Document Type : Research Paper
Authors
1 Ph.D.student in Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran. Researcher at Sugarcane Training and Research Institute, Khuzestan, Iran
2 Department of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran
3 Faculty Member, Iranian Research Organization for Science and Technology
4 Department of Biotechnology, Faculty of Biological Science and Technology, University of Isfahan, Isfahan 81746-73441, Iran
5 Alghadir BLVD, University of Qom, IRAN
6 The European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany
7 OMass Therapeutics, Biotechnology, Oxford, England
Abstract
There are crucial factors in the bioethanol production process that affect production efficiency. Accumulation of ethanol during the fermentation process and the inhibitory effect on growth are inevitable. Increasing ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae enhances survival and ultimately increases ethanol production. The evolutionary engineering approach is a promising strategy to improve the complex trait of ethanol tolerance in the Saccharomyces cerevisiae. The toxicity mechanism of short-chain alcohols on yeast are similar. In this study, the laboratory strain of Saccharomyces cerevisiae CEN PK113-7D was exposed to 1-butanol stress by evolutionary engineering strategy during a 144-days culture period, after which the specific growth rate (µ) of the evolved strain was boosted from 0.48 h-1 to 0.84 h-1. Increased stress tolerance of 1-butanol led to an increase in ethanol tolerance and also ethanol production in the evolved strain. Ethanol production improved from 68.50 g/L in the parent strain to 87.02 g/L in the evolved strain. The results of the whole genome sequencing of evolved strains and comparing it with the parent strain sequence revealed changes in the single nucleotide polymorphism (SNPs) of the genes involved in this trait. There were changes in genes such as PGM2, MTH1, TCB1, YAP1801, UBP2, FAB1, IAH1 and CIA1. These genes were related to intracellular transport and pathways involved in cytoplasmic membrane composition and structure, cell wall structure, glucose metabolism, and lipids metabolism. So, the significance of this set of genes in the enhancement of ethanol tolerance was reported for the first time.
Keywords
Main Subjects
بهبود تولید و مقاومت به اتانل در مخمر ساکارومایسس سرویزیه با راهبرد مهندسی تکاملی با استفاده از تنش 1- بوتانل
فاطمه شیخی1و2، خسرو رستمی1، مهرداد آذین1*، محمدعلی اسداللهی3،منصور ابراهیمی4، پیام غیاثی5 و امیر فیضی6
1 ایران، تهران، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، پژوهشکده بیوتکنولوژی
2 ایران، اهواز، موسسه تحقیقات و آموزش توسعه نیشکر و صنایع جانبی خوزستان
3 ایران، اصفهان، دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم و فناوریهای زیستی، گروه زیستفناوری
4 ایران، قم، دانشگاه قم، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوانفورماتیک
5 آلمان، هایدلبرگ ، آزمایشگاه زیست شناسی مولکولی ، هایدلبرگ
6 انگلستان، اکسفورد، گروه بیوتکنولوژی درمانی اوماس
تاریخ دریافت: 25/08/1399 تاریخ پذیرش: 24/10/1399
چکیده
در فرایند تولید بیواتانل، عوامل بسیار مهمی وجود دارد که کارایی تولید را تحت تاثیر قرار میدهد. تجمع اتانل در طول فرآیند تخمیر و اثر بازدارندگی بر رشد اجتنابناپذیر است. افزایش تحمل به اتانل در سویه ساکارومایسس سرویزیه منجر به افزایش قدرت بقا و در نهایت افزایش تولید اتانل خواهد شد. رویکرد مهندسی تکاملی یک راهبرد مناسب برای بهبود صفت پیچیده تحمل به اتانل در سویه ساکارومایسس سرویزیه است. سازوکار اثر سمیت الکلهای کوتاه زنجیره بر مخمر مشابه است. در تحقیق حاضر، سویه آزمایشگاهی ساکارومایسس سرویزیه CEN PK 113-7D باراهبرد مهندسی تکاملی طی یک دوره کشت 144 روزه تحت تنش 1- بوتانل قرار گرفت و نرخ ویژه رشد (µ) سویه تکامل یافته از h-1 048/0بهh-1 084/0 ارتقا یافت. افزایش تحمل به تنش 1- بوتانل منجر به افزایش تحمل به اتانل و همچنین افزایش تولید اتانل در سویه تکامل یافته شد. میزان تولید اتانل از 50/68 گرم بر لیتردر سویه والد به 02/87 گرم بر لیتر در سویه تکامل یافته افزایش یافت. نتایج تعیین توالی کل ژنوم سویههای تکامل یافته و مقایسه آن با سویه والد تغییرات پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی ژنهای درگیر در این صفت را آشکار نمود. تغییرات در ژنهایی مثل PGM2,MTH1, TCB1 YAP1801, UBP2, IAH1 CIA1, و FAB1 ایجاد شده بود که این ژنها در ارتباط با انتقال مواد درون سلول و مسیرهای دخیل در ترکیب و ساختار غشاء سیتوپلاسمایی، ساختار دیواره سلولی، متابولیسم قند، متابولیسم لیپیدها بودند. در تحقیق حاضر، برای اولین بار اهمیت گروه جدیدی از ژنهای دخیل در افزایش تحمل به اتانل گزارش شده است.
