Document Type : Research Paper
Authors
1 Shahrekord university
2 Shahrekord University
Abstract
Purification of proteins is an essential step to determining their function and structure. Proteins are often combined with a tag to facilitate purification prosses. The aim of this study was to design and construct pET32b(+)Rh vector based on pET-32b(+) expression vector to simplifiy purification of recombinant proteins only by Nicle column. The primer design was performed taking into account the targeted changes. Using PCR reaction, the desired fragment was amplified and cloned in pET-32b(+) vector. The recombinant vector was transformed into Escherichia coli. After screening by colony-PCR and restriction enzyme analysis, sequencing was performed. Vector function study, was performed by investigating the expression and purification of a toxic peptide IOD-NaTx with disulfide bonds in pET32b(+)Rh vector. In new pET32b(+)Rh vector, the histidine tag site at the C- terminal of thioredoxin was removed and the N-terminal of the recombinant peptide would not change much if BamHI is used for cloning . To evaluate the function of the vector, the soluble expression of a toxic peptide was successfully determined and two-step purification using IMAC method resulted into the pure recombinant peptide. In this study, the simple and fast method of cloning was used to construct a modified expression vector using a commercial plasmid. The new pET32b(+)Rh vector can be used to express complex peptides with disulfide bonds fused with thioredoxin. The recombinant protein could be purified simply without need to costly methods such as HPLC and FPLC or other chromatography columns.
Keywords
Main Subjects
طراحی و ساخت وکتور بیانی pET32b(+)Rh براساس سیستم pET جهت تسهیل پروسه تخلیص پروتئین نوترکیب
لیلا رضایی یونکی، هدا آیت* و علی محمد احدی
ایران، شهرکرد،دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم، گروه ژنتیک
چکیده
خالص سازی پروتئینها یک مرحله ضروری برای بررسی عملکرد و ساختار آنها است. بمنظور تسهیل تخلیص، پروتئینها غالباً به برچسب تمایلی متصل میشوند. هدف از این تحقیق طراحی و ساخت وکتور pET32b(+)Rh بر اساس وکتور بیانی پرکاربرد pET-32b(+) در جهت تخلیص آسانتر پروتئینهای نوترکیب و تنها با استفاده از ستون تمایلی نیکل میباشد. بعد از طراحی پرایمر، با استفاده از واکنش PCR قطعه مورد نظر تکثیر یافت و در وکتور pET-32bهمسانه سازی شد. وکتور نوترکیب در باکتری اشریشیا کلای ترانسفورم گشت. بعد از غربالگری با تست کلونی- PCR و آنالیز آنزیمی، تعیین توالی شد. مطالعه عملکرد وکتور با بررسی بیان و تخلیص یک پپتید کوچک سمی دارای پیوندهای دیسولفیدی در وکتور pET32b(+)Rh انجام شد. در وکتور جدید pET32b(+)Rh، محل برچسب هیستیدینی در ناحیه انتهای کربوکسیل تیوردوکسین حذف شده و همچنین ناحیه انتهای آمینی پپتید نوترکیب درصورت استفاده از آنزیم BamH I تغییر چندانی نخواهد کرد. برای بررسی عملکرد وکتور، بیان محلول یک پپتید سمی در آن با بررسی و تخلیص دومرحلهای با استفاده از روش IMAC، منجر به تخلیص پپتید نوترکیب شد. در این تحقیق از روش ساده و سریع کلونینگ برای دسترسی به یک وکتور تغییر یافته بیانی با استفاده از پلاسمید تجاری موجود، استفاده شد. از وکتور جدید pET32b(+)Rh میتوان برای بیان پپتیدهایی با ساختار پیچیده که نیازمند به تغییر پس از ترجمه و فیوژن با تیوردوکسین هستند، بهره برد و سپس از تخلیص سادهتر بدون نیاز به ستون کروماتوگرافی دیگر یا روشهای پر هزینهای نظیر HPLC و FPLC برای تخلیص نهایی آن استفاده کرد.
