Document Type : Research Paper
Authors
Biology Department, Faculty of Science, Shahrekord University, Shahrekord, Iran
Abstract
Iranian drug CinnoVex (Interferon beta) is an important drug for preventing the progress of M.S. disease and increase of its stability is very important. In this research, we designed five mutations in the structure of interferon and performed molecular dynamics simulation and docking and the best stabilizer mutation was determined. At first, the wild type structure of beta interferon was subjected to Pop music server for prediction of stabilizer mutations. Then the first four proper score mutations were selected and mutated structures and a mix mutation (mut 2+ mut 3) (mut 5) were made. Then, molecular dynamics simulation performed via Gromacs 5 package on wild and mutated structures in five temperatures (300, 350, 400, 450, 500 K) separately for 20 ns (in total 600 ns). The simulation parameters were calculated in each temperature for all structures during the last 10 ns of simulations. The plots of temperature against averages of parameters were drawn and the regression slope of parameters was calculated to find the more stable structure. The results revealed that mutation 3 (G127E) is the best mutation compare to wild interferon. Also, the binding power of mutation 3 with its receptor is more than wild type and other mutations. It seems that the increase of hydrophilicity of protein around position 127 in mutation 3 on interferon surface leads to increase the stability and solubility of it ex vivo.
Keywords
Main Subjects
پیشگویی جهشهای پایدارکننده بالقوه پروتئین اینترفرون بتا-a1 (سینووکس) بهوسیله شبیهسازی دینامیک مولکولی
سوگند امیری فر1 و کریم مهنام1،2*
1 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم، گروه زیستشناسی
2 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، مرکز پژوهشی فناوری نانو
تاریخ دریافت: 29/04/1398 تاریخ پذیرش: 07/07/1399
چکیده
داروی ایرانی سینووکس (اینترفرون بتا) یک داروی مهم در جلوگیری از پیشرفت بیماری ام اس است و افزایش پایداری آن اهمیت زیادی دارد. در این تحقیق با طراحی پنج جهش برای این پروتئین و انجام شبیهسازی دینامیک مولکولی و داکینگ پایدارکنندهترین جهش، مشخص شد. برای انجام این کار در ابتدا ساختار طبیعی اینترفرون بتا به درگاه اینترنتی پاپ میوزیک داده شد تا جهشهای پایدارکننده پیشگویی شوند. سپس مدل چهارجهش مناسبتر پیشگویی شده توسط این سرور و یک جهش ترکیبی (جهش ترکیبی 2 و 3 یا جهش 5) از این پروتئین تهیه شد. سپس مدل هرکدام از این جهشها و ساختار طبیعی بهطور جداگانه در دماهای 300 و 350 و 400 و 450 و 500 کلوین به مدت 20 نانوثانیه بهوسیله برنامه گرومکس شبیهسازی دینامیک مولکولی شدند(درمجموع 600 نانوثانیه). سپس پارامترهای ساختاری برای هرکدام از این ساختارها در هر دما در 10 نانوثانیه آخر شبیهسازیها محاسبه شد و نمودارهای دما دربرابر میانگین پارامترها رسم شدند و شیب تغییرات ساختاری در اثر افزایش دما برای همه جهشها و ساختار طبیعی به دست آمد تا ساختارهای پایدارتر مشخص شوند. نتایج بهدستآمده نشان داد که جهش شماره سه (G127E) در بین پنج جهش پایداری بیشتری در مقایسه با ساختار اینترفرون طبیعی دارد. به علاوه قدرت اتصال جهش شماره سه به گیرنده اینترفرون نسبت به حالت وحشی و سایر جهشها بیشتر بود. به نظر میرسد که افزایش آبدوستی اطراف باقیمانده 127 در جهش 3 در سطح پروتئین منجر به افزایش حلالیت و پایداری بیشتر آن در خارج از بدن شده است.
واژه های کلیدی: اینترفرون بتا، پایداری، جهش، شبیهسازی دینامیک مولکولی، داکینگ
* نویسنده مسئول، تلفن:09134096831 ، پست الکترونیکی: mahnam.karim@sci.sku.ac.ir
مقدمه
اینترفرونها سیتوکینهای پروتئینی مهمی هستند که خاصیت ضدویروسی و ضد تکثیر دربرابر ویروسها و باکتریها را دارند. از نظر ساختاری اینترفرونها شماری از خانواده سیتوکینهای دارای هلیکس هستند و همچنین از خانواده فاکتورهای رشد در موجود زنده به شمار میآیند. فعالیت ضدویروسی و مقابله در برابر عوامل بیگانه، اینترفرونها را بهعنوان دارو برای بیماریهایی مثل هپاتیت، سرطانهای ویروسی و بیماری اماس (Multiple sclerosis) پیشنهاد کرده است )16 .( اینترفرونها در کاهش شمار حملههای اماس و آسیب مغزی و درکاهش التهاب نورونها نقش دارند. علاوه بر این در افزایش تولید فاکتور رشد عصبی و درنتیجه در بهبود بقای نورونها تأثیر دارند. با این وجود تمام بیماران به این دارو پاسخ نمیدهند یعنی سطح بالایی از اینترفرون در بیماری های خود ایمن توسط آنتیبادیها خنثی میشود )7(.
اینترفرونها به دو گروه طبقهبندی میشوند. نوع یک
اینترفرونها شامل آلفا، بتا، تاو و امگا است، درحالیکه گاما تنها عضو شناختهشده گروه دو اینترفرونها است )3(. اینترفرون بتا که توالی DNA آن در سلولهای پستانداران و مهره داران مثل پرندگان و ماهیهای استخوانی یافت میشود، به دو گروه β1a و β1b تقسیمبندی میشود که اینترفرون β1a خنثی سازی آنتی بادیها را در 5 تا 30 درصد بیماران تحریک می کند و هر دو گروه از طرف سازمان غذا و داروی آمریکا (FDA) برای درمان بیماری ام اس تائید شدهاند. اینترفرون بتا یک گلیکوپروتئین است که به صورت همودیمراست و بدون درنظرگرفتن پپتید علامت 332 باقیمانده دارد. 21 باقیمانده اول آن پپتید علامت (signal peptide) است. وزن مولکولی دیمرآن 5/22 کیلو دالتون است که 35 درصد از توالی آن با اینترفرون آلفا و 50 درصد با توالی اینترفرون بتای موش مشابهت دارد. توالی اینترفرون بتا در درگاه اینترنتی UniProt با کد P01574 و در پایگاه داده پروتئینی PDB با کد 1AU1 موجود است. ساختار کریستالوگرافی ازاینترفرون بتای انسان نشان میدهد که این پروتئین از پنج مارپیچ آلفا تشکیلشده است (4).
