تجزیه پروتئوم: شناسایی پروتئینهای گیاهی تجمع یافته در روده حشرات کامل

 Aelia acuminata

محمد سعادتی

ایران، بیرجند، دانشگاه بیرجند، دانشکده کشاورزی، گروه گیاهپزشکی

تاریخ دریافت: 17/08/1399          تاریخ پذیرش: 28/01/1400

چکیده

برهمکنش حشره-گیاه وارد فاز مطالعات مولکولی گردیده است. پروتئومیکس یک تکنیک نسبتاً جدید در این زمینه می­باشد که می­تواند تفاوت بیان پروتئینها در بافتهای مختلف را اندازه­گیری نماید. شناسایی پروتئینهای گیاهی واردشده به دستگاه گوارش حشرات یکی از مهمترین چالشها در اکولوژی تکاملی می­باشد. در این مطالعه تعدادی از پروتئینهای گیاهی گندم تجمع یافته در روده حشرات کامل سنهای Aelia acuminate با استفاده از پروتئومیکس مورد ردیابی و شناسایی قرارگرفتند.مهار­کننده­های آنزیمی شامل سرپین و مهار­کننده آلفا-آمیلاز، پروتئینهای آنتی­اکسیدانت شامل پراکسیداز و دهیدرواسکوربات ردوکتاز و پروتئینهای ذاتی مانند کالمودولین، بتا-آمیلاز، داکسی میوژنیک اسید سنتاز، سیتوکروم C، آگلوتینین ایزولستین3 و هیپوتتیکال پروتئین(پروتئین فرضی) (Hypothetical protein) شناسایی گردیدند. نتایج پیشنهاد می­کنند که برای شناسایی پروتئینهای مؤثر در برهمکنشهای گیاه و گیاهخوار می­توان از پروتئومیکس استفاده نمود و نقش هریک از پروتئینهایی که شناسایی می­شوند را در فرایندهای  فیزیولوژی مورد بحث قرار داد.

واژه های کلیدی: پروتئومیکس، بیوشیمی، دستگاه گوارش، مهار­کننده، آنتی اکسیدانت.

* نویسنده مسئول، تلفن: 05632456630 ، پست الکترونیکی: M-saadati@birjand.ac.ir

مقدمه

تکامل قسمتهای مختلف دستگاه گوارش حشرات نقش ویژه­ای  در تعیین روش تغذیه از میزبانان متنوع ودر نتیجه  وقوع خسارتهای احتمالی در گیاهان را دارد (13). بطورکلی این دستگاه وظیفه اصلی در جذب مواد غذایی مورد نیاز برای سایر فرآیند­های متابولیکی بدن را به عهده دارد (8 و 12). از اینرو هر گونه اختلالی در روند جذب مواد­غذایی یا ایجاد صدمه­ای به ساختمان دستگاه گوارش باعث توقف جریان کسب انرژی از مواد­غذایی گردیده و هموستازی بدن مختل گردیده و حشره پس از مدتی از بین خواهد رفت (23). حشرات راسته ناجوربالان دارای هضم خارج دهانی (Extra oral digestion) می­باشند (7) که در این روش ابتدا غده بزاقی از طریق کانال بزاقی ترشحات پروتئینی خود را به بافت گیاه تزریق کرده که در نتیجه آن قسمتی از بافت گیاه به شکل مایع در­آمده و سپس از طریق کانال غذایی به درون روده پمپ می­شوند (12). ترشحات بزاقی بیشتر شامل پروتئازهایی می­شوند که باعث هیدرولیز پروتئین ذخیره­ای گندم به نام گلوتن می­گردند (8 و 13). مرحله هضم نهایی نیز در روده انجام شده که در طی آن مواد­غذایی به ذرات­ قابل جذب از طریق دیواره روده میانی تبدیل می­­گردند(21 و 46).