واژههای کلیدی: pET-32 ،pET32b(+)Rh ، تخلیص پروتئین نوترکیب، برچسب هیستیدین، تیوردوکسین
*نویسنده مسئول، تلفن: 03832324401، پست الکترونیکی: ayat-h@sku.ac.ir
مقدمه
در طول سالهای گذشته، تولید پروتئینهای نوترکیب به یک فناوری مهم تبدیل شده که طیف وسیعی از کاربردها را در زمینههای مختلف پزشکی و صنعتی شامل می شود (3). افزایش تعداد پپتیدهای درمانی، منجر به پویایی تجارت پپتیدهای نوترکیب شده است (15). تقاضا برای این پروتئینها را نمیتوان از منابع طبیعی تأمین کرد. اشریشیا کلای (Escherichia coli) اغلب بدلیل سهولت در کشت، رشد سریع و دانش گسترده از فرآیندهای ژنتیکی و فیزیولوژیکی آن، اولین انتخاب برای تولید پروتئینهای نوترکیب است (13). با این وجود مشکلات زیادی برای بیان پروتئینهای یوکاریوتی در سیستم پروکاریوتی، وجود دارد. عدم وجود چپرونهای یوکاریوتی، تغییرات تخصصی پس از ترجمه و وجود پیوندهای دیسولفیدی میتواند منجر به پیچش و تجمع اشتباه پروتئین شود. یکی از موفقترین راهکارها برای افزایش بیان پروتئینهای محلول، اتصال با برچسبهای تقویت کننده حلالیت یا پپتیدهای فیوژن، مانند پروتئین اتصال دهنده مالتوز (MBP) (Maltose-binding protein)، تیوردوکسین (Trx)( Thioredoxin) و گلوتاتیون-S-ترانسفراز(glutathione S-transferase) (GST) میباشد (8). این پروتئینهای فیوژن در وکتورهای بیانی تعبیه می شوند و باید در مراحل بعدی کار حذف شوند (11). پپتیدهای فیوژن میتواند برای افزایش سطح بیان و حلالیت، برای ساده سازی ریفولدینگ و افزایش کارآیی آن و برای جلوگیری از تجزیه پروتئین نوترکیب نیز استفاده شود (7). یکی از برچسبهای بسیار مورد استفاده، تیوردوکسین با وزن تقریبا 12 کیلودالتون میباشد که یک پروتئین کوچک، بسیار محلول و از نظر حرارتی پایدار با ویژگیهای فولدینگ قوی است (14). تیوردوکسین یک پروتئین کاتالیزوری برای تسهیل ایجاد پیوندهای دیسولفیدی و افزایش حلالیت پروتئینها است، بنابراین تشکیل اجسام انکلوژن را کاهش میدهد و برنامههای محلولسازی با استفاده از اوره را کم میکند (10). بغیر از این، در وکتورهای بیانی از برچسبهای تمایلی (affinity tag) نیز برای تسهیل پروسههای مختلف تشخیص و تخلیص استفاده میشود که حداقل تأثیر بر ساختار سوم و فعالیت زیستی پروتئین را دارند (23). امروزه برچسبهای تمایلی مختلفی استفاده می شود که شامل برچسبهای poly-Arg ، FLAG، poly-His، c-myc، S-tag میباشند (11). از این میان برچسبهای پلی هیستیدین (Polyhistidine)، برای خالصسازی پروتئینهای نوترکیب با روش کروماتوگرافی تمایلی (IMAC) (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) که مبتنی بر تعاملات بین یک یون فلز Ni2+، تثبیت شده روی ماتریس و زنجیرههای جانبی اسید آمینه هیستیدین است، بیشتر مورد استفاده قرار میگیرد (9).
