بررسی روابط تبارزایی در همتافت گونه‌ای گلپر (Heracleum sp.) ایران با استفاده از نشانگر ITS و trnl-rpl32

مریم عیدی¹، محمّدتقی عبادی^1*، محسن فلاحتی عنبران² و عبدالعلی شجاعیان¹

¹ ایران، تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه علوم باغبانی

² ایران، تهران، دانشگاه تهران، دانشکده زیست شناسی، گروه علوم گیاهی

تاریخ دریافت: 28/7/1398            تاریخ پذیرش: 13/8/1398

چکیده

تیره کرفسیان (Apiaceae) یکی از تیره‌های بزرگ گیاهی با پراکنش گسترده بوده که در ایران حدود 114 سرده شامل 363 گونه گزارش شده است. سرده گلپر (Heracleum) با دارا بودن بیش از 100 گونه در جهان، دارای هشت گونه در ایران است که سه گونه آن اختصاصی می‌باشد. بر اساس تشریح آرایه‌شناسی در فلور ایرانیکا گونه‌های گزارش شده گلپر در ایران در بخشه‌های Pubescentia و Wendia شباهتهای ریخت‌شناسی زیادی داشته به طوری که برخی از صفات، تنوع جغرافیایی وسیعی را نشان داده که شناسایی دقیق گونه‌ها مشکل می‌باشد. به همین منظور، از نشانگرهای مولکولی شامل توالی هسته‌ای ITS و کلروپلاستی rpl32-trnL برای ارزیابی روابط ژنتیکی جمعیتهای مختلف از گونه‌های ایران و همچنین گونه‌های دیگر این سرده استفاده شد. تجزیه و تحلیل تبارزایشی به روش استنباط بیزی انجام شد. نتایج نشان داد که توپولوژی درخت تبارزایی حاصل از دو توالی نسبتاً مشابه بود با این تفاوت که تعداد جایگاههای اطلاع‌رسان در نشانگر ITS به مراتب بیشتر از rpl32-trnL بود و ترکیب دو توالی توانست گونه‌های مربوط به بخشه‌های مختلف را از هم جدا کند ولی نتوانست به صورت کامل گونه‌های داخل بخشه‌ها را از یکدیگر جدا کند. نتایج حاصل از این تحقیق نشان می‌دهد که اطلاعات مولکولی، طبقه‌بندی مورفولوژی در سطح بخشه‌های موجود در فلور ایرانیکا را تأیید می کند. علاوه بر این جمعیتهای گونه‌های مختلف داخل هر بخشه به غیر از گونه
H. gorganicum از یکدیگر قابل تمایز نیستند. به منظور تأیید هر یک از گونه‌های معرفی‌شده انحصاری ایران از جمله
H. anisactis و H. rechingeri به عنوان گونه یکتا تهیه کلید جدید آرایه‌شناسی ضروری به نظر می‌رسد.

واژه های کلیدی: همتافت گونه‌ای، روابط تبارزایشی، Heracleum، توالی هسته‌ای ITS، توالی کلروپلاستی rpl32-trnL

