مطالعه تنوع ژنتیکی اکوتیپهای رازیانه با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR

محسن فرشادفر^*، هومن شیروانی، مصطفی امجدیان و مهرانوش قلی پور

تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی

تاریخ دریافت: 26/8/95                تاریخ پذیرش: 13/8/96

چکیده

یکی از قدیمی­ترین گیاهان دارویی رازیانه (.Fueniculum vulgare Mill) می­باشد که در طب سنتی کاربرد فراوان دارد. جهت تعیین میزان تنوع ژنتیکی بین اکوتیپهای مختلف رازیانه این تحقیق در دانشگاه پیام نور مرکز کرمانشاه انجام گرفت. 16 اکوتیپ با استفاده از 15 آغازگرISSR مورد ارزیابی قرار گرفت. آغازگرهای IS13 و IS10 به ترتیب با 10 و 9 باند بیشترین تعداد و آغازگر IS16 با 3 باند کمترین تعداد باند را تکثیر نمودند. میانگین درصد چند شکلی، محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI) و شاخص نسبت چندگانه مؤثر (EMR) در بین اکوتیپهای مورد بررسی به ترتیب برابر 00/91 درصد، 36/0، 83/1 و 98/4 بود. میانگین شباهت ژنتیکی مشاهده شده براساس اطلاعات این نشانگرها برابر 567/0 بود. بیشترین تشابه را اکوتیپهای (اردبیل 1) با (اردبیل 2) و (تهران 2) با (لرستان) (85/0) و کمترین تشابه را ژنوتیپ (بانک ژن 2) با (کرمانشاه) و (هرمزگان 3) (55/0) داشت. نتایج حاصل از گروه­بندی تجزیه خوشه­ای اکوتیپها را در3 گروه قرارداد که این نتیجه توسط تجزیه به مختصات اصلی تأیید گردید.

واژه های کلیدی: رازیانه، تنوع ژنتیکی، مارکر مولکولی،ISSR  

* نویسنده مسئول، تلفن: 09183313221 ، پست الکترونیکی: m.farshadfar@pnu.ac.ir

مقدمه

رازیانه Foemiculum Vulgare Mill از مهمترین و قدیمی‍ترین گیاهان دارویی و متعلق به خانواده چتریان Apiaceae می­باشد که در تمام فارماکوپه­های متعدد از آن به عنوان یک گیاه دارویی مهم یاد شده. میوه رازیانه دوکی شکل با دو انتهای باریک رنگ آن سبز یا قهوه­ای روشن است. تمام پیکر گیاه حاوی اسانس می­باشد ولی میوه آن بیشترین میزان اسانس را داراست اسانس گیاه در ساختمانهای کانالی شکل که توسط سلولهای غده­ای ایجاد شده­اند و در سراسر گیاه پراکنده­اند وجود دارد بیشترین کانالها در پوسته دانه موجود است (8). مطالعات بر روی خواص دارویی رازیانه نشان داده است که اسانس این گیاه دارای فعالیت ضدمیکروبی و آنتی­اکسیدانی قوی است (3). آگاهی تنوع ژنتیکی جمعیتها و ساختار جمعیتهای درون یک گونه نه تنها فرآیندهای تکامل و مکانسیم آن را بررسی می­کند، بلکه اطلاعات مفیدی را در مورد حفاظت بیولوژیکی فراهم می­نماید (10). یک رویکرد مهم در اصلاح نباتات افزایش تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپهای والدینی برای تلاقی است تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپهای والدینی معمولاً به وسیله تفاوتهای مورفولوژیکی و فیزیولوژیکی صفات مهم اقتصادی و کمی ارزیابی می­شود (15). توجه به این نکته مهم است که تعداد صفات مورفولوژیک اغلب محدود بوده و ممکن است ارتباط ژنتیکی حقیقی بین ژنوتیپها را به خوبی نشان ندهد. علاوه بر این وقتی صفات کمی بررسی می­شوند مقدار زیادی نمونه برای ارزیابی ژنوتیپ لازم است (6). انواع مختلفی از نشانگرها در عرصه علوم ژنتیک رده­بندی و به نژادی بکار رفته­اند اصولاً کاربرد آنها تفاوت چندانی با یکدیگر ندارد ولی هر کدام مزایا و معایب خاص خود را دارند مطالعات در سطح جمعیت نشان می­دهد که نشانگر DNA کارآیی زیادی در تشخیص تنوع در این سطح دارند و اطلاعات زیادی در تشخیص تنوع در این سطح را فراهم می­کنند (13). نشانگر  ISSR یک نشانگر مبتنی بر PCR است که می­تواند تفاوتهای افراد با خویشاوندی را به سرعت از یکدیگر جدا کند و ثابت شده است که نشانگر مولکولی مفیدی در مطالعات انگشت نگاری ژنومی بررسیهای فیلوژنتیکی و نشان­گذاری ژن است. این تکنیک از یک آغازگر منفرد طراحی شده براساس توالی زیرماهواره که در  '5 یا '3 با 2 تا 4  نوکلئوتید انتخابی اضافه شده است استفاده می­کند و برای طراحی آغازگر به اطلاع قبلی از ژنوم نیاز ندارد. نشانگر ISSR به­علت طول نسبتاً بلندتر آغازگرها و دمای اتصال بالاتر قابل اطمینان­تر از RAPD است و می­تواند به طور گسترده خصوصاً برای ارزیابی ژرم پلاسم گیاهی و تنوع ژنتیکی استفاده شود (13). نشانگرهای ISSR برای آشکارسازی چند شکلی ژنتیکی بین نژادها از طریق تولید تعداد زیادی نشانگر میکروساتلایتی توزیع شده در سراسر ژنوم مفید هستند (1). در کشور ایران تحقیقات انجام شده در زمینه اصلاح گیاه رازیانه به نسبت اهمیتی که این گیاه دارویی در صنایع مختلف دارد، محدود می‌باشد. بنابراین انجام تحقیقات بیشتر به منظور دستیابی به ارقام اصلاح شده ضروری به نظر  رسیده و تحقیق حاضر با هدف بررسی تنوع ژنتیکی در سطح مولکولی در اکوتیپهای مختلف رازیانه از مناطق مختلف ایران، انجام گرفت.