طیف گستردهای از وکتورهای کلونینگ تجاری برای تولید و بیان پروتئینهای نوترکیب دارای برچسب پلی هیستیدین در سیستمهای بیانی مختلف مانند اشریشیا کلای، وجود دارد (5). سیستم بیانی pET از قدرتمندترین سیستمهایی است که بمنظور کلون و بیان پروتئینهای نوترکیب در اشریشیا کلای استفاده میشود. زمانیکه ژن هدف در داخل وکتور کلون میشود، رونویسی تحت کنترل پروموتر قوی باکتریوفاژ T7 انجام میگیرد. RNA پلیمراز باکتریوفاژ T7 در ژنوم باکتری قرار دارد و بصورت کاملا اختصاصی به پروموتر خود متصل و رونویسی انجام میگیرد. پروموتر توسط IPTG القا میگردد و میتوان بیان بالایی از محصول را بدست آورد. این بیان بالای سیستم pET گاهی منجر به ایجاد اجسام انکلوژن بدلیل دارا بودن تغییرات پس از ترجمه در پپتید نوترکیب و یا پیوندهای دیسولفیدی آن میشود (16و19). وکتور بیانی قوی pET-32 که با اضافه کردن تیوردوکسین بصورت فیوژن به پروتئین نوترکیب میزان بیان را افزایش داده و حلالیت و ساختار پروتئین را تصحیح میکند، بسیار پراستفاده است. همچنین این سیستم بیانی برای بیان پروتئینهای سمی در اشریشیا کلای نیز بسیار کارآمد است، زیرا اضافه شدن تیوردوکسین مانع اعمال اثر سمیت پپتید در باکتری و کاهش بیان پپتید یا مرگ باکتری میشود. وکتور پرکاربرد pET-32b(+) دارای برچسبهای تخلیص و شناسایی S-tag و دو برچسبHis.tag در بالادست و پایین دست پپتید نوترکیب میباشد. تیوردوکسین جهت محلول سازی و افزایش بیان پروتئین نوترکیب در N ترمینال پپتید نوترکیب اضافه میشود. دو جایگاه آنزیمی ترومبین و انتروکیناز در وکتور تعبیه شده که در نهایت بعد از بیان و تخلیص، از طریق پروتئاز مربوطه تیوردوکسین با S.tag و یکی از تگ های His جدا میشود، در آخر برای تخلیص نهایی پپتید نوترکیب از روش HPLC یا FPLC و یا جداسازی تیوردوکسین متصل به S-tag استفاده میشود و پروتئین خالص طی دو مرحله بدست میآید. استفاده از S-tag برای جداسازی تیوردوکسین نیازمند به ستون کروماتوگرافی تمایلی با آنتی بادی اختصاصی دارد، همچنین می توان از روشهای پرهزینه HPLC یا FPLC برای تخلیص نهایی پپتید نوترکیب از تیوردوکسین، استفاده کرد. این پژوهش برای طراحی پلاسمیدی که با آن بتوان بهرهوری تخلیص را بالا برده و بصورت ساده تر و ارزان قیمت پروتئین نوترکیب را تخلیص کرد، طراحی شد. در پژوهش حاضر اولین توالی هیستیدینی در N ترمینال پروتئین نوترکیب بهمراه دو توالی برش آنزیمی Nco I و EcoR V حذف گردید. حذف اولین تگ هیستیدینی باعث می شود که در مرحله دوم تخلیص با ستون کروماتوگرافی نیکل، تیوردوکسین تخلیص نشده و تنها پپتید نوترکیب جداسازی شود. پس از تخلیص پروتئین نوترکیب با دم پلی هیستیدینی و روش IMAC، با هضم آنزیمی پروتئین، دو پپتید نوترکیب و پپتید تیوردوکسین حاصل میشود که در مرحله بعدی نیز میتوان از روش IMAC برای تخلیص پپتید نوترکیب استفاده کرد. بیان و تخلیص موفق یک پپتید کوچک با پیوندهای دیسولفیدی در وکتور جدید pET32b(+)Rh نشاندهنده عملکرد صحیح وکتور بود.
مواد و روشها
مواد: سویه Top10F اشریشیا کلای بعنوان میزبان کلونینگ، سویه BL21 بعنوان میزبان بیانی و همچنین وکتور بیانی pET-32b(+) ساخت شرکت نواژن جهت انجام تحقیق، تامین گردید. محیط کشت Luria-Bertani))LB برای کشت باکتری استفاده شد، آنزیمهای BamH I و Xho I و (Msc I) Bal I و کیت استخراج DNA از ژل آگارز و کیت تخلیص محصول PCR و T4 لیگاز از شرکت فرمنتاز، آنزیم Pfu از شرکت پیشگام و Taq پلیمراز از سیناژن خریداری گردید.
بررسی جایگاههای برش آنزیمی وکتور pET-32b(+) و طراحی پرایمر: در ابتدا با استفاده از نرم افزار Gene Runner 3.05 توالی بین T7 پروموتر و T7 ترمیناتور از لحاظ جایگاههای برش آنزیمی و همچنین حفظ ترتیب نوکلئوتیدها در قالب خواندن مورد بررسی قرار گرفت. بمنظور حذف توالی هگزا هیستیدین سمت انتهای آمین پلاسمید، با نرم افزار Gene Runner 3.05 طراحی پرایمر انجام گرفت. با در نظر گرفتن جایگاه آنزیمی Msc I پرایمر پیشرو For MscI با جایگاه برش (Bal I) Msc I و پرایمر معکوس Rev BamH I با جایگاه برش BamH I طراحی گردید مشخصات پرایمرهای در جدول 1 آمده است.
