Design, Cloning, expression and purification of mutated Histatin3 and investigation of its antimicrobial effects

Document Type : Research Paper

Authors

1 Department of Genetics, Faculty of Science, Shahrekord University, Shahrekord- Iran

2 1Department of biology, Faculty of Science, Shahrekord University, Shahrekord- Iran

3 Department of biology, faculty of basic sciences, Shahrekord University, Shahrekord ,Iran

Abstract

Antimicrobial peptides are desirable targets as new antibiotics. Histatin peptides belong to a family of antimicrobial peptides that are rich in histidine amino acids. Human histatin 3 functionally has both antimicrobial and wound healing properties. In this study, the mutation design of histatin 3 peptide were performed. Then, in order to produce this peptide on a laboratory scale, its sequencing followed by Sumo fusion peptide in E.coli was cloned and expressed and then purified by Ni++ affinity chromatography technique and the results were analyzed by SDS-PAGE technique. The results of its microbiological tests (MIC) indicate the value of this peptide, which is effective on gram positive bacteria such as Staphylococcus aureus. According to this research, the antimicrobial activity of this peptide and the possibility of its production, it is hoped to use this peptide in the pharmaceutical and medical industries as new antibiotics or in addition to traditional antibiotics to increase their efficiency.

Keywords

Main Subjects

طراحی،کلونینگ، بیان و خالص سازی پپتید هیستاتین 3 جهش یافته و بررسی اثرات ضد میکروبی آن

زهرا توکلی1، بهناز صفار2،3*، کریم مهنام4 و روح‌الله همتی4و2

1 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم پایه، گروه سلولی و مولکولی

2 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، پژوهشکده زیست فناوری

3 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم، گروه ژنتیک

4 ایران، شهرکرد، دانشگاه شهرکرد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 16/05/1398          تاریخ پذیرش: 24/02/1399

چکیده

پپتیدهای ضدمیکروبی اهداف مطلوبی بعنوان آنتی‌بیوتیک‌های جدید هستند. پپتیدهای هیستاتین،‌ پپتیدهای غنی از  اسید آمینه هیستیدین هستند که به یک خانواده از پپتیدهای ضد میکروبی تعلق دارند. هیستاتین 3 انسانی، از نظر عملکردی هم خاصیت ضدمیکروبی و هم خاصیت التیام زخم دارد. در این پژوهش، طراحی جهش پپتید هیستاتین3 انجام شد. سپس بمنظور‌ تولید این پپتید در مقیاس آزمایشگاهی، توالی ژنی آن به‌همراه پپتید الحاقی سومو در باکتری E.coli  همسانه سازی و بیان شد و پس از آن توسط تکنیک‌ کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل خالص گردید و نتایج آن با تکنیک SDS-PAGE بررسی شد. نتایج آزمون‌‌های میکروبی آن (آزمون سنجش MIC)، نشان‌دهنده ارزش این پپتید بوده که برروی باکتری‌ گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس که جز پاتوژن‌های بیمارستانی مقاوم به دارو می‌باشد، تاثیرگذار است. با توجه به پژوهش انجام شده، فعالیت ضدمیکروبی این پپتید و امکان تولید آن، امید است که از این پپتید در صنایع دارویی و پزشکی، ‌بعنوان آنتی‌بیوتیک جدید یا درکنار آنتی‌بیوتیک‌های سنتی برای افزایش کارایی آن‌ها، بهره گرفت.

واژه های کلیدی: پپتیدهای ضدمیکروبی، هیستاتین 3 جهش یافته، کلون و بیان، خالص سازی، خواص ضد میکروبی

* نویسنده مسئول: تلفن: 03832324419 ، پست الکترونیکی: saffar_b@sku.ac.ir

مقدمه

 

پپتیدهای ضدمیکروبی (AMPs)، اجزای سیستم ایمنی ذاتی هستند و اولین خط دفاعی علیه پاتوژن‌های مهاجم را در بسیاری از ارگانیسم‌ها تشکیل می‌دهند. این پپتیدها، ملکولهای دوگانه دوستی (آمفی‌پاتیک) هستند که دارای خصوصیات ضد میکروبی می‌باشند، بهمین دلیل به آنها آنتی‌بیوتیک‌های طبیعی گفته می شود (22).

