Detection of Lung Cancer Cell-Derived Exosomes in Microfluidic Platform via Immunofluorescence

Document Type : Research Paper

Authors

1 Dept of Biophysics, Faculty of Biological sciences, Tarbiat Modares University

2 Dept of Biophysics, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University

3 professor

4 assistant Professor, Biophysics Group, Tarbiat Modares University

Abstract

: Lung cancer is the most killer cancer in both men and female, as the lung cancer mortality rate is higher than death by the next two breast and prostate cancers. Lung cancer treatment compared to breast cancer is almost unsatisfied, since the most of lung cancer cases are diagnosed at a stage of the disease where metastasis has occurred. The cause of late diagnosis in lung cancer is the similarity of signs and symptoms of cancer with pulmonary symptoms and lack of confidence approaches to identify it at early stage.
Nowadays, much attempt is paid to biomarkers such micro RNAs, exosomes, and tetraspanins that can give us information about intracellular events. Microfluidic as science is the study of fluid behavior, and as technology is the construction and use of the specific properties in these dimension which is evolving and entering various fields, from chemical synthesis and biological analysis to optics and even information technology. In this work, we designed and fabricated via UV lithography a microfluidic chip for lung cancer cell derived exosomes capture followed by detection by CD63/CD151-FITC antibodies. The capture exosomes then extracted from microfluidic chip and investigated by Atomic Force Microscopy, AFM, and Dynamic Light Scattering DLS. The average size of exosomes was measured 19-37 nm by DLS and 35-37 nm by AFM that are similar to each other.

Keywords

Main Subjects

آشکار سازی اگزوزم های مترشح از سلولهای سرطان ریه در بستر میکروفلویدیک به روش ایمونوفلورسانس

کوشا ایرانی، رویا کلاهچی، مسلم صدقی، حسین نادری منش و عبداله اله وردی*

ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه بیوفیزیک

تاریخ دریافت: 25/01/1399          تاریخ پذیرش: 06/08/1399

چکیده

سرطان ریه عامل بیشترین موارد مرگ و میر ناشی از سرطان در سراسر جهان است و هرساله منجر به مرگ میلیون­ها نفر در جهان می­شود ، بطوریکه آمار مرگ بعلت سرطان ریه از مجموع دو سرطان بعدی یعنی سرطان سینه و پروستات بیشتر است. نتیجه درمان در سرطان ریه در مقایسه با سرطان سینه و پروستات نامطلوب­تر است، زیرا اکثر بیماران مبتلا به سرطان ریه در مرحله­ای از بیماری تشخیص داده می­شوند که متاستاز رخ داده است. علت عدم تشخیص زود هنگام سرطان ریه، تشابه علایم و نشانه های سرطان با علایم بیماران ریوی و نبود روشی که بتوان آنرا در مراحل اولیه شناسایی کند. امروزه توجه زیادی به نشانگرهای زیستی نظیر میکروRNA ، اگزوزمها و تتراسپانین ها به عنوان بیومارکرهایی که می توان اطلاعاتی از وقایع داخل سلول بدست آورد شده است. در این تحقیق، ابتدا چیپ میکروفلویدیک طراحی و با روش لیتوگرافی نوری ساخته شد، سپس اگزوزم‌های مترشح از سلولهای سرطان ریه داخل چیپ  میکروفلویدیک  تثبیت شدند، سپس توسط آنتی بادی های CD63  و CD151 کنژوگه با FITC آشکار سازی شدند. اگزوزمهای تثبیت شده با این روش از چیپ استخراج و با میکروسکوپ نیروی اتمی و DLS مطالعه شدند.  متوسط سایز اگزوزمها بدست آمده توسط DLS، 19 تا 37 نانومتر بود. متوسط سایز اگزوزمها محاسبه شده توسط میکروسکوپ نیروی اتمی برابر 35-37 نانومتر است که با نتایج بدست آمده توسط  DLS مطابقت دارد.

واژه های کلیدی: سرطان ریه، میکروفلوییدیک، اگزوزوم، نشانگرهای مولکولی، آنتی بادی های CD 63 و CD151

* نویسنده مسئول، تلفن:  02182884749 ، پست الکترونیکی: a-allahverdi@modares.ac.ir

مقدمه

 

سرطان ریه یکی از شایعترین سرطان های شناخته شده است و هرساله تعداد زیادی از بیماران مبتلا به این سرطان به دلیل عدم تشخیص به موقع جان خود را از دست می‍دهند.. در حالی که اگر این بیماری در مراحل اولیه تشخیص داده شود در صد زنده ماندن مبتلایان به بیماری، به طور چشمگیری افزایش پیدا می­کند. روش­های تشخیصی  که در حال حاضر در ازمایشگاه­ها و مراکز درمانی استفاده می­شوند اغلب مبتنی بر تصویر برداری می باشند، به عبارت دیگر زمانی قادر به مشاهده تومور هستندکه قطر تومور به یک سانتی متر رسیده باشد و در این مرحله به احتمال زیاد تومور متاستاز داده  است[6],[9]. در اکثر موارد بالینی بیشترین ضایعات ایجاد شده در سرطان ریه در مراحل پیشرفته تشخیص داده می‍شود به همین دلیل پزشکان زمان لازم برای درمان بیمار را ندارند. بنابراین محققان سعی بر این دارند که با توسعه روش­های نوین و با تمرکز ویژه برنشانگرهای مولکولی  بر این مشکل غلبه کنند