جدول 1- توالی پرایمری مربوط به طراحی وکتور در این پژوهش( جایگاه شناسایی آنزیم با خظ زیر آن مشخص شده است)
نام توالی |
تعداد نوکلئوتید |
توالی کد کننده(3 5) |
پرایمر پیشرو For Msc I |
28 |
5TGCTTGGCCATTCTTCCGGTCTGGTGCC3 |
پرایمرمعکوس Rev BamH I |
28 |
5TATCGGATCCGCCTTGTCGTCGTCGTCG3 |
پرایمر T7 ترمیناتور |
19 |
5GCTAGTTATTGCTCAGCGG3 |
پرایمر T7 پروموتر |
20 |
5TAATACGACTCACTATAGGG3 |
تکثیر توالی از جایگاه آنزیمی Msc I تا BamH I : بعد از کشت 16 ساعته باکتری در محیط LB مایع در دمای C˚37 درجه، استخراج پلاسمید pET-32b(+) از باکتری Top10 با روش قلیایی انجام شد و محصول بعنوان الگو در واکنش PCR استفاده شد؛ توالی بین T7 پروموتر و T7 ترمیناتور تکثیر شد و از روی محصول PCR آن، توالی بین جایگاه Msc I تا BamH I با پرایمرهای سنتز شده تکثیر گردید. واکنش PCR برای هر دو مورد در حجم نهایی 25 میکرولیتر با اضافه کردن 1 میکرولیتر از هر پرایمر، 5/2 میکرولیتر بافر PCR (10x) ، 5/ 0 میکرولیتر dNTP 10 میلی مولار، 2/0 میکرولیتر Taq پلی مراز 5 واحد بر میکرولیتر و 1 میکرولیتر DNA الگو انجام گرفت. تکثیر قطعه 123 جفت بازی بمنظور جلوگیری از جهش توسط Pfu پلیمراز انجام گرفت. چرخههای PCR برای توالی بین T7 پروموتر و T7 ترمیناتور شامل: یک مرحله واسرشت ابتدایی در دمای C˚94 به مدت 5 دقیقه، واسرشت شدگی در دمای C˚94 به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمر به رشته الگو در دمای C˚58 به مدت 45 ثانیه، تکثیر قطعه مورد نظر در دمای C˚72 به مدت 1 دقیقه برای 35 سیکل و در پایان یک مرحله تکثیر نهایی در دمای C ˚72 درجه به مدت 5 دقیقه استفاده شد. برای قطعه 123 جفت بازی به همان ترتیب فقط با 30 سیکل متوالی C˚72، 56، 94 هر کدام 40 ثانیه انجام پذیرفت. محصول PCR روی ژل آگارز برده شد و جهت خالص سازی توسط کیت، از روی ژل بریده شد (10).
هضم آنزیمی واکنش اتصال: پلاسمید pET-32b(+) و قطعهی تکثیر یافته تحت اثر آنزیمهای Msc I و BamH I به مدت 16 ساعت در دمای 37 هضم شدند. هر دو محصول هضم آنزیمی فوق روی ژل اگارز 1% الکتروفورز شدند. باند 123 جفت بازی و پلاسمید خطی شده از روی ژل با استفاده از کیت بیورد جدا شدند. مقدار 2/0 میکروگرم قطعه تخلیص شده از ژل با 1/0 میکروگرم پلاسمید در واکنش اتصال حاوی 1 واحد لیگاز و حجم نهایی 25 میکرولیتر قرار گرفتند. تیوپ حاوی واکنش اتصال، بمدت یک ساعت ونیم در دمای 16 و یک ساعت در دمای محیط قرار گرفت.
تهیهی سلولهای مستعد و ترانسفورماسیون: باکتری Top10 در ml5 محیط آمپیسیلین دار LB رشد داده شد تا OD به 4/0 رسید. با استفاده از CaCl2 1/0 مولار سلولهای مستعد تهیه شد. مخلوط واکنش اتصال در باکتری مستعد ترانسفورم شد و روی پلیتهای LB آگار آمپیسیلین دار، کشت داده شد و بمدت 16 ساعت در انکوباتور C˚37 قرار داده شدند.
غربالگری کلونیهای واجد پلاسمید جدید بروش کلونی-PCR: برای اینکه ورود قطعه ژنی به وکتور مورد تایید قرار گیرد، از روش کلونی-PCR استفاده شد. در این روش از پلیتی که حاوی کلونیهای حاصل از ترانسفرم بود، چند کلونی بهمراه کلونی کنترل بطریق شطرنجی کشت داده شد. واکنش PCR، با محلول باکتری قرار گرفته بمدت 10 دقیقه در دمای˚ C96 و شرایط قبلی، انجام گرفت و روی ژل 2% الکتروفورز شد. پرایمر T7 ترمیناتور و T7پروموتر نیز بمنظور انجام کلونی-PCR و طراحی وکتور مورد استفاده قرار گرفتند. چند کلنی با نتیجه PCR مثبت در محیط LB مایع کشت داده شد و سپس استخراج پلاسمید از آنها انجام گرفت.
