نقش رنگیزه های فتوسنتزی و آنزیمهای آنتی اکسیدان در مقابل تنش اکسیداتیوزهره امینی*،1 و رحیم حداد21 اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده کشاورزی2 قزوین، دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره)، گروه بیوتکنولوژی کشاورزیتاریخ دریافت: 16/4/89 تاریخ پذیرش: 31/3/90چکیدهدر این پژوهش اثر تنش اکسیداتیو (Oxidative stress) ناشی از تنش خشکی و پیری بر میزان کلروفیل a، کلروفیل b، کاروتنوئیدها، پروتئین زیر واحد بزرگ آنزیم روبیسکو (rbcl)، آنزیمهای آنتی اکسیدان شامل سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و آسکوربات پراکسیداز (APX) در مراحل شروع باروری، پرشدن دانه، شیری شدن ثانویه و خمیری نرم در شرایط مزرعه ای در دو ژنوتیپ جو با عملکرد متفاوت (ژنوتیپ Q13 با عملکرد 1390 کیلوگرم در هکتار و ژنوتیپ Q20 با عملکرد 1598 کیلوگرم در هکتار) در گیاهان تحت تیمارهای آبی و خشکی بررسی گردید. نتایج نشان دادند در هر دو ژنوتیپ تغییرات محتوای کلروفیل b به تنش کم آبی حساس تر از کلروفیل a می باشد. مقدار کاروتنوئیدها در ابتدای دوره تنش افزایش پیدا کرد اما با افزایش شدت تنش مقدار آنها کاهش یافت. میزان پروتئین زیر واحد بزرگ آنزیم روبیسکو با افزایش سن گیاه و در اثر تنش خشکی کاهش پیدا کرد. با افزایش سن گیاه فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در هر دو ژنوتیپ هم در گیاهان تیمار آبی و هم در گیاهان تیمار خشکی کاهش یافت. اما در گیاهان تحت تنش خشکی ژنوتیپ Q13 فعالیت این آنزیم با شدت بیشتری کاهش یافت. فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز با افزایش سن گیاهان ژنوتیپ Q13 در هر دو تیمار کاهش پیدا کرد. اما در ژنوتیپ Q20 با افزایش سن گیاهان هر دو تیمار کاهش معنی داری در فعالیت این آنزیم مشاهده نشد. به نظر می رسد توانایی بیشتر ژنوتیپ Q20 در حفظ فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در زمان تنش کم آبی و افزایش سن گیاه و همچنین حفظ فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در طی مراحل پیری گیاه جو نقش مؤثری در بیشتر بودن عملکرد دانه این ژنوتیپ نسبت به ژنوتیپ Q13 دارد.واژه های کلیدی: آنزیمهای آنتی اکسیدان، تنش اکسیداتیو، کلروفیل a، کلروفیل b، کاروتنوئیدها* نویسنده مسئول،  تلفن: 09163004669، پست الکترونیکی:  zohamini@gmail.comمقدمه پیری (senescence) برگ یا گیاه آخرین مرحله نمو آن می‌باشد که به صورت ژنتیکی و با دقت بسیار زیادی تنظیم می‌گردد. این مرحله از نمو گیاهان شامل تغییرات متابولیکی و فیزیولوژیکی منظمی است که در نهایت به مرگ برگ (گیاه) منجر می‌شود (28 و 29). مرحله پیری برگ معمولاً با تغییرات رنگی آشکار همراه است. برگهای سبز درختان در فصل پاییز قبل از قهوه ای شدن، مردن و جدایی از گیاه از سبز به زرد، نارنجی و قرمز تغییر رنگ می‌دهند. گیاهان یکساله مانند غلات نیز وقتی از سبز به زرد طلایی تغییر رنگ می‌دهند، فرآیند مشابهی را دنبال می‌کنند (4). در غلات از جمله جو تغییر رنگ برگها از مرحله رسیدن دانه آغاز می گردد. در مرحله رسیدن دانه می‌توان مراحل رسیدن سبز یا شیری، رسیدن زرد یا خمیری، رسیدن نیمه سخت و رسیدن کامل یا سخت را تشخیص داد (1).پیری برگ به دلیل اینکه طول دوره ساخت مواد غذایی را در گیاهان تعیین می‌کند، یکی از عوامل تعیین کننده میزان عملکرد گیاهان می‌باشد. اگر چه در بیشتر گونه‌ها پیری ناشی از افزایش سن می‌باشد، اما عوامل درونی گیاه مانند تنظیم کننده‌های رشد گیاهی و عوامل بیرونی می‌توانند بر آغاز  پیری و پیشرفت آن اثر داشته باشند (18). فرآیند پیری در سطح مولکولی، سلولی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی بسیار هماهنگ عمل می‌کند و با تغییرات ویژه در ساختمان سلول، افزایش تشکیل رادیکالهای فعال اکسیژن (Reactive Oygen Species)، افزایش پراکسیداسیون لیپیدی، از بین رفتن کلروفیل و کاهش میزان فتوسنتز شناسایی می‌گردد (27 و 37). تا به امروز اساس بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی فرآیندهایی که منجر به آغاز پیری و پیشرفت آن در گیاهان می‌شود، به خوبی شناخته نشده است. جهت درک بهتر فرآیندهای پیری لازم است مکانیسمهای تنظیم کننده میزان رادیکالهای فعال اکسیژن در گیاهان بررسی گردد. رادیکالهای فعال اکسیژن به طور مستقیم باعث تخریب پروتئینها، اسیدهای