واژه های کلیدی: تحمل به اتانل، ساکارومایسس سرویزیه، مهندسی تکاملی، 1-بوتانل، تعیین توالی کل ژنوم
* نویسنده مسئول، تلفن: 02156276636، پست الکترونیکی: azin@irost.ir
مقدمه
در طی سالهای اخیر به دلیل رشد سریع قیمت سوختهای فسیلی، کاهش سریع ذخایر سوخت و بالاخره بدلیل افزایش آلودگی محیط زیست توسط سوختهای فسیلی و تغییر در آب و هوای جهانی، انرژی زیستی و برپایه منابع تجدیدپذیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است (30). برای کاهش مسائل آلودگی محیط زیست ناشی از استفاده بیش از حد از سوخت های فسیلی در دهههای گذشته، تلاشهای عظیمی در جهت یافتن منابع سوخت پایدار و تجدیدپذیر شده است. سوختهای زیستی میکروبی، سوختهای مایع و گازی هستند که توسط میکروارگانیسمها تولید میشوند (1). بیواتانل یک سوخت سازگار با محیط زیست و جایگزین مناسبی برای سوختهای فسیلی است (20). اتانل عمدتاً از طریق فرآیند تخمیر با استفاده از مخمر ساکارومایسس سرویزیه تولید میشود. بنابراین تخمیر اتانلی توسط ساکارومایسس سرویزیه به عنوان فرایند بیوتکنولوژی صنعتی بسیار مهم و به لحاظ اقتصادی سودآور به شمار میآید. با توجه به ویژگیهای منحصر به فرد این میکروارگانیسم مانند توانایی تولید غلظت بالای اتانل از مواد تجدیدپذیر و تحمل غلظت بالای اتانل و سایر ترکیبات مهارکننده، مخمر ساکارومایسس سرویزیه از مدتها قبل به عنوان یک کارخانه سلولی در صنعت تخمیر استفاده می شود (31). با وجود این، تولید مقرون به صرفه اتانل و راندمان بالا جزء چالشهای اصلی این صنعت به شمار میرود (18). افزایش تولید اتانل در فرآیند صنعتی به عوامل مختلف بستگی دارد و مهمترین عامل، چگونگی عملکرد و قدرت بقاء مخمر در شرایط تخمیر میباشد. در طول فرایند تولید اتانل، مخمر ساکارومایسس سرویزیه با تنشهای مختلف از جمله افزایش غلظت اتانل، درجه حرارت بالا و فشار اسمزی حاصل از غلظت بالای قند روبرو است (6). یکی از مشکلات عمده در ارتباط با تولید اتانل، سمیت این ماده برای رشد مخمر ساکارومایسس سرویزیه است که باعث مهار رشد شده و در نتیجه باعث کاهش مقدار اتانل و راندمان تولید در صنایع تخمیر میشود (24). اتانل باعث مهار آنزیمهای مهم مسیر گلیکولیتیک و القاء تولید رادیکال آزاد اکسیژن در مخمر میشود (11). اتانل، استحکام غشاهای سلولی را مختل میکند، اندوسیتوز را مهار کرده، نیروی محرکهی پروتونی غشاهای داخلی میتوکندریایی را بلوکه میکند و چندین آنزیم مهم مانند پروتئین کیناز A و الکل دهیدروژناز را غیرفعال میسازد. همچنین این ترکیب موجب آسیب به DNAی میتوکندریایی و تجزیهی بیومولکولها میشود و از جابهجایی عناصر از غشاهای زیستی در سلولها جلوگیری میکند. تجمع اتانل در محیط باعث مهار رشد سلول مخمر شده و بر روی سیستم انتقال درون سلولی آن تاثیر میگذارد و درنهایت باعث کاهش مقدار اتانل تولیدی میشود (18). مهار متابولیسم، کاهش برداشت سوبسترا توسط مخمر، کاهش رشد، تغییر در ساختار غشاء و افزایش نفوذپذیری از جمله تغییرات دیگری است که اتانل در مخمر ایجاد میکند و در نهایت مرگ سلول مخمر را به دنبال دارد (19). تا به امروزه تحقیقات بسیاری در جهت شناسایی عملکرد سامانه پاسخ به تنش اتانل در مخمر انجام گرفته، اما ساز و کار تحمل به اتانل در این مخمر به طور کامل شناسایی نشده است. تحمل به اتانل به شبکه پیچیدهای بستگی دارد که در سطح ژنوم باهم واکنش متقابل دارند و تلاشهای پژوهشگران در جهت شناسایی ژنهای مرتبط با این صفت ادامه دارد (15). در تحقیقی که برای بررسی اساس مولکولی مقاومت مخمر ساکارومایسس سرویزیه در برابر تنش اتانل انجام شده است، بیش از700 ژن موثر بر مقاومت مخمر در برابر تنش ناشی از غلظت بالای اتانل شناسایی شدهاند (38). با توجه به فقدان دانش لازم در مورد صفت تحمل به اتانل در ساکارومایسس سرویزیه، پیچیدگیهای مربوط به سازوکار این صفت و تنوع ژنتیکی بسیار بالا و همچنین محدودیت موجود در اعمال گسترده دستکاری ژنها که مانع عملکرد سلول میشود، به راهکارهای موثرتری برای افزایش مقاومت مخمر به تنشهای محیطی مانند تنش اتانل نیاز است. امروزه از رویکرد مهندسی تکاملی (Evolutionary engineering) به عنوان یک رویکرد علمی استفاده میشود که در آن با استفاده از اعمال فشار انتخابی، میکروارگانیسمی با فنوتیپ مورد نظر بهدست میآید. پس از انجام مهندسی تکاملی و دستیابی به میکروارگانیسم با فنوتیپ دلخواه، با توالییابی آن میتوان تغییرات تکنوکلئوتیدی (SNP) ایجاد شده در آن را با میکروارگانیسم والد مقایسه کرد و سپس با بررسی ژنهای تغییریافته، نحوهی عملکرد آنها در این ویژگی را بررسی کرد تا در مطالعات بعدی مورد استفاده قرار گیرد. گسترش علوم بیوانفورماتیک، توسعه بیش از پیش توالییابی و تعیین توالی نسل جدید به عنوان تحولی اساسی در مسیر استخراج اطلاعات ژنتیکی از سامانههای زیستی، جنبه های بیحد و حصری ازاطلاعات کل ژنوم، رونویسی و اپیژنوم گونهها را آشکار کرده است. این قابلیت بسیاری از موانع مهم در استخراج اطلاعات از ژنوم را برطرف کرده و باعث ایجاد مسیرهای نوینی در توسعه میکروارگانیسم های مهم مورد استفاده در فرایندهای زیستی شده است (7).
در تحقیقات انجام شده تاکنون در زمینه بهبود صفت مقاومت به تنش اتانل با رویکرد مهندسی تکاملی، از غلظت اتانل بهعنوان فشارانتخابی استفاده شده است(18،11،10). با توجه به دمای جوش پایین اتانل و تبخیر آن درحین کشتهای مدتدار، احتمال تکثیر و گسترش جمعیتهای کاذب مخمر نسبت به صفت مقاومت به اتانل وجود دارد. از طرفی در تحقیقات اخیر نشان داده شده است که سازوکار سمیت الکلهای کوتاه زنجیره بر مخمرها، بهویژه سویه مخمر ساکارومایسس سرویزیه، مشابه میباشد (40،22). با توجه به این که 1-بوتانل یک الکل کوتاه زنجیره با ساختار مشابه اتانل ولی دارای نقطه جوش بالاتر است، در مطالعه حاضر از 1- بوتانل برای ایجاد فشارانتخابی در آزمایشهای تکامل تطبیقی استفاده شد و سپس میزان تحمل به اتانل و تولید اتانل سویه تکامل یافته با سویه والد مقایسه شد. در ادامه، ژنوم سویه منتخب تکامل یافته استخراج و توالی کل ژنوم آن تعیین شد. بدین ترتیب، تغییرات تکنوکلئوتیدی ایجاد شده در سویههای تکامل یافته با میکروارگانیسم مادر مقایسه و ژنهای جدیدی که در ارتباط با این صفت دستخوش تغییر شده بودند، معرفی شدند.