فرآیند تغذیه در حشرات مانند سایر جانوران وابسته به پروتئینهای موجود در دستگاه گوارش می­باشد. نوع و فراوانی پروتئینهای موجود در دستگاه گوارش اطلاعات مفیدی در زمینه تغذیه حشره شامل وابستگی به سوبستراهای خاص یا میزان استفاده از بعضی مواد­غذایی را ارائه می­نماید (15 و 44). استفاده از مهار­کننده­های پروتئینی برای ایجاد اختلال در برهمکنش پروتئینهای دستگاه گوارش با مواد­غذایی از راهکار­های جدید و مورد علاقه پژوهشگران برای کاهش تغذیه در حشرات می­باشد (46). این پروتئینهای سمی که دارای ساختمان سه بعدی ویژه­ای می­باشند به صورت نسبتاً اختصاصی بر علیه حشرات عمل می­کنند و در نتیجه آلودگی زیست محیطی کمتری را نیز در مقایسه با آفت­کشهای شیمیایی خواهند داشت(22،32).

از مهمترین پروتئینهای حشره­کش، مهار­کننده­های آنزیمهای گوارشی می­باشند که باعث بلوکه کردن فعالیت کاتالیتیکی آنزیمها شده و در نتیجه سوبستراهای زیستی تجزیه نشده و حشره توانایی خود را در بهره برداری از موادغذایی از دست داده و در اثر گرسنگی از بین می­رود. مهار­کننده­هایی که به صورت کاربردی بر علیه پروتئینهای گوارشی حشرات استفاده شده­اند در دو گروه مهار­کننده­های آلفا-آمیلاز (α-amylase inhibitors) و مهارکننده­های پروتئازی (Protease inhibitors) قرار می­گیرند (16 و 24). از مهارکننده­های آلفا-آمیلاز در کنترل عملی تعدادی از حشرات خانواده Bruchidae مانند سوسک نخود و سوسک چهارنقطه­ای حبوبات استفاده شده است (16 و 29). همچنین مهارکننده­های پروتئازی به دلیل تنوع بیشتر نسبت به سایر مهارکننده­ها به طور گسترده­تری در کنترل حشرات آفت مانند کرم قوزه پنبه و کرم ساقه­خوار سویا و کرم خوشه خوارذرت مورد آزمایش قرارگرفتند (30). علاوه بر مهارکننده­های آنزیمهای گوارشی،استفاده از لکتین در کنترل بالپولک­داران و جوربالان، کیتیناز در، گاما آندوتوکسین در کنترل سخت­بالپوشان، دوبالان و نیم­بالپوشان و دو پروتئین جدید IPD083Aa  و IPD083Cb در کنترل بالپولک­داران مقاوم به گیاهان تراریخت حاوی ژن باکتری Bacillus thuringiensis نیز به عنوان پروتئینهای حشره­کش گزارش شده اند (17، 25، 29، 33 و 37).   

دستگاه گوارش سن­گندم Eurygaster integriceps  شامل غده بزاقی و­کانال گوارش به طور نسبی تحت مطالعه تجزیه پروتئوم قرار گرفته­است (40 و 41). نقشه پروتئینی غده بزاقی و روده میانی در حشرات کامل سن­گندم زمستان گذران و همچنین حشرات کامل نسل جدید، تعیین اختلافات پروتئینی موجود بین حشرات کامل و پوره­های سن پنجم و همچنین شناسایی چندپروتئین گیاهی در روده حشرات کامل از جمله مهمترین آنها می باشند (42( .