هیستاتین‌ها یک خانواده از پپتیدهای ضدمیکروبی موجود در بزاق انسان و سایر پریمات‌ها هستند. هیستاتین‌ها پپتیدهای غنی از هیستیدین بوده که  تعداد آمینواسیدهای تشکیل دهنده آنها از 7 تا 38 متغییر است و با  غلظتی حدود 425-50 میکرومولار توسط غدد بناگوشی، زیرفکی و زیر زبانی ترشح می‌شوند. این پپتیدها همگی ترکیب آمینواسیدی مشابهی دارند و بنابراین احتمالاً حاصل شکست پروتئولیتیک یک پیش‌ساز بزرگتر بوده‌اند. براساس خصوصیات شیمیایی و توالی آمینواسیدی, پپتیدهای متنوعی از هیستاتین‌ها وجود دارد (12نوع پپتید هیستاتین) که همه آنها از دو جایگاه ژنی بر روی باند 13 بازوی بلند کروموزوم 4 انسانی، منشاء می‌گیرند. رایج ترین هیستاتین‌های طبیعی یافت شده در بزاق عبارتند از: هیستاتین 1 (دارای 38 آمینواسید و وزن ملکولی  تقریبا 4929 دالتون که در رزیدوی سرین-2 فسفریله است), هیستاتین 3 (دارای 32 آمینو اسید و وزن ملکولی 4063 دالتون) و هیستاتین 5 (دارای 24 آمینو اسید و وزن ملکولی 3037 دالتون). هیستاتین 1 و هیستاتین 3 محصول دو ژن his1 و his2 بوده و سایر هیستاتین‌ها محصول هضم پروتئولیتیکی آنها هستند (شکل 1). ساختار هیستاتین‌ها، بویژه هیستاتین 3 و 5، به گونه‌ای است که  دارای ساختار  مارپیچی در محیط آبگریز و ساختار رندوم کویل در محیط آبی هستند(15).

 

 

شکل 1- شمایی از ژن کدکننده هیستاتین‌ 3 بزاق انسان (15).

 

هیستاتین‌ها اولین بار در 1973 توسط هولبروک و همکارش، به‌عنوان پپتیدهایی که فعالیت گلیکولیزی میکروارگانیسم‌ها را افزایش می‌دهند، معرفی شدند (9). در 1988 اوپنهیم و همکاران، هیستاتین 1، 3 و 5 را از انسان توسط فیلتراسیون ژلی و کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)، جداسازی کردند که هر سه هیستاتین خاصیت ضد میکروبی و هم خاصیت التیام زخم دارند.(20).

اگر هیستاتین‌ها را به دو گروه دارای خاصیت ضدمیکروبی قوی و گروه واجد خاصیت التیام زخم  طبقه‌بندی کنیم؛ هیستاتین 3 حد واسط این دو گروه است. علاوه بر این، تغییرات پس از ترجمه این هیستاتین بحدی اندک است که امکان بیان مطلوب و عملکرد درست را از طریق تولید در میزبان باکتریایی فراهم می‌کند (20 ،11 ). بنابراین هیستاتین 3 یک پروتئین مطلوب جهت کاربردهای درمانی به شمار می‌رود.

بیان هیستاتین 3 در سیستم  بیانی  باکتریایی  با  دو  مشکل

جدی روبرو است: الف) این پپتیدها بطور بالقوه کشنده میزبان باکتریایی تولیدکننده خود هستند. ب) اندازه کوچک آنها نیز باعث تخریب زودهنگام آنها می‌شود. راه‌حل موثر برای غلبه بر این دو مشکل، افزودن یک پروتئین الحاقی به پپتید هدف است که بعدا توسط برش شیمیایی و یا آنزیمی جدا شود (22). یکی ازاین پروتئین‌های الحاقی، پروتئین‌های سومو (SUMO: Small Ubiquitin_like Modifire) هستندکه بدلیل خاصیت چاپرونی باعث افزایش حلالیت، تاخوردگی مناسب پروتئین نوترکیب و نهایتا باعث افزایش بیان و  فعالیت بیولوژیک آن می شود (16،9).

بسیاری از پپتیدهای ضدمیکروبی بصورت طبیعی فعالیت کافی نداشته و بایستی قبل از استفاده از آنها بعنوان عوامل درمانی، بهینه‌سازی شوند. پپتیدهای ضدمیکروبی نیز می‌توانند با جایگزین کردن آمینواسید های مناسب، بهینه شوند ( 22 ). یکی  از روشهای بهینه سازی ایجاد جهش است، هرچند که جهش‌های ایجاد شده براساس موتانت‌زایی تصادفی بوده و تأثیری در افزایش این خصوصیات نداشته است. درحالیکه جهش‌های هدفمند برروی پپتید اعمال می‌شود. بنابراین تلاش برای افزایش خاصیت ضدمیکروبی این پپتیدها و یا افزایش پایداری آنها حائز اهمیت است (12). هدف از این پژوهش تولید هیستاتین 3  جهش یافته در مقیاس  آزمایشگاهی با هدف افزایش خاصیت ضدمیکروبی آن در مقایسه با آنتی بیوتیک های رایج می باشد.