مواد و روشها
محیطهای کشت و شرایط کشت مخمرها: سویه آزمایشگاهی هاپلوئید ساکارومایسس سرویزیه CEN.PK 113.7D به عنوان سویه والد برای آزمایشهای تکامل تطبیقی استفاده شد. سویه والد در محیط کشت YPD (مرک) رشد داده شد. این محیط حاوی ترکیبات (20 گرم در لیتر گلوکز، 20 گرم در لیتر پپتون و 10 گرم در لیتر عصاره مخمر) بود. برای ساخت محیط جامد، 2درصد وزنی آگار (مرک) به سایر مواد افزوده شد و در نهایت محیطها در دمای 121 درجه سانتیگراد و به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو استریل شدند. این سویه با 6 تکرار طی 48 مرحله متوالی در میکروپلیت کشت داده شد و سویههای تکامل یافته با توجه به بهبود نرخ ویژه رشد به دست آمدند. غلظت 1- بوتانل به تدریج در طول کشتهای متوالی افزایش یافت بطوریکه غلظت1- بوتانل از 8/1درصد (حجم در حجم) شروع و نهایتا تا غلظت 2 درصد (حجم در حجم) افزایش یافت و قبل از هر کشت در حضور 1- بوتانل بهعنوان فشار انتخابی، سلولها در محیط تازه YPD به مدت 30 دقیقه برای آزمایشهای تکامل تطبیقی بازیابی شدند (22).
بررسی تحمل سویههای صنعتی مخمر به اتانل: برای بررسی میزان تحمل به اتانل و ویژگیهای رشد سویه CEN.PK 113-7D قبل از شروع آزمایشهای تکامل تطبیقی، این سویه در معرض غلظتهای مختلف اتانل از 0 تا 11 درصد (حجم در حجم) قرار گرفت و سرعت رشد ویژه آن مشخص شد. همچنین نرخ رشد ویژه این سویه در غلظت 5/0 تا 2 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل نیز تعیین شد.
آزمایشهای تکامل تطبیقی: محیط کشت ملاس با رقیق کردن ملاس نیشکر در آب مقطر تا بریکس 18 تهیه شد. پس از تهیه رقت، به منظور حذف ناخالصی های جامد، محیط کشت آماده شده در rpm 5000 به مدت 25 دقیقه، در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد. پس از افزودن 2 گرم در لیتر سولفات آمونیوم و 2 گرم در لیتر اوره (مرک)، pH محیط توسط اسید سولفوریک روی 5/4 تنظیم و سپس در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه اتوکلاو شد (1).
برای شروع آزمایشهای تکامل تطبیقی، با توجه به میزان نرخ ویژه رشد سویه والد، از غلظت اولیه 8/1 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل استفاده شد که بهطور مستقیم و بدون استریل کردن به محیط کشت اضافه شد. هر میکروپلیت با فویل غشایی کاملاً محکم پوشیده شد تا از تبخیر الکل جلوگیری شود. میکروپلیتها در دمای 30 درجه سانتیگراد و دور rpm70 گرماگذاری شد. برای جلوگیری از اثر تبخیر محیط از بیرونیترین ردیفهای میکروپلیت استفاده نشد.
خوگیری سویهها با اندازهگیری میزان کدورت در OD600 و محاسبه نرخ ویژه رشد تمام سویهها حین انجام آزمایشهای تکامل تطبیقی پایش شد. به منظور نگهداری تمامی ردههای سلول تکامل یافته، قبل از هر بار تکرار کشت، 2/0 میلی لیتر از کشت قبلی به 2/0 میلی لیتر از محلول گلیسرول 40٪ در محیط کشت YPD تازه (حجم در حجم) اضافه و در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شد (22). نرخ ویژه رشد مخمر در طول تکرار کشت در محیط حاوی غلظت مذکور الکل کاهش و افزایش یافت و درنهایت پس از 64 روز نرخ ویژه جمعیتها ثابت شد و کاهش نیافت. در این زمان، میزان غلظت 1- بوتانل از 8/1 درصد (حجم در حجم) به 2درصد در کشتها افزایش یافت.
بررسی تولید کمی اتانل توسط مخمر: از میکروپلیتهای با عمق 5 سانتیمتر برای کشت سویههای منتخب برای اندازهگیری میزان اتانل تولید شده استفاده شد، بهطوری که حجم نهایی محیط کشت 2میلی لیتر شد. غلظت قند در این مرحله 20 گرم در لیتر بود که در مرحله هوازی که برای تکثیر سویهها استفاده شد، سویهها بر روی محیط کشت YPDدر دمای 30 درجه سانتیگراد و دور rpm 250 در شیکر انکوباتور به مدت 8 ساعت گرماگذاری شدند. از یک محفظه شیشهای (Gas tight box) با قابلیت تنظیم و حفظ فشار گاز داخل محفظه از طریق یک خروجی گاز استفاده شد. این محفظه دارای یک ورودی برای گاز نیتروژن و یک خروجی برای هوا و اکسیژن بود و برای فراهم کردن شرایط کشت بیهوازی مورد استفاده قرار گرفت (شکل 1). پس از 8 ساعت هوادهی، غلظت گلوکز محیط کشت به 200 گرم در لیتر رسانده شد. کشت در شرایط بیهوازی در دمای 30 درجه سانتیگراد با دور همزن rpm70 برای تولید اتانل به مدت 36 ساعت ادامه یافت. تمام آزمایشها در سه تکرار انجام شد.
