Isolation, identification and evaluation of enzymes of a new psychrophilic bacterium from the intestine of Crustacean Gammarus sp collected from cold springs of Saman (Chahrmahal va Bakhtiari)

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of biology, faculty of basic sciences, Shahrekord University, Shahrekord ,Iran

2 Department of genetics, Faculty of basic sciences, Shahrekord University, Sharekord, Iran.

3 Department of biochemistry, faculty of biological sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran.

Abstract

Psychrophilic bacteria are useful in biotechnology due to their ability to produce different enzymes that capable of catalyzing biochemical reactions at low temperatures. Therefore, many studies have been done on these bacteria in recent years. The aim of this study was to isolate and identify the bacteria producing cold-adapted enzymes from the intestine of the new species of crustacean Gammarus species living in cold water spring of Saman in Chaharmahal va Bakhtiari province, Iran. The Gammarus samples were collected from cold spring of Saman. After transfer to the laboratory, bacteria were collected from the intestines in sterile condition. Then after, bacteria were cultured on the LB media and incubated at 5˚C temperature. Grown colonies were studied based on morphological characteristics, biochemical tests, and finally molecular identification was performed based on 16SrRNA sequence determination. A native strain of psychrophilic bacteria was isolated and identified, deposited with GenBank accession number MK961220. More experiments show that the new strain is capable of producing amylase, xylose isomerase, catalase, oxidase, and serine protease and laccase enzymes. The maximum activity and stability of most of the investigated enzymes were recorded at 5˚C. This study was conducted for the first time in the country to investigate the potential and ability of extracellular enzymes produce with biotechnological potential by the new psychrophilic strain. According to research, this strain can be used as a suitable candidate for the application of Cold adapted enzymes in various industries.

Keywords

Main Subjects

جداسازی و شناسایی باکتری سرمادوست از روده سخت پوست گاماروس جدا شده از چشمه­های آب سرد شهر سامان در استان چهارمحال و بختیاری وارزیابی آنزیم­های مختلف آن

معصومه یوسف زاده1، روح الله همتی2و3*، بهناز صفار1 و علیرضا نوری4

1 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم پایه، گروه ژنتیک

2 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی

3 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، پژوهشکده زیست فناوری، گروه بیوتکنولوژی صنعتی

4 ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوشیمی

تاریخ دریافت: 12/05/1399          تاریخ پذیرش: 07/07/1399

چکیده

باکتری­های سرما‌دوست بدلیل توانایی در تولید آنزیم­هایی که در دماهای پائین قادر به کاتالیز واکنش­های بیوشیمیایی می­باشند، بسیار مورد توجه قرار گرفته­اند. از این رو در سال­های اخیر مطالعات زیادی بر روی این باکتری­ها صورت گرفته است. این پژوهش نیز با هدف جداسازی و شناسایی باکتری­های تولید کنندة آنزیم­های مقاوم به سرما از رودة گونة جدید سخت­پوست گاماروس، ساکن چشمة آب سرد ارتفاعات رشته کوه زاگرس واقع در استان چهارمحال و بختیاری ایران، صورت پذیرفت. ابتدا گاماروس­ها جمع­آوری و پس از انتقال به آزمایشگاه، از روده آنها بصورت کاملاً استریل نمونه­برداری صورت گرفت و پس از تهیة رقت در محیط لوریا- برتانی آگار در دمای ˚C5 دمادهی شد. کلونی­های رشد یافته بر اساس ویژگی­های مورفولوژیکی، آزمون‌های بیوشیمیایی مورد مطالعه قرار گرفتند و در نهایت تعیین هویت مولکولی بر اساس توالی‌یابی ژن 16SrRNA انجام  شد. سویة بومی جدید شناسایی شده در این پژوهش با شمارة دسترسی  MK961220 در GenBank  ثبت شد که متعلق به باکتری سرمادوست Pseudomonas fragi می­باشد. طبق بررسی­های صورت گرفته، این سویة جدید توانایی تولید آنزیم­های آمیلاز، زایلوز ایزومراز، کاتالاز، اکسیداز، سرین پروتئاز و لاکاز را دارد و حداکثر فعالیت آنزیم­های بررسی شده در دمای 0 تا ˚C5 می­باشد. این پژوهش برای اولین بار در کشور بمنظور بررسی ظرفیت بالقوه و شناسایی منابع بومی تولید کنندة آنزیم­های صنعتی با کاربرد زیست فناوری انجام گرفته است. طبق بررسی­های صورت گرفته این سویة جدید می­تواند بعنوان کاندید مناسبی برای تخلیص و تولید آنزیم­های سرمادوست جهت استفاده در صنایع مختلف مورد استفاده قرار گیرد.

واژه­های کلیدی: آنزیم­های سرمادوست، سخت پوست گاماروس، باکتریPseudomonas fragi ، ژن 16SrRNA.

* نویسنده مسئول، تلفن: 32324401 98 ، پست الکترونیکی: roohullah.hemmati@sku.ac.ir

مقدمه

 

بخش وسیعی از سطح زمین دارای محیط­های سرد بوده که زیستگاه میکروارگانیسم­های سازگار به سرما، بنام سایکروفیل­ها می­باشند. بر اساس شرایط دمایی رشد، میکروارگانیسم­ها به سه دسته ترموفیل، مزوفیل و سایکروفیل تقسیم می­شوند (25). بدلیل سهولت رشد باکتریها و مقاومتشان در فرآیندهای مختلف، یک افزایش تقاضا برای استفاده از بیوکاتالیست­های میکروبی در کاربردهای صنعتی وجود دارد. امروزه اکثر آنزیم­هایی که در فرآیندهای صنعتی تولید می­شوند، مزوفیل هستند. کاربرد آنزیم­های مزوفیل، بدلیل پایداری کم آنها در برابر افزیش قدرت یونی، دما، و pH، محدود می­شود (3). علاوه بر این، ایجاد گرما جهت افزایش بازیابی تولیدات، در فرآیندهای صنعتی باکتری­های مزوفیل، مقرون به صرفه نمی­باشد. از این رو، آنزیم­های جداشده از میکروارگانیسم­های سرمادوست می­توانند جایگزین مناسبی برای آنزیم­های مزوفیل باشند (12). در چند دهة اخیر مشخص شده است که این میکروارگانیسم­ها بدلیل تولید آنزیم­های سازگار با سرما، مزایای اقتصادی و زیست­محیطی بسیار مفیدی را نسبت به میکروارگانیسم­های مزوفیل و ترموفیل از خود نشان می­دهند (37). آنزیم­های سازگار با سرما بدلیل ویژگی­های ساختمانی و کاتالیتیک در انجام واکنش­ها در دماهای پائین نسبت به رقبای مزوفیل و ترموفیل از مزیت بیشتری برخودارند. این آنزیم­ها با سرعتی بیش از دو برابر سرعت آنزیم­های مزوفیل قادر به کاتالیز واکنش­های شیمیایی در دماهای سرد می­باشند (12 و 17). سرمادوست­ها به دو دستة باکتری­های  Psychrophile(سرمادوست اجباری) و  Psychrotroph(سرمادوست اختیاری) تقسیم می­شوند. اغلب باکتری­های سرمادوست متعلق به جنس­های Pseudomonas، Vibrio، Cytophaga و Flavobacterium هستند (2).