مواد و روشها

در این پژوهش از باکتریهای  E.coli(DH5α)و E.coli BL21   بترتیب بعنوان ناقل همسانه سازی و ناقل بیانی استفاده شد. از باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 6538) و باکتری گرم منفی اشریشیاکولی (ATCC 32218.) نیز برای انجام بررسی خواص ضد میکروبی پپتید مورد نظر استفاده گردید.  پلاسمید pGH و پلاسمید pET-32a (+)  بترتیب بعنوان ناقلهای همسانه سازی و بیانی در باکتری استفاده گردید. آنزیم­های محدودالاثر BamHI و HindIII و آنزیم  DNA T4 لیگاز از شرکت تاکارا تهیه شدند. از محیط کشت لوریا برتانی مایع و جامد جهت کشت باکتری استفاده شد. روش­های  مولکولی استفاده شده در این پژوهش بر اساس روش­های استاندارد می باشد (24).

همسانه‌سازی: توالی نوکلئوتیدی  کد کننده ژن هیستاتین طبیعی انسانی و پروتئین سومو بترتیب  با شماره دسترسی  Accession BC095438 و Accession N.Q12306.1 از پایگاه داده ای NCBI بدست آمد. توالی پپتیدی هیستاتین طبیعی و جهش یافته  در شکل 2 مشاهده می شود.

 

 

DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGYRSNYLYDN : پپتید طبیعی1=32

ASHAKRHHWYKRKFHEKHHSHRGYRSNYLYDN : پپتیدجهش یافته1-32

شکل2- توالی پپتیدی هیستاتین طبیعی و جهش یافته . اسیدهای آمینه در موقعیتهای 1و 9 تغییر یافته اند که بصورت ایتالیک نمایش داده شده است.

 

امینواسید آسپارتیک اسید در موقعیت 1 به آلانین و گلیسین موقعیت 9 به تریپتوفان تغییر یافت. پس از طراحی و بهینه‌سازی ژن سومو- هیستاتین3 جهش یافته از طریق کدون‌های رایج، توالی به‌همراه جایگاه برش آنزیم‌های محدودگر BamHI در ابتدا و HindIII در انتهای آن برای سنتز به شرکت ندای فن ارسال و سپس توالی ژنی مورد نظر توسط همان شرکت در ناقل همسانه‌سازی pGH کلون شد. پس از دریافت، وکتور نوترکیب بدرون میزبان باکتریایی E.coli سویه DH5αکه قبلا ً مستعد شده بود، منتقل شد. پس از تکثیر ناقل هدف در میزبان، بمنظور بدست آوردن قطعه ابتدا پلاسمید استخراج و بعد توسط آنزیم‌های محدودگر فوق برش داده شد. سپس پلاسمید pET32a(+) نیز توسط همین آنزیم‌ها برش داده شد و پس از مجاورت با قطعه هدف، توسط آنزیم لیگاز T4 بهم متصل شدند. درنهایت محصول ایجاد شده جهت بیان پروتئین هدف بدرون باکتری E.coli (BL21) مستعد منتقل شد (18،24). صحت همسانه‌سازی توسط استخراج پلاسمید و برش آنزیمی و نهایتا ً از طریق تعیین توالی (توسط شرکت ندای فن) تایید گردید.

بیان و خالص‌سازی: باکتری ترانسفورم‌شده حاوی پلاسمید نوترکیب، در 50 میلی‌لیتر محیط LB مایع بمدت 16 ساعت کشت داده شد. سپس این سوسپانسیون میکروبی به 200 میلی‌لیتر محیط کشت LB مایع منتقل شد تا رشد باکتری‌ها به فاز لگاریتمی برسد (5/0OD ). سپس IPTG با غلظت نهایی 1 میلی‌مولار به محیط اضافه شد تا بیان پروتئین هدف در دمای 30 درجه سانتیگراد با دور rpm100 القا شود. آنگاه پس از گذشت 2، 4، 6 و 8 ساعت پس از القا، از محیط نمونه‌برداری شد و با دور g5000 بمدت 5 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ شده و پس از خارج کردن محیط رویی، رسوب در 20- درجه سانتیگراد ذخیره شد. سلول‌ها در بافر لیز ( تریس 5/1 مولار با 8=pH، EDTA 5/0 مولار با 8=pH، ساکارز 20%) سوسپانسیون شده و برای 20 دقیقه روی یخ نگهداری گردید. سپس سلول‌ها بروش سونیکاسیون (بمدت 30 ثانیه بدفعات 5-4 بار با قدرت 80 و با فاصله زمانی یک دقیقه) شکسته شدند. نمونه‌ها با دور rpm6000 و دمای 4 درجه سانتیگراد بمدت 30-25 دقیقه سانتریفوژ شده و فاز رویی جهت بررسی الگوی پروتئین‌های کل سلول حاوی پروتئین موردنظر بر روی الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید سدیم دو دسیل سولفات (SDS-PAGE) 12% برده شد (17).