مواد و روشها

به‎منظور ارزیابی تنوع ژنتیکی با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR تعداد 16 اکوتیپ رازیانه (Foeniculum vulgare) از بانک ژن مؤسسه تحقیقات جنگلها و مراتع کشور تهیه گردید. مشخصات مواد ژنتیکی مورد مطالعه، با ذکر کد اکوتیپ و محل دریافت یا جمع­آوری در جدول 1 نشان داده شده است.

جدول 1-  فهرست 16 اکوتیپ رازیانه انتخاب شده از بانک ژن منابع طبیعی

استخراج DNA به روش CTAB تغییر یافته برای اکوتیپهای مورد بررسی در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه پیام نور مرکز کرمانشاه انجام گرفت (12). بعد از انتقال 20 تا 50 میلی­گرم نمونه خرد شده با ازت مایع به تیوب، 800 میکرولیتر از بافر استخراج (4 گرم CTAB، 16/36 گرم NaCl، 15/3 گرم Tris-HCl، 48/1 گرم EDTA، 400 میکرولیتر b-mercaptoetchanol با ۸=pH) به تیوبها اضافه شد و به مدت یک ساعت نمونه­ها در حمام آبی با دمای ۶۵ درجه سانتی گراد قرار داده شدند. سپس به هر نمونه مقدار 800 میکرولیتر محلول کلروفرم-ایزوآمیل الکل (24:1) اضافه گردید و به مدت 2 دقیقه خوب به هم زده شد تا محلول داخل تیوب یکنواخت شود. پس از آن نمونه­ها را به مدت 10 دقیقه با 13000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ و فاز رویی به یک تیوب تمیز منتقل گردید و به هر تیوب مقدار 600 میکرولیتر محلول ایزوپروپانول سرد اضافه­ و به مدت یک ساعت در فریزر در دمای ۲۰- درجه سانتی گراد قرار داده شدند. سپس تیوبها را به مدت 15 دقیقه با 13000 دور سانتریفیوژ­ گردید و بعد از آن فاز مایع به آرامی خالی و به هر تیوب مقدار 600 میکرولیتر اتانول 80 درصد سرد اضافه و یک سانتریفیوژ کوتاه صورت گرفت و به آرامی فاز مایع خالی شد (این مرحله دو بار تکرار گردید) در پایان نیز تیوبها را در دمای اتاق قرار گرفت تا خشک شوند و بعد به هر تیوب میزان 100 میکرولیتر آب دو بار تقطیر استریل اضافه ­گردید. بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل 8/۰ درصد آگارز و دستگاه اسپکتوفتومتر صورت گرفت. واکنش زنجیره­ای پلیمراز طبق جدول 2 صورت گرفت. چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتی­گراد و به مدت ۵ دقیقه و به دنبال آن ۳۵ چرخه حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشت­سازی به ترتیب ۳۰  ثانیه و ۹۵ درجه سانتی­گراد، زمان اتصال آغازگر ۳۰ ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود. همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتی­گراد بود. توسعه نهایی به مدت 5 دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی­گراد انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد با بافر واکنش TBE یک درصد استفاده شد. به منظور تزریق نمونه در ژل، ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونه­گذاری به  DNAهای تکثیر شده اضافه و سپس میزان 10 میکرولیتر از هر نمونه