* نویسنده مسئول، تلفن: 02148292087 ، پست الکترونیکی: mt.ebadi@modares.ac.ir

مقدمه

سرده گلپر (Heracleum) از لحاظ تنوع گونه‌ای یک سرده بزرگ از تیره کرفسیان (Apiaceae) و بزرگ‌ترین سرده در طایفه‌ Tordylieae است که برطبق تحقیقات انجام ‌شده شامل حدود 90 تا 120 گونه است (17). از هشت گونه گزارش شده در ایران، سه گونه از آنها شامل
H. gorganicum، H. rechingeri و H. anisactis انحصاری هستند (3). در ایران گونه‌های این سرده اغلب در نواحی مرطوب در چمنزارها و کنار جویبارها، باغها و رودخانه‌ها در اکثر استانهای شمالی، شمال غربی و شمال شرقی و مرکزی از جمله خراسان، سمنان، گلستان، تهران، مازندران، گیلان، قزوین، اردبیل، آذربایجان شرقی و غربی، زنجان، کردستان، چهار محال و بختیاری، لرستان، کهگیلویه و بویراحمد، فارس و یزد می‌روید (4). اثرات و خواص درمانی اندامهای هوایی گیاه شامل برگها و عمدتاً میوه در تعداد زیادی از گونه‌های این سرده گزارش شده است (2). برای مثال از گونه H. persicum (گلپر ایرانی)، در ایران علاوه بر استفاده درمانی، به صورت ادویه، برای عطر و طعم‌دادن به غذاها و همچنین تعلیف دامها استفاده می‌شود (5 و 9).

تا به حال طبقه‌بندیهای آرایه‌شناسی متفاوتی بر اساس خصوصیات ریخت‌شناسی برای گونه‌های این سرده انجام شده است، به طور مثال گونه‌های منطقه شمال‌غرب آسیا و مدیترانه شرقی در مقیاس وسیع (27 گونه) برای اولین بار توسط Boissier تنها در دو بخشه با بخشه تک‌گونه‌ای Pseudotragium و بخشه Heracleum (Euheracleum) با 26 گونه تقسیم‌بندی شد (7). Boissier بخشه Euheracleum را بر اساس برش برگ، حضور برگه‌ها (Bracts) و برگک (Bracteoles)، تعداد و شکل لوله حاوی اسانس (Mericarp vittae) در نظر گرفت. Mandenova گونه‌های Heracleum را عمدتاً براساس وجود و ریخت‌شناسی لوله حاوی اسانس به بخشه‌های Heracleum L.، Villosa Manden.، Pubescentia Manden.، Apiifolia Manden.، Wendia (Hoffm.) Manden.، Vocontia (Calest.) Thell.، Lasiopetala Manden. و Pseudotragium Boiss) طبقه‌بندی کرد (17).

شواهد سیستماتیک قابل توجهی برای گونه‌های Heracleum، به‌خصوص در زمینه کاریولوژی (به‌طور عمده تعداد کروموزومها)، فیتوشیمی (12 و 23)، مورفولوژی دانه‌گرده (13) و آناتومی (14 و 15) به‌دست آمده است. ناپایداری درون گونه‌ای تعداد کروموزومها در تعدادی از گونه‌های این سرده، باعث شده است که تعداد کروموزومها ارزش طبقه‌بندی گیاه‌شناسی (Taxonomic) کمی داشته باشد. علی‌رغم اینکه دورگه‌گیری (هیبریداسیون) در تیره چتریان نادر می باشد، ولی این پدیده در این سرده گزارش شده است (26).

نشانگرهای مولکولی مبتنی بر توالیهای نوکلئوتیدی کوتاه ژنوم هسته‌ای و یا ژنوم اندامکها برای ترسیم روابط تبارزایی موجودات زنده از جمله گیاهان مورد استفاده قرار می‌گیرند. Logacheva و همکاران روابط تبارزایی 40 گونه آسیای غربی Heracleum را با استفاده از توالیهای ITS1 و ITS2 مورد مطالعه قرار دادند و بخشه Pubescentia به‌عنوان یک گروه تک‌نیا (Monophyletic) تأیید شد، در مقابل بخشه‌های Villosa و Heracleum هر کدام چندنیا (Polyphyletic) و بخشه Wendia پارافیلیتیک (Paraphyletic) بودند و به طور کلی گونه‌های گلپر در دو کلاد مختلف قرار گرفتند (17). Yu و همکاران روابط تبارزایشی گونه‌های گلپر از مبداء چین و همچنین گونه‌های Heracleum از منشاء منطقه هیمالیا را با استفاده از توالیهای ITS و همچنین پنج منطقه غیررمز کننده DNA کلروپلاست (شامل rps16-trnk، rps16 intron، trnQ-rps16، rpl32-trnL وpsbA-trnH) مورد مطالعه قرار دادند. نتایج حاصل نشان داد که سرده Heracleum چندنیاست و تعدادی از اعضایش وابسته به سرده‌های دیگر زیرقبیله Tordyliinae می­باشد (26).