استخراج ژنوم و تعیین توالی کل ژنوم: تغییرات ژنومی در سویههای تکامل یافته توسط تعیین توالی کل ژنوم (WGS) مشخص شد. کلونهای تکامل یافته از نمونههای جمعیتی منتخب مربوطه برروی پلیت YPD انتخاب شدند. سه کلونی از هر جمعیت منتخب بعد از آزمایشهای تکاملی، بهطور تصادفی برروی پلیت YPD انتخاب و به طور مجزا در محیط مایع YPD رشد داده شدند. بعد از تعیین میزان تولید و مقاومت این کلونها، DNA کلونهای تایید شده با استفاده از کیت Qiagen® استخراج شد. غلظت DNA نهایی با استفاده از ((Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometer Qubit با دقت بسیار بالا اندازهگیری شد و کیفیت وکمیت ژنوم استخراج شده تایید گردید. نمونههای ژنوم خالص شده با استفاده از پلتفرم ایلومینا (Illumina) NextSeq 500، با کیت NextSeq Mid Output v2 توالییابی شدند. هر قطعه توالی خوانده شده (read) از 150 جفت باز تشکیل شده بود که با پوشش x100 تعیین توالی شدند.
شکل1- محفظه شیشهای با قابلیت تنظیم فشار برای کشت بیهوازی سویهها و تولید اتانل
کیفیت توالی خوانده شده در 80٪ قرائت از تمام موارد با نمره کیفیت Q30 تضمین شد. از برنامه Trimmomatic-0.32 برای پیرایش توالی آداپتور با پارامترهای پیش فرض برای دادههای تعیین توالی در همه نمونهها استفاده شد (9). هر نمونه حاوی بیش از 10 میلیون توالی خوانده قابل نقشهبرداری بود. هر نمونه با 4 تکرار تکنیکال برای هر کلون تکامل یافته نسبت به ژنوم مرجع CEN.PK113-7D (http://cenpk.tudelft.nl) نقشهبرداری و با استفاده از پایپلاین GATK مطابقت داده شد. تجدید چینش INDEL، حذف تکراری SNP در همه نمونهها به طور همزمان با استفاده از پارامترهای استاندارد فیلترینگ انجام شد (16،36). برای مرتبسازی و فهرستبندی فایلهای تراز از SAMtools استفاده شد (26).
آنالیز دستگاهی: برای تعیین غلظت اتانل و گلوکز باقیمانده در محیط کشت، نمونهها با کروماتوگرافی مایع با فشار بالا (HPLC) (Ultimate 3000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) آنالیز شدند. از ستون تعویض یونی Aminex HPX-87H Product no: 1250140, Bio-Rad, Hercules, California, USA)) به عنوان فاز ثابت و از اسید سولفوریک 1 میلیمولار به عنوان فاز متحرک استفاده شد. ترکیبات با استفاده از یک آشکارساز RI شناسایی شدند (32). از آب میلیکیو (MilliQ water) استریل برای رقیقسازی نمونهها استفاده شد. از هر نمونه 20 میکرولیتر در ستون با دمای 30 درجه سانتیگراد و با سرعت جریان فاز متحرک 6/0 میلی لیتر در دقیقه تزریق شد. نمونههای استاندارد با رقیق کردن محلولهای گلوکز و اتانل به غلظتهایی که دامنه حساسیت تشخیص ستون را پوشش میداد، تهیه شدند. حجم نهایی نمونههای جمعآوری شده در ویالهایHPLC 5/0 میلی لیتر بود.
واکنش زنجیرهای پلیمراز (Polymerase chain reaction (PCR)): جهت تایید SNP های حاصل از تفسیر تعیین توالی کل ژنوم در سویههای تکامل یافته از روش (واکنش زنجیرهای پلیمراز) PCR برای تکثیر قطعات حاوی جهشها استفاده شد و در دستگاه ترموسایکلرBIORAD مدل BR582 با سیکل ارائه شده در جدول 1 قرار داده شد.
جدول 1- چرخه دمایی مورد نیاز برای واکنش زنجیره ایی پلیمراز
زمان (ثانیه) |
دما (سانتی گراد) |
مرحله |
30 |
98 |
واسرشتگی اولیه |
10 |
98 |
واسرشتگی |
60 |
متغیر براساس آغازگر |
اتصال |
30-15s/kb |
72 |
تکثیر |
تکرار مرحله 4-2 (30 بار) |
||
10 |
72 |
تکثیر |
|
4 |
توقف واکنش |
برای مبنای آغازگرها برای هر جهش دمای اتصال تعییین شد. تمام واکنشهای زنجیره ای پلیمراز با استفاده از با Phusion Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix (شماره محصول: F565S ،Thermo Scientific ، Waltham ، ماساچوست ، ایالات متحده آمریکا) با حجم 50 میکرولیتر طبق جدول 2 در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. آغازگرهای استفاده شده در کل این پروژه را می توان در جدول 3 مشاهده کرد..
نتایج
بررسی رشد سویه و تعیین تحمل به الکل: میزان رشد سویه ساکارومایسس سرویزیه CEN.PK 113-7D، قبل از شروع آزمایشهای تکامل تطبیقی ارزیابی شد.
جدول 2 -ترکیبات واکنش زنجیرهای پلیمراز
غلظت نهایی |
حجم (میکرولیتر) |
غلظت |
ترکیب |
1X |
25 |
2X |
مستر میکس آنزیم فیوژن 2X Master Mix (Phusion U) |
5/0 میکرومول |
1 |
10 پیکو مول |
پرایمر Forward |
5/0 میکرومول |
1 |
10 پیکو مول |
پرایمر Reverse |
250-10 نانوگرم |
1 |
|
ژنوم |
%3 |
5/1 |
|
DMSO 100% |
|
5/20 |
|
آب مقطر استریل |
سویه در معرض غلظتهای مختلف اتانل از 0 تا 11 درصد (حجم در حجم) قرار گرفت و نرخ رشد ویژه سویه در هر یک از غلظتهای یاد شده نیز تعیین شد (شکل 2). همچنین نرخ رشد ویژه سویه مذکور در غلظت 0 تا 2 درصد 1- بوتانل نیز تعیین شد (شکل 3). در این مطالعه، سویه مخمر تا 2 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل سازگار شد. سویهها تحت فشار انتخابی 1- بوتانل، تا 144 روز متوالی کشت شدند. انتقال سویه به یک محیط تازه حاوی غلظت 1- بوتانل بالاتر زمانی انجام شد که سرعت رشد در غلظت قبلی برای چندین نسل ثابت باقی مانده بود. پس از 48 دوره کشت در طی 144 روز، برخی از ردههای سلولی مورد آزمایش قادر به رشد در غلظت 2٪ (حجم در حجم) 1- بوتانل بودند، در حالی که سویه والد قادر به رشد در این غلظت نبود.