آمینه، اسیدهای نوکلئیک و پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی می شوند (36 و 39). گیاهان جهت مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از رادیکالهای فعال اکسیژن دارای مکانیزمهای آنتی اکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی می‌باشند (7، 29 و 31). آنتی اکسیدانهای غیرآنزیمی شامل ترکیبات آب گریز (توکوفرول ها و کاروتنوئیدها) و آب دوست (گلوتاتیون و اسید آسکوربیک) می باشند (34). آنزیمهای آنتی اکسیدان شامل سوپراکسید دیسموتاز (  SOD, EC 1.15.1.1)، کاتالاز (CAT,EC 1.11.1.6)، آسکوربات پراکسیداز (APX, EC 1.11.1.11 )، گلوتاتیون ردوکتاز (GR, EC 1.6.4.2) و پراکسیداز ( POX, EC 1.11.1.7 ) می باشد (8، 19 و 26). سیستم دفاع آنتی اکسیدانی سلول در محافظت سلولهای گیاهی در مقابل تنش اکسیداتیو ناشی از وجود رادیکالهای فعال اکسیژن نقش مهمی بر عهده دارد.  مشخص شده است که در ارقام همیشه سبز گونه‌های مختلف گیاهان نسبت به ارقامی که زودتر پیر می‌شوند و یا در ارقامی که به تنشهای محیطی مقاوم هستند، فعالیت آنتی اکسیدانها بیشتر می باشد (6، 14 و 23). هچنین زینالی یادگاری و همکاران (1388) گزارش کردند در گیاه سویا افزایش بیشتر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان آسکوربات پراکسیداز و پراکسیداز در اثر پیش تیمار سرمایی باعث می گردد این گیاهان نسبت به گیاهان شاهد بهتر بتوانند تنش سرمایی 4 درجه سانتی گراد را تحمل کنند (3). از این رو بررسی نحوه فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان به عنوان بخشی از سیستم دفاعی سلول، در درک بهتر فرآیندهایی که منجر به مقاومت گیاهان به تنشهای محیطی می شوند، نقش مهمی دارد.جو (Hordeum vulgare L.) به دلیل داشتن مالت در صنعت و همچنین به طور مستقیم به وسیله انسان و دام مصرف می شود و در بین غلات مقام چهارم را در تولید جهانی دارا می باشد (5). این گیاه نسبت به سایر غلات به تنش خشکی مقاوم تر می باشد، اما جو نیز در دوره رشد و نمو خود در دو مرحله شروع باروری و پرشدن دانه نسبت به کمبود آب حساس است و تنش خشکی در این مراحل منجر به کاهش عملکرد جو می‌شود (9 و 10). خشکی یکی از مهم ترین تنشهای محیطی می باشد که بر روی فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان در گیاهان تأثیر دارد. تا به امروز تحقیقات زیادی درباره اثر تنش خشکی بر فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدان صورت گرفته است، اما اطلاعات اندکی درباره اثر تنش خشکی بر فعالیت این آنزیمها در شرایط طبیعی رشد گیاهان وجود دارد. از این رو در این پژوهش اثرات تنش خشکی و افزایش سن گیاه بر تغییرات میزان کلروفیل a ، کلروفیل b ، کاروتنوئیدها (شامل β کاروتن و گزانتوفیل) و آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز در دو ژنوتیپ جو در چهار مرحله شروع باروری، پر شدن دانه، شیری شدن ثانویه و خمیری نرم بررسی شده است تا نقش آنتی اکسیدانها در مقاومت گیاه جو به تنش اکسیداتیو ناشی از تنش خشکی و مرحله پیری بررسی گردد. مواد و روشهامواد گیاهی و شرایط کاشت: بذر دو ژنوتیپ جو (Hordeum vulgare L.) به نامهای Q13 و Q20 با تراکم 250 بوته در هکتار و با سه تکرار در مزرعه کاشته شدند. از زمان کاشت تا 200 روز بعد از کاشت گیاهان در شرایط طبیعی مزرعه قرار داشتند و فقط آب باران را دریافت می کردند (مشخصات آب وهوایی شهر قزوین در طول دوره آزمایش در شکل 1 نشان داده شده است). از این تاریخ به بعد بر روی گیاهانی که باید تحت تنش خشکی قرار می گرفتند، پوشش پلاستیکی قرار داده شد تا از رسیدن آب باران به آنها جلوگیری شود. این گیاهان تا پایان دوره آزمایش آبیاری نشدند. گیاهانی که تحت تیمار آبی قرار گرفتند، در طول دوره آزمایش هفته ای یک بار آبیاری شدند. نمونه برداری از برگ گیاهان تیمار آبی در روزهای 215، 229، 236 و 241 بعد از کاشت بر اساس روش ده دهی یا زادوکس به ترتیب در مراحل شروع باروری (61-60)، پر شدن دانه (72-71)، شیری شدن ثانویه (76-75) و خمیری نرم (85) و 24 ساعت پس از آبیاری گیاهان صورت گرفت (اعداد نوشته شده در پرانتز نشان دهنده مراحل رشد و نمو غلات بر اساس روش ده دهی یا دو صفر تا 100 (زادوکس) می‌باشد). گیاهان تیمار خشکی در روزهای 215، 229 و236 بعد از کاشت در مراحل شروع باروری، پر شدن دانه و خمیری نرم نمونه برداری شدند. 