آنالیز آنزیمی پلاسمیدهای استخراج شده: از آنجایی که پلاسمید جدید فاقد جایگاه آنزیمی Nco I و EcoR V میباشد، بر روی پلاسمید استخراج شده و نیز پلاسمید pET-32b بعنوان کنترل، آنالیز آنزیمی تحت اثر آنزیم های BamH I و Nco I ، صورت گرفت. برش آنزیمی با آنزیم Nco I روی پلاسمیدها بمدت 4 ساعت و در دمای C˚37 انجام گرفت. همچنین جهت تایید سالم بودن جایگاه برش BamH I ، پلاسمید بمدت 4 ساعت بهمراه کنترل تحت اثر این آنزیم قرار گرفت و بر روی ژل 1% الکتروفورز شد. در نهایت پلاسمید تایید شده با آنالیز آنزیمی، تعیین توالی شد.
بررسی بیان و تخلیص پپتید نوترکیب از وکتور جدید pET32b(+)Rh: بمنظور بررسی صحت و تمامیت وکتور جدید، ژن کدکننده توکسین IOD-NaTx جدا شده از عقرب، در پلاسمید نوترکیب pET32b(+)Rh کلون شد (اطلاعات در دست چاپ) و به باکتری مستعد BL21 با روش شوک حرارتی ترانسفورم شد. تک کلونی از آن در محیط کشت LB کشت شبانه داده شد و بعد از تلقیح و رسیدن OD به 6/0 بیان آن در اثر القا با IPTG با مقدار 1 میلی مولار در مدت 8 ساعت و دمای C˚28 انجام شد. باکتریها جمعآوری شده، لیز شده و تخلیص پپتید نوترکیب فیوژن با تیوردوکسین با ستون IMAC انجام شد. بعد از هضم پپتید فیوژن با انتروکیناز، پپتید خالص IOD-NaTx با روش IMAC دوباره تخلیص شد و پپتید نوترکیب حاصل شد ( جزئیات روشها در مقاله در دست چاپ)
نتایج
طراحی وکتور: بمنظور تغییر وکتور pET-32b(+) طراحی پرایمر انجام شد. جایگاههای آنزیمی بررسی شد تا مشکل یا تداخل عمل آنزیمی یا تغییر قاب خوانش مشاهده نشود. برای عدم تغییر قاب خوانش، یک نوکلئوتید در انتهای ˊ5 پرایمر اضافه شد.
استخراج پلاسمید و تکثیر توالی: پلاسمید pET-32b(+)استخراج شده و سپس توالی بین T7 پروموتر تا T7 ترمیناتور با اندازه حدودا 650 جفت بازی تکثیر شد (شکل 1 الف) و بعنوان الگو برای تکثیر توالی 123 جفت بازی با پرایمرهای F و R که شامل جایگاه برش Msc I و BamH I میباشند، استفاده گردید (شکل 1 ب).
شکل 1- الکتروفورز محصول PCR : تصویر الف - باند مربوط به توالی بین T7 پروموتر و T7 ترمیناتور بر روی ژل آگارز 1 درصد. اصل از پرایمرهای For Msc I و Rev BamH I مربوط به توالی 123جفت بازی بر روی ژل آگارز 1 درصد. (M: مارکر 100 جفت بازی)
کلون سازی وکتور جدید: پلاسمید و قطعهی 123 جفت بازی هر دو تحت تاثیر آنزیم های برشگر Msc I و BamH I قرار گرفتند. قطعه 123 جفت بازی توسط کیت تخلیص DNA، خالص سازی گشت. پلاسمید هضم شده نیز از روی ژل بریده و تخلیص گردید. پس از اتصال پلاسمید برش خورده و قطعه 123 جفت بازی و ترانسفورم به سلولهای مستعد، کلونیهایی بر روی محیط کشت رشد یافت که شامل کلونیهای نوترکیب و غیرنوترکیب بودند.