در سلولها و موجودات زنده، اگزوزمها دو وظیفه بیولوژیکی را بر عهده دارند: حذف پروتین هایی که کارایی انها به اتمام رسیده و دیگری انتقال بیومولکولهای ویژه بین سلولها از طریق مایعات بیولوژیکی نظیر خون و پلاسما ]7[. مطالعات نشان داده که سلولهای سرطانی مقادیر بیشتری از وزیکولهای خارج سلولی آزاد می کنند که در فرایند تبدیل سلولهای غیر متاستاری به متاستازی نقش دارند]3[. مطالعات اخیرئنشان داده وزیکولهای خارج سلولیدکه توسط سلولهای سرطانی آزاد می شود محیط اطراف تومور را تغییر می دهند و در تبدیل سلولهای stromal به سولهای رگ ساز، پیش متاستازی یا سولولهای مهار کننده تومور نقش دارند ] 10[ .    اگزوزوم­های آزاد شده ازسلول سرطانی، بر سطح خود انبوهی از انتی ژن­های توموری دارند که از این انتی ژن­ها می­توان در تشخیص­های غیر تهاجمی و زود هنگام سرطان­  و همچنین نظارت بر روند درمان استفاده کرد.

در روشهای سنتی ، جداسازی اگزوزوم ها با استفاده از اولتراسانتریفیوژ انجام می­شود ولی این روش نمی­تواند اگزوزوم­ها را از سایر ساختارهای وزیکولی یا پروتیین­های  بهم چسبیده تمایز دهد. روش­های دیگر مانند وسترن بلات و سنجش­های ایمونولوژی، فرایندهای زمان­بری هستند که به مقدار زیادی از اگزوزوم جداشده از خون یا محیط کشت احتیاج دارند[9].

تحقیقات بر روی جداسازی اگزووزم­ها از طریق روشهای مبتنی بر میکروفلوییدیک از سال 2010 تا کنون انجام شده است و مزایای خود را مانند حجم کم نمونه­ی مصرفی، هزینه کم و زمان کارکرد کوتاه را به اثبات رسانده است. تکنیک­های میکروفلوییدیکی که تا کنون برای جداسازی اگزوزوم ها استفاده شده است به دو دسته طبقه بندی می­شوند: روش­های جداسازی  مبتنی بر اندازه وزیکولها و روش­های جداسازی مبتنی بر بیو مارکرهای سطحی.

استفاده از روش­های ایمنی سنجی برای جداسازی اگزوزوم­ها، ازدیگر  روش­ها مطمئن ­تر است زیرا در سایر روش­های جداسازی  عواملی نظیراندازه، غلظت و... باعث افزایش خطا شده بعلاوه واکنش انتی بادی- انتی ژن کاملا اختصاصی است.[2]. Zhao  و همکاران با استفاده از چیپ میکروفلویدیک، آنتی بادی  EpCAM ، CA125 ، CD9 ، CD81 و CD63 تثبیت کردند و از پلاسمای افراد مبتلا به سرطان تخمدان بعنوان منبع اگزوزم استفاده کردند. نتایج نشان داده در افراد مبتلا به سرطان تخمدان، اگزوزمهای حاوی آنتی بادی های فوق الذکر نسبت به افراد سالم افزایش قابل ملاحظه پیدا می کنند] 9[ . He و همکاران با استفاده از آنتی بادی تومور ( EpCAM  و CA125 ) و مارکرهای اگزوزومی ( CD63  ، CD81 و CD9 ) که بر روی کانالهای میکروفلویدیک ساخته شده از PDMS تثبیت شده بود توانسته اگزوزومهای مترشح از سلولهای سرطان ریه غیر کوچک را تثبیت کرده، سپس با استفاده از بافر لیز کننده تخریب و پروتین های سطحی اگزوزم را تعیین کنند. ] 4[.

در اینجا ما با طراحی و ساخت یک تراشه   میکروفلوییدیکی که قابلیت جداسازی اگزوزوم­ها را دارد روش جدیدی برای تشخیص زود هنگام سرطان ریه را ارائه می دهیم.  این تراشه میکروفلوییدیکی از طریق انتی بادی­هایی که بر روی سطحش تثبیت می­شود، اگزوزوم های موجود در محیط کشت وپلاسما را به دام می­اندازد و با نشانگرهای فلورسانس کنژوگه شده با آنتی بادی قابل رویت می گردد.