مطالعات صورت گرفته در مورد باکتری­های سرمادوست، توانایی آنها را در تولید آنزیم­های مختلف مقاوم به سرما نظیر آمیلازها، سلولازها، پکتینازها، بتاگالاکتوزیدازها، اکسیدازها، پروتئینازها، لیپازها و غیره آشکار می­سازد (39). این باکتری­ها بدلیل تولید آنزیم­ها، متابولیت­ها و ترکیبات جدید نظیر پروتئین­های ضد یخ از پتانسیل بالایی برای کاربردهای بیوتکنولوژی برخوردارند (5). توانایی بالقوه آنزیم­های سرمادوست منجر به افزایش سرمایه­گذاری در زمینه تحقیقات و توسعه استفاده از این آنزیم­ها در صنایع مختلف از جمله صنایع غذایی (نظیر پکتیناز، بتا گالاکتوزیداز)، صنایع شوینده (نظیر لیپاز، آمیلاز، سلولاز)، صنایع فرآوری گوشت (پروتئاز) و غیره می­شود (33 و 39). علاوه بر این آنزیم­های سرمادوست بطور موفقیت­آمیزی در زیست­پالایی (نظیر اکسیدازها)، تغییر و تبدیلات زیستی (متیلاز و آمینوترانسفرازها) و نیز در زیست دارویی بطور وسیع بکار می­روند و تحقیقات در این زمینه بطور روزافزونی در حال افزایش است (39). با توجه به اهمیت آنزیم­های سرمادوست و کاربرد وسیع آنها در صنایع، این پژوهش با هدف شناسایی باکتری­های سرمادوست همزیست در روده سخت پوست گاماروس موجود در چشمة آب سرد ارتفاعات استان چهارمحال و بختیاری با کاربرد احتمالی در زیست فناوری و صنایع انجام شده است.

مواد و روشها

جداسازی گونة سخت­پوست گاماروس از چشمة آب ­سرد: چشمة آب سردی که در این پژوهش از آن نمونه برداری صورت گرفت در فاصله 85 کیلومتری شهرکرد در ارتفاعات رشته کوه­های زاگرس استان چهارمحال و بختیاری واقع شده است. دمای آب آن از ˚C 5 تا ˚C 15 در فصول سرد و گرم سال متغیر است. این نمونه­ها پس از جمع آوری، توسط فلاسک در دمای˚C5 به آزمایشگاه منتقل شدند.

جداسازی باکتریهای سرمادوست از رودة گونة جدید سخت پوست گاماروس: ابتدا سطح گاماروس­ها توسط الکل رقیق و نیز اشعه UV بطور کامل ضدعفونی و از رودة آنها به­صورت کاملاً استریل نمونه­برداری صورت گرفت. نمونه­ها پس از تهیة رقت، در محیط لوریا-برتانی آگار در دمای ˚C4 گرماگذاری شدند. در این دما فقط یک نوع کلونی رشد یافت که جهت اطمینان از خالص بودن، بصورت جداگانه به پلیت LB آگار منتقل و برای 3-4 بارمتوالی کشت داده شد. کلنی جداشده بر اساس ویژگی­های مورفولوژیکی، آزمون‌های بیوشیمیایی مورد مطالعه قرار گرفت و در نهایت تعیین هویت مولکولی بر اساس توالی‌یابی ژن 16SrRNA انجام شد.

بررسی خصوصیات مورفولوژی و آزمون­های بیوشیمیایی: خصوصیات ظاهری کلنی و خصوصیات ظاهری سلول، پس از رنگ­آمیزی گرم توسط میکروسکوپ نوری بررسی و ثبت شد. بمنظور شناسایی نسبی و اولیة سویة جداشده، یکسری از آزمونهای بیوشیمیایی میکروبی از جمله رنگ­آمیزی گرم، آزمون مصرف سیترات، آزمون کاتالاز، آزمون اکسیداز، آزمون متیل رِد-وگس پروسکائر (MR-VP test)، آزمون سولفید-ایندول-تحرک (SIM test)، و هیدرولیز نشاسته، بر اساس کتاب سیستماتیک باکتری­شناسی برگی انجام شد (40). در نهایت جهت تشخیص نهایی، شناسایی مولکولی بر اساس توالی‌یابی ژن 16SrRNA صورت پذیرفت.

بررسی مولکولی باکتری جدا شده: برای این منظور از پلیت حاوی کشت خالص، یک کلنی تک برداشته و در cc10 محیطLB  مایع، در دمای ˚C5 بمدت 20 ساعت کشت داده شد. سپس محیط کشت نامبرده جهت رسوب­گیری در دورrpm  9000 بمدت 5 دقیقه سانتریفیوژ گردید. از رسوب حاصل، برای استخراج DNA با استفاده از کیت Cell DNA Isolation kit تهیه شده از شرکت Gene All استفاده شد. برای اطمینان از صحت کار، محصول استخراج ژنوم توسط دستگاه الکتروفورز (BioRad) بر روی ژل 1 درصد آگارز مشاهده شد. پس از استخراج ژنوم، ژن 16SrRNA با تکنیک PCR و با استفاده از پرایمرهای universal  با نام‌های F و R تکثیر شد (28 و 29). آغازگرهای مورد استفاده در این پژوهش عبارتند از:

Primer F: 5' –GAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'

Primer R:5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT -3'

اجزا واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) عبارتند از: 5/2 میکرولیتر بافر X10، 75/0 میکرولیتر Mgcl2 (50 میلی مولار)، 5/0 میکرولیتر dNTPs (10 میلی مولار)، 5/0 میکرولیتر از هریک از آغازگرهای پیش­رو و معکوس (10 میکرومولار)، 1 میکرولیتر DNA ژنومی، 25/0 میکرولیتر آنزیم Polymerase Taq  DNA که با آب تزریقی به حجم نهایی 25 میکرولیتر رسید.