در مطالعات اکوفیزیولوژی، برهمکنش حشره–گیاه به عنوان یک سیستم پویا که دائماً در حال تغییر است در نظر گرفته می­شود (22، 27 و 31). گیاهان سازوکارهای مختلفی را برای کاهش خسارت حشرات توسعه داده اند. از طرفی حشرات نیز از راهکارهای مختلفی  جهت غلبه بر دفاع گیاهان استفاده می­کنند تا بتوانند از میزبان تغذیه و روی آن رشد و تولید مثل نمایند. از جمله سازوکارهای مورد استفاده حشرات عبارتند از غیر سمی­کردن ترکیبات سمی گیاه، اجتناب از گیاه، ذخیره سموم در بدن و مهمترین آن تغییر الگوی بیان ژن در دستگاه گوارش حشرات (20، 26 و 33). تجزیه پروتئوم روده حشرات کامل سن­گندم نشان داد که سرپین گندم در روده حشرات کامل سن­گندم تجمع یافته و در واقع سن­گندم توانسته است بر این مهار کننده پروتئازی غلبه­کند. در این تحقیق برای اولین بار دستگاه گوارش سن A.acuminata مورد بررسی پروتئوم قرار گرفته و تعدادی از پروتئینهای گیاهی در آن را 72 ساعت پس از توقف تغذیه مورد شناسایی قرار خواهد گرفت. ردیابی پروتئینهای گیاهی در روده حشرات گیاهخوار نقش اساسی در روشن شدن راهکارهای تغذیه ای، موانع احتمالی تغذیه­ای وهمچنین روشن شدن مسیرهای بیوشیمیایی تغذیه در برهمکنشهای گیاه-گیاهخوار در حشره شناسی مولکولی بر عهده دارد.

مواد و روشها

جمع آوری   و   تشریح   حشرات  :    حشرات    کامل

A.acuminata برگشتی از مزارع گندم حومه تربت جام جمع آوری شدند و به اتاقک رشد منتقل شدند. این حشرات از دانه­های گندم رقم الوند تغذیه ­کرده و به آنها اجازه داده شد که جفتگیری کنند و حشرات نسل جدید را به وجود آورند. شرایط رشد 27 درجه­ سانتی گراد و رطوبت نسبی 60 درصد بود. بعد از تخم گذاری حشرات کامل والد از ظروف پرورش حذف شدند. حشرات کامل نسل جدید که 72 ساعت و حشرات شاهد که 24 ساعت تغذیه نکرده بودند  برای تشریح دستگاه گوارش انتخاب شدند. چون هدف آزمایش ردیابی پروتئینهای گیاهی بود نیاز است تا حشره زمان مشخصی را گرسنه بماند تا پروتئینهای تجمع یافته گیاهی در روده این حشرات مشخص گردد (22 و 39).

ابتدا سر و بالهای حشره قطع و یک طرف بدن آن در ظرف تشریح ثابت گردید و از طرف مقابل آن با استفاده از قیچی تشریح ارتباط قسمت پشتی و شکمی قطع شد. سپس قسمت پشتی با استفاده از پنس به صورت کتابی باز شده و روده آن به میکرو­تیوب حاوی بافر فسفات منتقل گردید و بلافصله برای انجماد سریع به ازت مایع منتقل و تا قبل از استفاده در دمای 80- درجه­ سانتی گراد نگهداری شد.

استخراج پروتئین: سه عدد روده در میکروتیوب حاوی بافر­فسفات و مهار­کننده کامل پروتئاز (Cocktail of protease inhibitors (Roche Applied Science, Manneheim, Germany)) هموژنیزه شدند، سپس در g 30000 به مدت 30 دقیقه و دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. سوپ ­رویی حاصل مجدداً در g 30000، 10 دقیقه و 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ گردید. سپس 6 درصد تری کلرو استیک اسید (TCA) به روشناور قبلی اضافه و به مدت 30 دقیقه در یخ انکوبه شدند. بعد از آن نمونه­ها مجدداً در g 15000، 10 دقیقه و 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. در این مرحله سوپ رویی  حذف، 200 میکرولیتر استون مطلق به رسوب اضافه و در g 15000، 2 دقیقه و 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. این مرحله (شستشو با استون) دو بار تکرار گردید. در نهایت 200 میکرو لیتر بافر لیز (Lysis buffer (Urea 7M, Thioure 2M, CHAPS 2%, DTT 6mM, Ampholyte 1%)) به رسوب پروتئینی افزوده و با استفاده از هموژنایزر محلول گردید. بالاخره محلول پروتئینی حاصل در g 15000، 10 دقیقه و دمای اتاق دو بار سانتریفیوژ شد و سوپ رویی  نهایی که پروتئین خام بود حاصل گردید. برای تعیین غلظت پروتئین از روش برادفورد و پروتئین سرم آلبومین گاوی به عنوان استاندارد استفاده گردید. مجموعه غلظتهای استاندارد 0،1،2،3،4 میلی­گرم بر میلی­لیتر بودند و بعد از ترسیم نمودار استاندارد در هر سه تکرار و تعیین معادله خطی مربوطه، غلظت پروتئین در نمونه­های مورد آزمایش محاسبه گردید (20، 39، 40 و 41).