خالص‌سازی پروتئین نوترکیب در مرحله اول توسط کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل انجام شد. ابتدا به رسوب باکتری حاصل از القای بیان پروتئین هدف، بافر لیز حاوی ایمیدازول با غلظت 10 میلی‌مولار اضافه شد. پس از اضافه کردن رزین ستون نیکل به سوسپانسیون حاصل و قرار دادن آن برروی ستون تخلیص، بافر شستشو حاوی ایمیدازول با غلظت 20 میلی‌مولار به آن اضافه شد. درنهایت بافر پاکسازی دارای ایمیدازول با غلظت 250 میلی‌مولار به ستون اضافه شده و خروجی‌های ستون جمع‌آوری شده و جهت بررسی صحت خالص‌سازی برروی ژل SDS-PAGE برده شد (23). در مرحله دوم، پروتئین توسط دیالیز خالص‌سازی شد تا ایمیدازول آن حذف گردد. بدین منظور محلول پروتئینی پس از قرارگیری در کیسه دیالیز در بافر فسفات نمکی X1 به‌مدت 24 ساعت غوطه‌ور شد (1). سپس بمننظور حذف قطعه سومو از پپتید، آنزیم سوموپروتئاز استفاده شد. 20 میکروگرم از پروتئین دیالیز شده با 10 میکرولیتر آنزیم سوموپروتئاز و 10 میکرولیتر بافر سوموپروتئاز ترکیب و به‌مدت 3-2 ساعت در حمام آب 30 درجه سانتیگراد قرار گرفت (14). ‌بمنظور خالص سازی قطعه پپتید هیستاتین3 جهش‌یافته از سومو،  از سانتریکون (Vivaspin, Sartorius) استفاده گردید. بعد از اضافه کردن 2 میلی لیتر از پروتئین برش یافته به ستون بمدت 20 دقیقه و دور4000 سانتریفیوژ گردید. محلول عبور کرده از سانتریکون شامل پپتید خالص شده می باشد که جهت سنجش خاصیت ضد میکروبی از آن استفاده گردید. برای سنجش غلظت پروتئین از روش برادفورد استفاده گردید (5).

سنجش خاصیت ضدمیکروبی: برای سنجش خاصیت ضدمیکروبی این پپتید، آزمون‌ میکروبی بررسی کمترین غلظت مهارکننده (Minimum inhibitory concentration (MIC)) از طریق میکروپلیت (ریز رقت سازی) بر روی باکتری‌های استافیلوکوکوس‌اورئوس (ATCC6538) بعنوان باکتری گرم مثبت و اشریشیاکولی (ATCC32218) بعنوان باکتری گرم منفی، انجام شد. این سویه‌ها در محیط LB مایع بمدت یک شبانه‌روز در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. بمنظور تلقیح سوسپانسیون باکتریایی به میکروپلیت 96 خانه، این سوسپانسیون به کدورت 01/0 نیم مک‌فارلند رسانده شد. همچنین پپتید هیستاتین3 جهش یافته برش خورده بصورت سریالی در بافر فسفات نمکی 10 میلی‌مولار رقیق شد. از پروتئین نوترکیب هیستاتین3 – سومو برش نخورده به‌عنوان کنترل منفی استفاده شد. پس از اضافه کردن حجم مساوی از سوسپانسیون باکتریایی به محلول‌های پپتید، پلیت 96 خانه بمدت 24-16 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. آخرین خانه‌ای که در آن رشد میکروارگانیسم مهار شد، غلظت آن به‌عنوان MIC گزارش گردید  (2،7،6).