مواد و روشها

ساخت تراشه میکروفلوییدیک: از طرح تراشه میکروفلوییدیک طراحی شده در مطالعه قبل  استفاده شد. طرح مورد نظر بر روی سیلیکون با استفاده از روش لیتوگرافی نوری بوسیله ی تایش نور  UV بر روی فتورزیست SU-8 مدل 2050 ساخته شد] 5[ . اساس طراحی این الگو بر مبنای جریان حداکثری در وسط کانال است و کناره های کانال جزیان کند می شود و  جریان حداقلی داخل اشکال ذوزنقه ایی تعبیه شده برقرار می باشد. جهت شبیه سازی جربان داخل کانال از نرم افزار Comsol Multiphysics  نسخه 5.5 استفاده شد. تراشه مورد نظر به عنوان مستر چیپ در نظر گرفته می شود و  از پلی مر Polydimethylsiloxane (PDMS)، جهت کپی برداری استفاده گردید. بدین ترتیب  از ترکیبی با نسبت  10:1 وزنی از پلی ­مر  PDMSو Curing agent استفاده شده، پس از مخلوط کردن پلیمر، آن را روی مستر چیپ سیلیکونی ریخته، حباب زدایی توسط دسیکاتور خلا بمدت 30 دقیقه انجام شده، سپس ان را جهت پلیمر شدن به مدت یک شب در دمای 65 درجه سانتیگراد قرار داده  شد. بعد از مدت زمان مذکور، هنگامیکه   PDMS  کاملا پلیمریزه  شد آن را از روی تراشه سیلیکونی جدا  کرده،   سپس محل ورود و خروج نمونه (reservoir) بر روی  تراشه PDMS سوراخ گردید.  در مرحله بعد، تراشه   PDMSو اسلاید شیشه ای جهت ایجاد گروه های هیدروفیل در داخل دستگاه Harrick plasma cleaner به مدت 45 ثانیه در مد Hi  قرار داده شد و سپس تراشه PDMS بر روی اسلاید شیشه ای قرار گرفته و با قرار دادن دردمای 95 درجه به مدت زمان 2 دقیقه  باعث تشکیل پیوند کوالانسی و اتصال محکم و دائمی شد.  تراشه مستر چیپ قابلیت  استفاده مکرر  جهت تهیه کپی باPDMS  را دارد.

استخراج اگزوزم از سلولهای سرطان ریه: از رده سلولی A549 (لاین سلول سرطانی ریه) برای کشت سلولی استفاده گردید. دو روش پیشنهاد شده برای استخراج اگزوزوم موجود بود که در روش اول مایع رویی سلول های کشت داده شده جدا شد و به مدت 10 دقیقه با دور 14000 دور/ دقیقه، سانتریفیوژ گردید و سپس محیط فوقانی  از فیلتر 2/0 میکرومتر عبور ­داده شد. در روش دوم  به منظور تهیه اگزوزم خالص از اولتراسانتریفیوژ با دور بالا استفاده شد.  جهت این امر ابتدا محیط رویی سلول های کشت داده شده را پس از سانتریفیوژ در مرحله قبل ( 14000 دور / دقیقه) را به مدت ۹۰ دقیقه با دور   g  ۱۰۰۰۰۰  و دمای ۴ درجه سانتیگراد اولتراسانتریفیوژ کرده و سوپرناتانت را دور ریخته و رسوب ته نشین شده را  که اگزوزم خالص می باشد در بافر PBS حل کرده و تا زمان مصرف در یخ ( حدود صفر درجه سانتیگراد)  قرار می گیرد .

تعیین اندازه ذرات با استفاده از پراکندگی نور دینامیکی (DLS): پراکندگی نور دینامیکی روشی فیزیکی است که برای تعیین توزیع ذرات موجود در محلول ها و سوسپانسیون استفاده می شود. این روش غیرمخرب و سریع برای تعیین اندازه ذرات در محدوده چند نانومتر تا میکرون به کار می رود. در این روش، از روی حرکت براونی ذرات در فاز سیال می توان توزیع ابعاد ذرات در یک محلول را مشخص کرد. این دستگاه برای تعیین توزیع اندازه ذرات، حرکت براونی ذرات مورد آزمایش را اندازه‌گیری می‌کند. اندازه‌گیری حرکت براونی ذرات بوسیله محاسبه میزان نوسانات در شدت پرتوهای نور متفرق شده توسط ذرات تعیین می‌گردد. این دستگاه از روی تغییرات الگوی نقطه‌ای که به صورت کم‌نور شدن و پر‌نور شدن نقاط تیره و روشن است، می‌تواند تغییرات شدت پرتوهای نور متفرق شده توسط ذرات را محاسبه کند که تعیین شدت تفرق پرتوهای نور، به اندازه‌گیری حرکت براونی ذرات منتهی می‌شود. سرعت حرکت براونی ذرات با اندازه آنها در ارتباط است (‌معادله استوک – انیشتین)، به‌طوری‌که حرکت براونی ذرات بزرگ‌تر، آرام‌تر از حرکت براونی ذرات کوچک‌تر است. پس هر چه ذراتی که مورد آزمایش قرار می‌گیرند بزرگ‌تر باشند، شدت نوسانات و یا تغییرات الگوی نقطه‌ای آنها نیز آرام‌تر است و در نتیجه شیب نمودار نزولی همبستگی در این ذرات در محدوده زمانی مشخص، با شیب کند‌تری سقوط می‌کند. با استفاده از الگوریتم‌های بدست آمده از نرخ شیب نزولی نمودار همبستگی، این دستگاه می‌تواند توزیع اندازه ذرات مورد آزمایش را بر حسب شدت نور متفرق شده از ذرات ارائه دهد.