الکتروفورز دوبعدی: الکتروفورز دو­بعدی بر اساس جداسازی پروتئینها با نقطه ایزوالکتریک در بعد اول و وزن مولکولی در بعد­دوم طراحی گردیده است. ایزوالکتروفوکسینگ (بعد اول) با روش ژل لوله­ای صورت پذیرفت.  در این روش از لوله­هایی به طول 11 سانتیمتر و قطر 3 میلی متر برای تهیه ژلهای بعد اول استفاده گردید. برنامه تنظیم شده برای انجام بعد اول 5/17 ساعت زمان نیاز داشت که شامل 30 دقیقه در 200 ولت، 16 ساعت در 400 ولت و یک ساعت انتهایی 600 ولت بود. لوله های حاصل از بعد اول الکتروفورز، برای بار­گذاری بعد دوم (SDS-PAGE) مورد استفاده واقع شدند(2). بعد از اتمام الکتروفورز بعد دوم، ژل به ظرف حاوی محلول رنگی کوماسی منتقل و برای یک ساعت با دور کم تکان داده شد. سپس ژل با دستگاه خشک­کن مخصوص خشک گردید. برای اینکار ابتدا ژل را در یک لایه از نایلون سلفون قرار داده و پس از خارج نمودن حبابهای هوای موجود بین لایه­های پلاستیک و ژل، دستگاه به مدت 2 ساعت حرارت 70 درجه سانتی گراد و 3 ساعت مکش هوا جهت خشک کردن ژل تنظیم گردید. ژلهای خشک شده یا مرطوب با استفاده از دانسیتومتر (Densitometer (GS-800, Bio-Rad)) اسکن شده و به فرمت مورد نیاز برای تجزیه نرم­افزاری ژل((tiff و فایلهای نوشتاری (jpg) تبدیل شدند. سه تکرار از هر ژل برای مقایسه کیفیت ژلها با استفاده از نرم افزار پی دی کوئست (PDQuest software (ver. 8.0.1, Bio-Rad)) استفاده شد. تجزیه ژل شامل چندین مرحله است که در ابتدا تصویر بهترین ژل مربوط به حشراتی که 24 ساعت از تغذیه محروم بودند را به عنوان ژل پایه انتخاب و سپس تصویر ژل­های دیگر تکرارها که مربوط به حشراتی بود که 72 ساعت تغذیه نکرده بودند همراه با ژل پایه وارد نرم افزارشده و لکه­های روی همه ژلها بصورت دستی متناظر گردید. نرم افزار یک فایل به فرمت اکسل که حاوی میزان شدت عبور نور از لکه­های پروتئینی بر اساس درصد حجمی هر لکه می­باشد برای تمام ژلها محاسبه و ارائه می­کند. با استفاده از این اعداد کمی و باروش تی تست می­توان لکه­های پروتئینی که دارای اختلاف معنی­دار در سطح پنج درصد بودند را برای برش نهایی انتخاب کرد(39، 40 و 41).

