی مقدار 20 میلی­گرم نانوذره تغییر مثبت معنی­دار داشت. همچنین تمام مقادیر نانوذره باعث افزایش مقدار فلاونوئید ساقه، نسبت به شاهد شدند که در این میان مقادیر 10 و 15میلی­گرم، تاثیر معنی‌دار داشته‌اند. براساس جدول 3، غلظت­های 5 و 20 میلی‌گرم نانوذره اکسید روی، نسبت به شاهد، بر میزان آنتوسیانین برگ اثر معنی­دار افزایشی داشت و مقدار20 میلی‌گرم نانوذره بیشترین تاثیر را داشت.

جدول 1- اثر تیمار نانوذره اکسید روی بر صفات رشدی گیاه عروسک پشت پرده

حروف متفاوت در هر ستون  نشان دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد است: مقایسه میانگین­ها حاصل از آزمون چند دامنه دانکن می باشند.

جدول 2- اثر قارچ S.indica بر صفات رشدی عروسک پشت‌پرده

حروف متفاوت در هر ستون  نشان دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد است: مقایسه میانگین­ها حاصل از آزمون چند دامنه دانکن می باشند.

در مورد میزان آنتوسیانین ساقه، فقط سطح 15 میلی‌گرم نانوذره باعث افزایش معنی‌دار نسبت به شاهد شد (جدول 3). در مورد ظرفیت آنتی‌اکسیدانی کل برگ، هر چند که در تمام سطوح نانوذره افزایش میزان این پارامتر نسبت به شاهد، دیده شد ولی در سطح 10 میلی‌گرم نانوذره، این افزایش معنی‌دار بود (جدول 3). ظرفیت آنتی‌اکسیدانی ساقه تنها در سطح 20 میلی‌گرم نسبت به شاهد افزایش داشت که این افزایش معنی‌دار نبود (جدول 3).

جدول 3- اثر تیمار نانوذره اکسید روی بر ویژگیهای فیتوشیمیایی گیاه تره‌تیزک.

حروف متفاوت در هر ستون  نشان دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد است: مقایسه میانگین­ها حاصل از آزمون چند دامنه دانکن می باشند.

برطبق جدول 4، حضور قارچ S. indica بر میزان فلاونوئید برگ نسبت به شاهد اثر معنی­دار کاهشی داشت ولی در ساقه گیاه P. alkekengi باعث افزایش میزان فلاونوئید در مقایسه با گیاهان شاهد شد. در مورد آنتوسیانین هم در برگ و هم در ساقه حضور قارچ S. indica باعث افزایش میزان آنتوسیانین نسبت به گیاهان شاهد شد. اثر اصلی قارچ S. indica بر میزان فنل کل در ساقه گیاه P. alkekengi تاثیر معنی­داری نداشته است ولی باعث افزایش میزان آن در برگ شده است. بر طبق جدول 4، حضور قارچ S. indica باعث افزایش میزان ظرفیت‌آنتی اکسیدانی (درصد مهار پراکسید هیدروژن) در برگ و ساقه گیاه عروسک پشت‌پرده نسبت به نمونه‌های شاهد بدون قارچ شد.

بحث

نتایج نشان داد (نمودار 1) که در گیاهان تلقیح نشده با قارچ، کلونیزه شدن ریشه مشاهده نشد. گیاهان تلقیح شده با قارچ همزیستی موثری با S. indica نشان دادند و افزودن نانوذره اکسید روی باعث افزایش میزان همزیستی قارچ S. indica با ریشه گیاه P. alkekengi شد. سینگال و همکاران (27) نشان دادند که نانولوله­های اکسید روی تا غلظت ppm500 بر لیتر باعث افزایش رشد  S. indica می­شود.  

جدول 4- اثر قارچ S. indica بر ویژگیهای فیتوشیمیایی گیاه تره‌تیزک.

حروف متفاوت در هر ستون  نشان دهنده اختلاف معنی‌دار در سطح 5 درصد است: مقایسه میانگین­ها حاصل از آزمون چند دامنه دانکن می باشند.