نتایج

همسانه‌سازی: همانگونه که قبلا ً ذکر  شد،  ابتدا  پلاسمید

pGH نوترکیب بدرون میزبان باکتریایی ترانسفورم شده و پس از تکثیر، پلاسمید مذکور مجددا ً از باکتری استخراج شد. سپس پلاسمید نوترکیب با آنزیم‌های محدودکننده BamHI/HindIII برش داده شده و قطعات حاصل بر روی ژل آگارز 1% برده شد. قطعه برش داده شده شامل 393 جفت باز بود (شکل 3).

 

شکل 3- محصول برش پلاسمید pGH توسط آنزیم‌های BamHI و HindIII.

قطعه موردنظر از ژل استخراج و به پلاسمید pET32a(+) برش خورده با آنزیم‌های محدودکننده BamHI/HindIII متصل گردید. پلاسمید نوترکیب ایجاد شده به باکتری E.coli ترانسفورم شد. بمنظور تایید همسانه‌سازی تعدادی از کلون‌های باکتری ترانسفورم‌شده کشت داده شد و سپس پلاسمید نوترکیب از سلول باکتری استخراج و دوباره توسط آنزیم‌های محدودکننده BamHI/HindIII برش داده شد. در شکل4 تصویر قطعه موردنظر و پلاسمید برش خورده حاصل از استخراج پلاسمید یکی از کلون‌ها برروی ژل آگارز 1% نشان داده شده است که صحت همسانه‌سازی را تایید می‌کند.

بیان و خالص‌سازی: بیان پروتئین هدف توسط میزبان باکتریایی پس از همسانه‌سازی پلاسمید نوترکیب صورت گرفت. پس از 2، 4، 6 و 8 ساعت بعد از القای پروتئین هدف، نمونه‌های پروتئینی استخراج شده بهمراه نمونه قبل از القا  برروی ژل SDS-PAGE 12 درصد برده شد.

 

 

شکل 4- پلاسمید pET32a(+) و محصول برش آن توسط آنزیم‌های BamHI و HindIII.

همانطور که در شکل 5 مشاهده می‌شود، پروتئین موردنظر (دارای توالی پپتیدی سومو- هیستاتین 3 جهش‌یافته و با وزن حدود 32 کیلودالتون) کمی پایین‌تر از باند 35 کیلودالتون دیده می‌شود. نمونه پروتئینی قبل از مرحله القا، به‌عنوان کنترل منفی درنظر گرفته شد.

 

 

شکل5- بررسی بیان پروتئین هدف برروی ژل SDS-PAGE 12%.1) نمونه پروتئینی 8 ساعت پس از القا. 2) نمونه پروتئینی 6 ساعت پس از القا. 3) نمونه پروتئینی 4 ساعت پس از القا. 4) نمونه پروتئینی 2 ساعت پس از القا.  5) پروتئین سلولی قبل از القای بیان به‌عنوان کنترل منفی.

بررسی خالص‌سازی پروتئین با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل: پس از عبور نمونه‌های پروتئینی 4 و 6 ساعت پس از القا ( شرایط بهینه بیان) از ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل، نتایج حاصل، در شکل 6 برروی ژل SDS-PAGE 12% قابل مشاهده است که باند پروتئینی موردنظر اندکی پایین‌تر از باند 35 کیلودالتون قرار دارد.

سنجش غلظت پروتئین با روش برادفورد: غلظت پروتئین هدف در مراحل مختلف توسط روش برادفورد بدست آمد. بیشترین میزان غلظت پروتئین از فراکشن 5 حاصل از بافر پاکسازی ستون تخلیص بمیزان µg/ml 1271 بدست آمد.

 

 

شکل 6- نتایج خالص‌سازی نمونه‌های پروتئینی حاصل از کروماتوگرافی برروی ژل 12%. نمونه‌های 1 تا 11 فراکشن‌های حاصل از خالص سازی با بافر پاکسازی و شماره 12 نمونه کنترل منفی قبل از ستون را نشان می‌دهد. علامت فلش باند 32 کیلودالتونی را مشخص می‌کند.

 

سنجش خاصیت ضدمیکروبی: نتایج حاصل از سنجش MIC بدین شرح است: غلظت محلول پپتیدی مورد آزمون درون چاهک‌ها بترتیب کاهش عبارتند از:,600  300، 150، 75، 5/37، 75/18، 375/9و 69/4 میکروگرم بر میلی‌لیتر. این پپتید برروی باکتری‌ گرم منفی اشریشیاکولی اثر نداشت اما  مقدار MIC برای باکتری استافیلوکوکوس اورئوس µg/ml 150بدست آمد که نشان‌دهنده تاثیر باکتریواستاتیکی (مهارکنندگی رشد) این پپتید بر روی این  باکتری‌ پاتوژن گرم مثبت می‌باشد.