برای انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز، واسرشت سازی اولیه با دمای˚C 94 بمدت 5 دقیقه و 35 چرخة تکرارشونده شامل واسرشت­سازی ثانویه در دمای˚C 94 به مدت 45 ثانیه، اتصال پرایمرها در دمای ˚C56 بمدت 1 دقیقه و سنتز در دمای˚C 72 بمدت 1 دقیقه و 30 ثانیه و مرحله طویل شدن نهایی نیز در دمای˚C 72 بمدت 10 دقیقه در نظر گرفته شد.

جهت شناسایی نهایی باکتری مورد نظر، محصول حاصل از PCR بطول bp 1500 الکتروفورز و پس از تخلیص، برای تعیین توالی به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال و بصورت دو طرفه خوانش  تعیین توالی گردید. توالی حاصل، با استفاده از نرم­افزار Chromas pro ویرایش و توسط نرم افزار BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)، با توالی‏های ثبت شده در پایگاه داده NCBI مورد مقایسه قرار گرفت و نزدیک‌ترین سویه بر اساس توالی ژن16SrRNA  انتخاب شد.

تحلیل و رسم درخت فیلوژنتیک سویة جدا شده: بمنظور بررسی ارتباط فیلوژنی میان سویة جداسازی شده و توالی­های مشابه موجود در پایگاه داده، همردیفی توالی‌های 16SrRNA توسط نرم افزار Clustal W انجام شد. درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزارMEGA4  (52) و الگوریتمNeibour-Joining(NJ)  ترسیم شد (20 و 48). توالی بدست آمده از تحقیق حاضر در بانک ژنی NCBI ثبت گردید.

سنجش فعالیت آنزیم آمیلاز از سویه جداشده: بمنظور تأیید خاصیت هیدرولیزکنندگی نشاسته، تولید آمیلاز در پلیت آگار نشاسته­دار مورد بررسی کیفی قرار گرفت (شکل 7) و سنجش کمی فعالیت آن نیز براساس روش برنفلد Bernfeld)) و با استفاده از معرف دی­نیتروسالیسیلیک (DNS) صورت پذیرفت (8). ابتدا سویة جداشده در محیطLB  براث بمدت 48 ساعت در دمای ˚C5 کشت داده شد. سپس برای شکستن دیواره سلولی و رهاسازی آنزیم­ها، محیط کشت روی یخ با قدرت 80 پالس بمدت 30 ثانیه و به تعداد 13 بار سونیکیت شد. پس از سونیکیشن، محیط کشت با دور rpm 10000 بمدت 10 دقیقه و دمای ˚C4 سانتریفیوژ شد و سوپ رویی که حاوی آنزیم بود برای سنجش فعالیت آنزیم آمیلاز مورد استفاده قرارگرفت. بدین منظور، 400 میکرولیتر از محلول رویی حاوی آنزیم به 250 میکرولیتر نشاسته یک درصد محلول در 1350 میکرولیتر بافر فسفات 100 میلی مولار بعنوان سوبسترا اضافه شد (7 pH= ). جهت انجام واکنش، مخلوط حاصل بمدت 2 ساعت در دمای ˚C 5 قرار داده شد. در مرحلۀ بعد، واکنش آنزیمی با اضافه کردن یک میلی­لیتر از معرف DNS به مخلوط و قراردادن آن بمدت 5 دقیقه در آب جوش پایان یافت. سپس جذب نمونه­ها در طول موج nm540 قرائت گردید (44).

سنجش فعالیت آنزیم زایلوز ایزومراز از سویة جدا شده: زایلوز ایزومراز آنزیم مهمی است که ایزومریزاسیون برگشت­پذیر گلوکز به فروکتوز و زایلوز به زایلولوز را کاتالیز می­کند و در تولید صنعتی شربت فروکتوز با درصد شیرینی بالاتر از ساکارز مورد استفاده قرار می­گیرد. علاوه بر استفادة این آنزیم در صنایع غذایی، بدلیل کاربردهای بالقوة آن در صنعت سوخت­های زیستی، بسیار مورد توجه قرار گرفته است (13). بدلیل اهمیت موضوع، تولید این آنزیم مهم در سویة جدید مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش تولید آنزیم زایلوز ایزومراز بوسیله تست سیلوانف تصدیق شد (34 و 46). بدین منظور ابتدا سویة جدا شده در محیط LB براث کشت داده شد. در مرحلة بعد برای رهاسازی آنزیم، محیط کشت با شرایط عنوان شده در بالا سونیکیت شد. سپس برای بررسی فعالیت آنزیم زایلوز ایزومراز، پس از سانتریفیوژ محیط سونیکیت شده در دورrpm 10000 بمدت 10 دقیقه و دمای ˚C4، 5 میلی لیتر از سوپ رویی برداشته و به آن 5 میلی لیتر سوبسترای گلوکز 1 مولار اضافه شد. پس از قرار دادن مخلوط حاصل روی یخ، در زمانهای صفر، 2، 4، 6 ساعت، یک میلی لیتر از آن را برداشته و با اضافه کردن یک میلی­لیتر از معرف سیلوانف و قراردادن مخلوط بمدت 5 دقیقه در آب جوش واکنش آنزیمی پایان یافت. سپس جذب نمونه­ها در طول موج nm560 قرائت گردید (18).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز از سویه جدا شده: کاتالاز آنزیمی است که تقریباً در همه موجودات از باکتریها گرفته تا گیاهان و جانوران یافت می­شود و وظیفة محافظت از سلول در برابر تخریب اکسیداتیو آب اکسیژنه را بر عهده دارد. این آنزیم، آب اکسیژنه را به آب و اکسیژن تجزیه می­کند (14). کاتالاز دارای بالاترین Turn over در بین آنزیم­ها می­باشد؛ زیرا هر مولکول آنزیم قادر به تجزیة بیش از یک میلیون مولکول پراکسید هیدروژن است (21). بدلیل اهمیت کاتالاز بعنوان یکی از آنزیم­های مهم در زمینه­های مختلف صنعتی و بیوتکنولوژی و کشاورزی از جمله زیست پالایی و صنایع غذایی و غیره (30 و 35)، در پژوهش حاضر کیفیت این آنزیم در سویة جدا شده مورد ارزیابی قرار گرفت. این آزمایش بر طبق دستورالعمل مندرج در مقالات پیشین با کمی تغییر صورت پذیرفت (27). بدین منظور پس از کشت باکتری و سونیکیت روی یخ، محلول رویی توسط سانتریفیوژ جدا شد. سپس 4 لام یا لوله با اندازه یکسان برداشته و درون هر یک مقدار یکسانی از پراکسید هیدروژن (300 میکرولیتر) ریخته شد (البته یکی از لوله­ها برای کنترل منفی است). لوله­ها را در دماهای مختلف مورد نظر قرارداده تا پراکسید به دمای مورد نظر برسد. سپس به هر لوله، 300 میکرولیتر از محلول رویی با همان دما اضافه شده و پس از گذشت زمان 3 دقیقه، کیفیت تشکیل حباب در لوله­ها مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش فعالیت آنزیم در دماهای˚C 5 و ˚C 10 و ˚C 15 بررسی شد و نتایج حاصل از آن در بخش مربوطه ارائه گردید.