شکل 1- میزان بارندگی (▲)، دمای متوسط (●) و رطوبت نسبی (■) در طول دوره آزمایش تعیین میزان نسبی آب برگ (RWC): از برگ پرچم ساقه اصلی دیسکهایی تهیه شد. ابتدا وزن تر هر نمونه اندازه گیری گردید (FW). پس از آن دیسکهای هر نمونه به مدت 5 ساعت در آب مقطر قرار داده شده تا به حالت اشباع برسند. پس از گذشت این مدت زمان دیسکها از آب مقطر خارج شده و پس از رفع رطوبت سطحی، دوباره توزین گردیدند (SW). در مرحله بعد دیسکهای اشباع شده به مدت 72 ساعت در دمای 70 درجه سانتی گراد قرار گرفتند. در پایان این زمان، دیسکها دوباره وزن شدند (DW). به منظور محاسبه میزان نسبی آب برگ پرچم از رابطه ریاضی زیر استفاده گردید (29):  پروتئین محلول کل: جهت استخراج پروتئین محلول کل یک گرم بافت برگ در حضور 100 میلی‌گرم پلی وینیل پیرولیدون (PVP) و 3 میلی‌لیتر بافر استخراج (شامل بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار (7 = pH) و سدیم متا بی سولفات یک میلی‌مولار) همگن شدند. جهت عصاره گیری نمونه حاصل به لوله‌های سانتریفیوژ انتقال داده شده و در rpm 15000 و دمای 4+ درجه سانتی گراد به مدت 25 دقیقه در دستگاه سانتریفیوژ رومیزی (Beckman Culter مدل  Allegra – 64R) سانتریفیوژ شدند. همه مراحل تهیه عصاره آنزیمی در دمای 4+ درجه سانتی گراد صورت گرفت. میزان پروتئین محلول کل به روش بردفورد (11) اندازه گیری شد. جهت تهیه منحنی استاندارد از غلظتهای مختلف پروتئین آلبومین سرم گاوی (Bovin serum albumin, BSA) استفاده گردید.کلروفیل و کاروتنوئیدها: جهت سنجش کلروفیل های a و b و کاروتنوئیدها از روش لیختن تیلر (1987) استفاده شد (24). یک گرم برگ تازه در هاون چینی با 5 میلی لیتر استن 80 درصد ساییده و محتوی با کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف گردید. جذب محلول در طول موجهای 664، 667 و 470 نانومتر خوانده شد. مقدار کلروفیل a ، کلروفیل b و کاروتنوئیدها با استفاده از فرمولهای زیر محاسبه گردید.   Ca، Cb و CX+C به ترتیب غلظت کلروفیلa، کلروفیلb و کاروتنوئیدها می باشد.پروتئین زیرواحد بزرگ آنزیم روبیسکو (rbcl): بررسی تغییرات مقدار این پروتئین در طول دوره آزمایش با استفاده از روش SDS-PAGE انجام گرفت. جهت آماده سازی نمونه‌های پروتئینی 5 میکرولیتر از عصاره خام با 1 میکرولیتر بافر SDS×3 ( شامل تریس هیدروکلراید 5/187 میلی مولار ( 8/6 = pH )، سدیم دو دسیل سولفات (SDS) 6 درصد، گلیسرول 30 درصد و برموفنل بلو 03/0 درصد) و 5/0 میکرولیتر بافر DTT ×30 (دی‌تیوتریتول 40 میلی‌مولار) مخلوط کرده و به مدت پنج دقیقه در آب جوش (با دمای 95 درجه سانتی گراد) قرار داده شدند. بعد از آن، نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه در rpm 13000 سانتریفیوژ شدند. سپس 5 میکرولیتر از مایع سطحی در چاهک ژل SDS – پلی اکریل آمید به روش لاملی (22) تزریق گردید. با استفاده از نرم افزار LabWorks 4.0 ژلهای SDS-PAGE تجزیه و تحلیل شده و وزن مولکولی نوارها مشخص گردید. سنجش آنزیمی: فعالیت آنزیمها به روش اسپکتروفتومتری (اسپکتروفتومتر Labomed مدل UV-3200) در دمای آزمایشگاه (2±25) اندازه گیری شد. فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز(1. 1. 15. 1 SOD, EC ) از طریق اندازه گیری توانایی آن در جلوگیری از احیای نوری نیترو بلو تترازولیوم کلراید (NBT) به روش دهیندسا و همکاران (15) اندازه گیری شد. 3 میلی‌لیتر مخلوط واکنش شامل فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار (8/7 = (pH، متیونین 13 میلی‌مولار، نیتروبلوتترازولیوم کلراید 75 میکرومولار، اتیلن دی آمین تترا استیک اسید 1/0 میلی مولار، ریبوفلاوین 360 میکرومولار و 30 میکرولیتر عصاره خام بود. پس از آن که مخلوط به هم زده شد سلهای اسپکتروفتومتر به مدت 10 دقیقه در زیر یک لامپ فلورسنت w15 به فاصله 35 سانتیمتر قرار داده شد. با خاموش کردن لامپ واکنش متوقف و جذب مخلوط واکنش در 560 نانومتر خوانده شد. یک واحد فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز، مقدار آنزیمی در نظر گرفته می‌شود که می‌تواند تا50 درصد مانع از احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم کلراید گردد. فعالیت ویژه آنزیم به صورت تعداد واحدهای آنزیم در میلی‌گرم پروتئین گزارش گردید. فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (11.1.11.1 APX, EC) به روش ناکانو و اسدا (30) اندازه گیری گردید. یک میلی لیتر مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیم یک مولار (8/7 = (pH، آسکوربات 10 میلی‌مولار، پراکسید هیدروژن 10میلی‌مولار و 10 میکرولیتر عصاره خام بود. فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز بر اساس میزان اکسید شدن آسکوربات در طول موج 290نانومتر و با استفاده از ضریب خاموشیmM-1cm-1 8/2 تعیین گردید.تجزیه و تحلیل داده ها: آزمایش به صورت فاکتوریل 3 × 2 × 2 در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. عوامل پراکندگی مورد مطالعه در این تحقیق عبارت از دو نوع تیمار آبیاری (‏T)‏‏‏‏‏‏‏‏‏ ب: دو نوع ژنوتیپ (‏G) و ج: سه مرحله رشد گیاه (‏S) بودند. بررسی داده‌ها به کمک نرم‌افزار (Chicago, Il, USA) SPSS 11.5 انجام گرفته و میانگینها به وسیله آزمون دانکن در سطح احتمال 1 درصد با یکدیگر مقایسه شدند.