بحث و نتیجه‌گیری

هیستاتین‌ها پپتیدهای ضد میکروبی کاتیونی و غنی از هیستیدین می باشند که بار مثبت این پپتیدها نقش اساسی در تخریب غشای باکتری ایفا می کند (8) . در این پژوهش، طراحی جهش در آمینواسیدهای موقعیت‌ آسپارتات 1 به آلانین و گلیسین 9 به تریپتوفان انجام شد. تبدیل آسپارتات 1 به آلانین  در انتهای آمین باعث می شود که بار منفی پپتید کاهش یابد. همچنین تبدیل گلیسین 9 به تریپتوفان  با این هدف صورت گرفت که رزیدوی تریپتوفان، اتصال پپتید به سطح دولایه غشا را تسهیل می‌کند.  نهایتا این تغییرات، فعالیت ضدمیکروبی پپتید مورد نظر علیه باکتری‌های گرم مثبت را افزایش میدهند (10).

پپتید سومو یکی از پپتیدهای الحاقی بوده که حلالیت و تاخوردگی پپتید هدف را بهبود بخشیده و همانند تیوردوکسین به‌دلیل اندازه کوچک خود (2/11 کیلودالتون) باعث افزایش کارایی بیان می‌شود که این خصوصیت به‌علت نسبت وزنی بالای پپتید به ناقل است. علاوه براین، وجود آنزیم سوموپروتئاز با اختصاصیت بالا، رهاسازی پپتید هدف را تسهیل می‌کند که یکی از خصوصیات منحصربفرد این پپتید است. جایگاه برش آنزیم اختصاصی سوموپروتئاز، دو آمینواسید گلیسین انتهایی این فیوژن بوده، به‌طوریکه این آنزیم، پپتید هدف را بدون اضافه یا کم کردن حتی یک آمینواسید رها می‌کند. همچنین طی مطالعات اخیر نشان داده شده است که استفاده از سومو بمنظور بیان پپتیدهای ضدمیکروبی، مقرون به‌صرفه است که این خصوصیت به‌دلیل کارایی بالای سومو در فرار از اثر پروتئازهای داخل سلول می‌باشد. همچنین با پوشش اثرات مخرب پپتیدهای ضدمیکروبی، باعث حفاظت میزبان نیز می‌شوند (13، 25 ). بیان هیستاتین3 جهش یافته به‌همراه سومو موجب افزایش بیان پروتئین در مقایسه با کارهای دیگر شده است. در مطالعه‌ای که اپنهیم و همکاران برروی هیستاتین3 انجام دادند توانستند، هیستاتین3 نوترکیب را از طریق پپتید الحاقی گلوتاتیون ترانسفراز، بمیزان 25/3 میلی‌گرم به ازای یک لیتر محیط کشت حاوی باکتری دارای پلاسمید نوترکیب به‌دست آورند (19). درحالیکه در مطالعه جاری، میزان پروتئین نوترکیب هیستاتین3 جهش یافته به‌همراه پپتید الحاقی سومو و سایر دنباله‌های پروتئینی اضافه‌شده، معادل  mg/l71/12 است.