گونه‌های Heracleum ایران در فلور ایرانیکا که مرجع اصلی شناسایی و طبقه‌بندی این گونه‌ها می‌باشد بر اساس خصوصیات ریختی مانند ارتفاع، شکل میوه، شکل برگ، ضخامت ساقه و رنگ بساک به سه بخشه (Division) یعنی Pubescentia (شامل گونه‌های H. persicum،
H. rechingeri و H. gorganicum)، Villosa (شامل گونه‌ H. antasiaticum) و Wendia (شامل گونه‌های
H. rawianum ، H. pastinacifolium، transcaucasicum.H و H. anisactis) تقسیم بندی شده است (20.( در بررسی ترکیبات اصلی متابولیتهای ثانویه اسانس میوه شش گونه گلپر (H. persicum،
H. gorganicum، H. rechingeri، H. rawianum،
H. pastinacifolium و H. anisactis) که از ایران گزارش شده است، گونه‌های H. persicum، H. gorganicum و
H. rechingeri با محتویات بالای اکتیل‌استات و هگزیل بوتیرات از دیگر گونه های‌ (H. rawianum ،
H. pastinacifolium و H. anisactis) با محتویات هگزیل بوتیرات پایین‌تر و محتویات اکتیل‌استات بالاتر متمایز شده‌اند (18). تفاوت در ترکیب اسانس در میان شش گونه نشان داد که ترکیبات اسانس به خوبی طبقه‌بندی گیاه‌شناسی بخشه‌های گلپر را بر پایه داده‌های مورفولوژیک تأیید می‌کنند. بررسی تنوع فیتوشیمیایی جمعیتهای مختلف H. persicum و همچنین سایر گونه های این همتافت (Species Complex) نیز نشان داده است که تنوع زیادی بین جمعیتها وجود دارد؛ به طوری که شناسایی برخی گونه های اندمیک ایران از جمله گونه‌های ساقه ضخیم
H. persicum، H. gorganicum و H. rechingeri و همچنین گونه‌های ساقه نازک شامل H. pastinacifolium و H. anisactis به علت شباهت زیاد ترکیبات شیمیایی اسانس میوه قابل تفکیک از سایر گونه ها نمی‌باشند (12).

با توجه به تنوع قابل‌ملاحظه ریختی در بین جمعیتهای وحشی و مشکل شناسایی گونه‌های گزارش شده بر اساس منابع گیاه‌شناسی موجود برای تأیید کارایی طبقه‌بندی گیاه‌شناسی گونه‌های Heracleum ایران بر اساس داده‌های ریخت‌شناسی، انجام بررسیهایی بر روی تنوع ژنتیک درون و بین گونه‌ها و مطالعات تبارزایی در این سرده ضروری به نظر می‌رسد. برای پاسخ به این سوال، روابط تبارزایی گونه‌های گلپر ایران با لحاظ نمودن چندین جمعیت از هر گونه با استفاده از هسته‌ای نشانگرهای هسته‌ای ITS و همچنین کلروپلاستی rpl32-trnl در این پژوهش مورد مطالعه قرار گرفته است.