جهت تعیین سایز اگزوزمها به روش پراکندگی نور دینامیکی ، حدود ۱ میلی لیتر از نمونه اگزوزم خالص شده را  را در کووت دستگاه ریخته و داده ها توسط  دستگاه زتا سایزر برند Malvern  بدست آمد.

نشان دار کردن اگزوزم: جهت اطمینان از وجود اگزوزم مترشح از سلول سرطان ریه ( A549)  به اگزوزم خالص بدست آمده از مرحله قبل،  3 میکرولیتر از  انتی بادی با غلظت mg.mL-1 1000/1 اختصاصی (CD151) کنژوگه با FITC،  اضافه  گردید. اتصال انتی بادی با میکروسکوپ فورسانس Olympus IX81 تصویر برداری شد[4].

بررسی مورفولوژی اگزوزوم ها با میکروسکوپ نیروی اتمی (Atomic force microscopy= AFM): میکروسکوپ نیروی اتمی پرکاربردترین میکروسکوپ روبشی است. به کمک ان می توان توپوگرافی سطح (تصویر سه بعدی )، زبری سطح، تصویر فاز، تصویر اصطکاک، خواص مغناطیسی و ضخامت تک لایه را مورد بررسی دقیق قرار داد. این میکروسکوپ از یک پروب کانتی لیور (Cantilever) که یک نوک سوزنی مخصوص دارد برای ارزیابی سطح استفاده می کند که معمولا از جنس سیلیکون است. نوک سوزنی سطح نمونه را روبش می­کند. در این دستگاه از نور لیزر استفاده می­شود. باریکه لیزر به صورت مداوم به کانتی لیور در حال روبش برخورد کرده و کوچک ترین انحراف پرتو در حال تابش که متاثر از حرکت روبشی کانتی لیور است توسط یک اشکارساز تجزیه و تحلیل می­شود.

جهت اماده سازی لام جهت عکسبرداری با میکروسکوپ AFM ، لام مورد نظر با استون شست و شو داده شد و پس از خشک شدن در دمای 60 درجه ، مقدار 50-70 میکرولیتر از مایع  اگزوزم بعد  از اولترا سانتریفیوژ   روی لام ریخته شد. این لام به مدت 1-2 ساعت در دمای اتاق جهت خشک شدن قرار گرفت و سپس با میکروسکوپ نیروی اتمی Nanosurf Bio-AFM Swiss  مورد مطالعه قرار گرفت.

تثبیت لینکر، انتی بادی در کانالهای میکروفلویدیک: سطحی PDMS  جهت اتصال آنتی بادی باید بهینه و آماده شود. از آنجایی که پلیمر  PDMS  آب گریز است ابندا باید  توسط پلاسما گروهای هیدروفیل –OH در سطح اولین مرحله، تثبیت لینکر Glycidyloxypropyl trimethoxysilane (GPTMS)  می باشد که بر روی سطح PDMS انجام گرفت.  بدین منظور غلظت  2% از لینکر در متانول را اماده کرده و در کانال میکروفلویدیک ساخته شده از  PDMSتزریق گردبد و به مدت 2 الی 3 ساعت در دمای 60 درجه سانتیگراد با جریان آهسته که بوسیله پمپ سرنگی ایجاد می شود بصورت جریان بسته به حرکت دراورده شد تا لینکرها با سطح، اتصال مناسب را برقرار کنند. گروه­های اپوکسی در لینکر بستر مناسبی را برای اتصال انتی بادی (CD63-FITC)  فراهم می­کنند.  پس از مدت زمان مناسب، کانال میکروفلویدیک مورد نظر با متانول شست وشو داده و تحت گاز  نیتروژن خشک گردید، سپس انتی بادی اول (CD63-FITC) اضافه شد. غلظت مناسب انتی بادی mg.mL-1 1000/1 می باشد. این غلظت را تهیه کرده و به ورودی چیپ 100 میکرولیتر از انتی بادی­ اضافه نموده و به مدت  حداقل 2 ساعت در دمای محیط با جریان مشخص به حرکت دراورده شد. بعد ازگذشت زمان فوق الذکر جهت اتصال انتی بادی­، ان را با بافرPBS شست وشو ­داده تا اتصالات غیر اختصاصی از بین برود. در مرحله ی بعد ۱۰۰ میکرولیتر از اگزوزوم خالص شده را به آرامی وارد چیپ کرده و حدود 1 ساعت بدون حرکت اجازه داده می شود اتصال بین بیومارکر موجود در اگزوزم و آنتی بادی برقرار شود. سپس کانال با بافر شستشو داده شد و با میکروسکوپ فلورسنت  Olympus IX81 کانالها بررسی و مطالعه شدند. لازم به ذکر است CD63 مارکر عمومی است که روی همه اگزوزم های انسانی ( چه سالم و چه اگزوزمی ) وجود دارد. در ادامه جهت شناسایی مارکر اختصاصی سرطان ریه که CD151 است و در 98% سلولها و اگزوزمهای سرطان ریه بیان می شود از آنتی بادی  CD151-FITC استفاده شد. جهت این امر، کلیه مراحل فوق نظیر فعال کردن سطح با پلاسما، عامل دار کردن با لینکر GPTMS، خشک کردن با گاز نیتروژن انجام شد و در مرحله آخر از آنتی بادی CD151-FITC استفاده شد و وجود یا عدم وجود اگزوزم حاوی مارکر سرطانی با میکروسکوپ فلورسنت Olympus IX81  مورد بررسی قرار گرفت.  به این صورت که چیپ مورد استفاده را زیر میکروسکوپ قرار داده و نقاط رنگی که نشان دهنده ی محل هایی است که آنتی بادی متصل شده است بررسی شدند.