ارزیابی فعالیت آنزیم اکسیداز از سویه جدا شده: باکتری‌ها اصولاً به دو روش انرژی تولید می‌کنند یا با تخمیر یا با اکسیداسیون مواد آلی که این گروه از باکتریها آنزیم اکسیداز دارند و اصطلاحاً اکسیداز مثبت هستند. اکسیدازها برداشت هیدروژن از سوبسترا را کاتالیز می­کنند اما از اکسیژن فقط بعنوان گیرندة هیدروژن استفاده می­کنند (19 و 36). اگر باکتری دارای آنزیم اکسیداز باشد (مانند Pseudomonas یا Gonococcal) در صورت مجاورت با سوبستراهایی مانند تترا متیل پی فنیلین دی آمین و یا معرف کواکس به رنگ بنفش تغییر رنگ می‌دهد و اگر اکسیداز منفی باشد (مانند آسینتوباکتر) تغییر رنگ نداریم. در این پژوهش فعالیت آنزیم اکسیداز بر اساس روش ارائه شده در مقالات بشرح زیر ارزیابی شد (31). ابتدا مقداری از سوپ رویی کشت سونیکیت شده روی کیتی که حاوی سوبستراست ریخته می-شود، تغییر رنگ کیت نشان­دهندة وجود آنزیم اکسیداز می­باشد (7 و 50).

ارزیابی فعالیت آنزیم سرین پروتئاز از سویه جدا شده: تنها 8 درصد از آنزیم­های صنعتی از منابع گیاهی و 4 درصد آن از منابع جانوری تولید می­شوند و مابقی خاستگاه میکروبی دارند (10). میکروارگانیسم­ها از مهم­ترین و عمده­ترین منابع تولید آنزیم­ها بوده که بیشتر آنها متعلق به جنس باسیلوس­ها و سودوموناس­ها هستند (6 و 9). از بین آنزیم­های باکتریایی، پروتئازها بدلیل کاربرد وسیعشان در صنایع مختلف، بسیار مورد توجه قرار می­گیرند (32 و 45). در میان پروتئازها، سرین پروتئازها بعلت پایداری و فعالیت در pH بالا نقش مهمی در دناتوره کردن پروتئین­ها در محیط قلیایی بازی می­کنند و کاربرد وسیعی در صنایع دارند (23).

بررسی­های صورت گرفته در سال 2016 بر روی گونه­های مختلف سودوموناس نشان داد، برخی ازگونه­ها توانایی تولید آنزیم سرین پروتئاز را داشته که در دماهای مختلف فعالیت متفاوتی را نشان می­دهند (4). در پژوهش حاضر بررسی کمّی وجود این آنزیم در دماهای مختلف طبق دستورالعمل موجود در مقالات پیشین با اندکی تغییرات (11 و 22) صورت گرفت. بدین منظور پس از کشت باکتری و سونیکیت روی یخ، توسط سانتریفیوژ، محلول رویی جدا شد. سپس 200 میکرولیتر از محلول رویی با 200 میکرولیتر از محلول BSA 1 درصد بعنوان سوبسترا بهمراه 200 میکرولیتر بافر فسفات در داخل لوله آزمایش با هم مخلوط و همراه با لولة بلانک (نمونة کنترل) که شامل همة مواد بجز محلول رویی بود، بمدت 10 دقیقه در داخل یخچال قرار داده شد و سپس جذب در  nm280 قرائت گردید. در مرحلة بعد برای بررسی اثر مهارکنندة PMSF بر فعالیت آنزیم، در آزمایشی مشابه، ابتدا محلول رویی با مهارکننده PMSF مخلوط سپس به محلول واکنش اضافه شد و پس از گذشت زمان­های مختلف جذب در nm 280 قرائت شد. در تحقیق حاضر زمان و دماهای متفاوتی برای بررسی فعالیت این آنزیم انتخاب و نتایج آن در بخش مربوطه ارائه گردید.

نتایج

باکتری سرمادوست از رودة گونة جدید سخت پوست گاماروس بومی چشمه آب سرد کوههای زاگرس جداسازی شد. رشد بهینة این باکتری در دمای˚C5 و کمتر بود و در دمای ˚C37 هیچگونه رشدی از خود نشان نداد (شکل 1). از لحاظ مورفولوژی در زیر میکروسکوپ به شکل کوکوباسیل گرم منفی دیده شد (شکل 2). نتایج مربوط به آزمونهای بیوشیمیایی این سویه بومی نیز در جدول 1 ارائه شده است.

 

شکل 1- (A) پلیت کشت داده شده در دمای ˚C 5 و (B) پلیت انکوبه شده در دمای ˚C37.

 

شکل 2- گستره سویه جداشده در زیر میکروسکوپ.

 

جدول 1- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی باکتری استخراج شده از روده گاماروس

Growth at 30˚C

Indole

H2S

VP test

Glucose

Citrate

Starch hydrolysis

Motility

Oxidase test

Catalase test

Gram stain

Morphology

-

-

-

-

+

+

+

+

+

+

-

cocobacil

 

 

 

شکل 3- (A) تست مربوط به حرکت سویة جداشده و (B) نمونة کنترل منفی.