حداکثر نرخ ویژه رشد به تدریج در طول آزمایشهای تکامل تطبیقی افزایش یافت. اگرچه، در برخی مراحل کاهش نرخ رشد نیز مشاهده شد، اما پس از 48 دوره کشت متوالی تحت تنش 1- بوتانل، حداکثر نرخ ویژه رشد یک سویه از h-1 048/0بهh-1 084/0 ارتقا یافت (شکل 4).
جدول3- فهرست آغازگرهای استفاده شده برای تایید جهشهای تکنوکلئوتیدی
نام |
توالی آغازگر ˊ3 →ˊ5
|
نوکلئوتید |
Tm (ᵒC) |
||||
DAN4
|
Forward TCTACAACCTCCACCACT |
18 |
3/58 |
||||
Reverse GGAAGTGGTTGCTTTACTGA |
۲۰ |
59 |
|||||
ISC1 |
Forward GAAAATCAAACCCACCCTT |
|
2/57 |
||||
Reverse TCATCATCATCCCCGGTA |
18 |
3/58 |
|||||
|
Forward ATGGCGTCTATCAATCTGAT |
|
7/57 |
||||
Reverse GCTGCTTTTTCTAGAGACCA |
20 |
8/58 |
|||||
|
Forward GCCGAACGAAGATAATGAA |
20 |
6/56 |
||||
Reverse TGGAGGGACGTATTCAGTA |
19 |
2/58 |
|||||
IAH1 |
Forward AGATGGCAAAGATCAGTA |
18 |
2/54 |
||||
Reverse CCATCATCTAGCACATCTCT |
20 |
6/57 |
|||||
FAB1 |
Forward ACAATAGCTCTGCAACA |
17 |
7/54 |
||||
Reverse ATCGCTAGTATATCGGGATTC |
21 |
7/57 |
|||||
|
Forward GGAACACGCAGACTGTA |
17 |
2/57 |
||||
Reverse AGAACTCCTCAGCGTAAGA |
19 |
7/58 |
|||||
|
Forward AGCAGACCCATCCAACAT |
18 |
8/59 |
||||
Reverse GGTAAACTTGTGCCTGACA |
19 |
8/58 |
|||||
PGM2 |
Forward GCCGCTTCTCACATCAT |
17 |
1/58 |
||||
Reverse CGTACTTTGCCCAGAATT |
18 |
8/56 |
|||||
|
Forward GGAGTATGCGCCATATGA |
18 |
5/57 |
||||
Reverse TCTTTATTCCCGTGTTGCT |
18 |
2/58 |
|||||
|
Forward GAATGATCCAATCGATAGCT |
20 |
2/56 |
||||
Reverse TCGACCACTGCTTTATCAA |
18 |
8/57 |
|||||
|
Forward CCGTTCGCATTGCACAA |
17 |
9/59 |
||||
Reverse GAGGTTGTTAGCATATTGGT |
20 |
6/56 |
|||||
|
Forward GAAGTTCGTGACAGCTAGT |
19 |
9/57 |
||||
Reverse CCAATTCACCCTTCATGT |
17 |
56 |
شکل 2- منحنی نرخ ویژه رشد سویه ساکارومایسس سرویزیه در غلظتهای مختلف اتانل، هر داده میانگین 3تکرار میباشد.
شکل 3- منحنی نرخ ویژه رشد سویه ساکارومایسس سرویزیه در غلظتهای مختلف 1-بوتانل، هر داده میانگین 3تکرار میباشد.
شکل4- تغییرات نرخ ویژه رشد سویه ساکارومایسس سرویزیه طی آزمایشهای تکامل تطبیقی در شرایط تنش 1- بوتانل. غلظت بوتانل تا روز شصت و چهارم برابر با 1.8% (حجم در حجم) بود و سپس به 2% افزایش داده شد.
به منظور مشابه سازی با شرایط صنعتی برای انتخاب سویههای برتر به لحاظ مقاومت به الکل، از محیط کشت ملاس استفاده شد. معیار انتخاب سویههای برتر، توان تکثیر بالاتر طی کشتهای پی در پی تحت تنش الکل و محاسبه زمان نسل بود. میزان نرخ ویژه رشد سویه منتخب در محیط کشت ملاس از h-1 048/0به h-1 06/0 ارتقا یافته بود.
تعیین میزان تولید اتانل سویههای منتخب: برای بررسی تأثیر افزایش مقاومت به 1- بوتانل سویههای تکامل یافته منتخب بر افزایش تولید اتانل آنها، میزان تولید اتانل و مصرف گلوکز هر سویه تکامل یافته مشخص شد (شکل 5). برای مشخص شدن تاثیر افزایش مقاومت به اتانل بر میزان تولید اتانل، از غلظت گلوکز 200 گرم بر لیتر محیط کشت استفاده شد. در محیط YPD حاوی 200 گرم در لیتر گلوکز، تغییرات جمعیت سلول سویههای تکامل یافته با والدین متناظر آنها تفاوت معنیداری وجود داشت.
میزان تولید اتانل و مصرف گلوکز برای دو سویه تکامل یافته افزایش یافت. تولید اتانل سویه تکامل یافتهE1 منتخب که در محیط کشت YPD در غلظت 2 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل تکامل یافته بود به 76/1±02/87 گرم در لیتر و میزان مصرف گلوکز 34/163 گرم در لیتر و برای سویه E2 که در محیط کشت ملاس در غلظت 2 درصد (حجم در حجم) 1- بوتانل تکامل یافته بود به 37/3±1/78 گرم در لیتر و میزان مصرف گلوکز 34/159 گرم در لیتر ارتقا یافته بود و این در حالی است که میزان تولید اتانل سویه والد تحت شرایط مذکور46/2±5/68 گرم بر لیتر و میزان مصرف گلوکز 0/145 گرم بر لیتر بود. این دادهها نشان میدهد که افزایش تحمل مخمر در برابر 1- بوتانل منجر به افزایش تحمل به اتانل (شکل 6) و سرعت مصرف قند شده که نهایتاً میزان تولید اتانل نیز در این دوسویه تکامل یافته افزایش یافت.
نتایج حاصل از تفسیر توالی یابی کل ژنوم: برای رمزگشایی از مسیرهای جهش یافته در هنگام سازگاری با 1-بوتانل، ژنوم سویههای منتخب تکامل یافته در طول آزمایش، مجدداً توالییابی و شناسایی شد، 68 جهش در مناطق رمزگذار ژن، از جمله 38 جهش missense، 78 جهش خاموش و 6 حذف در ژنوم اتفاق افتاده بود. برخی جهش ها درمنطقه رمزگذار ژن غالب ژنهای شناسایی شده، در ارتباط با انتقال مواد درون سلول و مسیرهای دخیل در ترکیب و ساختار غشاء سلولی، ساختار دیواره سلولی، متابولیسم قند و متابولیسم لیپید بودند با استفاده از واکنش زنجیرهایی پلیمراز تایید شدند (جدول 1).