نتایجمیزان نسبی آب برگ (RWC)، پروتئین محلول کل، کلروفیل ها و کاروتنوئیدها: میزان این صفات در گیاهان آبیاری شده وگیاهان تحت تنش خشکی در طول دوره آزمایش با افزایش سن گیاه به تدریج کاهش پیدا کرد. الگوی کاهش در گیاهان آبیاری شده وگیاهان تحت تنش خشکی مشابه بود. میزان RWC گیاهان آبیاری شده ژنوتیپهای Q13 و Q20 بعد از چهار مرحله نمونه برداری به ترتیب 62/5 درصد و 68/7 درصد و در گیاهان تحت تنش خشکی بعد از سه مرحله نمونه برداری 4/48 درصد و 7/51 درصد کاهش پیدا کرد (شکل 2). در هر دو ژنوتیپ در نمونه برداری اول تفاوت معنی داری بین تیمارها مشاهده نگردید. اما در نمونه برداری دوم و سوم تفاوت بین تیمارها معنی دار بود. پروتئین محلول کل در گیاهان آبیاری شده بعد از چهار مرحله نمونه برداری در ژنوتیپهای Q13 و Q20 به ترتیب 37 درصد و 46 درصد و در گیاهان تحت تنش خشکی بعد از سه مرحله نمونه‌برداری به ترتیب 21 درصد و 43 درصد کاهش نشان داد (شکل 2). در اثر تنش خشکی میزان پروتئین محلول کل درگیاهان تحت تنش خشکی نسبت به گیاهان آبیاری شده کاهش پیدا کرد. کاهش میزان پروتئین محلول کل در نمونه برداری اول در هر دو ژنوتیپ‌ و در نمونه برداری دوم فقط در ژنوتیپ Q13 معنی دار بود. در نمونه برداری سوم بین گیاهان آبیاری شده و گیاهان تحت تنش خشکی هر دو ژنوتیپ تفاوت معنی داری مشاهده نگردید. در گیاهان آبیاری شده میزان کاهش کلروفیل a پس از چهار مرحله نمونه برداری در ژنوتیپ Q13، 75 درصد و در ژنوتیپ Q20 77 درصد و میزان کاهش کلروفیل b به ترتیب 80 درصد و 90 درصد به دست آمد (شکل 3). در گیاهانی که تحت تنش خشکی قرار داشتند بعد از سه مرحله نمونه برداری در ژنوتیپهای Q13 و Q20 میزان کاهش کلروفیل a به ترتیب 68 درصد و 78 درصد و میزان کاهش کلروفیل b به ترتیب 70 درصد و 82 درصد بود. مقدار کلروفیل a درنمونه برداری اول و دوم بین گیاهان آبیاری شده و گیاهان تحت تنش خشکی تفاوت معنی داری نشان نداد و فقط در نمونه برداری سوم میزان کلروفیل a در هر دو ژنوتیپ در گیاهان تحت تنش خشکی کمتر از گیاهان آبیاری شده مشاهده شد. تفاوت مقدار کلروفیل b در گیاهان تحت تنش خشکی و گیاهان آبیاری شده در ژنوتیپهای Q13 و  Q20در نمونه برداری اول، به ترتیب 52 درصد و60 درصد  به دست آمد. در نمونه برداری دوم و سوم فقط در ژنوتیپQ13 میزان کلروفیل b در گیاهان تحت تنش خشکی به ترتیب 43 درصد و 51 درصد از مقدار کلروفیل b در گیاهان آبیاری شده کمتر بود. در این آزمایش مقدار کاروتنوئیدها شامل β- کاروتن و گزانتوفیل در طول دوره آزمایش در گیاهان آبی و گیاهانی که تحت تنش خشکی قرار داشتند به طور مشابه کاهش پیدا کرد (شکل 3). در گیاهان آبیاری شده میزان کاهش کاروتنوئیدها بعد از چهار مرحله نمونه برداری در ژنوتیپ Q13، 14/57 درصد و در ژنوتیپ Q20 2/62 درصد و در گیاهانی که تحت تنش خشکی قرار داشتند بعد از سه مرحله نمونه برداری به ترتیب 41/57 درصد و 24/73 درصد مشاهده گردید. در ابتدای اعمال تنش میزان کاروتنوئیدها در هر دو ژنوتیپ افزایش یافت. اما با افزایش شدت تنش، مقدار آن کاهش پیدا کرد به طوریکه در نمونه برداری سوم مقدار آن در گیاهان تحت تنش کمتر از گیاهان آبیاری شده بود. جدول 1- نتایج اندازه گیری برخی صفات مورفولوژیکی در مرحله شروع باروری ژنوتیپهای بکار برده شده در این پژوهش .ژنوتیپ ارتفاع بوته (cm) طول خوشه (cm) طول ریشک (cm) طول برگ پرچمی (cm) وزن هزار دانه (gr) متوسط عملکرد (Kg/ha)Q13 33/48 7/6 00/8 27/6 11/36 1390Q20 07/65 60/8 00/13 27/9 99/35 1582جدول 2- همبستگی بین صفات اندازه گیری شده شامل میزان نسبی آب برگ پرچم (RWC)، کلروفیل a (Chla)، کلروفیل b (Chlb)، کاروتنوئیدها (CAR)‏‏‏‏, پروتئین محلول کل (TSP) و فعالیت آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، آسکوربیت پراکسیداز (APX) در تیمار آبی در طول دوره آزمایش.Chla Chlb CAR TSP APX SOD صفت**686/0 **684/0 **619/0 **744/0 **611/0- 272/0 RWC **785/0 **929/0 **833/0 158/0- **573/0 Chla **599/0 **799/0 *374/0- **446/0 Chlb **754/0 **048/0- **589/0 CAR *388/0- *413/0- TSP *419/0 APX
                                                               







شکل 2 – تغییرات میزان نسبی آب برگ پرچم و پروتئین محلول کل ژنوتیپ Q13 (♦) و ژنوتیپ Q20 (▲) در مراحل شروع باروری (215 روز بعد از کاشت)، پر شدن دانه (229 روز بعد از کاشت)، شیری شدن ثانویه (236 روز بعد از کاشت) و خمیری نرم (241 روز بعد از کاشت) در گیاهان تیمار آبی (−) و در مراحل شروع باروری (215 روز بعد از کاشت)، پر شدن دانه (229 روز بعد از کاشت) و خمیری نرم (236 روز بعد از کاشت) گیاهان تحت تنش خشکی ( --- ) . هر عدد میانگین سه تکرار می‌باشد(Mean±SE). میانگینها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 1 درصد مقایسه شدند.