اینترفرونهای آلفا و بتا حدود 30 درصد در توالی باقی مانده مشابهت دارند و هردو باهم برای اتصال به گیرندههای مشابه رقابت میکنند )16(.
توانایی ایجادآپوپتوزتوسط اینترفرون بتا با القای مقدماتی مرگ تومور همراه با مولکولهایی که آپوپتوز را تحریک میکنند انجام میپذیرد. همچنین اینترفرون بتا تنظیمکننده بالینی آنتیژنهای سازگاری بافتی است که اجازه افزایش پپتیدهای مشتقشده از آنتیژنهای ویروسی را میدهد (4).
سینووکس (CinnoVex) نام تجاری اینترفرون بتا یک a است که در ایران بهصورت همسان زنده (تکثیر در باکتری (Ecoli تولید میشود. این دارو بهصورت تزریقی هفتهای یکمرتبه باید مصرف شود. علیرغم مزیت درمانی این پروتئین نگهداری و استفاده از این داروی زیستی با مشکلاتی همراه است و نیمهعمر این دارو درخارج از بدن نسبتاً کم است. همچنین در داخل بدن نیز درطول یک هفته دارو توسط آنزیمهای کبدی متابولیزه میشود یا از طریق کلیه دفع میگردد(12). گلیکوزیلاسیون در موتیف حفاظتشده Asn –x-Thr/ser منجر به پایدارتر شدن این پروتئین میشود)13(.
روشهای مختلف محاسباتی برای تغییر در پایداری پروتئین از طریق جهش توسعه یافته است. تمامی این روشها از ساختار سه بعدی پروتئین استفاده میکنند. یکی از این روشها، روش سرویس دهنده پاپ میوزیک است که توسط آقای دهوک و همکاران ابداع شد(6). این درگاه اینترنتی تغییرات پایداری ترمودینامیک ناشی از جهشهای نقطهای را با استفاده از ترکیب خطی پتانسیل های آماری پیش بینی می کند. ضرایب پتانسیل ها وابسته به سطح در دسترس حلال باقی مانده های جهش یافته است. این سرور پس از اتمام، لیستی از جهشهای پایدارکننده، ناپایدارکننده و بی اثر ایجاد میکند. این درگاه اینترنتی مقدارتأثیر یک جهش را به طور کمی در پایداری پروتئین محاسبه میکند که می تواند برای ارزیابی بهینه بودن جایگاه هر یک از باقی مانده ها در توالی پروتئین و بررسی پایداری ساختار آن استفاده شود (6).
شبیهسازی دینامیک مولکولی یک پروتئین یا اسید نوکلئیک حرکت اتمهای ماکرومولکول یا سامانه در طی یکزمان مشخص را با استفاده از حل معادله حرکت نیوتن و توابع انرژی پتانسیل بررسی میکند. خروجی شبیهسازی یک سری از ساختارهای ایجادشده در طی زمان شبیهسازی است که روند تغییرات ساختار را در طی زمان موردنظر ارائه میدهد که چگونگی این تغییرات دینامیک سامانه یا مولکول را منعکس میکند (15و5). شبیهسازیهای دینامیک مولکولی میتواند در هنگرد (ensamble) مقادیر ثابت تعداد اتم، حجم و دمای ثابت NVT)) یا هنگرد تعداد اتم، فشار و دمای ثابت (NPT)انجام شود. هنگرد NPT نتایج شبیهسازی با شرایط آزمایشگاهی همخوانی بیشتری دارد و رفتار واقعی سامانه در شرایط تجربی بهتر منعکس میشود. روشهای محاسباتی می توانند برای پیش بینی تغییرات ساختار پروتئین دراثر جهش استفاده شوند. آقای Doss همکارانش در سال 2012 با استفاده از روشهای محاسباتی اقدام به طراحی چند جهش روی آنزیم سیستاتیونین بتا سنتاز بهمنظورافزایش پایداری این آنزیم کردند )9(. آقای Pikkemaat و همکاران در سال 2002 روی آنزیم هالوآلکان دهالوژناز کارکردند و نشان دادند که شبیهسازی دینامیک مولکولی میتواند پیوندهای دی سولفید مهم که باعث پایداری میشوند، را مشخص کند. آنها برای افزایش پایداری پروتئین چند جهش روی ساختار آنزیم ایجاد کردند و مشاهده کردند که آنزیمهای جهشیافته، تغییرات قابلتوجهی را نسبت به حالت وحشی نشان می دهند و دمای ذوب پروتئین نسبت به حالت وحشی افزایش می یابد (17).
در این تحقیق بهمنظور افزایش پایداری این داروی پروتئینی در خارج از بدن و نگهداری طولانیتر در داروخانه و کاهش هزینه نگهداری اینترفرون بتا اقدام به پایدارسازی دارو بهوسیله طراحی جهشهای پایدارکننده و پیشگویی تغییرات پایداری به کمک روشهای نظری و شبیهسازی دینامیک مولکولی گردید.
شبیهسازی دینامیک مولکولی یک پروتئین یا اسید نوکلئیک حرکت اتمهای ماکرو مولکول یا سامانه در طی یکزمان مشخص را با استفاده از حل معادله حرکت نیوتن و توابع انرژی پتانسیل بررسی میکند. خروجی شبیهسازی یک سری از ساختارهای ایجادشده در طی زمان شبیهسازی است که روند تغییرات ساختار را در طی زمان موردنظر ارائه میدهد که چگونگی این تغییرات دینامیک سامانه یا مولکول را منعکس میکند (14).