 

استخراج ژنوم باکتری و انجام  PCRجهت تکثیر قطعه 16SrRNA: ابتدا ژنوم باکتری استخراج شد (شکل 4). سپس بمنظور شناسایی مولکولی سویه جداسازی شده، تکثیر ژن 16SrRNA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی صورت پذیرفت (شکل 5). ژن تکثیری توسط شرکت ماکروژن از دو طرف خوانش گردید. نتایج حاصل از BLAST توالی بدست آمده با توالی‌های موجود در بانک اطلاعاتی NCBI، شباهت 64/99 درصدی این سویة جدید به باکتری Pseudomonas Fragi را نشان داد که با شمارة دسترسی  MK961220 در GenBank ثبت شد (جدول 2).

 

شکل 4- محصول استخراجDNA  ژنومی سویة جدا شده همراه با مارکر bp100.

 

شکل 5- محصول PCR ژن 16SrRNA درسویة جدا شده همراه با مارکر bp100.

 

جدول 2- شناسایی مولکولی سویة جداسازی شده بر اساس مقایسه توالی ژن 16SrRNA با سویه‌های معتبر در بانک اطلاعاتی ژنوم

شماره دسترسی **

نام سویه

درصد شباهت

MK961220

Pseudomonas fragi

99/64

** شماره دسترسی، توالی‌های ثبت شده در بانک اطلاعات ژنوم NCBI می‌باشد.

 

نتایج تحقیقات انجام شده نشان می­دهد که جنس‌های Pseudomonas، Azospirillum و Bacillus از جمله میکروارگانیسم‌های تجاری بشمار می‌روند؛ یعنی نسبت به جنس­های دیگر بطور گسترده مورد بررسی قرار گرفته‌اند و آنزیم­های موجود در آنها بصورت نوترکیب بمیزان وسیع در صنایع مورد استفاده قرار می­گیرند (10). در تحقیق حاضر نیز سویة شناسایی شده، متعلق به جنس Pseudomonas می‌باشد که در تحقیقات متعدد نقش‌های زیادی برای این جنس مطرح شده است (9).

بمنظور بررسی رابطة فیلوژنتیکی میان سویة شناسایی شده با نمونه­های بدست آمده از BLAST، درخت فیلوژنی با استفاده از نرم افزار MEGA4 و روش Neibour-Joining (NJ) (19) رسم شد. نتایج حاصل از درخت فیلوژنی نشان می­دهد که سویه مورد مطالعه (sa**) با باکتریPseudomonas fragi  در یک کلاد خواهری قرار گرفته است (شکل 6). توالی بدست آمده از تحقیق حاضر در بانک ژنی NCBI ثبت شد.

 

 

شکل 6- درخت فیلوژنی باکتری شناسایی شده با استفاده از نرم­افزار  MEGA4و روشNeibour-Joining (NJ). باکتری جداشده با ستاره مشخص شده است.

 

سنجش فعالیت آنزیم آمیلاز: همانگونه که در شکل 7 مشاهده می­شود هاله تشکیل شده در اطراف کلنی مورد نظر بیانگر توانایی تولید آنزیم آمیلاز توسط ایزوله جداشده می­باشد و با توجه به نتایج تکمیلی بدست آمده از بررسی کمَی که با استفاده از روش بنفیلد در طول موج nm540 و در دماهای 0˚C و ˚C12 صورت پذیرفت، این باکتری از توانایی بالایی برای تولید این آنزیم برخوردار است ( شکل 8 و جدول 3). بر اساس نتایج حاصله، میزان فعالیت این آنزیم در دمای صفر درجه بیشتر از فعالیت آن در دمای 12 درجه می­باشد.

شکل 7- (A) بررسی کیفی آنزیم آمیلاز تولید شده توسط سویه مورد مطالعه و (B وC) نمونه­های کنترل فاقد آنزیم آمیلاز.

شکل 8- بررسی کمی آنزیم آمیلاز تولید شده توسط سویه مورد مطالعه، سمت راست میکروتیوب حاوی آنزیم وسمت چپ شاهد.

جدول 3- نتایج بررسی کمّی فعالیت آنزیم آمیلاز

دما ((˚C

جذب (nm540)

روی یخ (صفر درجه)

478/0

12 درجه

281/0

 

سنجش فعالیت آنزیم زایلوز ایزومراز: بررسی کمّی آنزیم زایلوز ایزومراز با سوبسترای گلوکز 1 مولار و معرف سلیوانف انجام شد (8(. ایجاد رنگ قرمز نشاندهندة وجود فروکتوز بدلیل حضور آنزیم زایلوز ایزومراز می­باشد. شدت رنگ در طول موج nm 560 در 4 تکرار قرائت گردید. با توجه به نتایج، بیشترین فعالیت آنزیم بعد از 4 ساعت بدست آمد که نمودار آن در شکل 9 نشان داده شده است.

شکل 9- تعیین زمان بهینه برای فعالیت آنزیم در دمای صفر درجه.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز از سویه جدا شده: طبق نتایج مشاهده شده در شکل 10، این سویه جدید از توانایی تولید میزان بالایی از آنزیم کاتالاز برخودار بوده که فعالیت آن در دماهای پایین بیشتر از فعالیت آن در دماهای بالا است.

شکل 10- ارزیابی کیفی آنزیم کاتالاز و بررسی فعالیت آن در دماهای مختلف.

A و B و C بترتیب نشاندهندة میزان فعالیت آنزیم کاتالاز سویة جدا شده در دماهای 5 و 10 و 15 درجه می­باشد در حضور استرپتوکوک بعنوان کنترل منفی برای تولید آنزیم کاتالاز(D).

سنجش فعالیت آنزیم اکسیداز از سویه جدا شده: بمنظور سنجش فعالیت آنزیم اکسیداز بصورت کیفی از کیت استفاده شد که رنگ آبی مایل به بنفش نشاندهندة وجود آنزیم اکسیداز می­باشد )شکل 11).

شکل 11- ارزیابی کیفی آنزیم اکسیداز

ارزیابی فعالیت آنزیم سرین پروتئاز از سویة جدا شده: نتایج آزمون ارزیابی تولید آنزیم سرین پروتئاز در این پژوهش نشان داد که سویه شناسایی شده از توانایی تولید این آنزیم برخوردار است (جدول 4). طبق نتایج بدست آمده این آنزیم در دماهای پایین نظیر˚C 5 پایدارتر از دماهای بالا نظیر˚C 12 می­باشد. بطوری که در دمای 12 درجه بعد از گذشت 20 دقیقه فعالیت آنزیم کاهش یافته در حالی که در دمای 5 درجه، با گذشت این زمان فعالیت آنزیم افزایش می­یابد. همچنین نتایج موجود در در جدول 5 نشان می­دهد که افزودن بازدارنده PMSF (فنیل متیل سولفونیل فلوراید) سبب مهار آنزیم سرین پروتئاز شده است.