هضم: در این فرایند لکه­های پروتئینی با استفاده از آنزیم تریپسین توسط ماشین تمام اتومات (Digest Pro 96;Intavis, koeln, Germany) هضم و به پپتیدهای کوچکتر تبدیل شدند. برنامه دستگاه شامل سه مرحله متوالی بود. ابتدا مرحله احیای پیوندهای دی­سولفیدی است که با کمک مشتقات DDT (Reduction solution) انجام می­گیرد، سپس مرحله الکیله­کردن است که به وسیله ترکیبات یدواستاماید انجام می­پذیرد. مرحله سوم هضم با تریپسین می باشد (39، 40 و 41).

تعیین نسبت وزن مولکولی به بار هر پپتید با استفاده از nano LC-MS/MS (Nano liquid chromatography- mass spectrometry/mass spectrometry): این دستگاه از دو قسمت اصلی تشکیل شده است. قسمت اول یک کروماتوگرافی با کارآیی بالاست که به طور مستقیم به اسپکترومتری جرمی پیاپی (MS/MS) متصل گردیده است. به طور خلاصه به این صورت عمل شد که یک میکرولیتر پپتیدهای حاصل از هضم پروتئینی با استفاده از نمونه بردار خودکار به ستون C18 PepMap trap (300 میکرومتر قطر درونی × 5 میلی متر طول) با جریان 25 میکرولیتر بر دقیقه در نانوکروماتوگرافی (Ultimate 3000 nano LC (Dionex, Germering, Germany)) تزریق شدند. سپس پپتیدها با استفاده از فرمیک اسید 1/0 درصد در استو­نیتریل رقیق شده و در ستون C18 (Nikkyo Technos, Tokyo, Japan)(75میکرولیتر قطر درونی و 12 سانتیمتر طول) براساس حرکت در فاز معکوس و با جریان 200 نانولیتر بر دقیقه از یکدیگر جدا شدند. بعد از آن پپتیدها در ولتاژ 1.8 کیلوولت به اسپکترومتری جرمی (LTQ XL Orbitrap MS (Thermo Fisher, San Jose, CA, USA)) پاشیده شدند. نرم افزار نصب شده برای تعیین تنظیمات اسپکترومتری پیاپی ایکس کالیبر (Xcalibur software (ver. 1.4, Thermo Fisher)) نام داشت و محدوده کسب داده بر اساس نسبت جرم بر بار (Mass-to-charge ratio (m/z)) بین 100 تا 2000 در نظرگرفته شد. دستگاه محتویات پپتیدها را سه بار متوالی در 60 دقیقه برای هر نمونه اسکن کرد. داده حاصل از اسپکترومتری با نرم­افزار بیوورکس (Bioworks software ( ver. 3.3.1, Thermo Fisher)) به فرمت قابل استفاده با موتورهای جستجوگر مثل مسکات (Mascot search engine (ver. 2.3.02, Matrix Science, London, UK)) (MGF= Mascot generic format) تبدیل شدند (39، 40، 41 و 42).