مواد و روشها

مواد گیاهی:نمونه‌های 19 جمعیت از سرده گلپر جمع‌آوری شده از نواحی مختلف ایران و نروژ مورد بررسی مولکولی قرار گرفت که مشخصات جغرافیایی مربوط به آنها در جدول یک ذکر شده است. با توجه به اینکه در خصوص منشا گونه‌های اروپایی گلپر به ویژه گونه H. persicum و گونه H. mantegazzianum، که گونه‌های مهاجم در کشور نروژ بوده و در شباهت آن به گونه متداول ایران اختلاف نظرهایی وجود دارد، تعدادی از گونه های متداول در مناطق شمالی نروژ نیز مورد بررسی قرار گرفتند. برای ایجاد درخت تبارزایشی ریشه‌دار از گونه lasiopetalum Heracleum به‌عنوان برون‌گروه استفاده گردید که در برخی منابع، آن را در سردهTetrataenium قرار می‌دهند.

جدول 1- اطلاعات جغرافیایی جمعیتهای گونه‌های مختلف Heracleum مطالعه شده در این تحقیق

نمونه‌های ^* و ^** به ترتیب توسط آقای مهدی دائمی سعید آباد و آقای امیر طالبی در دسترس قرار گرفته شده است.

تجزیه و تحلیل مولکولی: نمونه‌های برگ‌ خشک‌شده، توسط دستگاه Mixer mill مدل Retsch MM 200 شرکت Qiagen پودر شدند. استخراج DNA از برگ با استفاده از کیت مخصوص استخراج DNA گیاهی (Sp Plant DNA Kit) شرکت Omega Bio-Tek صورت گرفت. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای تکثیر قطعه ITS با آغازگرهای رو به جلو ITS-p5 (5′-CCTTATCAYTTAGAGGAAGGAG-3′) و رو به عقب ITS-p4 (CCGCTTAKTGATATGCTTAAA) (8) و برای تکثیر قطعه trnl-rpl32 ازآغازگرهای رو به جلو rpl32 (′CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC-3-′5) و رو به عقب trnL (5′CTGCTTCTTAAGAGCAGCGT-3′) (24) با استفاده از دستگاه GeneAmp 9700 شرکت Applied Biosystems انجام شد. با توجه به مطالعات قبلی به خصوص مطالعه تبارزایی گلپرهای چین با استفاده از نشانگر ITS و 5 نشانگر کلروپلاستی و تنوع نسبتاً بالای نشانگرهای ITS و trnl-rpl32 در بین نشانگرهای مورد بررسی، از این دو قطعه در این مطالعه استفاده گردید (26). چرخه‌های حرارتی برای واکنش زنجیره پلیمراز برای توالی ITS شامل یک چرخه واسرشت‌سازی اولیه: در دمای 95 درجه به مدت 5 دقیقه، 35 چرخه شامل واسرشت‌سازی در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگر در دمای 54 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه، و به مدت 45 ثانیه در 72 درجه سانتی‌گراد و بسط نهایی به مدت 7 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد بود. برای قطعه trnL- rpl32 از دمای اتصال 50 درجه سانتی‌گراد استفاده گردید. برای تأیید تکثیر قطعات، الکتروفورز محصولات PCR بر روی ژل آگارز یک درصد انجام شد. محصولات PCR تک باندی قوی و بدون کشیدگی توسط شرکت ماکروژن Macrogen (کره جنوبی) با استفاده از آغازگر ITS-p5 برای قطعه ITS و آغازگر rpl32 برای قطعه rpl32-trnl در جهت پیشرو توالی‌یابی شدند. همردیفی چندگانه توسط نرم‌افزار آنلاین Clustal Omega انجام شد و نتایج همردیفی بصورت چشمی نیز مورد بررسی قرار گرفت.