نتایج

الگوی طرح میکروفلویدیک: الگوی طرح میکروفلویدیک بر مبنای سادگی جهت ساخت و دست ورزی است . بدین معنی که یک ورودی و یک خروجی داشته و جهت افزایش نسبت سطح به حجم اشکال ذوزنقه ایی تعبیه شد تا سرعت جریان در این اشکال به حداقل رسیده و مناطق مرده ( Dead zone) تشکیل گردد. این طرح میکروفلویدیک در مطالعه قبلی نیز استفاده شده ] 5 [ و در شکل 1 الف نشان داده شده است.  طول میکروکانال 40000 میکرومتر در نظر گرفته شد، عرض کانال 40 میکرومتر و ارتفاع 50 میکرومتر در نظر گرفته شد. الگوی کانال با نرم افزار Adobe Illustrator CC2014 ترسیم شد و ماسک مورد نظر از شرکت انتشارات رسا تهیه شد.

معادلات حاکم در جریان کانال­ها با استفاده از نرم افزار کامسول مولتی فیزیک نسخه 5.5 شبیه سازی شد. به خاطر تقارن هندسه کانال شبیه سازی به صورت دو بعدی صورت گرفت. هندسه مدل شده عبارت است از کانالی با عرض 40 میکرو متر با خانه­هایی ذوزنقه شکل به صورت یک در میان، در چپ و راست کانال ایجاد شده است. فاصله هر ذوزنقه از کناری 150 میکرومتر می باشد. جریان به صورت جریان لامینار تک فازی شبیه سازی شد و با توجه به رقیق بودن برای شبیه سازی از ویژگی­های فیزیکی آب در دمای اتاق استفاده شد.الگوی طرح مورد نظر در شکل 1- الف،  پروفایل جریان  سیال در کانال در شکل 1 – ب، و پروفایل خطوط جریان در کانال در شکل 1- ج نشان داده شده است.

 

شکل 1- الف الگوی طرح استفاده شده، 1-ب نتایج شبیه سازی.   پروفایل جریان در کانال، 1- ج نتایج شبیه سازی.خطوط جریان را نشان می دهد

اندازه گیری سایز اگزوزم: پراکندگی دینامیکی نور یکی از روشهای دقیق، سریع، تکرارپذیر و نسبتا کم هزینه در اندازه گیری شعاع هیدرودینامیکی و سایر مشخصه های دینامیکی نانوذرات معلق در یک مایع است]8[. سایز اگزوزوم­ها توسط بررسی تفرق دینامیکی نور ( DLS) ارزیابی شد. سنجش توزیع تعداد توسط DLS پیک حدودا.۳۵.نانومتر را برای جمعیت اگزوزوم­های استخراج شده نشان می­دهد.

 

 

شکل 2 - نمودار سنجش اندازه اگزوزوم ها توسطDLS توزیع سایز زنگوله­ای شکل با پیک ذراتی با سایز حدودا 37 نانومتر را نشان می­دهد.

 

 

همانطور که در شکل ۲ مشخص است بازه ی تغییرات سایز ذرات موجود در نمونه محدود بوده و پیک حدودا.۳۵.نانومتر را برای جمعیت اگزوزوم­های استخراج شده نشان می­دهد که نشان دهنده ی کارایی چیپ و استخراج اگزوزوم به صورت خالص است.