 

جدول 4- نتایج مربوط به وجود آنزیم سرین پروتئاز از سویه جدا شده

دما

پس از گذشت 10 دقیقه

پس از گذشت 20 دقیقه

˚C5

751/0

93/0

˚C12

86/0

65/0

جدول 5- نتایج مربوط به مهار آنزیم سرین پروتئاز با بازدارنده PMSF

پس از گذشت 10 دقیقه

پس از گذشت 20 دقیقه

25/0

03/0

 

 

بحث و نتیجه گیری

در سال­های اخیر بدلیل اهمیت قابل توجه میکروارگانیسم­های سرمادوست، با هدف دستیابی به آنزیم­های فعال در سرما، توجه ویژه­ای به اکوسیستم­های سرد و میکروارگانیسم­های آن شده است (17). تولید این آنزیم­ها از نظر بیوتکنولوژی بسیار مفید و از نظر اقتصادی نیز مقرون به صرفه می­باشد (42). افزون بر این با افزایش دما می­توان این آنزیم­ها را غیر فعال نمود و به همین دلیل در مقایسه با اتواع مزوفیل و ترموفیل آلودگی زیست محیطی ایجاد نمی­کنند. با مطالعات صورت گرفته در مورد باکتری­های سرمادوست، توانایی آنها در تولید آنزیم­های مختلفی نظیر آمیلازها، سلولازها، پکتینازها، بتاگالاکتوزیدازها، اکسیدازها، پروتئینازها، لیپازها و غیره اثبات شده است (39).  نتایج بررسی وجود آنزیم­های مختلف از سویه بومی شناسایی شده در پژوهش حاضر و کاربردهای آن نیز در جدول 6 خلاصه شده است.

بدلیل اهمیت این موضوع، در این مطالعه باکتری جداشده از روده سخت پوست گاماروس ساکن چشمه­های آب سرد ارتفاعات زاگرس استان چهارمحال بمنظور توانایی تولید آنزیم­های سرمادوست با پتانسیل بیوتکنولوژی مورد بررسی قرار گرفت. با توجه به بومی و جدید بودن گونه سخت پوست، پژوهش کنونی برای نخستین بار انجام شده است. شناسایی مولکولی این باکتری همولوژی 64/99 درصدی آن را با جنس Pseudomonas نشان داد که این نتایج با تست­های بیوشیمایی صورت گرفته تطابق دارد. طبق گزارش اخیر در سال 2019 ریزوباکتر sp Pseudomonas از ریزوسفر گیاهان بدست آمد که بصورت همزیست با گیاه و تولید متابولیت­های محرک رشد سبب افزایش رشد گیاه ونیز افزایش جوانه زنی دانه می­شود (43).

 

جدول 6- نتایج بررسی وجود آنزیم­های مختلف از سویه بومی شناسایی شده

آنزیم­ها

کاربردها

تولید در سویة جداشده

آمیلاز

در صنایع مختلف مانند صنایع غذایی، دارویی، نساجی، کاغذ، شوینده و غیره (47 و 51)

+

سرین پروتئاز

شوینده، صنایع لبنی، نساجی، تولید چرم، صنایع دارویی مثل پمادها و محلولهای شتشو (49)

+

زایلوز ایزومراز

صنایع غذایی، نوشیدنی­ها، صنایع نانوایی، تولید شربت فروکتوز، سوخت زیستی و غیره (13)

+

کاتالاز

تهیه اسفنج، صنایع لبنی، شوینده­ها، صنایع غذایی، زیست پالایی و غیره (21 و 51)

+

پراکسیداز

معرف برای تشخیص و تعیین گلوکز خون و ادرار، تعیین مقدار اتانول در مایعات بیولوژیک، تصفیه فاضلاب­ها، دخالت در سنتز ترکیبات آروماتیکی مختلف و حذف فنولها و پراکسیدها از مواد زائد صنعتی (1 و 24)

+

لاکاز

در صنایع مختلف و نیز طیف وسیعی از فرآیندهای شیمیایی، نظیر رنگبری در صنعت نساجی، سفید کردن خمیر کاغذ، سمیت زدایی از پساب، پالایش زیستی، صنایع غذایی، تولید مواد آلی از سوبسترای فنولی و آمینی، پیل­های سوختی، زیست نانو فناوری و غیره )15 و 26)

+

 

 