برای ترسیم درخت تبارزایی، ماتریس داده‌های همردیف شده مورد استفاده قرار گرفت. توالی نوکلئوتیدی ITS شامل ITS1، 5.8s و ITS2 و توالی trnl-rpl32 19 جمعیت از نه گونه‌ سرده Heracleum، و ترکیب توالی ITS و rpl32-trnl 19 جمعیت از نه گونه از سرده Heracleum برای آنالیز تبارزایشی استفاده شد. برای رسم درخت تبارزایشی از روش‌ آنالیز بیزی با نرم‌افزارMRBAYES استفاده شد (16). برای تأیید همگرایی نتایج پارامترهای آنالیز بیزی از برنامه Tracer v1.6 (19) و برای تعیین نوع مدل جانشینی نوکلئوتیدی مناسب برای داده‌ها از نرم‌افزار jModeltest 2.1.9 استفاده شد (11). بهترین مدل جانشینی برای توالی ITS، و توالی trnl-rpl32 مربوط به 19 جمعیت از سرده Heracleum، به‌ترتیب مدلهای SYM + I و TPM3uf + G، بودند. برای ترسیم درخت تبارزایشی از نرم‌افزار FigTree استفاده گردید. برای تعیین انواع هاپلوتایپ به عنوان یکی از آماره‌های توصیف کننده تنوع ژنتیک از نرم‌افزار DnaSp 5.0 استفاده گردید (22) آنالیز شبکه‌ای هاپلوتیپ‌ها بر اساس روش اتصال میانهMJ (Median-Joining) به وسیله نرم‌افزار Network 4.6 انجام گردید (6).

نتایج

تنوع نوکلئوتیدی در قطعات ITS و trnl-rpl32: طول توالیها بعد از همردیفی چندگانه برای 19 جمعیت از گونه‌های سرده Heracleum برای هر دو قطعه مورد استفاده ITS و trnl-rpl32 به ترتیب برابر 610 و 981 نوکلئوتید بود (جدول 2)، که تعداد جایگاههای نوکلئوتیدی متغیر (Number of variable sites) در توالی ITS و trnl-rpl32 به ترتیب 42 (شکل 1) و 112 بودند. تعداد مکانهای اطلاع‌رسان صرفه‌جویی (Number of parsimony informative positions) از بین جایگاههای نوکلئوتیدی متغیر، در توالی ITS و توالی trnl-rpl32 به ترتیب 28 و 14 بود. تعداد جایگاههای یگانه یا دارای تفاوت مشاهده شده در تنها یک نمونه در توالی ITS و trnl-rpl32 به ترتیب 14 و 98 متغیر بود.

تجزیه و تحلیل تبارزایشی: در زمانی که درخت تبارزایشی توالی ITS برای 19 جمعیت از نه گونه‌ سرده Heracleum با روش استنباط بیزی ترسیم شد، گونه‌های H. transcaucasicum، H. anisactis و
H. pastinacifolium در یک گروه قرار گرفتند (شکل 2). گونه‌های H. persicum، H. mantegazzianum و
H. rechingeri نیز در یک گروه جدا قرار گرفتند، گونه
H. gorganicum از شیرین‌آباد با حمایت شاخه‌ای (Branch support) بالا در بیرون از این گروه قرار گرفت. گونه H. sphondylium و Hybrid2 و Hybrid1 در یک گروه قرار گرفتند به طوری که گونه‌ H. antasiaticum در گروه‌ خواهری این گونه و هیبریدهای احتمالی آنها قرار گرفت (شکل 2).  

جدول 2- تنوع نوکلئوتیدی در توالی نوکلئوتیدی ITS و rpl32-trnlو توالی ادغام شده آنها در گونه‌های Heracleum

شکل 1- تنوع نوکلئوتیدی در قطعه ITS در گونه‌های مورد بررسی Heracleum . جایگاههای شماره 1 تا 14، 15 تا 18 و 19 تا 42 به ترتیب نشان‌دهنده منطقه ITS1، 5.8s و ITS2 می‌باشند.

شکل2- درخت تبارزایی حاصل از روش استنباط بیزی 19 جمعیت از نه گونه‌ از سرده Heracleum بر اساس توالی نوکلئوتیدی ITS اعداد روی شاخه‌ها حمایت شاخه‌ای براساس احتمال پسین (Posterior probability) می‌باشد.