تصویربرداری اگزوزم با میکروسکوپ نیروی اتمی: تصاویر بدست امده از میکروسکوپ نیروی اتمی، اگزوزوم­های با اندازه­های مختلف را نشان می­دهد. شکل3-الف تصویر دو بعدی از اگزوزوم­ها را نشان می­دهد که بزرگترین اگزوزومی که در تصویر مشاهده می­شود قطر144 نانومتر دارد و کوچکترین اگزوزوم با قطر 19 نانومتر می­باشد و بیشترین تراکم اگزوزمها، قطر 37 نانومتر را نشان می دهند.  شکل 3-ب تصویر سه بعدی از اگزوزوم­ها می­باشد که پستی­ها و بلندی­ها به وضوح مشخص است، شکل 3-ج اندازه دقیق متوسط اگزوزم ها سایزی برابر 35-37 نانومتر را نشان میدهد.

اطلاعات تصاویر بدست آمده از میکروسکوپ نیروی اتمی به صورت خلاصه در جدول 1 نمایش داده شده است :

 

جدول1 - مشخصات تصاویر میکروسکوپ نیروی اتمی

788 nm

Image size

1

780 ms

Time/line

2

512

Point/line

3

70%

Set point

4

160.086 kHz

Vibration freq.

5

500 mV

Vibration ampl

6

Non-contact

Operating mode

7

Tap 190AI-G

Cantilever type

8

 

 

 

 

شکل3- الف  تصویر دوبعدی گرفته شده با میکروسکوپ نیروی اتمی  از اگزوزوم های تثبیت شده بر روی لام ، 3-ب  تصویر سه بعدی از اگزوزوم های تثبیت شده یر روی لام، 3-ج سایز دقیق  متوسط اگزوم ها

 

تثبیت لینکر، انتی بادی در کانالهای میکروفلویدیک: در حالت طبیعی، سطح PDMS به علت گروه هیدروفوب CH3 تمایلی به اتصال به لینکر ندارد. اکسیداسیون سطح PDMS در فرایند  پلاسما برخی از گروه­های متیل را حذف نموده و موجب ایجاد انتهای سیلانول(SiOH) بر سطح آن شده و در حقیقت ستون PDMS حاوی گروه های هیدروکسیل می­شود. سطح اکسید شده PDMS وارد تماس متقابل با شیشه شده و یک اتصال محکم و غیر قابل برگشت با آن ایجاد می­کند. همچنین این تغییر PDMS را قابل اتصال با لینکر هایی از جنس سیلان نظیر GPTMS می کند. این ترکیبات از یک طرف با گروه های –OH ایجاد شده (توسط پلاسما) در PDMS متصل می شود و از طرف دیگر با داشتن گروههای اپوکسی به گروهای –NH2 آنتی بادیها متصل می شود. حلال اصلی سیلانها تولوئن می باشد. از آنجایی که تولوئن باعث خوردگی و نهایتا بسته شدن کانال‌های میکروفلویدیک می شود حلالهای مختلفی مورد بررسی قرار گرفتند و در نهایت متانول انتخاب شد. چگونگی این فرایند در شکل 4 نشان داده شده است.

 

شکل 4- نحوه اتصال لینکر به PDMS و انتی بادی - ساختار شیمیایی لینکرGPTMS

 

بررسی اتصال انتی بادی های CD63  و CD151  به اگزوزوم ها ی مترشح از سلولهای سرطان ریه: فلوروسانس یکی از روش های متداول در تصویر برداری زیست شناختی است. میکروسکوپ فلوروسانس به میکروسکوپی اطلاق می­شود که در ان برای ایجاد یک تصویر از خاصیت فلوروسانس استفاده شود. در پدیده فلوروسانس مولکول، یک فوتون با طول موج خاص را جذب و سپس ان را با طول موج بلندتری منتشر می­کند. بنابراین نور متفرق شده از سطح سلول را می توان از نور تابیده شده به سلول تفکیک کرد.

جهت اطمینان از اتصال مارکر اگزومی ( CD63) و مارکر اختصاصی سرطان ریه ( CD151 )، دو مرحله آزمایش انجام شد که در مرحله اول ۱ میکروایتر از آنتی بادی CD63 در کنار رنگ DPH به محیط حاوی اگزوزوم اضافه شد و در مرحله دوم 1 میکرولیتر از آنتی بادی های مربوطه را به حدود 70 میکرولیتر محیط اضافه شده و بلافاطه با میکروسکوپ فلورسانس مطالعه می گردد. شکل 5 اگزوزوم‌ها در حضور انتی بادی های نامبرده و همچنین بدون آنتی بادی به عنوان کنترل نشان داده شده است.