مواد و روشها
|
در این تحقیق از روش شبیه سازی دینامیک مولکولی برای بررسی تغییر پایداری پروتئین دارویی اینترفرون بتا یک a استفاده شد. برای شبیه سازی ساختار کریستالوگرافی پروتئین بتا اینترفرون a از بانک PDB با کد 1AU1 و بزرگنمایی 2/2 انگستروم گرفته شد و شبیهسازی دینامیک مولکولی با برنامه گرومکس 5 در شرایط فشار و دمای ثابت (NPT) با میدان نیروی G43a1 به مدت 20 نانوثانیه انجام شد (15). برای انجام شبیهسازی ساختار کریستالوگرافی پروتئین اینترفرون در یک جعبه آب شامل 12774 مولکول آب با مدل spc216 قرار داده شد. همچنین 33 یون سدیم و 42 یون کلر بهطور تصادفی جایگزین مولکولهای آب شدند. ابتدا کل سامانه با الگوریتم کاهش پرشیب و سپس شیب مزدوج کمینه (minimize) شد. در مرحله بعد بهمنظور به تعادل رساندن حجم و دمای سامانه به مدت 500 پیکوثانیه شبیهسازی دینامیک مولکولی در هنگرد NVT (دما وحجم و تعداد مولکولهای ثابت) و سپس به منظور به تعادل رساندن دما و فشار سامانه 1000 پیکوثانیه در هنگرد NPT (دما و فشار و تعداد مولکولهای ثابت) با ثابت در نظر گرفتن مکان اتمهای پروتئین (position restraint) انجام شد. در مرحله نهایی 20 نانوثانیه شبیهسازی دینامیک مولکولی در هنگرد NPT و در دمای 300 کلوین و گام زمانی 2 فمتوثانیه بدون ثابت در نظر گرفتن مکان اتمهای پروتئین انجام شد(5 و9). جزئیات بیشتر در منبع 14 ذکر شده است (2و14).
همچنین ساختار کریستالوگرافی پروتئین به سرور پاپ میوزیک (http://dezyme.com/) داده شد (6). این سرور میتواند جهشهای پایدارکننده ساختار پروتئین را پیشبینی کند و آنها را برحسب تغییرات پایداری ترمودینامیکی (Thermodynamic stability changes) نسبت به حالت وحشی مرتب میکند. سپس چهارجهش پیشنهادی اول (شکل 1) با منفیترینΔΔG (تغییرات پایداری ترمودینامیکی حالت جهشیافته نسبت به حالت وحشی) انتخاب شد. مقادیر ∆∆G در این شکل در زیر هر باقی مانده نوشتهشده است که مجموع تغییرات انرژی جهش آن باقی مانده به 19 باقی مانده دیگر است.
شکل 1- نتایج سرورپاپ میوزیک در مورد نقاط مستعد به جهش در پروتئین همودیمر اینترفرون. قسمت های سبز رنگ و قرمز و سبز پررنگ و صورتی به ترتیب ساختار کویل(C) ( کلاف بختانه)، مارپیچ آلفا(H)، پیچ ( (Bend (S) و پیوند های هیدروژنی کوتاه برد در مارپیچ (T) هستند . مقادیرGΔΔ در زیر هر باقی مانده ذکر شده است. در جهش1 هردوی والین 314 و 148و در جهش 2 هردوی گلوتامات 107 و 273 و در جهش 3 هر دوی گلیسین 127 و 293 و در جهش 4 هردوی لوسین 32 و 198 جهش داده شده اند.
انتخاب جهشهای پایدارکننده به این صورت است که ابتدا باقی مانده هایی که دارای منفیترین ∆∆G بودند بعنوان نقاط مستعد انتخاب شدند که عبارت بودند ازوالین 314 و گلوتامات 273 و گلیسین 127 و لوسین 198. از آنجایی که پروتئین اینترفرون همودیمر می باشد و تعداد باقی مانده های هر مونومر آن 166 می باشد و ایجاد جهش ها در هر دو زیر واحد بطور همزمان انجام شد در ادامه مقاله برای ذکر شماره جهش ها از شماره های باقی مانده های زیر واحد اول یعنی والین 148 و گلوتامات 107 و گلاسین 127 و لوسین 32 استفاده شد. مثلا منظور از جهش والین148، جهش همزمان در والین 148 و 314 است. همچنین برای هر کدام از این نقاط مستعد بهترین و منفی ترین ∆∆G از بین 19 جهش انتخاب شد که عبارت بودند از جهش والین 148 به گلوتامات (جهش 1) و جهش گلوتامات 107 به ایزولوسین(جهش 2) و جهش گلیسین 127 به گلوتامات (جهش 3) و جهش لوسین 32 به پرولین(جهش 4)
پس از انتخاب جهشها با استفاده از برنامه هایپرکم 8(Hyperchem 8) چهار جهش بهطور جداگانه در ساختار دیمر ایجاد شد. همچنین یک جهش از ترکیب جهش 2 و 3 تهیه شد(جهش 5). این ساختارهای جهشیافته بهصورت فایل PDB ذخیره شدند.