غربالگری کلونیهای واجد پلاسمید جدید بروش کلونی-
PCR:از تعداد کلونیهایی که ترانسفورم شده بودند 8 کلونی کشت شطرنجی شده بود که بر روی آنها کلونی-PCR با پرایمرهای T7 پروموتر و T7 ترمیناتور انجام گرفت. کلونیهای حاوی وکتور نوترکیب که pET32b(+)Rh (Rh حروف اول نام سازندگان وکتور) نام گرفت، با اندازه 30 جفت باز کمتر از وکتور کنترل در ژل مشخص میباشند که در (شکل 2) مشخص میباشد.
آنالیز آنزیمی: پلاسمید نوترکیب استخراج و مورد بررسی آنزیمی قرار گرفت. در این مرحله تعدادی از پلاسمیدها توسط آنزیم Nco I خطی شدند که نشان دهنده وکتور اولیه میباشد ولی تعدادی از آنها بدلیل عدم وجود این جایگاه در پلاسمید جدید، خطی نشدند و دارای هر 3 باند تخلیص پلاسمید میباشد (شکل 3 الف)، برش با آنزیم BamH I برای بررسی پلاسمید نیز انجام شد (شکل 3 ب).
بررسی نتایج حاصل از آنالیز آنزیمی تایید کننده جایگزینی توالی جدید در پلاسمید pET32b است. همچنین نتایج حاصل از تعیین توالی با استفاده از پرایمرهای عمومی T7 پروموتر و T7 ترمیناتور تایید کننده نهایی پلاسمید جدید بود. شکل 5 نشاندهنده تغییر اعمال شده در وکتور جدید در مقایسه با pET32b می باشد.
بررسی بیان و تخلیص پروتئین نوترکیب: بمنظور بررسی بیان پروتئین نوترکیب در وکتور طراحی شده، پپتیدIOD-NaTx که یک پپتید سمی با سه پیوند دیسولفیدی در ساختار خود است، در این وکتور کلونسازی و بیان شد و سپس مورد تخلیص با روش IMAC قرار گرفت.
شکل 2 - نتیجهی کلونی-PCR با پرایمرهای وکتور بر روی باکتریها بر روی ژل 2 درصد. ، C: کلونی کنترل و 1 تا 8 نمونههای کلونی. نمونههای 1 تا 4 باند مورد نظر را حدودا 30 نوکلئوتید کمتر از کنترل نشان میدهند(M: مارکر 100 جفت بازی)
شکل 3- تایید تغییر پلاسمید نوترکیب با استفاده از الگوی هضم آنزیمی Nco I و BamH I : (الف) آنزیم Nco I و (ب) آنزیم BamH I . شکل الف ستون 1 مربوط به پلاسمید نوترکیب است که بدلیل فقدان جایگاه برش Nco I ، خطی نشده است و ستون 2 مربوط به پلاسمید کنترل است که بصورت خطی دیده میشود و در شکل ب نیز ستون 1 مربوط به پلاسمید جدید و ستون 2 پلاسمید کنترل میباشد که در هر دو بدلیل حضور جایگاه برش BamH I بصورت خطی دیده میشود.
پپتید تخلیص شده مورد هضم آنزیمی با انتروکیناز قرار گرفت. برای جداسازی پپتید IOD-NaTx از تیوردوکسین حاصل از هضم، تخلیص مجدد با ستون کروماتوگرافی IMAC انجام شد که در نتیجه پپتید نوترکیب خالص بر روی ژل SDS-PAGE مشخص شد (شکل 5).
بحث
سیستم بیانی پروکاریوتی برای تولید زیاد پروتئینهای نوترکیب اولین انتخاب است اما بدلیل عدم تغییرات پس از ترجمه و نیز تشکیل اجسام انکلوژن در بیان های بالا مشکلساز است. از آنجایی که دوباره تاخوردن و ریفولد پروتئینهای نامحلول در اجسام انکلوژن کار دشواری است، بنابراین تولید پروتئین نوترکیب محلول از اهمیت بسیار زیادی در بیوتکنولوژی برخوردار هست. برای برطرف کردن این چالشهای بهره وری، پپتیدهای فیوژن و برچسبهای مختلف برای افزایش بازده بیان و تأثیر در حلالیت و ساختار پروتئین نوترکیب در وکتورهای بیانی گنجانیده شده است (24).
شکل 4- شکل شماتیک وکتور pET32b(+) و توالی مربوط به کاست بیانی آن در مربع. توالی مربوط به کاست بیانی وکتور طراحی شده pET32b(+)Rh در مربع پایین آمده است. همانطور که در شکل مشخص میباشد توالی His.tag اول و دو جایگاه برش Nco I و EcoR V حذف گردیده است.