                                                            

                                                                 

















شکل 3 – تغییرات میزان نسبی کلروفیل a، کلروفیل b، نسبت Chla/b و کاروتنوئیدهای ژنوتیپ Q13 (♦) و ژنوتیپ Q20 (▲)در مراحل شروع باروری (215 روز بعد از کاشت)، پر شدن دانه (229 روز بعد از کاشت)، شیری شدن ثانویه (236 روز بعد از کاشت) و خمیری نرم (241 روز بعد از کاشت) در گیاهان تیمار آبی (−) و در مراحل شروع باروری (215 روز بعد از کاشت)، پر شدن دانه (229 روز بعد از کاشت) و خمیری نرم (236 روز بعد از کاشت) گیاهان تحت تنش خشکی ( --- ) . هر عدد میانگین سه تکرار می‌باشد(Mean±SE). میانگینها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 1 درصد مقایسه شدند. آنزیمهای آنتی اکسیدان: فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(10150101 SOD, EC) با افزایش سن گیاهان هر دو تیمار کاهش پیدا کرد (شکل 4). در گیاهان آبیاری شده فعالیت SOD درطول دوره آزمایش با افزایش سن برگ در ژنوتیپهای Q13 و Q22 به ترتیب 62 درصد و 57 درصد کاهش نشان داد. الگوی کاهش فعالیت SOD در گیاهان تحت تنش خشکی نیز مشابه گیاهان آبیاری شده بود. در گیاهان تحت تنش خشکی با افزایش سن گیاه در طی سه مرحله نمونه برداری فعالیت SOD در ژنوتیپهای Q13 و 0Q2 به ترتیب 57 درصد و 35 درصد کاهش نشان داد. تنش خشکی باعث افزایش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز گردید. بنحوی که فعالیت این آنزیم در ژنوتیپ Q13 در نمونه برداری دوم 44 درصد ودر ژنوتیپ Q20 در نمونه برداری سوم 58 درصد در گیاهان تحت تنش خشکی از گیاهان آبیاری شده بیشتر مشاهده شد. اما در نمونه برداری اول تفاوت معنی داری بین تیمارها مشاهده نگردید.
 



                                                                









شکل 4 – آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز ژنوتیپ Q13 (♦) و ژنوتیپ Q20 (▲)در مراحل شروع باروری (215 روز بعد از کاشت)، پر شدن دانه (229 روز بعد از کاشت)، شیری شدن ثانویه (236 روز بعد از کاشت) و خمیری نرم (241 روز بعد از کاشت) در گیاهان تیمار آبی (−) و در مراحل شروع باروری (215 روز بعد از کاشت)، پر شدن دانه (229 روز بعد از کاشت) و خمیری نرم (236 روز بعد از کاشت) گیاهان تحت تنش خشکی ( --- ) . هر عدد میانگین سه تکرار می‌باشد(Mean±SE). میانگینها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 1 درصد مقایسه شدند.









                              ژنوتیپ Q13                                                             ژنوتیپ Q20شکل 5- تغییرات پروتئین زیر واحد بزرگ آنزیم روبیسکو در تیمارهای آبی و خشکی طی مراحل مختلف رشد. اعداد یک تا چهار به ترتیب نشان دهنده مراحل مختلف رشد شامل شروع باروری (مرحله 1)، پر شدن دانه (مرحله 2)، شیری شدن ثانویه (مرحله 3) و خمیری نرم (مرحله 4) در گیاهان تیمار آبی و مراحل شروع باروری (مرحله 1)، پر شدن دانه (مرحله 2) و خمیری نرم (مرحله 3) می‌باشند. شانه بکار برده شده شده جهت ژل تیمار خشکی ژنوتیپ Q20 کوچکتر از شانه استفاده شده در سایر شکلها بوده است. لذا شدت باند رابیسکو در این تصویر بیشتر از سایر تصاویر به نظر می رسد. در صورتی که اندازه واقعی آن کمتر می باشد. دلیل صحت موضوع فوق الذکر ضخامت بارز خط کش می باشد. در هر چاهک 5 میکرو لیتر عصاره خام بارگیری شد. فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز(101101011 APX, EC) در طی چهار مرحله نمونه برداری در گیاهان آبیاری شده در ژنوتیپ Q13 52 درصد کاهش نشان داد(شکل 4). در صورتی که در ژنوتیپ Q20 کاهش معنی دار نبود. تنش خشکی باعث گردید میزان فعالیت APX افزایش پیدا کند. در هر دو ژنوتیپ فعالیت APX در طول دوره آزمایش در گیاهان تحت تنش خشکی از گیاهان آبیاری شده بیشتر بود. فعالیت APX در گیاهان تحت تنش نسبت به گیاهان آبیاری شده در ژنوتیپ‌های Q13 و  Q20به ترتیب در نمونه برداری اول 127 درصد و 62 درصد، در نمونه‌برداری دوم 126 درصد و 52 درصد و در نمونه برداری سوم 163 درصد و 114 درصد افزایش نشان داد. فعالیت APX در گیاهان تحت تنش خشکی ژنوتیپ Q13 نیز مانند گیاهان آبیاری شده با افزایش سن گیاه کاهش پیدا کرد. اما میزان کاهش در گیاهان تحت تنش خشکی از گیاهان آبیاری شده کمتر بود. فعالیت APX در طول دوره آزمایش در گیاهان تحت تنش خشکی در ژنوتیپ Q13، 15 درصد کاهش نشان داد. در صورتی که در ژنوتیپ  Q20تغییر معنی داری مشاهده نگردید.