تحمل دمای بالا و حفظ عملکرد و تاخوردگی و ساختار پروتئین ها یکی از مهمترین پارامترها برای تطابق موجود زنده با شرایط محیطی است. بنابراین جلوگیری از تغییرات ساختاری به منظور حفظ عملکرد پروتئین ها در دمای بالاتر از حد عادی یک مساله حیاتی برای موجود زنده است. ما نیز به طورمنطقی انتظار داریم پروتئین های پایدارترمثل پروتئین های ترموفیل در اثرافزایش دما تغییرات ساختاری نامطلوب کمتری را متحمل شوند. دراین مقاله اثر دما روی تغییرات ساختاری بررسی شده است و می توان انتظار داشت که پروتئین هایی که دراثر افزایش دما تغییرات ساختاری کمتری داشته باشند، پایدارتر باشند. بنابراین هرکدام از جهشها و ساختار طبیعی در پنج دما (300 و 350 و 400 و 450 و 500 کلوین) بهطورجداگانه و به مدت 20 نانوثانیه شبیهسازی شدند. این محدوده دمایی هرچند در شرایط تجربی نمی تواند وجود داشته باشد ولی در کار های نظری می توان از استفاده کرد و دمای بالا باعث شکسته شدن پیوندهای پروتئین نمی شود. در این مطالعه هدف از افزایش دما فراهم آوردن امکان باز شدن پروتئین و بررسی پایداری آن بود. در مقالات دیگر هم از شبیه سازی در دمای بالا استفاده شده است (18). بنابراین درمجموع برای همه جهشها و ساختار طبیعی (6 ساختار) در 5 دما به مدت 600 نانوثانیه شبیهسازی دینامیک مولکولی انجام شد. سپس مقادیرRMSD (جذر میانگین جابهجایی اتمها نسبت به لحظه شروع)،RMSF (جابهجایی مکان هرباقی مانده نسبت به مکان لحظه شروع خودش)، سطح در دسترس کل پروتئین، سطح در دسترس باقیماندههای غیر قطبی، سطح در دسترس باقیماندههای قطبی، شعاع چرخش پروتئین (Rg)، تعداد پیوندهای هیدروژنی پروتئین با خودش، تعداد پیوندهای هیدروژنی پروتئین با آب، پارامتر ناپایداری و محتوی ساختار دوم پروتئین برای همه شبیهسازیها محاسبه شد و شیب هر یک از پارامترها در اثر افزایش دما روی نمودار محاسبه شد تا تغییرات ساختارها (که از مقایسه هر جهش با خودش بهدستآمده بود) در حالت جهش یافته و حالت وحشی بدست آید.
یکی دیگر از راههای نشان دادن پایداری پروتئین و میزان حلالیـت آن (∆Gsol)، محاسبه انرژی آزاد حلالیت است که هر چه کمتر باشد نشاندهنده حلالیت بیشتر پروتئین است (19). در این پژوهش انرژی آزاد حلالیت همه جهشها و ساختار طبیعی در همه دماها محاسبه شد. برای محاسبه انرژی آزاد حلالیت از ده نانوثانیه آخر هرشبیهسازی بیست ساختاراستخراج شد و انرژی آزاد حلالیت این ساختارها توسط برنامه APBS(Adaptive Poisson-Boltzmann Solver) محاسبه شد (1 و10) و سپس از این انرژیها میانگین گرفته شد.
پساز انجام آنالیزهای شبیهسازی، ساختار نهایی همه جهشها و حالت وحشی که در دمای 300 کلوین بهدستآمده بود به گیرنده اینترفرون (کد PDB: 1n6v) داک شد تا مشخص شود که کدامیک از جهشیافتهها به گیرنده خود محکمتر اتصال مییابد. باقی مانده های 44 و 45 و 46 و 47 و 100 و 107 بعنوان باقی مانده های فعال برای گیرنده و همچنین باقی مانده های 41 و 42 و 46 برای پروتئین اینترفرون وحشی یا جهش یافته در نظر گرفته شدند(11). برای انجام داکینگ ساختار وحشی وجهشیافته اینترفرون به گیرندهاش ازسرور هادداک (http://haddock.science.uu.nl/services/HADDOCK/ haddock server-easy.html) استفاده شد (8). در ضمن هرچه انرژی اتصال منفیتر باشد اتصال قویتراست.
نتایج و بحث
نتایج شبیهسازی دینامیک مولکولی: نمودار تغییرات جذر میانگین مربع انحرافات (RMSD) پروتئین در حالت وحشی و جهش یافته در طول زمان شبیهسازی در دما 300 کلوین در شکل 2 نمایش دادهشده است.
شکل 2- جذر میانگین مربع انحرافات(RMSD) پروتئین اینترفرون وحشی (native) و جهش های 1(m1) و جهش 2m2) ) و جهش 3(m3) و جهش 4(m4) و جهش 5(m5) در دمای 300 کلوین در طول 20 نانوثانیه شبیهسازی دینامیک مولکولی
همانطور که در این شکل مشخص است، در ده نانوثانیه پایانی شبیهسازی در همه حالت های پروتئین در دمای 300 کلوین به تعادل ساختاری رسیده اند. بنابراین میانگین همه آنالیزها در 10 نانوثانیه آخر محاسبه شد.
بعد از ایجاد جهش و شبیهسازی در 5 دما برای هر جهش پارامترهای ذکرشده در هر دما برای هر سویه به دست آورده شد و از هر پارامتردر 10 نانوثانیه آخر شبیه سازی میانگین گرفته شد ونمودار نقاط میانگین هر پارامتر در برابر دما رسم شد و شیب بهترین خط عبوری از بین نقاط به دست آورده شد (برازش) و روند تغییر آن پارامتر نسبت به افزایش دما مشخص شد. هرچه شیب این خط کمتر باشد افزایش دما اثر کمتری روی آن پارامتر خواهد داشت و آن جهش پایدارتر است. بهعبارتدیگر در اثر افزایش دما آن ساختار کمتر دچار تغییر و تحول میشود. ازآنجاییکه هدف ما پیدا کردن جهشی است که منجر به پایداری بیشتر اینترفرون نسبت به حالت وحشی باشد، انتظار می رود شیب تغییرات در جهش پیشنهادی این تحقیق کمتر از فرم وحشی باشد و نسبت به فرم وحشی پایداری بیشتری به دست آید. نتایج شیب تغییرات پارامترها در جدول 1 نشان دادهشده است.