آزمون MIC نشان داد که پپتید جهش‌یافته علیه باکتری‌‌های گرم مثبت بخوبی عمل کرده و منجربه مهار رشد آن‌ها می‌شود ولی اثری برروی باکتری‌ گرم منفی مشاهده نشد. یمان و همکاران طی مطالعه‌ای برروی مکانیسم عملکرد پپتیدهای ضدمیکروبی، بیان کردند که لیپوپلی‌ساکارید موجود در غشای باکتری‌های گرم منفی، مورد هدف پپتیدهای ضدمیکروبی قرار می‌گیرد ولی از آنجائیکه این پلی‌مر در باکتری‌های گرم منفی دچار تغییرات (اضافه شدن قند، پپتید و...) می‌شود، لذا پپتیدهای ضدمیکروبی تاثیر کمی بر باکتری‌های گرم منفی می‌گذارند. درمقابل، در باکتری‌های گرم مثبت، اسید تیکوئیک یافت شده که کمتر دچار تغییرات فوق می‌شود، بنابراین اثرات ضدمیکروبی پپتیدهای ضدمیکروبی برروی باکتری‌های گرم مثبت بیشتر است (29). در 1996 برای افزایش فعالیت قارچ کشی هیستاتین 5 از طریق موتانت‌زایی تصادفی، چندین آمینواسید تغییر داده و در میزبان E.coli بیان شد و در نهایت مشخص گردید که آمینواسید های لیزین-13 و آرژنین-22 در توالی هیستاتین 5, نقشی حیاتی برای فعالیت قارچ‌کشی دارند (27). در سال 2012 برای افزایش فعالیت قارچ کشی هیستاتین 3, از طریق مهندسی ژنتیک, واریانت‌های هیستاتین 3 با یک, دو, سه یا چهار کپی از دومین عملکردی آن, توسط روش SOE PCR (PCR با رویکرد گسترش قطعات همپوشان) ایجاد شدند (28). در جدول 1 نتایج MIC این پژوهش با نتایج مطالعات برخی از پپتیدهای ضدمیکروبی برروی باکتری‌ استفاده شده در این پژوهش مقایسه شده است. هرچند این مطالعات برروی میکروب‌هایی با کد بانکی متفاوت انجام شده، ولی از آنجاییکه جنس و گونه این میکروب‌ها یکسان هستند؛ لذا بررسی نتایج این پژوهش با مطالعات فوق از اهمیت برخوردار است. هرچند که  عملکرد پپتید هیستاتین جهش یافته بروی باکتری های گرم منفی تغییری نکرده است ولی خاصیت ضدمیکروبی آن برعلیه  باکتریهای گرم مثبت افزایش یافته است. با مقایسه میزان MIC پپتید مورد نظر با انتی بیوتیک های رایج در درمان بیماریهای ایجاد شده توسط باکتری استافیلوکوکوس اورئوس ، ارزش مطالعه روی این پپتید آشکار می شود.

نتیجه‌گیری کلی

پپتیدهای ضدمیکروبی اهداف مطلوبی بعنوان آنتی‌بیوتیک-

‌های جدید هستند و به‌دلیل طیف گسترده فعالیت خصوصاً علیه باکتری‌های مقاوم به دارو، مورد توجه قرار می‌گیرند. هیستاتین‌ها به‌عنوان خانواده‌ای از این پپتیدها دارای خصوصیات متنوعی هستند که مهم‌ترین آن‌ها، خاصیت ضدمیکروبی علیه سویه‎‌های مقاوم به دارو است. در این پژوهش، طراحی جهش روی هیستاتین 3  با هدف افزایش خاصیت ضد میکروبی انجام و سپس بمنظور‌ افزایش بیان این پپتید در مقیاس آزمایشگاهی، توالی ژنی آن به‌همراه پپتید الحاقی سومو در  باکتری E.coli  زیرهمسانه‌سازی  و

بیان شد.

 

جدول 1- نتایج MIC این پژوهش و برخی از مطالعات صورت گرفته بر روی پپتیدهای ضدمیکروبی.

میکروب

نوع نمونه آزمون

MIC (µg/ml)

منبع

استافیلوکوکوس اورئوس

پپتید هیستاتین 3 جهش یافته

150

این مطالعه

بوچیتین

400<

 (21)

پلی میکسینBسولفات

250

(21)

 

سیپروفلوکسازین

250<

(21)

کاتلیسیدین‌ها ( LL-13، LL-17)

256<

(26)

آلفا دیفنسین1 (HNP-1)

1000

(4)

بتا دیفنسین1 (hBD-1)

500

(4)

سفوتاکسیم

2000

(4)

 

 

اثر ضد میکروبی این پپتید روی باکتری‌ استافیلوکوکوس‌اورئوس که از باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک است، ارزش مطالعه روی این پپتید را نشان می دهد. امید است که از این پپتید در صنایع دارویی و پزشکی، به‌عنوان آنتی‌بیوتیک جدید یا درکنار آنتی‌بیوتیک‌های سنتی برای افزایش کارایی آن‌ها، بهره گرفت.