شکل5- میزان تولید اتانل سویههای تکامل یافته و گلوکز باقیمانده در محیط کشت در مقایسه با سویه والد. P سویه والد، E1 سویه تکامل یافته در محیط کشت ملاس و E2 سویه تکامل یافته در محیط کشت YPD
شکل6- تغییرات نرخ ویژه رشد دوسویه تکامل یافته در طی آزمایشهای تکامل تطبیقی در غلظت 9% حجم در حجم اتانل
دراین مطالعه، جهشهای تکنوکلوتیدی در مناطق غیر رمزگذار ژن حذف شدند. تعداد جهشهای یافت شده در سویه تکامل یافته در محیط کشت YPD نسبت به سویهی تکامل یافته در محیط کشت ملاس بیشتر بود. برخی از SNPهای سویههای تکامل یافته با طراحی آغازگرها و انجام PCR تأیید شدند (جدول 4).
جدول 4- فهرست SNPs تایید شده حاصل از توالییابی کل ژنوم و ژنهای مرتبط |
||||
ژن |
اسید آمینه تغییر یافته |
شماره کروموزوم |
شرح کار پروتئین |
|
YAP1801 |
Gln575His |
کروموزوم 9 |
پروتئین متصل شونده به کلاترین در فرایند اندوسیتوز و دخیل سازماندهی اسکلت سلولی |
|
CIA1 |
Arg63Phe |
کروموزوم4 |
از پروتئینهای کلاستر سولفور- اهن سیتوزلی دخیل دربیوسنتز متیونین، دخیل در سازماندهی زیرواحد بزرگ ریبوزم |
|
RTK1 |
Pro585Thr |
کروموزوم4 |
پروتئین مورد نیاز برای بیوژنز ریبوزوم |
|
TCB1 |
Asp96Asn |
کروموزوم15 |
از پروتئینهای دخیل در سازماندهی غشای شبکه اندوپلاسمی و تنظیم دفسفوریله شدن فسفاتیدیل اینوزیتول |
|
SHE4 |
Lys25Asn |
کروموزوم15 |
پروتئین متصل شونده به میوزین و دخیل در سازماندهی میوزین و اکتین، انتقال سلولی |
|
IAH1 |
Lys163Asn |
کروموزوم15 |
آنزیم هیدرولیز کنده ایزوآمیل استات استراز |
|
DAN4 |
Glu181Lys |
کروموزوم 10 |
مانوپروتئین دیواره سلولی، بیان ژن در شرایط بیهوازی |
|
UBP2 |
Asp342Ala |
کروموزوم15 |
آنزیم پروتئاز یوبیکیتیون وابسته به تیول دخیل در تنظیم دساتورهکردن لیپیدهای غشاء میتوکندری |
|
PGM2 |
Met226Ilu |
کروموزوم13 |
آنزیم فسفوگلوموتاز |
|
TUB3 |
Ala338Val |
کروموزوم13 |
پروتئین آلفا توبولین، نقش در تقسیم سلولی |
|
MTH1 |
Cys329Trp |
کروموزوم4 |
پروتئین داخل غشایی، دخیل در انتقال گلوکز و انتقال سیگنال |
|
SEC12 |
Lys25Asn |
کروموزوم14 |
پروتئین مورد نیاز برای تشکیل وزیکول COP11 برای انتقال از شبکه اندوپلاسمی به شبکه گلژی |
|
FAB1 |
Asn582Ser |
کروموزوم6 |
پروتئین فسفاتیدیل اینوزیتول 3فسفوکیناز، نقش در هموستازی سلول |
نتایج تعیین توالی کل ژنوم منجربه آشکارسازی تغییرات تکنوکلوتیدی در ژنوم سویههای منتخب شد. اغلب SNPها برای بار نخست در این مقاله در رابطه با این صفت گزارش میشوند. این SNPها در ژنهایی, TCB1, YAP1801, UBP2, FAB1,DAN4 ,SEC12, رخ دادهاند که این ژنها مرتبط با سازماندهی غشاء سیتوپلاسمی و غشاء اندامکهای داخل سلولی و دیواره سلولی و متابولیسم لیپدها هستند. جهشهای روی داده در ژنهای TUB3 و SHE4 در ارتباط با اسکلت سلولی و دینامیک درون سلولی ، ژن آنزیم فسفوگلوموتاز PGM2 و MTH1 دخیل در متابولیسم گلوکز، ژن آنزیم ایزوآمیل استات استراز IAH1 و CIA1 رمزگذار پروتینی که در همانندسازی و تعمیر ژنوم نقش داشته و از طرفی در حفظ و نگهداری تلومر موثر است.
بحث
امروزه تولید بیواتانل از چشمانداز کاملاً منحصر به فردی در جهان برخوردار است و همچنان به عنوان یک محصول راهبردی محسوب میشود و امنیت انرژی را تضمین می کند (2،3). افزایش تولید اتانل در فرآیند صنعتی به عوامل مختلف بستگی دارد و مهمترین عامل، چگونگی عملکرد و قدرت بقاء مخمر در شرایط تخمیر میباشد. تجمع اتانل در طول فرآیند تخمیر در واکنشگاه اجتنابناپذیر است و اثر بازدارندگی آن برروی رشد ثابت شده است (17). یک رویکرد موفق برای بهبود تحمل تنش ساکارومایسس سرویزیه، بهبود مقاومت این سویه از طریق سازگاری فیزیولوژیکی با الکل هاست (5) و انتخاب سویه مقاومی که ناشی از جهش ایجاد شده در اثر فشار انتخابی باشد، میتواند باعث افزایش طول عمر مخمر در شرایط تنشزا شده و درنهایت راندمان تولید را بالا برد (10،1). در تحقیقات گذشته اثر سمیت مشابه الکلهای کوتاه زنجیره بر روی ساکارومایسس سرویزیه ثابت شده است. براساس این پژوهشها، سویههایی که طی آزمایشهای تکامل تطبیقی در برابر بوتانل بهبود یافتهاند، در برابر اتانل نیز مقاومت بالاتری از خود نشان میدهند (40،22). در این تحقیق نیز از ترکیب 1- بوتانل که سمیت نسبتاً بالاتری نسبت به سایر انواع بوتانل و همچنین اتانل دارد (22)، به عنوان فشار انتخابی استفاده شد. نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد افزایش تحمل به این ترکیب منجر به افزایش تحمل به اتانل نیز میشود و علاوه بر این، سویههای منتخب قادر به مصرف گلوکز بیشتر و تولید اتانل بالاتری شدند.