درخت تبارزایشی ترسیم شده با روش استنباط بیزی به دست آمده از قطعه trnl- rpl32در 19 جمعیت از نه گونه‌ سرده Heracleum نشان ‌می دهد که گونه‌های
H. persicum، H. mantegazzianum، H. rechingeri ،
H. gorganicum، Hybrid1، Hybrid2، H. sphondylium و H.persicum نروژ در یک گروه قرار دارند، که در بین این گونه‌ها، گونه‌های Hybrid1، Hybrid2،
H. sphondylium و H. persicum نروژ در یک شاخه جدا قرار گرفتند. این روش نتوانست جمعیتهای گونه‌های
H. pastinacifolium، H. anisactis و
H. transcaucasicum را از یکدیگر جدا کند ولی گونه
H. anisactis لیقوان را در یک گروه جداگانه قرار داد (شکل 3).

‌شکل 3- درخت تبارزایشی حاصل از قطعه trnl-rpl32 بر اساس 19 جمعیت از نه گونه Heracleum با روش استنباط بیزی. اعداد روی شاخه‌ها حمایت شاخه‌ای براساس احتمال پسین می‌باشد.

درخت تبارزایشی حاصل از ادغام توالیهای ITS و trnl-rpl32 نشان داد که گونه‌های بخشه Wendia شامل
H. pastinacifolium، H. transcaucasicum و
H. anisactis به طور کامل از سایر بخشه‌ها جدا شدند. ولی همانند تحلیلهای قطعات انفرادی، ادغام قطعات نیز نتوانست جمعیتهای مختلف مربوط به گونه مختلف داخل بخشه‌ها را تفکیک کند (شکل 4).

شکل 4- درخت تبارزایی حاصل از ترکیب توالی ITS و rpl32-trnl 19 جمعیت از نه گونه از سرده Heracleum به روش استنباط بیزی. اعداد روی شاخه‌ها حمایت شاخه‌ای براساس احتمال پسین می‌باشد.

به منظور تأیید نتایج حاصل از ترسیم درخت تبارزایشی، آنالیز شبکه‌ بر اساس هاپلوتیپ‌های شناسایی شده در هر دو توالی ترسیم شد (شکل 5و6). در نمودار شبکه، قطر بزرگتر و کوچکتر دایره‌ها به‌ترتیب نشان‌دهنده فراوانی بالا و پایین هاپلوتیپ را نشان می‌دهند. در کل نه هاپلوتیپ در نمونه‌های توالی‌یابی شده در این تحقیق مشخص شد. روابط هاپلوتیپی بر اساس ساختار شبکه در توالی ITS نشان داد که دو گروه هاپلو عمده شامل گونه‌های Aza H. transcaucasicum، H. pastinacifolium Nir ،
H. pastinacifolium Ala، H. pastinacifolium Asa ،
H. anisactis Lig، H. anisactis Kan و H. anisactis Dam گروه دیگر شامل گونه‌های H persicum Mar ،
H. persicum Anb، H. rechingeri Gar و H. rechingeri Asa بوده و گونه‌های H. sphondylium و Hybrid2 در یک هاپلو‌گروه کوچکتر و بقیه گونه‌ها به صورت انفرادی در گروههای مجزا قرار گرفتند. گونه H. gorganicum Shi با هاپلوتیپ شماره پنج با دو جهش و گونه H. persicum Nor با هاپلوتیپ شماره هشت با یک جهش از گونه‌های اصلی بخشه Pubescentia که هاپلوتیپ شش را شامل می‌شوند فاصله گرفته است. گونه‌های بخش Wendia همگی در هاپلو گروه یک قرار گرفتند. گونه Hybrid1 در هاپلوتیپ شماره نه توسط یک هاپلوتیپ مفقود شده از هاپلوتیپ شماره چهار که شامل H. sphondylium و Hybrid2 جدا شده است (شکل 5). قابل ذکر است که نمونه‌های Hybrid1 و Hybrid2 از نظر فنوتیپی شباهت زیادی به گونه H. sphondylium دارند.