جستجو پروتئین هدف در پایگاه­های بیو­انفورماتیکی: موتور جستجوگر مسکات قابلیت جستجو در پایگاههای بیوانفورماتیکی مختلفی را دارد. در مورد سن Aelia acuminata  چون پایگاه اختصاصی برای پروتئوم این حشره وجود نداشت از پایگاه اطلاعاتی مرکز ملی اطلاعات زیست فناوری (NCBI) (National Center of Biotechnology Information) استفاده شد. برای استفاده از مسکات پارامترهای مورد استفاده در شناسایی پروتئین شامل حداکثر تغییرات وزن 5/0 دالتون، حداکثر تعداد پیوندهای از دست رفته (Maximum number missed cleavages) 1 عدد، صحت وزن هر پپتید (Accuracy of peptide mass) 10 پی­پی­ام در نظر گرفته شد. کربوآمیدلاسیون سیستئین­ها به عنوان پارامتر ثابت و اکسیداسیون متیونین به عنوان پارامتر متغیر تعیین شدند. برای جستجو در پایگاه NCBI دو زیر مجموعه در نظر گرفته شد، بدین طریق که ابتدا کلیه داده های اسپکترومتری در بخش جانوران جستجو گردیدند و برای بار دوم کل داده های پایگاه مورد جستجو قرار گرفتند. درجه مورد قبول برای این دو جستجو به ترتیب عبارت بودند از 55 و 48 . نتایج مسکات شامل چند پروتئین در قسمت نتایج نمایش داده می­شود. بالاترین درجه نتیجه حاصل از مسکات و همچنین بالاترین میزان همپوشانی و داشتن حداکثر پپتید­های مشابه با پروتئینهای موجود در نتیجه مسکات به عنوان شاخصهای اصلی انتخاب پروتئین در نظر گرفته شدند. در این مطالعه حداقل پپتید­های مشابه پنج و حداقل همپوشانی هفت درصد لحاظ گردیدند و پروتئینهایی که این شاخصها را نداشتند به عنوان پروتئین ناشناخته محسوب گردیدند (33، 34 و 35).

نتایج و بحث

الگوی پروتئینی روده حشرات کامل سنهای A.acumniata با استفاده از الکتروفورز دوبعدی تعیین گردید (شکل 1). مرکز ملی اطلاعات زیست فناوری استفاده شد تا پروتئینهای احتمالی با منشاء غیر جانوری( گیاهی، باکتریایی و ...) مورد شناسایی قرار بگیرند. نتایج همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است بیان می­دارد که 10 لکه پروتئینی از مجموع 11 لکه ناشناخته منشا گیاهی داشته و از گیاه گندم وارد روده حشره کامل شده بودند و یک لکه نیز (لکه شماره 10) ناشناخته باقی­ماند.

شکل 1- الگوی  پروتئینی بیان شده از روده حشرات کامل Aelia acuminate. حلقه ها نشان دهنده تجمع پروتئینهای گیاهی در روده حشرات کامل می‍باشند.

اکثر لکه های پروتئینی در این الگو مربوط به پروتئینهای ذاتی دستگاه گوارش حشره بودند. یازده لکه پروتئینی در پایگاه داده جانوران شناسایی نگردید، از این رو در جستجو دوم به جای جانوران از گزینه کل موجودات و داده­ها در پایگاه اطلاعاتی لکه­های شناسایی شده به ترتیب عبارت بودند از سرپین، دهیدرواسکوربات ردوکتاز، بتا آمیلاز، داکسی میوژنیک سنتاز، مهار کننده آلفا-آمیلاز، پراکسیداز، سیتوکروم C، آگلوتینین ایزولسیتین 3، هیپوتتیکال پروتئین و کالمودولین.  سعادتی و تورچی در سال 2017 (39)  دستگاه گوارش حشرات کامل سن­گندم را مورد تجزیه پروتئوم قرار دادند و شش پروتئین گیاهی شامل تریتیسین، سرپین، مهارکننده آلفا-آمیلاز، بتا-آمیلاز، دهیدرواسکوربات ردوکتاز و  آلفا- آرابینوفورینادوز را با منشا گیاه گندم مورد ردیابی و شناسایی قرار دادند. در پژوهش جاری نیز مشابه سن گندم چهار پروتئین سرپین، مهارکننده آلفا-آمیلاز، بتا-آمیلاز و دهیدرواسکوروبات ردکتاز در روده A.acuminata مورد شناسایی واقع گردید.