 

 

شکل 5 - نتایج اتصال انتی بادی CD 63  و DPH( الف)،  CD151 ( ب)  و کنترل بدون آنتی بادی ( ج ) به اگزوزوم های مترشح شده از سلولهای A549  سرطان ریه

 

تثبیت و آشکار سازی  اگزوزوم ها در کانال های تراشه: پس از تثبیت لینکر  GPTMS به پلی مر PDMS  ( شکل 4)، انتهای اپوکسی لینکر به گروه آمین آنتی بادی متصل می شود. بنابراین آنتی بادی که از طریق گروه آمین به پلیمر متصل است می تواند از طریق مارکرهای موجود در سطح اگزوزم به آن ها متصل شود. آنتی بادی مورد استفاده دارای نشانگر FITC می باشد که در حضور نور UV به رنگ سبز دیده می شود.  فرآیند میکروفلوییدیک بر طبق پرتوکل انجام گردید و تصاویر زیر بیانگر اتصال اگزوزوم با آنتی بادی ها در داخل تراشه است که با میکروسکوپ فلورسنت تصویربرداری شده است:  ( شکل 6)

 

شکل6 - نتایج   تثبیت و مشاهده اگزوزم توسط آنتی بادی CD63  و CD151    ( الف)  و کنترل ( ب)

 

بطور خلاصه، روشهای موجود تشخیص سرطان غالبا شامل بیوپسی بافت سرطانی و تکنیک های بر پایه پردازش تصاویر است.  پژوهش جهت یافتن نشانگرهای غیر تهاجمی در مایعات بدن  به منظور تشخیص تومور، یکی از زمینه­های  تحقیقاتی رو به رشد در تحقیقات سرطان است. یکی از این نشانگرهای موجود، اگزوزم های مترشح از سلولهای سرطانی می باشد. هدف ما از این مطالعه توسعه روشی مبتی بر میکروفلویدیک تا بتوان اگزوزم های مترشح از سلولهای سرطانی را بتوان با استفاده از آنتی بادی بر علیه بیومارکرهای اختصاصی اگزوزمها در کانالهای میکروفلویدیک تثبیت کرد و با استفاده از رنگهای فلورسانس – کنژوگه شده با انتی بادی زیر میکروسکوپ مشاهده کرد. نتایج نشان می­دهد اگزوزمها بخوبی توانستند به اطراف کانالها ( که در آن قسمت سرعت جریان کمتر بوده و فرصت اتصال بیشتر است ) متصل شده و با آنتی بادی کنژوگه شده با FITC مشاهده گردد.

بحث

سرطان ریه به عنوان یکی از کشنده ترین نوع سرطان در جهان، سالانه میلیونها نفر از زنان و مردان را به کام می کشاند. مشخصه اصلی این نوع سرطان، رشد کنترل نشده سلولها در بافت ریه است. اگر این بیماری درمان نشود، سلولهای سرطانی می تواند طی فرایند متاستاز به بیرون از ریه گسترش یابد و کل بدن را درگیر سرطان کند. اصلی ترین علت مرگ در سرطان، تشخیص دیرهنگام می باشد، به عبارت دیگر هنگامی سرطان ریه تشخیص داده می شود که متاستاز اتفاق افتاده باشد و علت تشخیص دیرهنگام این نوع سرطان، تشابه علایم سرطان ریه و بیماری های ریوی، تهاجمی بودن روشهای تشخیص، نبود روشی که بتواند این نوع سرطان را در مراحل اولیه تشخیص دهد. اگزوزومها وزیکولهای حباب شکل اندوژنیک هستند که از جوانه زدن در تقسیم اندوزوم در طول بلوغ اندوزوم، از انذوزوم اولیه تا ثانویه به شکل ، وزیکولهای چندتایی تشکیل میشوند. اگزوزومها از انواع مختلف پروتئینها تشکیل شده است مانند پروتئینهای اصلی سازگاری هیستولوژیک CD ،اینتگرین، MHC -II ، تتراسپانینها، پروتئین شوک حرارتی (Hsp)، پروتئین مرتبط با Ras( Rab )و غیره. حاوی انواع مختلف چربی، مانند اسفنگومیلین و کلسترول است. در نهایت، اگزوزومها حاوی اسید نوکلئیک هستند، از جمله miRNA ،mRNA  و ncRNA ها. اگزوزوم ها دیدگاه جدیدی را نسبت به زیست شناسی سرطان با هر دو مفاهیم تشخیصی و ارزیابی درمان ارائه می دهند. به دلیل ارتباط سلول به سلول،اگزوزوم ها پیشرفت ، متاستاز، و اثر بخشی درمانی تومور را تحت تاثیر قرار می دهند. آنها را می توان از خون و سایر مایعات بدن برای تعیین فرآیندهای بیماری که در بدن رخ می دهند، از جمله رشد سرطان،  جدا سازی کرد.  همچنانکه عنوان شد، اگزوزمها همزمان با شروع سرطان در مایعات بدن افزایش می یابد و چنانکه بتوان با روشهای ساده اگزوزمهایی که مارکرهای سرطانی را دارند بتوان در خون نشان داد می توان پی به وجود کانونی در سرطان برد که گام مهمی در تشخیص و درمان سرطان می باشد. مارکر CD63  مارکر اگزومی است که روی همه اگزوزمها وجود دارد و مارکر CD151 ماکر سرطان ریه است که از سولولهای سرطانی نشات می گیرد و بر روی 98% اگزوزمها وجود دارد.