شکل 5- آنالیز شبکه‌ای بر اساس تنوع هاپلوتیپی در توالی ITS. گونه‌های دارای هاپلوتیپ مشابه در کنار آن نوشته شده است. اندازه هر دایره نشان‌دهنده تعداد نمونه‌های متعلق به آن هاپلوتیپ است و هر خط تیره بین هاپلوتیپ‌ها نشان‌دهنده یک واحد جهش می‌باشد. نقاط قرمز بر روی شبکه هاپلوتیپ‌های مفقود شده را نشان می‌دهد.

روابط هاپلوتیپی بر اساس ساختار شبکه در توالی trnL- rpl32 نشان داد که سه هاپلو گروه عمده که یکی شامل گونه‌های H. transcaucasicum Aza ،
H. pastinacifolium Ala، H. pastinacifolium Asa ،
H. pastinacifolium Nir، H. anisactis Dam ،
H. anisactis Kan، هاپلو گروه دیگر شامل گونه‌های
H. sphondylium، H. persicum Nor، Hybrid1 و Hybrid2 و هاپلو گروه دیگر شامل گونه‌های
H. mantegazzianum، H. persicum Anb و
H. rechingeri Asa است. بقیه گونه‌ها به صورت انفرادی در هاپلو گروههای مجزا قرار گرفتند. اعضای بخشه Wendia به غیر از گونه H. anisactis Lig در یک هاپلوتیپ قرار گرفتند. گونه‌های H. persicum Mar با یک هاپلویید مفقود شده از بخشه Pubescentia در هاپلوتیپ شماره دو فاصله گرفته اند (شکل 6).

شکل6- آنالیز شبکه‌ای هاپلوتیپ‌های موجود در توالی trnL-rpl32 برای جزئیات بیشتر به شکل شماره 5 مراجعه شود.

بحث

نتایج بررسی توالیهای نوکلئوتیدی نشان می‌دهد که تعداد جایگا‌ههای اطلاع‌رسان صرفه‌جویی در توالی ITS (6/4 درصد) بیشتر از توالی rpl32-trnL (4/1 درصد) است که نشان‌دهند تنوع اطلاع‌رسان بیشتر درتوالی ITS نسبت به توالی rpl32-trnL است. در مقایسه توالی ITS و rpl32-trnL، توالی اولی گونه‌های مربوط به بخشه‌ها را در گروه جدا قرار داد ولی جمعیتهای مختلف داخل گونه‌ها را نتوانست جدا کند، اما توالی کلروپلاستی در جدا کردن بخشه‌ها به خوبی عمل نکرده است. توالی ITS که با سرعت بیشتری تکامل پیدا می‌کند، که این موضوع با درصد بیشتر مکانهای دارای اطلاعات اثبات می‌شود. در تحقیق حیدری و همکاران (1393) توالی ITS توانست زیرگونه‌های گیاه بادرنجبویه و ژنوتیپهای درون یک جمعیت را به خوبی تفکیک کند و این نشانگر را برای این هدف بسیار کارآمد معرفی کرد (1).

درخت تبارزایشی حاصل از ادغام توالیهای ITS و trnl-rpl32 نشان داد که گونه‌های بخشه Wendia شامل
H. pastinacifolium، H. transcaucasicum و
H. anisactis به طور کامل از سایر بخشه‌ها جدا شدند. مطالعات دیگر انجام گرفته بر روی گونه های ایرانی سرده Heracleum با استفاده از داده‌های حاصل از آنالیز اسانس میوه نتایج مشابهی را حاصل کرده است (12 و 18). علاوه بر این داده های حاصل از نشانگرهای ریزماهواره معرفی شده با استفاده از روش توالی یابی نسل جدیدی RADseq، تنها قادر به شناسایی گونه‌های در سطح بخشه بوده است (10). نتایج این تحقیق توانست طبقه‌بندی سرده را بر اساس داده‌های مورفولوژیک در سطح بخشه تأیید کند ولی جداکردن برخی از گونه‌های مشابه در همتافت‌های گونه‌ای با این داده‌ها میسر نشد.