وارما و همکاران (30) در پژوهشی که در مورد تاثیر نانوذره­های مختلف بر روی رشد قارچ S. indica انجام دادند مشاهده نمودند که نانوذره اکسید روی بیشتر از نانوذره­های اکسید تیتانیوم (TiO₂)، نانولوله کربن (CNT) و نانوذره نقره بر روی رشد قارچ S. indica موثر است. همچنین افزودن نانوذره اکسید روی به محیط کشت باعث افزایش بیومس قارچ S .indica می­گردد. با توجه به نتایج ذکر شده و پژوهش حاضر می­توان نتیجه گرفت که نانوذره اکسید روی، احتمالاً با توجه به ضروری بودن عنصر روی در رشد و تاثیر آن بر فعالیت آنزیم‌های مختلف متابولیسمی قارچ اندوفیت، باعث افزایش رشد قارچ و لذا افزایش میزان همزیستی قارچ S. indica با ریشه گیاه P. alkekengi می­شود.

همچنین پژوهش حاضر نشان داد که نانوذرات اکسید روی بر پارامترهای رشدی گیاه عروسک پشت‌پرده تاثیر مثبت معنی­داری می­گذارند. پاسخ گیاهان به نانوذرات بر اساس نوع گونه، مرحلۀ رویشی، سن و ماهیت نانوذرات متفاوت است (36). یون روی بعنوان کوفاکتور برخی آنزیم­ها مانند اکسیدازها، دهیدروژنازها و پراکسیدازها عمل می­کند و نقش تنظیمی در سنتز اکسین، متابولیسم نیتروژن و تقسیم سلولی دارد (33).  مشخص گردیده که تیمار نانوذرات اکسید روی، همه پارامترهای اندازه­گیری شده در گیاه لوبیای سبز که شامل وزن خشک ریشه و ساقه و نیز طول ریشه و ساقه در گلدان را نسبت به تیمارهای اکسید روی معمولی بهبود می­بخشد (2). در تحقیقی دیگر، گیاه کرچک با نانواکسیدروی با غلظت­های صفر، 100،10، 500 و1000 میلی گرم بر لیتر تیمار شد و نتایج حاصل نشان داد که در غلظت­ 10 میلی‌گرم سبب افزایش درصد و سرعت جوانه زنی، طول ریشه‌چه، ساقه‌چه و میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی شد و در غلطت‌های بالاتر احتمالاً تنش اکسیداتیو ناشی از سمیت فلز روی، تاثیر منفی بر رشد داشت (1). از آن جا که روی در تولید اکسین نقش دارد، افزایش رشد گیاه به دلیل گسترش طول گره­های داخلی را به افزایش اکسین نسبت داده­اند (26). البته سازوکار مشخصی در خصوص تاثیر عنصر روی بر انتقال اکسین در پیکره گیاه هنوز ارائه نشده­است. به نظر می­رسد غلظت اکسین تابعی از غلظت عنصر روی در گیاه باشد. نسبت دو هورمون اکسین و آبسزیک اسید در ریشه بیش از بخش هوایی است که این افزایش نسبت اکسین در ریشه می‌تواند عامل اصلی افزایش وزن خشک و طول ریشه باشد (34). هر چند که در غلظت‌های بالاتر عنصر روی، سمیت روی می‌تواند اثر معکوس در شاخص‌های رشدی گیاه داشته باشد.

فلاونوئیدها که به عنوان ترکیبات فنلی و گروه بزرگی از ترکیبات ثانویه گیاهی مطرح هستند و در تحقیق حاضر نیز میزان آنها در اثر کاربرد نانوذره روی افزایش یافت، با تغییر دادن لیپیدهای غشاء سیالیت آن را کاهش داده، موجب افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی شده و در نتیجه در برابـر تـنش­هـای زیسـتی و غیرزیستی، نقش حفاظتی دارند (6، 23 و 25). در گیاه بادرنجبویه با افزایش غلظت نانوذره اکسید مس، محتوی فلاونوئید کل افزایش یافت (4). در پژوهشی دیگر García-López و همکاران (14) نشان دادند که محلول پاشی نانوذره اکسید روی بر گیاه  Capsicum annuum باعث افزایش فلاونوئیدکل می­شود. با توجه به این نتایج به نظر می‌رسد که افزایش میزان فلاونوئیدهای گیاه عروسک پشت پرده یک نوع پاسخ دفاعی گیاه در برابر افزایش میزان فلز روی باشد.