  • Andrew SM, Titus JA, Zumestein L. 2001. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Immunology A. 3H. 5.
  • Andrews JM. 2001. Determination of minimum inhibitory concentrations. Journal of antimicrobial Chemotherapy. 5-16.
  • Bahar AA, Ren D. 2013.Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6(12):1543-75.
  • Bolatchiev A, Baturin V, Bazikov I, Maltsev A, Kunitsina E. 2019. Effect of Antimicrobial Peptides HNP-1 and hBD-1 on Staphylococcus aureus Clinical Strains in vitro and in vivo. bioRxiv. 578278.
  • Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72(1-2):248-54.
  • Cockerill FR. 2012. Clinical, Institute LS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-second informational supplement;[... provides updated tables for... M02-A11 and M07-A9]: National Committee for Clinical Laboratory Standards.
  • Coyle MB. 2005. Manual of antimicrobial susceptibility testing: BCIT Imaging Services.
  • Crusca Jr E, Câmara AS, Matos CO, Marchetto R, Cilli EM, Lião LM, et al. 2017. NMR structures and molecular dynamics simulation of hylin‐a1 peptide analogs interacting with micelles. Journal of Peptide Science. 23(6):421-30.
  • De Smet K, Contreras R.2005. Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins and histatins. Biotechnology letters. 27(18):1337-47
  • Dong W, Mao X, Guan Y, Kang Y, Shang D. 2017. Antimicrobial and anti-inflammatory activities of three chensinin-1 peptides containing mutation of glycine and histidine residues. Scientific Reports. 7:40228.
  • Khurshid Z, Najeeb S, Mali M, Moin SF, Raza SQ, Zohaib S, et al. 2016. Histatin peptides: Pharmacological functions and their applications in dentistry. Saudi Pharmaceutical Journal. 25:25-31.
  • Langham A, Kaznessis YN. 2010. Molecular simulations of antimicrobial peptides. Antimicrobial Peptides: Methods and Protocols.
  • Li Y. 2011. Recombinant production of antimicrobial peptides in Escherichia coli: a review. Protein expression and purification. 80(2):260-7.
  • Malakhov MP, Mattern MR, Malakhova OA, Drinker M, Weeks SD, Butt TR. 2004. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of structural and functional genomics. 5(1-2):75-86.
  • Melino S, Santone C, Di Nardo P, Sarkar B. 2014. Histatins: salivary peptides with copper (II) and zinc (II) binding motifs. FEBS Journal. 281(3):657-72
  • Mortazavi M, Saffar B, Mirakhorli N, Dehkordi MM. 2014. Design, Synthesis, Molecular Cloning and Expression Evaluation of Wheat (Triticumaestivum) Defensin Protein in coli Host. Iranian Journal of Public Health. 43(2):258
  • Novagen: 2003. Novagen pET system manual.
  • Old RW, Primrose SB. 1981. Principles of gene manipulation: an introduction to genetic engineering: Univ of California Press.
  • Oppenheim F, Xu T, McMillian F, Levitz S, Diamond R, Offner G, et al. Histatins, a novel family of histidine-rich proteins in human parotid secretion. Isolation, characterization, primary structure, and fungistatic effects on Candida albicans. Journal of Biological Chemistry. 263(16):7472-7
  • Oppenheim FG, Helmerhorst EJ, Lendenmann U, Offner GD. 2012. Anti-Candidal activity of genetically engineered histatin variants with multiple functional domains. PloS one. 7(12):e51479
  • Oyama LB, Crochet J-A, Edwards JE, Girdwood SE, Cookson AR, Fernandez-Fuentes N, et al. Buwchitin. 2017. A Ruminal Peptide with Antimicrobial Potential against Enterococcus faecalis. Frontiers in chemistry. 5:51.
  • Pasupuleti M, Schmidtchen A, Malmsten M. 2012. Antimicrobial peptides: key components of the innate immune system. Critical reviews in biotechnology. 32(2):143-71
  • Qiagen I, Valencia C. 2003. The QIA Expressionist: A Handbook for High-level Expression and purification of 6× His-tagged Proteins. Qiagen Inc: Chastworth, CA.
  • Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
  • Satakarni M, Curtis R. 2011. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein expression and purification. 78(2):113-9.
  • Shurko JF, Galega RS, Li C, Lee GC. 2018. Evaluation of LL-37 antimicrobial peptide derivatives alone and in combination with vancomycin against S. aureus. The Journal of antibiotics. 71(11):971.
  • Tsai H, Raj PA, Bobek LA. 1996. Candidacidal activity of recombinant human salivary histatin-5 and variants. Infection and immunity. 64(12):5000-7
  • Welling MM, Brouwer CP, van't Hof W, Veerman EC, Amerongen AV.2007. Histatin-derived monomeric and dimeric synthetic peptides show strong bactericidal activity towards multidrug-resistant Staphylococcus aureus in vivo. Antimicrob Agents Chemother. 51:3416-3419.
  • Yeaman MR, Yount NY. 2003. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacological reviews. 55(1):27-55.
Volume 35, Issue 1
May 2022
Pages 75-88
  • Receive Date: 06 February 2019
  • Revise Date: 07 August 2019
  • Accept Date: 13 May 2020