یکی از بهترین برچسبهای محلول سازی تیوردوکسین میباشد. این برچسب برای کاهش تولید پروتئین بصورت نامحلول و شکلگیری باندهای دیسولفیدی و تشکیل ساختار سوم صحیح استفاده میشود (16و14). اکثر وکتورهای حاوی تیوردوکسین بصورت فیوژن با پپتید نوترکیب، یک تخلیص دومرحلهای برای جدا سازی تیوردوکسین نیاز دارند. مرحله اول معمولا تخلیص پروتئین نوترکیب فیوژن با برچسب هیستیدینی و یا برچسبهای دیگر با روشهای IMAC یا کروماتوگرافی تمایلی است و پس از این تخلیص، پپتیدهای فیوژن توسط پروتئازها بریده میشود (12). در مرحله دوم تخلیص از روشهای تخلیص پیچیدهتر بر اساس اندازه و یا خواص دیگر پروتئین استفاده میشود که معمولا هزینهبر خواهد بود. معروفترین وکتور حاوی تیوردوکسین در وکتورهای بیانی pET-32 میباشد که از همین روش تخلیص استفاده میکند و بیان بهتری برای پروتئین نوترکیب موجب میشود (1).
شکل 5- تصویر تخلیص پروتئین IOD-NaTx. ستون 2 مربوط به پروتئین فیوژن IOD-NaTx با تیوردوکسین و ستون 1 پس از جداسازی انتروکیناز و تخلیص مجدد پروتئین IOD-NaTx با ستون نیکل می باشد، M مارکر پروتئینی.
جداسازی پپتید تیوردوکسین از محلول حاوی پروتئین نوترکیب مرحله نهایی تخلیص در استفاده از این وکتور است که یا با S-tag تیوردوکسین جدا می شود و یا با روشهای کروماتوگرافی خاص مانند HPLC یا FPLC پروتئین نوترکیب تخلیص میشود. مشکلات استفاده از این روشها بیشتر مربوط به گرانقیمت بودن دستگاه، هزینه بالای مواد لازم برای تخلیص و شرایط خاص آنها میباشد. در نهایت ماهیت نمونه و تلاش برای حفظ عملکرد فعال آنها، به چالش منجر میشود. بعنوان مثال در کروماتوگرافی FPLC از آنجایی که ساختار سوم پروتئین برای عملکردش بسیار مهم میباشد، در طول تخلیص، پروتئین نباید تحت دما، فشار بالا، pH شدید یا حلالها قرار بگیرد. چالش دیگر FPLC مربوط به اجزای دستگاه میباشد که در تماس با محلولهای بافری نمکی فاز متحرک میباشد. دستگاههای کروماتوگرافی عموما از فولاد ضد زنگ ساخته میشوند. نمک موجود در بافرها میتواند منجر به خوردگی فلز شود و از سوی دیگر، یونهای فلزی موجود در فولاد ضد زنگ میتوانند ساختار پروتئین را مختل سازند. همچنین از FPLC برای جداسازی پپتیدهای کوچک نمی توان استفاده کرد و باید از تکنیک HPLC بدین منظور استفاده کرد که نیاز به دسترسی به دستگاه های مختلف برای پپتیدها با اندازه های مختلف را لازم می کند (21). سایر روشهای تخلیص تبادل یونی، تعامل آبگریزی و کروماتوگرافی مبتنی بر اندازه بعنوان گامهای کمکی برای تقویت بیشتر خلوص نمونه در صورت لزوم استفاده میشوند که منجر به هزینههای بیشتر میشوند(20). تغییر در وکتورهای بیانی بدلایل مختلف برای افزایش راندمان تولید پپتید نوترکیب انجام شده است (22). Liu و همکاران ساخت وکتورهای pET32α را برای اهداف مختلف بیانی مورد بررسی قرار دادند (17). در مطالعه دیگر برای تولید مداوم و زیاد پروتئین نوترکیب وکتورهای بیانی بر اساس پلاسمید pIGDM1 توسعه یافت (18). در این مطالعه نیز بهینه کردن پروسه تخلیص با تغییر وکتور مورد توجه قرار گرفت. بدلیل وجود دو توالی پلی هیستیدین در pET-32، بعد از بیان به هر دو انتهای کربوکسیل ژن مطلوب و تیوردوکسین دو توالی پلی هیستیدین میتواند اضافه شود که بعد از بیان در تخلیص نهایی پروتئین