پروتئین زیر واحد بزرگ آنزیم روبیسکو: با استفاده از نرم افزار LabWorks 4.0 ژلهای SDS-PAGE آنالیز شدند و وزن مولکولی باندها مشخص گردید. باندی که وزن مولکولی آنKD 3±55 بود به عنوان باند پروتئین زیر واحد بزرگ آنزیم روبیسکو شناسایی گردید (شکل 5). تعیین نوار پروتئینی با وزن مولکولی KD 55 به عنوان نوار پروتئین زیر واحد بزرگ آنزیم روبیسکو به وسیله دیگران نیز گزارش شده است (42). نتایج به دست آمده نشان داد که میزان پروتئین rbcl در طی دوره آزمایش در گیاهان آبیاری شده و گیاهانی که تحت تنش خشکی بودند، کاهش پیدا کرد. همچنین در اثر تنش خشکی در دو ژنوتیپ به کار برده شده در این آزمایش مقدار پروتئین  rbcl کاهش نشان داد. 

بحث و نتیجه گیرینتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که تنش خشکی باعث تسریع پیری می‌گردد. به طوری که گیاهان تیمار آبی تا 241 روز بعد از کاشت نمونه برداری شدند. در صورتی که گیاهان تیمار خشکی تا 236 روز بعد از کاشت نمونه برداری شدند. تنش خشکی یکی از مهم ترین تنشهای محیطی می‌باشد که باعث کاهش رشد گیاهان و در نتیجه کاهش عملکرد آنها می‌شود. در شرایط تنش خشکی گیاه جهت حفظ آب سلول اندامهای مختلف روزنه‌های خود را می‌بندد. در نتیجه میزان فتوسنتز به دلیل کمبود میزان دی اکسید کربن کاهش می‌یابد (34). در چنین شرایطی میزان تشکیل رادیکالهای فعال اکسیژن به ویژه رادیکال سوپراکسید در کلروپلاست افزایش پیدا می‌کند (33 و 38). رادیکالهای آزاد باعث تخریب ماکرومولکول‌ها و پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء می‌شوند. بدین ترتیب تنش اکسیداتیو ناشی از شرایط نامساعد خشکی منجر به تسریع پیری در گیاهان می‌شود (18). از آنجایی که گیاهان نمی‌توانند از شرایط نامساعد محیطی فرار کنند، پیر شدن برگ در اثر تنش خشکی مکانیسمی است که می‌تواند باعث بقای گیاه در شرایط نامساعد محیطی گردد (12). در این زمان، مواد غذایی از برگ به سایر قسمتهای گیاه (برگهای جوان‌تر، میوه و گل) منتقل می‌شود (28). بررسیها نشان می‌دهد در غلات اگر تنش خشکی شدیدتر شود، گیاهان دچار رسیدن اجباری شده و گیاه به سرعت زرد و خشک می‌گردد (1). با افزایش سن گیاه، میزان RWC در تیمارهای آبی و خشکی کاهش پیدا کرد. همچنین تنش خشکی نیز باعث کاهش RWC گردید. در تحقیقی بر روی ارتباط خشکی و تنش اکسیداتیو ناشی از آن با پیری برگ در گیاه مریم گلی (Salvia officinalis L.) انجام گردید، گزارش شده است که تنش خشکی باعث بروز علائم پیری در برگ می‌شود. این علائم شامل افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء، کاهش میزان کلروفیل، فتوسنتز و کاهش شدید آنتی اکسیدانهای غیر آنزیمی شامل β - کاروتن و α - توکوفرول بود. همچنین در این آزمایش مشخص گردید با افزایش شدت تنش خشکی RWC نیز به تدریج کاهش می‌یابد (28). نمونه برداری اول‏‏‏ 215 روز بعد از کاشت و در مرحله شروع باروری انجام شد. با توجه به اینکه جو در طول دوره رشد و نمو در این مرحله نسبت به خشکی حساس می‌باشد (9 و 10). بنابراین می‌توان نتیجه گرفت که حساسیت گیاه جو به کمبود آب در این مرحله ناشی از کاهش پروتئین محلول کل می باشد. کاهش پروتئین محلول کل در اثر تنش خشکی  در سایر گیاهان مانند آفتابگردان، گندم و برنج نیز گزارش شده است (17، 33 و 37).کاهش مقدار کلروفیل در طی مراحل پیری و در اثر تنش خشکی در سایر گونه های گیاهی نیز گزارش شده است (12، 16 و 21). میزان کاهش کلروفیل b در اثر تنش خشکی بیشتر از کلروفیل a می‌باشد. زیرا در اثر تنش خشکی مقدار کمپلکس پروتئینی جذب کننده نور chl a/b موجود در فتوسیستم II به شدت کاهش پیدا می کند. بخش کلروفیل b این کمپلکس پروتئینی درون غشاء کلروپلاست قرار دارد (4). با افزایش تشکیل ROS در کلروپلاست در اثر تنش خشکی، میزان تخریب غشاهای کلروپلاستی نیز افزایش می‌یابد. از این رو در اثر تنش خشکی تخریب کمپلکس پروتئینی Chl a/b و در نتیجه کلروفیل b نیز افزایش پیدا می کند. افزایش