در راستای افزایش میزان فلاونوئیدهای ساقه و برگ گیاه عروسک پشت پرده در اثر تیمار با قارچ اندوفیت در مطالعه حاضر، در تحقیقی مشابه که در مورد اثر قارچ S. indica بر روی گیاه نعناع فلفلی بود نشان داده شد که تلقیح با قارچ باعث افزایش میزان فلاونوئید کل در گیاه می‌شود (3). افزایش ترکیبات فنلی مانند فلاونوئیدها در مواجهه با قارچ به چند عامل بستگی دارد: واکنش سیستم دفاعی گیاه به کلونیزه شدن قارچ در ریشه و افزایش جذب مواد غذایی معدنی از ریشه بعلت گسترش هیف­های قارچی در ریشه گیاه (28).

در تحقیق حاضر نانوذره روی در برخی سطوح باعث افزایش میزان آنتوسیانین برگ و ساقه شد که می‌تواند ناشی از نقش آنتی‌اکسیدانی آنتوسیانین‌ها به عنوان گروهی از فلاونوئیدهای گیاهی در جمع‌آوری گونه‌های فعال اکسیژن تولیدی در اثر غلطت بالای فلز روی باشد (32) . در پژوهشی که برروی گیاه تنباکو و تیمار آن با نانوذرات اکسید روی انجام شد نتایج به­دست آمده نشان داد که نانوذرات اکسید روی باعث افزایش میزان آنتوسیانین گیاهان تیمار شده نسبت به گیاهان شاهد شدند (10). آنتوسیانین­ها به عنوان یک گروه از فلاونوئیدهای محلول در آب بوده و افزایش آنتوسیانین­ها نشان دهنده افزایش مسیر اصلی تولید فلاونوئید است که در یک نقطه پایانی در مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها سنتز می­شوند. آنتوسیانین­ها با خاصیت آنتی­اکسیدانی از گیاه در برابر واکنش­های فتودینامیک آسیب رساننده، با سرکوب کردن گونه­های فعال اکسیژن محافظت می­کنند (32).

در پژوهش حاضر نشان داده شد که قارچ S. indica بر میزان ظرفیت آنتی‌اکسیدانی برگ و ساقه گیاه عروسک پشت پرده اثر افزایشی معنی‌داری دارد که می‌تواند ناشی از فعال کردن سیستم دفاعی گیاه تحت شرایط تنش فلز باشد. وهبی و همکاران (29) در پژوهشی نشان­دادند که قارچ S.indica باعث کاهش تولید H₂O₂ در گیاهArabidopsis thaliana  پس از مواجهه با آلودگیAlternaria brassicae  می­شود. این نتایج نشان‌دهنده اثر محافظت‌کنندگی قارچ S. indica در برابر استرس­های اکسیداتیو از طریق افزایش انواع آنتی‌اکسیدان‌ها و در نتیجه جمع‌آوری گونه‌های فعال اکسیژن و بخصوص پراکسید هیدروژن است. همچنین در این تحقیق تیمار نانوذره روی باعث افزایش ظرفیت آنتی‌اکسیدانی برگ در همه سطوح نانودره و ظرفیت آنتی‌اکسیدانی ساقه در برخی سطوح نانوذره شد (جدول 3). در آزمایش مشابه کاربرد نانوذره اکسید روی باعث افزایش آنتی‌اکسیدان کل و برخی آنتی‌اکسیدانهای غیر آنزیمی مانند فنل و فلاونوئید در گیاه Brassica napus شد (33). گیاهان از طریق سیستم آنتی‌اکسیدان، سمیت رادیکال‌های آزاد ناشی از تنش فلزاتی مانند روی را کاهش می‌دهند (5). همچنین این امر مهم است که در نظر بگیریم که برخی از نانوذرات ممکن است اثر محافظت زیستی در برابر آسیب گونه‌های فعال اکسیژن ایجاد کنند (10).