جدول 1- شیب تغییرات پارامترها در برابر دما برای ساختار وحشی و حالتهای جهشیافته
شیب
شییب پارامتر
|
وحشی |
جهش 1 V148E |
جهش 2 E107I |
جهش 3 G127E |
جهش 4 L32P |
جهش 5 (ترکیبی) |
مجموع انرژی الکتروستاتیک و واندروالسی پروتئین-آب |
7/46 |
3/38 |
7/33 |
7/39 |
32/36 |
56/39 |
RMSD اسکلت اصلی دیمر |
005/0 |
005/0 |
004/0 |
004/0 |
006/0 |
005/0 |
RMSD مونومر |
003/0 |
004/0 |
003/0 |
0046/0 |
004/0 |
003/0 |
RMSF اسکلت اصلی باقیماندهها |
003/0 |
003/0 |
0029/0 |
0027/0 |
002/0 |
002/0 |
شعاع چرخش کل پروتئین |
002/0- |
001/0- |
001/0- |
001/0- |
001/0- |
001/0- |
شعاع چرخش مونومر |
0004/0 |
0004/0 |
0002/0 |
0001/0 |
0004/0 |
0005/0 |
فاصله مرکز جرم دومونومر |
0069/0- |
0061/0- |
0031/0- |
0037/0- |
0064/0- |
005/0- |
سطح در دسترس حلال |
043/0 |
032/0 |
01/0 |
021/0 |
052/0 |
014/0 |
سطح در دسترس حلال مونومر |
12/0 |
098/0 |
059/0 |
053/0 |
097/0 |
085/0 |
سطح در دسترس باقیماندههای قطبی |
02/0 |
015/0 |
005/0 |
01/0 |
02/0 |
015/0 |
سطح در دسترس حلال باقیماندههای غیر قطبی |
24/0 |
032/0 |
055/0 |
04/0 |
04/0 |
041/0 |
تعداد پیوند هیدروژنی پروتئین- پروتئین |
42/0- |
43/0- |
35/0- |
34/0- |
39/0- |
40/0- |
تعداد پیوند هیدروژنی پروتئین- آب |
04/1- |
12/1- |
11/1- |
26/1- |
14/1- |
12/1- |
تعداد پیوندهای هیدروژنی بین مونومر |
11/0 |
11/0 |
07/0 |
04/0 |
1/0 |
07/0 |
پارامتر ناپایداری |
03/0- |
26/0- |
23/0- |
02/0- |
039/0- |
039/0 |
افزایش تعداد باقی ماندههای شرکتکننده در کلاف بختانه |
42/0 |
46/0 |
36/0 |
11/0 |
46/0 |
46/0 |
تعداد باقی ماندههای شرکتکننده در ساختار سخت |
85/0- |
92/0- |
65/0- |
46/0- |
81/0- |
82/0- |
انرژی آزادگیبس حلالیت |
52/26 |
32/14 |
52/16 |
81/17 |
49/21 |
95/17 |
نتایج جذر میانگین مربع انحرافات RMSD)): از نظر تغییرمیانگین RMSD اسکلت اصلی دیمر در برابر دما، به نظر میرسد همه جهشیافتهها تغییر ساختار قابل توجهی نسبت لحظه شروع شبیهسازی نداشتهاند و جهشها و فرم وحشی عکسالعمل یکسانی در برابر افزایش دما از خود نشان میدهند یا اگر اختلاف دارند این اختلافات ناچیز است. پروتئین اینترفرون همودیمر است و هر دو مونومر کاملاً باهم یکساناند. ازآنجاکه RMSD دیمر متعلق به دو زیر واحد است و ممکن است ارتباط و فاصله مونومرها روی نتایج اثر بگذارد و باعث نتیجهگیری نامناسب شود، بنابراین RMSD یک زیر واحد یعنی زیر واحد اول محاسبه و مقایسه شد. در این مورد نیز مثل RMSD پروتئین دیمرتغییرات شیب RMSD در اثر افزایش دما ناچیز بود و افزایش اندکی در شیب مشاهده شد.
نتایج جذر میانگین مربع نوسانات (RMSF): همچنین
RMSF اسکلت اصلی (Backbone) همه نمونهها در همه دماها در 10 نانوثانیه آخر شبیهسازی محاسبه شد و سپس از RMSF همه باقیماندهها در هر پروتئین در هر دما میانگین گرفته شد. این میانگین میتواند نشاندهنده انعطافپذیری کلی پروتئین باشد. شیب تغییر میانگین RMSF اسکلت اصلی باقیماندهها در همه جهشها مشابه نمونه وحشی بود، بنابراین میتوان نتیجه گرفت افزایش دما در همه جهشها و نمونه وحشی تقریباً اثر یکسانی روی انعطافپذیری کلی پروتئین داشته است.
باقی مانده های 41 و 42 و 46 از اینترفرون به پروتئین گیرنده اینترفرون متصل میشوند. شیب میانگین RMSF باقی ماندههای متصل به گیرنده در همه نمونهها در هر دما گرفته شد و شیبخط برازش شده از بین این نقاط به دست آمد که نتایج حاکی از آن است که جهشهای شماره دو وچهار و پنج دارای کمترین شیب هستند ولی در کل میتوان گفت همه مدلها نزدیک به هم بوده و این پارامتر در آنها ثابت هستند وافزایش دما اثر قابلتوجهی روی روند انعطافپذیری باقی ماندههای متصل به گیرنده نگذاشته است.
نتایج شعاع چرخش پروتئین (Rg): شیب تغییرات شعاع چرخش اینترفرون منفی است که به معنی کاهش شعاع چرخش کل پروتئین با افزایش دما است. در کلیه آنالیزها برای مقایسه شیبها قدرمطلق اعداد را با هم مقایسه میگردد چون علامت منفی تنها به معنی کاهش آن پارامتر است. ازنظر شعاع چرخش پروتئین (Rg) میتوان گفت با افزایش دما در هرمدل کاهش این پارامتررا دیده می شود. کاهش شعاع چرخش در اثر افزایش دما بهواسطه نزدیکتر شدن دو مونومرنسبت به هم در اثر افزایش دماست که در جدول 1 ذکرشده و بعداً به آن اشاره میشود. با توجه به شیب یکسان کاهش شعاع چرخش دیمر در برابر افزایش دما میتوان نتیجه گرفت همه جهشها بهطور یکسان باعث کاهش جزئی شعاع چرخش دیمر اینترفرون در اثر افزایش
دما شدهاند.
برای حذف اثر فاصله دو منومر در نتایج شعاع چرخش کل، شعاع چرخش یک مونومر هم محاسبه گردید. در این حالت برخلاف شعاع چرخش کل که با افزایش دما کم میشد با افزایش دما شعاع چرخش مونومر اول زیاد میشود. ازآنجاکه جهش دوم و سوم شیب افزایش شعاع کمتری نسبت به حالت وحشی دارد میتوان نتیجه گرفت که جهش دوم و سوم باعث باز شدن کمتر پروتئین یا ناپایدارتری کمتر دراین جهشها نسبت به حالت وحشی در اثر افزایش دما میشوند. بهعبارتدیگر این جهشها نسبت به افزایش دما حساسیت کمتر دارند اما در نمونه وحشی جهشهای یک و چهار افزایش شیب ثابت است و باز شدن و ناپایداری پروتئین بیشتر است.