نسبت Chl a/b  در اثر تنش خشکی نیز ناشی از این مسئله می باشد. حساسیت کلروفیل b به سایر تنشهای اکسیداتیو  از جمله تنش غرقابی نیز مشخص شده است. بررسیهای انجام شده بر روی گیاهان ذرت و فلفل نشان داد که تنش غرقابی مقدار کلروفیل  a و b به ویژه کلروفیل b را کاهش می‌دهد. مطالعه بر روی گیاهان مختلف از جمله ژنوتیپهای مختلف ذرت نشان می‌دهد که کلروفیل b حساسیت بیشتری به تنش غرقابی دارد. همچنین فتوسیستم II که دارای مقدار بیشتری کلروفیل b می‌باشد به تنشهای محیطی حساس است و در نتیجه کلروفیل b بیشتری در اثر شرایط نامساعد محیطی از بین می‌رود (2). تغییرات نسبت Chl a/b  در دوران پیری در دو ژنوتیپ به کار برده شده در این آزمایش در گیاهان آبیاری شده و گیاهان تحت تنش خشکی الگوی مشخصی را دنبال نکرد (شکل 3). مون ـ بوش و همکاران (2001) در آزمایشی در شرایط مزرعه بر روی Salvia  officinalis L. نشان دادند که در دوران پیری برگ نسبت Chl a/b فقط 4 درصد کاهش پیدا کرد (27). همچنین در آزمایشی که بر روی Panicum miliaceum صورت گرفت؛ هم در برگهای پیر شده به وسیله تاریکی و هم در برگهایی که در اثر تنش خشکی پیری در آنها تشدید شده بود، نسبت Chl a/b  فقط زمانی به طور معنی دار در دوران پیری کاهش پیدا کرد که میزان کاهش کلروفیل بیش از 85 درصد  بود (17).کاروتنوئیدها شامل   کاروتن و گزانتوفیل ها آنتی اکسیدانهای چربی دوست با وزن مولکولی کم در کلروپلاست هستند که غشاهای کلروپلاستی را در مقابل تنش اکسیداتیو محافظت می کنند. کاروتنوئیدها علاوه بر نقش ساختمانی و جذب نور می توانند به صورت مستقیم اکسیژن یکتایی را غیر فعال کنند و یا از طریق فرو نشاندن کلروفیل برانگیخته شده، به صورت غیر مستقیم از تشکیل اکسیژن یکتایی جلوگیری کنند (2، 25 و 29). بدین ترتیب دستگاه فتوسنتزی را از شروع پراکسیداسیون لیپیدی محافظت می کنند. مولکول کاروتن برانگیخته شده از طریق انتقال الکترون به سایر رنگیزه‌های موجود در گیرنده‌های کلروپلاست و یا به وسیله انتشار گرما به حالت بنیادی برمی‌گردد(20). در این پژوهش مقدار کاروتنوئیدها در ابتدای دوره تنش افزایش پیدا کرد اما با افزایش شدت تنش مقدار آن کاهش یافت. مون بوش و همکاران (2003) گزارش کردند در اوایل دوران پیری کاهش معنی داری در مقدار کاروتنوئیدها مشاهده نگردید، اما در اواخر پیری میزان آنها به شدت کاهش می یابد (29). بنابراین به نظر می رسد که مکانسیم دفاع محافظت نوری در اوایل دوره پیری می تواند کلروپلاست ها را در مقابل تنش اکسیداتیو محافظت کند. اما در اواخر پیری دفاع محافظت نوری از بین می رود. تنش خشکی نیز باعث کاهش مقدار کاروتنوئیدها می شود .طبق نتایج حاصله میزان پروتئین زیر واحد بزرگ آنزیم روبیسکو (rbcl) طی مراحل مختلف رشد در گیاهان تیمارهای آبی و خشکی کاهش یافت. همچنین تنش خشکی باعث کاهش مقدار پروتئین rbcl گردید. این نتایج با سایر نتایج گزارش شده در این زمینه هماهنگ می باشد. بوچانان و همکاران (2003) به کمک تکنیک SDS-PAGE نشان دادند که در برگهای آرابیدوپسیس از روز 32 بعد از کاشت (بعد از اینکه برگها کاملاً توسعه یافتند) میزان پروتئین زیر واحد بزرگ آنزیم روبیسکو کاهش پیدا می کند (12). مشخص شده است که تخریب پروتئینهای استرومای کلروپلاست بویژه آنزیم روبیسکو در شرایط تنش اکسیداتیو به وسیله رادیکالهای فعال اکسیژن به صورت غیر آنزیمی صورت می گیرد (40). از آنجایی که در زمان پیری و در اثر تنش خشکی میزان ROS در کلروپلاست افزایش می یابد، بنابراین هم در اثر پیری و هم در زمان تنش خشکی تخریب پروتئین  آنزیم روبیسکو افزایش می یابد. بیش از 40 درصد پروتئین محلول کل برگ را آنزیم روبیسکو تشکیل می‌دهد (42). بنابراین کاهش آنزیم روبیسکو در اثر تنش اکسیداتیو می تواند کاهش پروتئین محلول کل را در زمان پیری و در اثر تنش خشکی توجیه کند. همچنین با توجه ‌به نقش آنزیم روبیسکو در تثبیت CO2 در گیاهان، کاهش فعالیت آنزیم روبیسکو در اثر تنش خشکی می تواند اثر تنش خشکی را در تسریع پیری  نیز توجیه کند(33). فعالیت SOD با افزایش سن برگ گیاهان هر دو تیمار کاهش پیدا کرد. کاهش فعالیت SOD در دوران پیری برگ در سایر گونه های گیاهی از جمله تنباکو ، ذرت ، کلم بروکلی و نخود فرنگی نیز گزارش شده است (15، 18 و 32). آنالیز