فراوانی مهارکننده­های پروتئازی کوچک در ساختار گیاهان می­تواند به طور بالقوه بر علیه حشرات گیاهخوار موثر باشد (19). سرپین یکی از مهارکننده پروتئازی درگندم است که بیشتر آنزیم کیموتریپسین را هدف قرار می­دهد (11،36،38).  سرپین دارای یک توالی کاملا حفاظت شده اسیدآمینه ای پرولین- فنیل آلانین- لوسین- فنیل آلانین- لوسین می باشد که در تمام موجودات حامل آن مشترک می باشد(1،11،31). بیشتر مطالعات انجام شده مربوط به سرپینهای جانوری بوده و اطلاعات کمی در مورد سرپینهای گیاهی موجود می­باشد. پروتئوم روده حشرات برای مقابله با سرپینهای گیاهی اقدام به تولید بیش از اندازه پروتئاز­های موجود کرده و در صورت عدم تاثیر ، اقدام به تولید ایزوفرم­های جدیدی از پروتئاز کرده که حساسیت کمتری نسبت به مهار­کننده های گیاهی داشته باشند (33 و 35).  گیاهان نیز برای غلبه بر این پدیده در طی فرایند تکامل متقابل اقدام به تغییر سرپین گیاهی خود کرده و این نبرد بین گیاه و حشره برای چندین سال ادامه خواهد یافت (10، 14 و 20). تجمع این پروتئین در روده حشرات کامل سنها دلالت بر این موضوع دارد که  این مهارکننده طی فرایند تکامل متقابل در رابطه سن-گندم کارآیی خود را از دست داده و اگر چه غلظت بالایی از آن در روده تجمع یافته ولی هیچگونه اثر منفی روی تغذیه ودر نتیجه خسارت این حشره ندارد (6 و 39). مکانیسم دقیق اینکه سرنوشت نهایی این مهارکننده ها در روده حشرات به کجا می انجامد نیاز به مطالعات تکمیلی دارد ولی اینکه حتی 24 ساعت پس از تغذیه هنوز این پروتئین سمی در روده حشرات کامل به صورت تجمع یافته موجودند قویاً تأیید می­کند که در رقابت گندم و سن، سن توانسته بر این مکانیسم دفاع بیوشیمیایی گیاه غلبه کند.

مهار کننده آلفا-آمیلاز موجود در گیاه گندم به عنوان یک پروتئین سمی بر علیه تعدادی از حشرات مانند سوسک چهار نقطه­ای حبوبات، شپشه آرد و شپشه برنج گزارش گردیده است(10 و 30). همچنین عدم تأثیر آن بر علیه حشرات راسته بالپولک­داران و نیم بالپوشان تأیید گردد (9 و 45). مشابه سرپین، این مهارکننده نیز نتوانسته است مانع کارآیی در مقابل تغذیه سن A.acuminata باشد. در شباهت با نتیجه این تحقیق، در پروتئوم روده حشرات کامل سن­گندم E.integriceps نیز این مهار­کننده تجمع یافته بود­(39).

دهیدرواسکوربات ردوکتاز و پراکسیداز دو آنزیم مهم آنتی­اکسیدان گیاهی در مقابله با رادیکالهای آزاد اکسیژن می باشند(3، 28 و 33). دهیدرواسکوربات ردوکتاز در تنظیم فعالیت اسکوربیک اسید نقش اساسی داشته و پر اکسیداز نیز علاوه بر مقابله با اکسیژنهای آزاد نقش حیاتی در تولید لیگنین در دیواره سلولی گیاهان به عهده دارد(18). بتا-آمیلاز یک آنزیم اختصاصی در گیاهان است که وظیفه آن هیدرولیز پیوندهای ثانوی گلیکوزیدی از انتهای غیر احیا­کننده نشاسته و ترکیبات مشابه می­باشد (16). 