در تحقیق حاضر، افزایش نرخ رشد ویژه به عنوان پارامتر انتخابی برای جداسازی سویههای با تحمل بالاتر به الکل انتخاب شد. جمعیت طی مراحل مکرر رشد مداوم تحت غلظت بالای الکل با تنش موجود خوگرفته و رشد در حضور تنش پایدار، منجر به تکثیر جمعیت برتر در این شرایط شد. برای بررسی تاثیر افزایش تحمل به الکل بر افزایش تولید اتانل، از غلظت 200 گرم بر لیتر گلوکز استفاده شد. نتایج نشان داد دو سویه تکامل یافته منتخب که براساس افزایش نرخ رشد ویژه تحت تنش انتخاب شده بودند نسبت به سویه والد میزان اتانل بالاتری در شرایط یکسان تولید کردند. به نظر میرسد، تحمل این سویهها نسبت به اتانل بهبود یافته و قادر به استفاده از گلوکز بیشتری نسبت به سویه والد بوده و به رشد خود دراین شرایط ادامه دادند و درنهایت میزان اتانل بیشتری نسبت به سویه والد تولید کردند.
در ارتباط با صفت تحمل به اتانل، ژنهای متعددی دخیل هستند که طیف وسیعی از مسیرهای متابولیسمی مانند بیوسنتز پروتئین، مسیر انتقال مواد به داخل سلول، چرخه رشد سلولی و رشد، متابولیسم اسیدهای چرب ، سازمانیابی دیواره سلول و غشاء را دربرمیگیرند. هرکدام از این ژنها، در گروههای عملکردی مختلف طبقهبندی شدهاند. با وجود این، سازوکار تحمل به اتانل بهطور کامل شناخته نشده است. تعداد زیادی از این ژنها دارای عملکرد چندگانه بوده و باهم میانکش دارند. پیچیدگی شبکه پاسخ مخمر طوری است که مسیرها بهطور مداوم برنامهریزی میشوند و این، تعیین سازوکار تحمل اتانل را مشکل کرده است. با وجود این، تلاش محققین برای شناسایی ژنهای موثر براین صفت همچنان ادامه دارد.
موریا و همکاران در تحقیقی اهمیت بیان ژن MTH1 برای تنظیم بیان ژن HIX1 در مسیرانتقال هگزوزها به داخل سلول مخمر را بیان کردند (27). در واقع ژن MTH1 پروتئینی را رمزگذاری میکند که تنظیم کننده منفی مسیر انتقال سیگنال حسگر گلوکز بوده و میزان ورود و خروج گلوکز را به داخل سلول از طریق میانکش با پروتئین دو ژن SNF3 و RGT2 تنظیم میکند (25). با توجه به افزایش میزان مصرف گلوکز سویههای تکامل یافته، به نظر میرسد که جهش در این ژن حائز اهمیت است. آنزیم فسفوگلوکوموتاز حاصل از ژن PGM2، مسئول تبدیل گلوکز 1-فسفات به گلوکز6-فسفات است و این ترکیب ماده اولیه مسیر گلیکولیز و مسیرپنتوزفسفات بوده و یکی از آنزیمهای کلیدی در متابولیسم گلوکز به شمار می رود. از طرفی متابولیسم گلوکز بهطور تنگاتنگی در مسیر تولید ترهالوز تاثیرگذار است. کربوهیدراتهایی مثل ترهالوز، مواد سازگار کنندهای هستند که میتوانند در هنگام ورود نمکهای اضافی از دهیدراته شدن برگشتناپذیر سلولهای مخمر جلوگیری کنند. مخمرها قادرند در شرایط تنش محیطی تا %15 وزن خشک سلول ترهالوز در خود جمع کنند. تجمع ترهالوز تحت شرایط تنش اتانل هم مشاهده شده است و سلولهایی که قادر به تجمع ترهالوز نباشند، رشدشان در شرایط تنش اتانل کاهش و با تاخیر انجام میگیرد (28). بعد از رهایی از تنش اتانل، ژنهای تجزیهکننده ترهالوز نیز فعال شده و بیان آنها بالا میرود. تجمع ترهالوز با افزایش بیان ژنهای مسئول سنتز ترهالوز مثل TPS2، TSL1، PGM2، UGP1 همراه است. ترهالوز باعث کاهش نفوذپذیری غشاء سلولی میشود و این کار میتواند از طریق شکلگیری پروتئینها باشد. در شرایط عادی، تر هالوز در سلول تجمع نمییابد و برخلاف شرایط تنش اتانل، به سرعت تجزیه میشود؛ اما در شرایط تنش دما و اتانل این ترکیب در سلول تجمع یافته و باعث حفظ تمامیت سلول مخمر در این شرایط میشود. هرو و همکاران تاثیر آنزیم فسفوگلوکوموتاز برتولید ترهالوز طی تنش اتانل را گزارش کردند (23).
افزایش سنتز پروتئین در سلول حین مواجهه مخمر با تنش اتانل در مطالعات قبلی اثبات شده است (11). پروتئین سیتوزولیک و هستهای آهن-گوگردی حاصل از بیان ژن CIA1 عملکرد بسیار مهمی در پردازش rRNA و بیوژنز ریبوزوم در سلولهای یوکاریوت دارد. این پروتئین برای مخمر ساکارومایسس سرویزیه حیاتی بوده و در شروع ترجمه نقش بنیادی دارد. سلولهای یوکاریوتی سازوکارهای مقابلهای زیادی از جمله تنظیم ترجمه و بیان ژنهای آنتی اکسیدانی محافظ را ایجاد کردهاند، و از طریق تقویت سیستم پروتئینسازی، پروتئینهای مورد نیاز برای مقابله با شرایط تنشزا را سنتز میکنند. این پروتئین در بیوژنز ریبوزوم موثر بوده و باعث افزایش سنتز پروتئین در پاسخ به تنش شده و با افزایش همانندسازی DNA، باعث افزایش نرخ رشد میشود (37).