از این رو ما فرض کردیم که احتمالاً این سویه نیز بصورت همزیست در ریشه گیاهان قرار دارد و پس از خورده شدن ریشه گیاهان توسط سخت پوست گاماروس، وارد دستگاه گوارش این سخت پوست شده است. اگر این فرض درست باشد، بر اساس رژیم غذایی سلولزی و پروتئینی گاماروس، شاید بتوان از این سویه جدید برای تحریک جوانه­زنی دانه­ها و بذرها در مناطق سردسیر کشور نیز بهره برد. البته تحقیقاتی در این زمینه و استفاده از این سویه جدید و بررسی تأثیر آن در رشد گیاه در حال انجام است. رشد بهینه ایزوله جدا شده این تحقیق در دماهای پایین با نتایج بدست آمده از تحقیقاتGavali, J., & Pathak, A.  در سال 2015 مطابقت دارد. این محققان نیز توانستند از یخچال­های طبیعی، سویه­ای را جداسازی کنند که رشد بهینه آن در دمای ˚C 5 بود (41). البته، علیرغم گزارش آنها مبنی بر عدم توانایی مصرف ایزوله جداشده از نشاسته، در تحقیق حاضر سویه جدید بدلیل تولید آنزیم آمیلاز فعال، توانایی مصرف نشاسته را داشته و آزمایشات کیفی و کمی چندین بار تکرار شدند تا نتایج تأیید شوند. با وجود اینکه اطلاعات زیادی در مورد آنزیم­های موجود در Pseudomonas fragi در دست نیست ولی زنوم کامل دو سویه از آن بنام­های A22 و B25 توسط Wang, Q و همکارانش تعیین توالی شده است (53) و توالی ژن­های مختلف آن از جمله ژن تولید کننده آنزیم آمیلاز در Gene bank ثبت شده است. در خصوص آنزیم پروتئاز Pseudomonas fragi نیز گزارش­های محدودی ارائه شده است. در گزارشی Noreau و همکارانش در سال 1979 این آنزیم را جداسازی کرده­اند (38). در پژوهش حاضر نیز نتایج، بیانگر تولید این آنزیم توسط سویه جدید می­باشد که جهت کسب جزئیات بیشتر تحقیقات بیشتری نیاز است. این سویه همچنین قادر به تولید زایلوز ایزمراز است که در صنایع تولید آبمیوه مصرف زیادی دارد و با توجه به اینکه ژن تولید کننده این آنزیم ازPseudomonas fragi در Gene bank موجود می­باشد، امکان تحقیق جامعی راجع به آن فراهم شده است. در این پژوهش ما وجود این آنزیم را در سویه جدید بررسی نمودیم. ناگفته نماند تنها از سر کنجکاوی این سویه جدید را روی پلیت حاوی متیلن بلو و در حضور سویه لاکاز منفی کشت دادیم و مشاهده کردیم که بخوبی رشد کرد و حدس می­زنیم که این سویه جدید توانایی حذف آلاینده­ها را نیز داشته باشد. همان­گونه که در بخش نتایج مشاهده شد این سویة جدید همچنین از پتانسیل بالایی برای تولید آنزیم کاتالاز سرمادوست برخوردار است که کاربرد وسیع در صنایع مختلف دارد. در پژوهشی که توسطPathak, A  و  Gavali, Jارائه شده، تنها به حضور و عدم حضور کاتالاز در Pseudomonas fragi اشاره شد و بررسی کیفی و کمی از آنزیم کاتالاز جهت مقایسه ارائه نشده است (41). در مورد دیگر آنزیم­ها نیز وضع به همین منوال است. البته در مورد گونه­های دیگر Pseudomonas نظیر fluorescens و aeruginosa تحقیقات بیشتری انجام شده است؛ ولی علیرغم اهمیت آنزیم­های سرمادوست و کاربرد وسیعشان در صنایع مختلف، متأسفانه هنوز پژوهش­های زیادی در مورد آنزیم­های Pseudomonas fragi صورت نگرفته است. نطر به اینکه سویة جدید، بومی کشورمان ایران می­باشد و با توجه به پتانسیل بالای آن در تولید آنزیم­های سرمادوست که در دماهای بسیار پایین قادر به فعالیت می­باشند، این سویه کاندید بسیار مناسبی جهت تخلیص آنزیم به فرم طبیعی یا تولید آنزیم­های سرمادوست نوترکیب جهت استفاده در صنایع مختلف می­باشد و استفاده از این آنزیم­ها در صنایع، موجب افزایش کیفیت محصولات شده و با ایجاد ارزش افزوده، افزایش درآمد را برای شرکت­های مربوطه در پی خواهد داشت.