ازآنجاییکه پروتئین اینترفرون یک همودیمراست و مونومر دوم هم دقیقاً مانند مونومر اول است نتایج این آنالیز برای مونومر دوم هم قابلتعمیم است و نیازی به تکرار محاسبات برای مونومر دوم نیست. این مسئله در همه آنالیزهایی که برای مونومر یک انجامشده است صادق است.
نتایج فاصله مرکز جرم دو زیر واحد: افزایش دما باعث کاهش فاصله دومونومر میشود. ازنظر فاصله مرکز جرم دو مونومر پروتئین جهش دودارای کمترین شیب است و با شیب کمتری دو مونومر در اثر افزایش دما نسبت به بقیه جهشها و حالت وحشی به هم نزدیک میشود. کاهش فاصله مرکز جرم دو مونومر هماهنگ با کاهش شعاع چرخش کل پروتئین است که قبلاً بحث شد.
نتایج سطح در دسترس حلال پروتئین (ASA): با افزایش دما در همه مدلها ساختار پروتئین باز میشود و سطح در دسترس کل اینترفرون(ASA) افزایش مییابد. ازآنجاییکه روند افزایش سطح جهش دوم در اثر افزایش دما کندتر از بقیه جهشها و حتی حالت وحشی است، میتوان نتیجه گرفت جهش دوم باعث پایداری بیشتراینترفرون نسبت به حالت وحشی و سایر جهشها میشود؛ بنابراین جهش دو، پایدارکنندهترین جهش در این آنالیز بهحساب میآیند. با توجه به اینکه با افزایش دما سطح پروتئین زیاد شده است، انتظار افزایش در شعاع کل پروتئین هم وجود دارد درحالیکه قبلاً نشان داده شد شعاع کل پروتئین کم میشود و شیب تغییرات شعاع کل پروتئین منفی بود. این اختلاف را به این صورت میتوان توضیح داد که دو مونومر اینترفرون توسط یک اتم روی (Zn) به هم وصل هستند و با افزایش دما دو مونومر به هم نزدیک میشوند و درنتیجه شعاع کلی اینترفرون کاهش مییابد، اما ازآنجاییکه شعاع هرمونومر بهطور جداگانه افزایش پیدا میکند وسطح در دسترس کل پروتئین نیز افزایش پیدا میکند. نتایج جدول 1 نشان میدهد که افزایش دما باعث افزایش در سطح دردسترس حلال مونومر یک میشود. به علت اینکه افزایش سطح به معنای ناپایداری در نظر گرفته می شود میتوان گفت جهش شماره سه و بعد از آن جهش دو با سرعت کمتری نسبت به همه حالات باز میشود و از بقیه پایدارتراند. جهش شماره یک وچهار هم تقریباً باهم از این نظر مشابهاند.
با توجه به اینکه افزایش سطح دردسترس حلال قطبی به معنی افزایش حلالیت پروتئین است، با افزایش دما سطح در دسترس حلال قطبی زیاد میشود ولی همه جهشها با شیب کمتر یا مساوی حالت وحشی سطح در دسترس حلال قطبی خود را افزایش میدهند، بنابراین هیچکدام از جهشها مزیتی نسبت به حالت وحشی ازنظر افزایش سطح قطبی در اثر افزایش دما ندارند. افزایش سطح در دسترس حلال غیر قطبی به معنی کاهش حلالیت و رسوب پروتئین است. به بیان دیگر هر چه سطح در دسترس حلال باقیماندههای غیرقطبی یا هیدروفوب کمتر باشد پروتئین حلالیت و پایداری بیشتری دارد و در این مورد هر پروتئینی که با افزایش دماشیب کمتری برای افزایش سطح در دسترس حلال غیر قطبی داشته باشد پایدارتر است، بنابراین از این نظر جهش شماره یک ((V148E از همه بهتر و ازحالت وحشی پایدارتر است. دلیل این پایدارکنندگی را میتوان اینگونه توضیح داد که وقتی زنجیره غیر قطبی والین به گلوتامات قطبی منفی تبدیل شود جایابی گلوتامات به صورتی است که آبگریزی صورتبندی ساختار را کمتر میکند.
نتایج تعداد پیوند های هیدروژنی پروتئین با خودش: آقای وان هیپل و همکارانش )20( در مورد جهشهای زیانبار روی پروتئین دیستروفی گلیکان تحقیق کرده و به این نتیجه رسیدند که در بین چند جهش آن جهشی که موجب افزایش تعداد پیوندهیدروژنی درساختارپروتئین میشود ساختار را منسجمتر کرده و باعث میشود آن جهش کمتر باعث بیماری شود یعنی کمتر زیانبار باشد. افزایش دما باعث شکسته شدن پیوندهای هیدروژنی درونی و کاهش تعداد پیوندهای هیدروژنی میشود. ازآنجاکه جهش سوم و دوم کمترین روند کاهش پیوند هیدروژنی با افزایش دما را داشته است میتوان آن را بهعنوان جهش پایدارتر از همه جهشها و همچنین نسبت به حالت وحشی در نظر گرفت. بهعبارتدیگر پیوندهای پایدارکننده پروتئین با سرعت کمتر باز میشوند وساختار دیرتر از هم گسیخته می شود. در این مورد میتوان گفت نمونه وحشی و جهش شماره یک عملاً یکسان هستند. جهش شماره چهار هم نسبت به نمونه وحشی دارای شیب کمتری است ولی روند کاهش پیوند هیدروژنی سریعتری نسبت به جهشهای شماره دو و سه دارد.
نتایج تعداد پیوندهای هیدروژنی پروتئین با آب: در این مورد هم با افزایش دما پیوندهای هیدروژنی پروتئین با آب از بین میروند و حلالیت پروتئین با افزایش دما کم میشود. نتایج حاصل از بررسی شیبخط بهدستآمده نشاندهنده اختلافات کم نمونهها نسبت به هم است ولی اگر به اختلافات کمتوجه کنیم مشخص میشود که همه جهشها شیب بیشتری نسبت به حالت وحشی دارند وحلالیت با افزایش دما با سرعت بیشتری نسبت به حالت وحشی کم میشود، بنابراین همه جهشها باعث حساسیت بیشتر اینترفرون ازنظر کاهش حلالیت داشتهاند. دربین جهشها، جهش شماره دو دارای کمترین شیب و کمترین کاهش حلالیت نسبت به بقیه است پس جهش بهتری از این نظر است.