داکسی میوژنیک اسید سنتاز آنزیم کلیدی در ساخت یک حدواسط مهم گیاهی در تغذیه غلات به نام داکسی میوژنیک اسید می­باشد. این مولکول واسطه نقش کلیدی در جذب آهن برای گیاهان داشته و به طور مستقیم روی تمام فعالیتهای مربوط به نقش فیزیولوژیکی آهن مثل تنفس و فتوسنتز  تأثیرگذار می­باشد (4). سیتوکروم C یک پروتئین کلیدی در زنجیره انتقال الکترون  است که در غشای داخلی میتوکندریها قرار داد (5). نقش اصلی این پروتئین انتقال الکترون از کمپلکس شماره سه به کمپلکس شماره چهار می باشد. کالمودلین پروتئین تنظیم­کننده یون کلسیم در موجودات زنده بوده که در گیاهان بیش از چهار ایزوفرم مختلف دارد که بین 97 تا 99 درصد با کالمودلین جانوران به خصوص مگس سرکه شباهت در توالی دارد. علاوه بر این کالمودلین گیاهی نقشهای فیزیولوژیک ویژه ای  در گیاهان دارد (34). کالمودولین گیاهی می­تواند با اتصال به آنزیم سیتوکروم P-450 در روند رشد و نمو تاثیر­گذار باشد. کالمودولین همچنین می­تواند با اتصال به کینازها در گرده افشانی و بارور کردن گیاهان نقش داشته باشد (29). آگلوتینین ایزولستین 3 یک پروتئین باند شده به ترکیبات قندی مونوساکارید، دی ساکارید و الیگوساکارید است که نقش ویژه فیزیولوژیک آن به خوبی شناخته نشده است. هیپوتتیکال پروتئینهای ناشناخته­ای هستند که اگر چه منشاء ژنی آنها شناخته شده است ولی درک درستی از نقش فیزیولوژیک آنها موجود نیست (43). در حین  مطالعات پروتئوم ممکن است پروتئینهای زیادی در پایگاه داده ها به صورت هیپوتتیکال یا فرضی شناسایی گردند که نیاز است برای هریک به طور موردی مطالعه جداگانه ای صورت پذیرد تا بیشتر در مورد منشاء و سرنوشت آنها اطلاع کسب شود. به نظر می­رسد حشرات نتوانند از پروتئینهای موجود در روده گیاهی به عنوان منبع اسید آمینه ای­ تغذیه کنند چون علیرغم گذشت 72 ساعت از آخرین تغذیه حشرات، این پروتئینها هنوز به صورت دست نخورده در آنجا تجمع یافته می­باشند. اگر چه این احتمال نیز وجود دارد که این پروتئینها خود محصول کاتابولیسم پروتئینهای بزرگتری نیز باشند که در حال حاضر نمی توان با قاطعیت این فرضیه را نیز رد نمود.

شناسایی پروتئین­های گیاهی در روده حشرات اولین مرحله برای شروع مطالعات برهمکنش گیاه-گیاهخوار در سطح مولکولی می­باشد.تجمع پروتئین­های گیاهی در روده این حشره نیز نشان داد که ستیز حشره و گیاه در غالب فرایند تکامل متقابل بسیار پویا بوده، چون علیرغم وجود بعضی از مهارکننده­های آنزیمی که می­توانند بطور بالقوه پروتئین حشره­کش محسوب گردند، تغذیه و در نتیجه آن خسارت این حشره روی گندم بطور پیوسته ومداوم تکرار می­گردد. در مطالعات پروتئومیکس جهت کلی روند تحقیقات مشخص می­شود و برای مطالعه هر پروتئین بصورت موردی نیاز به خالص سازی، تعیین ساختار و نقش فیزیولوژیکی اختصاصی آن در بافت مورد نظر می­باشد.

سپاسگزاری

نویسنده مراتب تشکر صمیمانه خود را از همکار گرامی جناب مهندس اسماعیل جامی و جناب مهندس نادری بابت کمک در جمع آوری نمونه ها اعلام کرده و همچنین مراتب قدردانی خود را حضور مهندس سعید اسفهرودی بابت کمک در ویرایش ادبی و ساختاری نوشتار حاضر تقدیم می کند.