تنش اکسایشی یک چالش برای شرایط هموستاز سلولی است و تنش الکل یکی از عواملی است که میتواند منجر به ایجاد این شرایط اکسایشی در سلول مخمر شود. محصول ژن UBP2 یکی از تنظیمکنندههای اصلی مسیر غیراشباعکردن اسیدهای چرب در میتوکندری است که اثر آنتاگونیستی بر فعالیت پروتئین ژن RSP5 داشته و منجر به سنتز اسیدچرب اولئیک، یک اسید چرب غیراشباع، میشود. غشاء سلولی تحت تاثیر الکلها تغییر ساختار داده و وارد فرآیند پاسخ میشود. افزایش دو اسید چرب غیراشباع اسید پالمتولئیک و اسید اولئیک در غشاء ساکارومایسس سرویزیه باعث افزایش سیالیت غشاء و تحمل تنش اتانل میشود (30). این دو اسید چرب بهویژه اسید اولئیک در گونههای مقاوم به اتانل دیده شدهاند (13،12).
نوع اجزای تشکیل دهنده غشاء سیتوپلاسمی سلول شامل پروتئینها و لیپیدها با تنظیم فرآیندهای اگوسیتوز و اندوسیتوز، کنترل بسیاری از فرآیندهای سلولی ضروری مانند جذب مواد مغذی و انتقال سیگنال با واسطه گیرنده را برعهده دارند. ژن YAP1801 پروتئینی را رمزگذاری میکند که به پروتئین کلاترین متصل شده و در انتقال وزیکول به ارگانل مناسب نقش بهسزایی دارد. این پروتئین همچنین در سازماندهی اسکلت سلولی نقش دارد (39). شبکه اندوپلاسمی یک اندامک بسیار مهم در سلولهای یوکاریوت بهشمار میرود که نقش اساسی در سنتز لیپیدها، ترشح پروتئینها و انتقال سینگال کلسیم دارد. پروتئین حاصل از ژن TCB1 که در شبکه اندوپلاسمی سنتز و ترشح شده، یکی از پروتئینهایی است که شبکه اندوپلاسمی را به غشاء پلاسمایی متصل می کند، در انتقال کلسیم و انتقال آن به داخل سلول و سازماندهی شبکه اندوپلاسمی تاثیرگذار است (35).
ژن DAN4 سنتز مانوپروتئین دیواره سلولی در مخمر را رمزگذاری میکند که در شرایط بیهوازی بیان می شود. به نظر میرسد که الیگوساکاریدهای کوچک مرتبط با مانوپروتئینها نیز به ثبات دیواره سلول کمک میکنند. این پدیده را میتوان با وجود پیوندهای قوی که بین ساکاریدهای مرتبط با این پروتئینها وجود دارد، توضیح داد. وجود این نوع مانوپروتئینها در ثبات دیواره سلولی بسیار موثر است (4).
فسفاتیدیل اینوزیتول 4, 5 بیس فسفات در غشاء سیتوپلاسمی مخمر قرارداشته و دارای دو نقش ساختاری و سیگنالی است. درحفظ تمامیت سلول و هموستازی سلول از طریق دینامیک غشاء نقش داشته و همچنین در سازماندهی رشتههای اکتین اسکلت سلولی تاثیرگذار است. ژنFAB1 یک پروتئین 257 کیلو دالتونی را رمزگذاری میکند که حاوی یک دامنه غنی از سیستئین در انتهای NH2 میباشد. Fab1p به عنوان یک فسفاتیدیل اینوزیتول 4-فسفات کیناز عضوی از یک خانواده آنزیمی شناخته میشود که با فسفریله کردن فسفولیپیدها و ایجاد پیامبرهای ثانویه در مسیرهای مختلف انتقال پیام از جمله تکثیر، تمایز، کنترل سیکل سلولی تاثیرگذار است (14.33). پروتئین پوششی (COPII) نیز یکی از پروتئینهای مهم در جوانهزدن و ساختار دیواره سلولی مخمر ساکارومایسس سرویزیه بوده و از طریق وزیکولها، حمل و نقل پروتئین صادراتی را از شبکه آندوپلاسمی به شبکه گلژی منتقل میکند. ژن SEC12 پروتئینی را رمزگذاری میکند که اولین مرحله تشکیل وزیکول COPII، شامل تبدیل Sar1p-GDP به Sar1p-GTP توسط عامل تبادل نوکلئوتید گوانین (GEF) Sec12p را به انجام می رساند (21 (. به نظر میرسد این ژن در تکثیر و رشد مخمر تاثیرگذار باشد. در ساکارومایسس سرویزیه، TUB3 یکی از ژنهایی است که پروتئین آلفاتوبولین را رمزگذاری میکند. میکروتوبولها عناصر اسکلتی محافظت شدهای هستند که در فرایندهای هستهای مانند تفکیک کروموزوم در میتوز و میوز، جهت دوک همانندسازی و مهاجرت هستهای در طی میتوز و جفتگیری تاثیرگذار هستند. بد و همکاران گزارش کردهاند که محصول این ژن با افزایش دینامیک میکروتوبولها بر جوانهزدن و تکثیر مخمر تاثیرگذار است (8). پروتئین ژن SHE4 عضوی از خانواده پروتئینهایی است که برای اندوسیتوز و قطببندی اسکلت سلولی اکتین در ساکارومایسس سرویزیه مورد نیاز است. She4p تنظیم تعامل بین موتور Myo3/5p و F-actin را برعهده دارد و به نظر میرسد که برای عملکرد پروتئین میوزین حضور She4p ضروری است (34). ژنهای درگیر در جوانه زدن و دینامک سلولی بهدلیل این که منجر به تطابق درون سلولی مخمر با شرایط محیطی و توان ادامه بقا می شوند، حائز اهمیت هستند.
با توجه به نتایج بهدست آمده در این پژوهش، استفاده از 1- بوتانل بهعنوان فشار انتخابی جایگزین اتانل، منجر به بهبود تحمل به اتانل در سویه تکامل یافته شده است و دو سویه منتخب نسبت به اتانل مقاومتر شدهاند. میتوان از SNPهای تایید شده در این تحقیق، برای مهندسی معکوس و بررسی اثر آن در سویه وحشی در مطالعات بعدی استفاده نمود.
سپاسگزاری
ازحمایت مادی و معنوی موسسه تحقیقات و آموزش توسعه نیشکر و صنایع جانبی خوزستان و همچنین مرکز the Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability دانشگاه صنعتی دانمارک که قسمتی از این طرح در آنجا انجام شد، تشکر وقدردانی می گردد.