انرژی واندروالسی و الکتروستاتیک پروتئین و آب: همانطور که در جدول 1 مشخص است مجموع انرژی واندروالسی والکتروستاتیک بین پروتئین و آب و با افزایش دما زیاد میشود که به معنی کاهش حلالیت و جاذبه بین پروتئین و آب است. شیبخط برازش شده از بین میانگینهای 10 نانوثانیه آخر هر شبیهسازی نشان میدهد جهش شماره دو دارای کمترین شیب افزایشی در بین مدلها است و بعدازآن جهش شماره یک و چهار دارای کمترین شیب هستند ولی در کل همه مدلهای جهشیافته از نمونه طبیعی دارای شیب بهتر و کمتری هستند و از این نظر پایداری بیشتری دارند.
نتایج پارامتر ناپایداری: آقایZeiske و همکاران)21( از چهار سویه آنزیم ریبونوکلئاز برای محاسبه این پارامتر استفاده کردند این چهار سویه به ترتیب سرمادوست ((so RNH، متعادل دوست (ec RNH))، گرمادوست متوسط (Ct RNH) و گرمادوست (Tt RNH) بودند. هدف آنها این بود که دمای ذوب (Tm) هر یک از این سویهها را بهوسیله شبیهسازی دینامیک مولکولی به دست بیاورند. برای این کارابتدا پارامتر نظم پیوندهای NH اسکلت اصلی که نشاندهنده نوسانات جهتگیری پیوندهای NH درپروتئین است را در هر دما به دست آوردند. سپس از پارامتر نظم در چند نانوثانیه آخر شبیهسازی میانگین گرفتند و در عدد 89/0 ضرب کردند و از یککم کردند و لگاریتم نپری آن را حساب کردند. به علاوه لگاریتم نپری دما را هم محاسبه کردند و این کار را برای همهسویهها در چند دما انجام دادند و نموداراعداد بهدستآمده از این دو لگاریتم را رسم کردند و شیب بهترین خطی که از بین این نقاط عبور میکرد را به دست آوردند. با داشتن اطلاعات تجربی در مورد دمای ذوب(Tm) سویههای گرمادوست و سرمادوست مشخص شد که این شیب با دمای ذوب رابطه عکس دارد، یعنی هرچه کمتر باشد، پایداری بیشتر و دمای ذوب بالاتر است. بنابراین میتوان این پارامتر را پارامتر ناپایداری نامید. این پارامتر برای نمونه وحشی و پنج جهش محاسبه شد و نتایج حاصل نشان داد که شیبخط برازش برای جهش شماره سه از همه نمونههای جهشیافته و وحشی کمتر است. پسازآن جهش شماره چهار دارای شیبی تقریباً برابر با نمونه وحشی است و جهش شماره یک و دو دارای شیبهای نامناسب و بیشتر از نمونه وحشی میباشند.
نتایج میانگین تعداد باقی ماندههای شرکتکننده در ساختار کلاف بختانه و ساختار سخت: آقای لئون و همکاران نشان دادند که جهشی که باعث افزایش ساختار دوم پروتئین مونلین می شود باعث افزایش پایداری آن در دمای بالاتر هم می شود )14(. در مورد اینترفرون بتا ، چون افزایش دما منجر به باز شدن پروتئین میشود میانگین تعداد باقی ماندههایی که در ساختار کلاف بختانه شرکت میکنند با افزایش دما زیاد میشود و شیب نمودارها در همه موارد مثبت است. کمترین شیب در این مورد متعلق به جهش سوم است که نشاندهنده پایدارتر بودن آن نسبت به بقیه جهشها و نمونه وحشی است. پس از آن جهش شماره دو دارای شیب کمتری نسبت به حالت وحشی است و بنابراین پایدارتراست. بقیه جهشها دارای شیبهای تقریباً برابر و زیادتر از نمونه وحشی هستند ومقاومت کمتری برای تبدیل به ساختار کلاف بختانه شدن در برابر افزایش دما دارند.
با افزایش دما ساختاردوم سخت (مجموعه ساختارهای مارپیچ آلفا و صفحات بتا و دور (turn) ) اینترفرون هم کم میشود و شیب در همه نمونهها منفی میشود. دراینجا کمترین شیب متعلق به جهش سوم است که نسبت به نمونه وحشی شیب کمتر و پایداری بیشتری دارد، بنابراین جهش سوم در اثر افزایش دما ساختار دوم پایدارتر مانده و کمتر تخریبشده است. پس از جهش سوم، جهش دوم نیز بهتر از حالت وحشی است. جهش شماره یک از نمونه وحشی دارای شیب بیشتر شده یعنی پایداری ساختار دوم کمتری دارد. جهش شماره چهار تقریباً مثل نمونه وحشی بوده است و در کل میتوان گفت جهش شماره سه و دو بیشتر از بقیه جهشها باعث پایداری ساختار دوم پروتئین اینترفرون شده است.
انرژی آزاد گیبس حلالیت پروتئین: از نظر اختلاف انرژی آزادگیبس حلالیت میتوان گفت در همه نمونهها با افزایش دما انرژی آزاد حلالیت زیادتر میشود که به معنی کاهش حلالیت با افزایش دما است و شیب در همه نمونهها مثبت است. در همه جهشها شیب افزایش انرژی حلالیت کمتر از نمونه وحشی است که به معنی سرعت کمتر کاهش حلالیت با افزایش دماست. در این نتایج کمترین شیب متعلق به جهش یک و دو است و جهش شماره چهاردارای بیشترین شیب و بیشترین کاهش حلالیت است.