1- Agarwal, S., Gupta, K. K., Chaturvedi, V. K., Kushwaha, A., Chaurasia, P. K., & Singh, M. P. (2018). The Potential Application of Peroxidase Enzyme for the Treatment of Industry Wastes0 In Research Advancements in Pharmaceutical, Nutritional, and Industrial Enzymology . 278-293.
2- Amico S.D., Collins T., Marx J.C., Feller G., Gerday C. (2006) Psychrophilic microorganisms: challenges for life.Embo Rep.7:385–389.
3- Amico S, Gerday C, Feller G (2001) Structural determinants of cold adaptation and stability in a large protein. J Biol Chem 276: 25791-25796.
4- Andreani, N. A., Carraro, L., Fasolato, L., Balzan, S., Lucchini, R., Novelli, E., & Cardazzo, B. (2016). Characterisation of the thermostable protease AprX in strains of Pseudomonas fluorescens and impact on the shelf-life of dairy products: preliminary results. Italian journal of food safety, 5(4).
5- Antikainen, M. and Griffith, M. (1997) Antifreeze protein accumulation in freezing-tolerant cereals. Plant Physiology 99: 423-432.
6- Archer, D. B. (1994). Enzyme production by recombinant Aspergillus. Recombinant microbes for industrial and agricultural applications, 373-393.
7- Atlas, R. M., & Snyder, J. W. (2006). Handbook of media for clinical microbiology. CRC Press.
8- Bernfeld, P.,(1955). Amylases, α and β.Methods in Enzymology 1: Academic Press; pp. 149-589.
9- Bommarius, A. S., & Riebel-Bommarius, B. R. (2004). Biocatalysis: fundamentals and applications. John Wiley & Sons.
10- Bornscheuer, U. T., & Pohl, M. (2001). Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design. Current opinion in chemical biology, 5(2), 137-143.
11- Caballero, A.R., Moreau, J.M., Engel, L.S., Marquart, M.E., Hill, J.M., and O’Callaghan, R.J. (2001) Pseudomonas aeruginosa protease IV enzyme assays and comparison to other Pseudomonas proteases. Anal Biochem 290: 330– 337.
12- Cavicchioli R, Siddiqui KS, Andrewss D, Sowers KR (2002) Low-temperature extremophiles and their applications. Curr Opin Biotechnol 13: 253–261.
13- Chanitnun, K., & Pinphanichakarn, P. (2012). Glucose (xylose) isomerase production by Streptomyces sp. CH7 grown on agricultural residues. Brazilian Journal of Microbiology, 43(3), 1084-1093.
14- Chelikani, P., Fita, I., & Loewen, P. C. (2004). Diversity of structures and properties among catalases. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 61(2), 192-208.
15- Couto, S. R., & Herrera, J. L. T. (2006). Industrial and biotechnological applications of laccases: a review. Biotechnology advances, 24(5), 500-513.
16- D’Amico S, Claverie P, Collins T, Georlette D, Gratia E, et al. (2002) Molecular basis of cold adaptation. Phil Trans R Soc Lond B Biol Sci 357: 917-925.
17- D'Amico, S., Collins, T., Marx, J. C., Feller, G., & Gerday, C. (2006). Psychrophilic microorganisms: challenges for life. EMBO reports, 7(4), 385-389.
18- Dische Z, Borenfreund E. A new spectrophotometric method for the detection and determination of keto sugars and trioses. The Journal of Biological Chemistry. 1951;192(2):583-587.
19- Forbes, B. A., Sahm, D. F., & Weissfeld, A. S. (1998). Diagnostic microbiology (pp. 355-61).
20- Gascuel, O., & Steel, M. (2006). Neighbor-joining revealed. Molecular biology and evolution, 23(11), 1997-2000.
21- Goodsell, D. S. (2004). Catalase. Molecule of the Month. RCSB Protein Data Bank.
22- Guedes, H. L., Neto, J. M. R., Fonseca, M. A., Salles, C. M., Rossi-Bergmann, B., & De-Simone, G. (2007). Identification of serine proteases from Leishmania braziliensis. Zeitschrift für Naturforschung C, 62(5-6), 373-381.
23- Haddar, A., Bougatef, A., Agrebi, R., Sellami-Kamoun, A., & Nasri, M. (2009). A novel surfactant-stable alkaline serine-protease from a newly isolated Bacillus mojavensis A21. Purification and characterization. Process Biochemistry, 44(1), 29-35.
24- Hamid, M. (2009). Potential applications of peroxidases. Food chemistry, 115(4), 1177-1186.
25- Herla, K. K., Ghosh, M., Kumar, P. S., & Sambasiva Rao, K. R. S. (2011). Psychrozymes-the next generation industrial enzymes. J Marine Sci Res Development, 1(2).
26- Imran, M., Asad, M. J., Hadri, S. H., & Mehmood, S. (2012). Production and industrial applications of laccase enzyme. Journal of Cell & Molecular Biology, 10(1).
27- Iwase, T., Tajima, A., Sugimoto, S., Okuda, K. I., Hironaka, I., Kamata, Y & Mizunoe, Y. (2013). A simple assay for measuring catalase activity: a visual approach. Scientific reports, 3, 3081.
28-  James, Greg (15 May 2018). "Universal Bacterial Identification by PCR and DNA Sequencing of 16S rRNA Gene". PCR for Clinical Microbiology. Springer, Dordrecht. pp. 209–214. doi:10.1007/978-90-481-9039-3_28ISBN 978-90-481-9038-6.
29- Jiang H, Dong H, Zhang G, Yu B, Chapman LR, Fields MW (June 2006). "Microbial diversity in water and sediment of Lake Chaka, an athalassohaline lake in northwestern China". Applied and Environmental Microbiology. 72 (6): 3832–45. 
30- Kaushal, J., Mehandia, S., Singh, G., Raina, A., & Arya, S. K. (2018). Catalase enzyme: application in bioremediation and food industry. Biocatalysis and agricultural biotechnology, 16, 192-199.
31- Kovács, N. 1956. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature (London) 178:703.
32- Kumar C, Takagi H. (1999), Microbial alkaline proteases: from a bioindustrial view point. Biotechnol Adv; 17(7): 561–94.
33- Kumar, P. S., Ghosh, M., Pulicherla, K. K., & Rao, K. R. S. S. (2011). Cold active enzymes from the marine psychrophiles: biotechnological perspective. Advanced Biotechnol, 10, 16-20.
34- Lee, S. M., Jellison, T., & Alper, H. S. (2012). Directed evolution of xylose isomerase for improved xylose catabolism and fermentation in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol., 78(16), 5708-5716.
35- Luhova, L., Lebeda, A., Hedererova, D., & Pec, P. (2003). Activities of amine oxidase, peroxidase and catalase in seedlings of Pisum sativum L. under different light conditions. Plant soil and environment, 49(4), 151-157.
36- MacFaddin JF. Biochemical tests for Identification of medical Bacteria . 3rd ed . Philadelphia: lippincott Williams and wilkins, 2000 .P: 368-77.
37- Margesin R, Feller G, Gerday C, Russell N (2002) Cold-Adapted Microorganisms: Adaptation Strategies and Biotechnological Potential. In: The Encyclopedia of Environmental Microbiology G. Bitton (Ed.) John Wiley & Sons New York 2: 871-885.
38- Noreau, J. E. A. N., & Drapeau, G. R. (1979). Isolation and properties of the protease from the wild-type and mutant strains of Pseudomonas fragi. Journal of bacteriology, 140(3), 911-916
39- Okuyama H. et al. (1998) Cold-adapted microorganisms for use in food biotechnology. In: Margesin R., Schinner F. (eds.): Biotechnological Applications of Cold-Adapted Organisms. Berlin: 101-117.
40- Parte, A. (2012). Bergey's manual of systematic bacteriology: Volume 5: The actinobacteria. Springer Science & Business Media.
41- Pathak, A, & Gavali, J (2015). Isolation and Identification Of Cold Active Amylase Producer From Gastro Intestinal Tract Of Channa Striata. Current Trends in Aquaculture, 53.
42- Pulicherla, K. K., Ghosh, M., Kumar, P. S., & Sambasiva Rao, K. R. S. (2011). Psychrozymes-the next generation industrial enzymes. J Marine Sci Res Development, 1(2).
43- Qessaoui, R., Bouharroud, R., Furze, J. N., El Aalaoui, M., Akroud, H., Amarraque, A & Chebli, B. (2019). Applications of new rhizobacteria Pseudomonas isolates in agroecology via fundamental processes complementing plant growth. Scientific reports, 9(1), 1-10.
44- Ramian, P., Arabi, M., & Hemmati, R. (2018). Novel Amylase in Coelomic Fluid and Body Extract from the Earthworm Allolobophora Chlorotica. Biomacromolecular Journal, 4(1), 35-45.
45- Rao M, Tanksala A, Ghatge M, Deshpande V.( 1998), Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiol Mol Biol Rev; 62(3): 597-635.
46- Ravikumar, S., Vikramathithan, J., & Srikumar, K. (2011). Purification and characterization of a novel thermostable xylose isomerase from Opuntia vulgaris mill. Applied biochemistry and biotechnology, 164(5), 593-603.
47- Saini, R., Saini, H. S., & Dahiya, A. (2017). Amylases: Characteristics and industrial applications. J. Pharmacogn. Phytochem, 6(4), 1865-1871.
48- Saitou, N., & Nei, M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular biology and evolution, 4(4), 406-425.
49- Sawant, R., & Nagendran, S. (2014). Protease: an enzyme with multiple industrial applications. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(6), 568-579.
50- Shields, P., & Cathcart, L. (2010). Oxidase test protocol.
51- Sooch, B. S., Kauldhar, B. S., & Puri, M. (2017). Types, Structure, Applications and Future Outlook. Microbial Enzyme Technology in Food Applications, 241.
52- Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S., (2007). MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology and evolution, 24(8), pp.1596-1599.
53- Wang, Q & Mei, Y., Sun, Y., He, J., Sun, Y., Shao, W. (2012). Genome sequences of Pseudomonas fragi strains A22 and B25.
Volume 35, Issue 2
June 2022
Pages 239-255
  • Receive Date: 15 December 2019
  • Revise Date: 02 August 2020
  • Accept Date: 28 September 2020
  • First Publish Date: 22 November 2020