به درون چاهکهای ایجاد شده در ژل آگارز بارگزاری و با ولتاژ 100 و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت و سپس ژل را جهت رنگ­آمیزی در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرو­لیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت نمایان شده نوارها استفاده شد. محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC= Polymorphic information content) از طریق ( رابطه 1:(PIC=1  محاسبه شد در اینجا p برابر با مجموع نوارهای هر لوکوس برای کلیه اکوتیپها است  (5). همچنین شاخص نشانگری (Marker Index = MI) (از رابطه 2: MI= PIC × N× β) که N تعداد کل باندها و β نسبت چندشکلی برای هر آغازگر بود به دست آمد (9). شاخص نسبت چندگانه مؤثر (Effective multiplex ratio EMR=) از (رابطه 3: EMR= NPB × β) که از درصد چندشکلی (β) ضربدر تعداد نوارهای چند­شکل (NPB) به دست آمد (7) محاسبه گردید. در پایان نیز با استفاده از نرم افزارهای Ntsys و DARwin 6 ماتریس تشابه، تجزیه خوشه­ای و تجزیه به مختصات اصلی (PCo) مورد ارزیابی قرار گرفت.

جدول ۲- اجزا واکنشISSR  بهینه سازی شده

نتایج

تنوع ژنتیکی اکوتیپهای رازیانه با استفاده از 15 آغازگر ISSR مورد بررسی قرار گرفت. آغازگر­های ISSR در مجموع توانستند 86 باند تولید کنند که از این تعداد، 7 باند یک شکل مشاهده شد و سایر باندها چند شکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 16 اکوتیپ برابر 37/5 به دست آمد. آغازگرهای IS13 و IS10 به ترتیب با 10 و 9 باند بیشترین تعداد و آغازگر IS16 با 3 باند کمترین تعداد باند را تکثیر نمود. اکوتیپ (بانک ژن 1) بیشترین باند (68 باند) و اکوتیپ (بانک ژن 2) کمترین باند (30 باند) را در بین اکوتیپهای مورد بررسی داشتند شکل 1 الگوی باندی 16 اکوتیپ مورد بررسی به ترتیب با استفاده از آغازگر UBC869 را نشان می­دهد.

نتایج به دست آمده برای آغازگر­های استفاده شده در جدول 3 ارائه شده است. میانگین درصد چند شکلی در بین اکوتیپهای مورد بررسی برابر 00/90 بود که درصد چند شکلی برای آغازگرهای UBC866 (50 درصد)، IS9 (60 درصد)، UBC864 (75 درصد) و IS14 (80 درصد) و برای سایر آغازگرها میزان چند شکلی برابر 100 درصد بود. میانگین محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC) در آغازگر­های مورد بررسی برابر 36/0 بود که بیشترین میزان PIC مربوط به آغازگرهای UBC807 (48/0)، UBC844 (42/0)، IS16 (41 درصد)، UBC848 (40/0) و IS10 (40/0)  بود که این آغازگرها بهتر از سایر آغازگر­ها بر اساس شاخص PIC توانست فاصله ژنتیکی اکوتیپها را مشخص کنند. آغازگر IS9 (15/0) با کمترین میزانPIC  توانایی خوبی در جداسازی اکوتیپها نداشت. همچنین میانگین شاخصهای MI و EMR به ترتیب برابر 83/1 و 98/4 بود. بیشترین میزان MI و EMR را آغازگرهای   IS10 و IS13 و کمترین میزان را آغازگرهای  IS9 و UBC866 داشتند.