نتایج داکینگ: نتایج بهدستآمده از سرورهاد داک برای جهش 3 و2و 4 و5و 1 و وحشی به ترتیب برابر با 3/99- و2/93-و 9/85- و1/59- و 9/52- کیلوکالری برمول است. بنابراین در بین همه نمونهها جهش شماره سه دارای منفیترین انرژی آزاد اتصال یعنی قویترین اتصال است و نسبت به نمونه وحشی اتصال محکمتری به گیرنده خود دارد که مزیت دیگری برای جهش شماره سه است. همچنین در جهش شماره سه در بین همه جهشها دارای کمترین انرژی اتصال واندروالسی و کمترین انرژی الکتروستاتیک بین اینترفرون و گیرنده و بیشترین سطح مدفونشده در اثر اتصال به گیرنده بود.
نتیجه گیری
داروی سینووکس (اینترفرون بتا) یک داروی مهم برای
جلوگیری از عود مجدد بیماری اماس است که افزایش نیمهعمر آن از اهمیت به سزایی برخوردار است چون این دارو بهصورت محلول و در یخچال نگهداری میشود. در این تحقیق اقدام به افزایش پایداری پروتئین اینترفرون بتا (سینووکس) با استفاده از شبیهسازی دینامیک مولکولی شد. هدف از این تحقیق کمک به بیماران مبتلابه اماس و پیدا کردن جهشهایی بود که منجر به پایداری بیشتر آن شود در اینجا برای طراحی جهشهای پایدارکننده از درگاه اینترنتی پاپ میوزیک استفاده شد و برای تائید دقیقتر نتایج این سرور از شبیهسازی دینامیک مولکولی استفاده شد. مطالعه تغییر ساختار پروتئینها در اثرجهش به کمک تکنیک شبیه سازی دینامیک مولکولی توسط محققین زیادی انجام شده است (2). همچنین از انرژی آزاد حلالیت برای بررسی پایداری ساختار پروتئینها استفاده شده است (1). از بین جهشهای پیشنهادی این سرور، چهار جهش مناسبتر انتخاب شد. در ضمن یک جهش ترکیبی از جهش دو و سه نیز تهیه شد (جهش 5) و با انجام شبیهسازی دینامیک مولکولی در دماهای 300 و 350 و 400 و 450 و 500 کلوین و به مدت 20 نانوثانیه در پنج دمای مذکور برای این پنج جهش پارامترهای مختلف محاسبه شد و شیب تغییرات این پارامترها در اثر افزایش دما بدست آمد. بطور منطقی انتظار داریم ساختار پایدارتر در اثر افزایش دما شیب تغییرات کمتری در این پارامترها داشته باشد. با بررسی شیب تغییرات پارامترهای بدست آمده در شبیه سازی و مقایسه آن با ساختار وحشی نشان داده شد که جهش شماره دو و سه از بین پنج جهش، جهشهای مناسبتری میباشند. بهعنوان نتیجهگیری کلی میتوان گفت جهشهای شماره دو و سه بهصورت جداگانه در خیلی از آنالیزها توانسته بودند پایدارکنندگی مناسبی را نشان دهند اما وقتی این دوجهش باهم ترکیب شد (جهش 5) برخلاف انتظار به پایدارکنندگی بیشتر از هرکدام از آنها به طور جداگانه نرسیدیم و ترکیب این دو جهش اثر مثبت هرکدام بهتنهایی را خنثی کرده بود و جهش ترکیبی تقریباً در هیچکدام از آنالیزها برتری نسبت به حالت وحشی از نظر پایداری نداشت. در مورد جهش شماره دو (E107I) با تبدیل گلوتامیک به ایزولوسین احتمالاً آبگریزی ساختار داخلی پروتئین زیاد میشود که منجر به افزایش پایداری نسبت به حالت وحشی میشود. همچنین احتمال دارد که ایزولوسین با همسایه های خود اقدام به برقراری پیوندهای آبگریز قویتری کرده که به فشردگی بیشتر هسته آبگریز و پایداری کمک کند یا در مورد جهش شماره سه (G127E) وقتی گلایسین که بدون بار است به یک باقیمانده قطبی باردار(گلوتامات) تبدیل میشود سطح پروتئین قطبی ترشده و به پایداری و حلالیت کمک میکند. با بررسی مجموع نتایج بدست آمده به نظر می رسد در بین جهش2 و 3، جهش 3 ((G127E بهتر از همه منجر به پایداری اینترفرون نسبت به حالت وحشی می شود. از نظر اتصال به گیرنده هم جهش شماره سه دارای اتصال بهتری نسبت به حالت وحشی و سایر جهشها است که مزیت دیگری برای جهش شماره سه است. با توجه به اینکه این مطالعه تنها بر روی خود مولکول اینترفرون انجام شده است، افزایش پایداری را بیشتر به خارج از بدن میتوان نسبت داد چون پایداری در داخل بدن ممکن است تابع عوامل دیگری غیر از ساختار پروتئین هم باشد مانند سرعت دفع پروتئین از طریق کلیه. البته افزایش پایداری در خارج بدن با پایداری در داخل بدن متناسب است. بهرحال حتی اگر این جهش منجر به افزایش پایداری دارو در خون هم نشود منجر به پایداری دارو در خارج از بدن و افزایش زمان ذخیرهسازی و نگهداری آن میشود. به علاوه این جهش میتواند باعث افزایش و بهبود عملکرد دارو در اتصال به گیرندهاش شود. برای انجام بررسیهای دقیقتر باید بهطور تجربی این پروتئین جهشیافته تهیه شود و پایداری و قدرت اتصال آن به گیرندهاش با روشهای تجربی بررسی شود. در این مطالعه از ترکیب روشهای بیوانفورماتیکی ومحاسباتی برای بررسی پایداری پروتئین اینترفرون استفاده شده است که جالب و قابل کاربرد برای بررسی پایداری سایر پروتئینها در اثر جهش می باشد و بنابراین بدون نیاز به صرف هزینه های سنگین برای انجام کاری های تجربی می توان به طراحی جهشهای پایدار کننده ساختار پروتئین اقدام نمود. در پایان امید است نتایج این مطالعه کمکی به درمان بهتر بیماری اماس کرده باشد.
سپاسگزاری
نویسندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه شهرکرد به خاطر حمایت و پشتیبانی از این کار تشکر و قدردانی مینمایند.