وسترن بلات (Western blot) پروتئینهای لپه خیار که به طور طبیعی پیر شده بودند نشان داد که در دوران پیری لپه‌های خیار، به موازات کاهش فعالیت SOD، میزان پروتئین SOD در میتوکندری کاهش پیدا می کند(20). هی و اوساکی (2005) در آزمایشی بر روی برگهای تنباکو با سنین مختلف نشان دادند که در دوران بلوغ برگ به موازات کاهش فعالیت SOD میزان mRNAs مربوط به SOD نیز کاهش می یابد(18). در آزمایش مشابهی بر روی برگهای جوان و پیر جو، نیز مشخص گردید که میزان mRNAs مربوط به SOD در برگهای پیر کمتر از برگهای جوان می‌باشد. محققین با قرار دادن برگهای جوان و پیر در معرض تنش اکسیداتیو نوری نتیجه‌گیری کردند تخریب اکسیداتیو در زمان پیری به دلیل عدم توانایی برگهای پیر در تنظیم مقدار SOD  مربوط به  mRANs متناسب با سرعت تشکیل رادیکالهای فعال اکسیژن، به وجود می‌آید(13).افزایش فعالیت SOD در اثر تنش خشکی به وسیله محققین دیگر نیز گزارش شده است. حبیبی و همکاران (2004) در بررسی نحوه فعالیت آنزیمهای آنتی‌اکسیدان در شرایط مزرعه در 5 رقم آفتابگردان نشان دادند که در اثر تنش خشکی فعالیت SOD افزایش می یابد (17). در آزمایش مشابهی بر روی نشاهای برنج نیز مشخص گردید که فعالیت SOD در اثر تنش خشکی افزایش می یابد. به طور کلی آنزیمهای سوپراکسید دیسموتاز نقش عمده ای در محافظت سلولها علیه تنش اکسیداتیو بر عهده دارند. زیرا آنها رادیکال سوپراکسید را به پراکسید هیدروژن و اکسیژن مولکولی تبدیل می کنند. در اثر تنش خشکی فعالیت هر سه نوع آنزیم سوپراکسید دیسموتاز افزایش پیدا می‌کند. افزایش فعالیت SOD می تواند به دلیل افزایش رادیکال سوپر اکسید و یا اینکه یک مکانیسم دفاعی علیه تنش اکسیداتیو در گیاهان باشد (38).فعالیت آنزیم APX در هر دو ژنوتیپ در اثر تنش خشکی افزایش پیدا کرد. رتنایاکا و همکاران (2003) گزارش کردند که تنش خشکی باعث می گردد فعالیت APX در گیاه کتان (Gosspium hrsutum L.)40 درصد و در گیاه آنودا (Anoda cristata L.) 26 درصد افزایش یابد(35). همچنین در تحقیقی که میزان فعالیت APX را در برگهای تنباکو، با سنین مختلف بررسی کردند، مشخص گردید با افزایش سن برگ فعالیت APX کاهش می‌یابد(15).به طور کلی آنزیمهای آنتی اکسیدان نقش مهمی در مقابله با تنش اکسیداتیو ناشی از دوران پیری و شرایط نامساعد محیطی دارند. در این آزمایش با افزایش سن گیاه فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در هر دو ژنوتیپ و در هر دو تیمار کاهش پیدا کرد. اما در گیاهان تیمار خشکی ژنوتیپ Q13 فعالیت این آنزیم با شدت بیشتری کاهش یافت. فعالیت آنزیم‌ آسکوبات پراکسیداز با افزایش سن گیاهان ژنوتیپ Q13 در هر دو تیمار کاهش پیدا کرد. اما در ژنوتیپ Q20 کاهش معنی داری در فعالیت این آنزیم مشاهده نشد. به نظر می رسد توانایی بیشتر ژنوتیپ Q20 در حفظ فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز در زمان تنش خشکی و همچنین حفظ فعالیت آسکوربات پراکسیداز در طی مراحل پیری می تواند نقش مؤثری در بیشتر بودن عملکرد این ژنوتیپ نسبت به ژنوتیپ Q13 داشته باشد.در این آزمایش بین صفات همبستگی مشاهده شد. همبستگی بین صفات مثبت بود. فقط همبستگی بین فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز و سایر صفات شامل میزان RWC، کلروفیل b، کاروتنوئیدها، پروتئین محلول کل و فعالیت آنزیم‌ SOD منفی می‌باشد. به عبارت دیگر با کاهش میزان این صفات، فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در مراحل آخر رشد گیاه جو تغییر معنی داری پیدا نکرد. علی رغم اینکه در مراحل پیری توانایی محافظتی سلول در مقابل رادیکالهای فعال اکسیژن کاهش می‌یابد و سلول دچار تنش اکسیداتیو می‌شود به نحوی که فعالیتهای طبیعی سلول و به دنبال آن ماکرومولکولهای سلول از جمله پروتئینها از بین می روند(41)، فعالیت ویژه آنزیم آسکوربات پراکسیداز تغییر معنی داری نداشته است، از آنجایی که فعالیت ویژه آنزیم نشان دهنده فراوانی نسبی پروتئین می‌باشد، این امر می‌تواند ناشی از افزایش بیان ژنهای کد کننده این آنزیم و یا اینکه پایداری مولکولهای پروتئینی این آنزیم در مقابل تخریب اکسیداتیو ناشی از شرایط پیری سلول باشد. اما نتیجه‌گیری قطعی درباره این موضوع نیاز به تحقیقات بیشتر در این زمینه دارد.