شکل 1- تصویر ژل الکتروفورزی اکوتیپهای مورد بررسی برای آغازگر UBC869

جدول 3- تعداد مکان تکثیر شده، تعداد مکان چند شکل، درصد چند شکلی، PIC، MI و EMR در آغازگرهای مورد استفاده

Y=(C,T), V=(A,C,G), D=(A,G,T), B=(C,G,T)

محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI) و نسبت چندگانه مؤثر (EMR)

بررسی میزان تشابه ژنتیکی بین اکوتیپها: تشابه ژنتیکی اکوتیپهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه دایس از 55/0 تا 85/0 متغیر بود (جدول 4)،  میانگین تشابه بین اکوتیپها برابر 56/0 بود که پایین بودن تشابه ژنتیکی یاد شده نشان­دهنده تنوع­ژنتیکی خوب و قابل قبولی در بین اکوتیپهای رازیانه بر اساس آغازگر­های مورد بررسی می­باشد. بیشترین تشابه را اکوتیپهای (اردبیل 1) با (اردبیل 2) و (تهران 2) با (لرستان) (85/0) و کمترین تشابه را اکوتیپ (بانک ژن 2) با (کرمانشاه) و (هرمزگان 3) (55/0) داشت. نمودار توزیع فراوانی نشان داد که بیشترین فاصله در بین اکوتیپها در محدوده 29/0 و کمترین فاصله در 48/0 می­باشد (شکل 2).

جدول 4- ماتریس تشابه اکوتیپها برای پرایمرهای ISSR استفاده شده بر اساس ضریب دایس

شکل 2- نمودار توزیع فراوانی فواصل ژنتیکی بین اکوتیپهای رازیانه

تجزیه خوشه­ای: دندرو­گرام حاصل از تجزیه خوشه­ای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه دایس برای اکوتیپها در شکل 3 ارائه شده است. همچنان که ملاحظه می­گردد اکوتیپها در 3 گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل اکوتیپهای (مازندران)، (کرمانشاه)، (لرستان)، (مرکزی)، (یزد)، (تهران 2) و (سیستان و بلوچستان) بود. اکوتیپ (بانک ژن 2) به تنهایی در  گروه دوم قرار گرفت. گروه سوم شامل 8 اکوتیپ (بانک ژن 2)، (اردبیل 2)،  (تهران 1)، (هرمزگان 1)، (بانک ژن 1)، (هرمزگان 2)، (هرمزگان 3) و (قزوین) بود.

شکل 3- دندروگرام حاصل از داده های نشانگر ISSR برای اکوتیپهای  مورد مطالعه

تجزیه به مختصات اصلی (PCo): بر اساس داده­های حاصل از آغازگر­های مورد بررسی تجزیه به مختصات اصلی برای اکوتیپها انجام شد، که نتایج نشان داد محور مختصات اول و دوم به ترتیب 51/20 و 27/17 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند و در مجموع 87/37 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید. بر اساس مختصات اول و دوم دیاگرام پراکنشی اکوتیپها رسم گردید (شکل 4)، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشه­ای کاملا مطابقت داشت و اکوتیپها به سه گروه تقسیم شدند.

بحث

با استفاده از آغازگر­های ISSR مشاهده گردید  تنوع  قابل

ملاحظه­ای در بین اکوتیپهای رازیانه وجود دارد که این موضوع تایید کننده مطالعات قبلی می­باشد که در بین ژنوتیپها از نظر مولکولی تنوع وجود دارد. Bahmani و همکاران (2012) در مطالعه­ای بر روی 25 ژنوتیپ رازیانه ایران به منظور بررسی تنوع ژنتیکی آنها با استفاده از 10 نشانگر RAPD انجام دادند گزارش نمودند که رازیانه­های ایران دارای تنوع ژنتیکی بالایی هستند و نشانگر RAPD به خوبی ژنوتیپهای رازیانه را بر اساس توزیع جغرافیایی و تشابهات اقلیمی از هم تفکیک کرده است (2).

محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC)، یکی از شاخصهای مهم جهت مقایسه نشانگرهای مختلف، از نظر قدرت تمایز آنها به شمار می­رود. مقادیر بالای این معیار، دلالت بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه نشانگری دارد که در تفکیک و تمایز افراد نقش به سزایی دارد (11).

شکل 4- بای پلات اکوتیپها برای نشانگر ISSR بر اساس محور مختصات اصلی اول و دوم