در این تحقیق، از بستر میکروفلویدیک ( به عنوان روشی سریع، قابل کنترل، با مصرف بسیار کمتر مواد و نمونه) جهت تثبیت و آشکار سازی اگزومها مترشح از سلولهای سرطانی A549 به عنوان سلولهای اصلی سرطان ریه استفاده شد. استفاده از تراشه های  میکروفلویدیک باعث افزایش سرعت و کاهش مصرف مواد شده و همچنین می توان تعداد کمتری  اگزوزم را نیز مشاهده کرد. این امر در اوایل سرطان که میزان اگزوزم های حاوی مارکرهای سرطانی  انتشار یافته بسیار کم است بسیار اهمیت دارد. جهت اتصال آنتی بادی بر روی بستر کانالهای میکروفلویدیک که از PDMS تشکیل شده از یک سیلان به نام (3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane (GPTMS)  استفاده شد. شبیه سازی کامسول به خوبی نشان داد، جریان در اشکال ذوزنقه ایی تعبیه شده در کانالهای میکروفلویدیک، به شدت کاهش یافت و سیلان فرصت کافی جهت اتصال شیمیایی با PDMS را با بستر پیدا کرد. از آنجایی که هر مولکول آنتی بادی به یک مولکول FITC متصل شده است، هر چه شدت نور فلورسانس نشر شده ( در محدوده سبز) بیشتر باشد نشان دهنده بیشتر بودن میزان آنتی بادی متصل شده و در نتیجه بیشتر بودن میزان اگزوزم می باشد.  در این تحقیق، روشی ساده، سریع  و قابل تکرار در بستر میکروفلویدیک پایه گذاری شده که می تواند اگزوزمهای مترشح از سلولهای سرطان ریه را تثبت و آشکار کند.

در تحقیقات بعدی، نمونه های بیولوژیک ( حاصل از سرم خون افراد بیمار) مورد بررسی قرار خواهد گرفت . با استفاده از دستگاه Nano Particle Tracking Analyzer “NTA” به نام آنالیز دریابی نانوذرات که به تازگی توسط دانشگاه زاهدان خریداری شده  می توان تعداد اگزوزم را در واحد حجم تعیین کرد. در اینصورت می توان تعداد مشخصی از اگزوزم را داخل تراشه وارد کرده و تصاویر حاصل را با نرم افزار های پردازش آنالیز  و با کنترل مقایسه کرد و بصورت کمی بیان کرد..

تشکر و قدردانی

بدینوسیله مولفین از صندوق حمایت از پژوهشگران
(INSF) بخاطر گرنت شماره 96006759 و دانشگاه تربیت مدرس بخاطر گرنت هسته پژوهشی IG-39708  تشکر می‍کنند.

1- B. J. Berne, R. Pecora, Dynamic Light Scattering: With Applications to Chemistry, Biology, and Physics, Dover, 2000. [3] R. Pecora, Dynamic Light Scattering. Plenum, New York, 1985
2- Fang, S., et al., Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS one, 2017. 12(4): p. 175050
3- Griffiths, S.G., Cormier M.T., Clayton A., Differential proteome analysis of extracellular vesicles from lung cancer cell lines by chaperone affinity enrichment. Proteomes 2017, 5, 25
4- He, M., Crow J., Roth M., Zeng Y., Godwin AK. Integrated immunoisilation and protein analysis of circulating exosomes using microfluidic technology. Lab-on-a-chip 2014, 14, 3773-3780
5- Keshavarz, E.,  Allahverdi, A., Sedghi, M., Naderi, A., Koohkan, F. and Naderi-Manesh, H.,    Surface modification in microfluidic platform to miR-21 and miR-486 detection from lung cancer cell.   Cell and Molecular Research Journal:  Accepted.
6- Lianidou, E. and C. Alix-Panabières, Early detection of lung cancer based on DNA methylation analysis in sputum and plasma. Translational Cancer Research, 2017. 6(1): p. S51-S53
7- Raposo G., Stoovogel W., Extracellular vesicle: exosomes, microvesicle, and friends. J. Cell. Bio. 2013, 200, 373-383
8- Sandfeld-Paulsen, B., et al., Exosomal proteins as diagnostic biomarkers in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology, 2016. 11(10): p. 1701-1710.
9- Zhao, Z., Yang Y., Zeng Y., He M.,  A microfluidic ExoSearch chip for multiplexed exosome detection towards blood-based ovarian cancer diagnosis. Lab on a Chip, 2016. 16(3): p. 489-496.
10- Webber J.P, Spary L.K., Sanders A.J, Chowdhury R., Jiang WC., Steadman R., Wymant J., Jones A.T., Kynaston H., Mason M.D. Differentiation of tumo – promoting stromal myofibroblast by cancer exosomes. Oncogene 2015. 34, 290-302
Volume 35, Issue 2
June 2022
Pages 225-238
  • Receive Date: 13 April 2020
  • Revise Date: 28 September 2020
  • Accept Date: 27 October 2020
  • First Publish Date: 18 November 2020