بروش کروماتوگرافی تمایلی، ایجاد اختلال مینماید. پس از برش پروتئین نوترکیب از تیوردوکسین در هر دو انتهای کربوکسیل پروتئین نوترکیب و تیوردوکسین جداشده، تگ هیستیدینی وجود خواهد داشت و امکان استفاده از ستون نیکل برای جدا کردن پروتئین نوترکیب وجود ندارد. بنابراین در این پژوهش، پلاسمید تغییر یافته pET32b(+)Rh بمنظور تسهیل فرایند خالصسازی ساخته شد. در این وکتور توالی پلی هیستیدین انتهای کربوکسیل تیوردوکسین، حذف شده و در نتیجه پروتئین با یک توالی پلی هیستیدین منفرد در انتهای کربوکسیل، بیان میشود که فرآیند تخلیص آن ساده میباشد و با توجه به مطالعات زیاد انجام گرفته این توالی معمولا تداخلی در عملکرد پروتئین ایجاد نخواهد کرد (6). حضور یک توالی هیستیدین در وکتور pET32b(+)Rh امکان خالصسازی کم هزینه تر محصول را در یک پروسه دو مرحلهای با استفاده از ستونهای تمایلی نیکل فراهم کرد و نیاز به روشهای کروماتوگرافی دیگر را از بین برد. در اینجا برای بررسی عملکرد وکتور از پپتید سمی IOD-NaTx با سه پیوند دیسولفیدی در ساختار استفاده شد که در بیان بالا در باکتری فولدینگ نادرست داشته و تشکیل اجسام انکلوژن میدهد. بیان IOD-NaTx در وکتور pET32b(+)Rh بدلیل ترکیب فیوژن تیوردوکسین با آن، در فاز محلول دیده شد، همچنین اتصال تیوردوکسین به آن مانع از اثر سمی IOD-NaTx بر میزبان شد. پس از تخلیص با توالی هیستیدینی در ستون نیکل در مرحله اول، هضم با انتروکیناز و جداسازی ناحیه تیوردوکسین از آن، انجام شد و سپس تخلیص مجدد با ستون نیکل برای جداسازی پپتید از تیوردوکسین صورت گرفت.
تغییر دیگری که در وکتور جدید اعمال شد حذف دو جایگاه برش آنزیم های Nco I و EcoR V از سایت کلون سازی بود که بدین صورت آنزیم BamH I بعنوان اولین آنزیم محل کلون سازی قرار می گرفت. با توجه به پرکاربرد بودن آنزیم BamH I در پروسههای کلونسازی بدلایل مختلف نظیر دردسترس بودن، ارزانتر بودن و سادگی کار در مقایسه با دیگر آنزیمهای برشدهنده، نحوه تغییر وکتور بصورتی انجام شد که این آنزیم بعنوان اولین آنزیم در ناحیه آمینی پپتید نوترکیب قرار گرفته و اسید آمینههای اضافی موجود در pET-32 اصلی در این ناحیه قرار نمیگیرد. با حذف دو جایگاه برش آنزیمهای Nco I و EcoR V از وکتور، بعد از استفاده از آنزیم انتروکیناز، در ابتدای ژن مطلوب، تنها دو اسیدآمینه اضافه قرار میگیرد که احتمال تغییر در ساختار پروتئینی آن را کم کرده و انتهای آمینی ساده ایجاد خواهد کرد.
نتیجه گیری
در این تحقیق از روش ساده و سریع کلونینگ برای دسترسی به یک پلاسمید جدید pET32b(+)Rh با استفاده از پلاسمیدهای تجاری موجود، استفاده شد. این وکتور که دارای پپتید فیوژن تیوردوکسین می باشد باعث افزایش میزان حلالیت پروتئین نوترکیب میشود. همچنین استفاده از pET32b(+)Rh از لحاظ اقتصادی مقرون به صرفه میباشد چرا که نیاز بروشهای تخلیص پرهزینه در مرحله دوم تخلیص را از بین میبرد. وکتور جدید میتواند در تولید کم هزینهتر پروتئینهای نوترکیب که دارای باندهای دیسولفیدی هستند نظیر اکثر پروتئینهای یوکاریوتی استفاده شود و پروسه تخلیص نهایی را با استفاده از ستون نیکل سادهتر کند.
قدردانی و تشکر
بدین وسیله نویسندگان مقاله از دانشگاه شهرکرد بدلیل حمایت مالی و معنوی برای انجام این پژوهش تشکر میکنند.