توپولوژی درخت حاصل از دو توالی ITS و rpl32-trnL در جدا کردن بخشه‌های اصلی نسبتاً مشابه بود و ترکیب دو توالی توانست بخشه‌های مختلف را از یکدیگر جدا کند و نتیجه بهتری را ارائه داد. با این تفاوت که با توجه به تنوع پایین داده‌های rpl32-trnL پلی‌تومی نسبتاً زیادی در داخل بخشه‌ها در درخت تبارزایی حاصل نسبت به درخت حاصل از داده های ITS مشاهده شد. Yu و همکاران (2011) نیز همین نتیجه را از ترکیب توالی ITS و پنج منطقه غیررمز کننده DNA کلروپلاست برای گونه‌های Heracleum از چین گزارش کردند (26). این درخت تبارزایشی توانست گونه‌های مربوط به بخشه‌های مختلف را از هم جدا کند ولی نتوانست با توجه به متفاوت بودن در طول شاخه افراد که نشان‌دهنده متفاوت بودن آنهاست، به صورت کامل گونه‌های داخل بخشه (بر اساس طبقه‌بندی فلور ایرانیکا و ماندنوا) را از یکدیگر جدا کند. تفاوت توپولوژی بین ژنوم هسته‌ای و ژنوم پلاستیدی مختلف توسط یوسف‌زاده و همکاران (2019) هم گزارش شده است (25). که Yu و همکاران (2011) چنین تضادی بین تبارزایی به دست آمده از توالیهای هسته‌ای و پلاستیدی را در تیره کرفسیان را غیرمعمول شمرده‌اند و عواملی مانند هیبریداسیون و یا جورشدن ناقص تبارها را از علل احتمالی آن برشمردند (26) و با توجه به وجود هیبریداسیون طبیعی بین گونه‌های خواهری نقش هیبرید بین‌گونه‌ای را در این زمینه پررنگ‌تر دانستند (26). علاوه بر این وجود دورگه سازی طبیعی در بین گونه‌های گلپر اروپایی نیز در مطالعات مولکولی پیشنهاد شده است (21). نتایج حاصل از آنالیز شبکه بر اساس هاپلوتیپ‌ها نیز توپولوژِی درخت تبارزایشی حاصل از قطعه ITS را تأیید نمود.

نتیجه‌گیری کلی

در پژوهش حاضر با استفاده از داده‌های توالیهای نوکلئوتیدی جمعیتهای مختلف گونه‌های همتافت
H. persicum و H. pastinacifolium نشان داده شد که بخشه‌ها به‌صورت کاملاً مشخص از یکدیگر جدا شدند، که این نتایج تا حدود زیادی نتایج قبلی حاصل از داده‌های مورفولوژیک را تأیید نمود، اما در آنها تفکیک کامل جمعیتهای مختلف داخل هر همتافت گونه‌ای صورت نگرفت به جز مواردی از قبیل گونه H. gorganicum و
H. anisactis Lig دیده نمی‌شود و این شباهت بسیار زیاد این گونه‌ها از لحاظ مورفولوژیکی و همچنین عدم توانایی ژنهای مورد مطالعه در تفکیک کامل این گونه‌ها می‌تواند نشان‌دهنده این موضوع باشد که بعضی از گونه‌ها در اصل یک گونه هستند و به خاطر شرایط اکولوژیک از لحاظ مورفولوژیکی تغییر پیدا کرده‌اند و در عرصه جغرافیایی وسیع تنوع قابل ملاحظه‌ای نشان می‌دهند که نیاز به بررسیهای بیشتر آرایه‌شناسی برای ارائه کلیدهای شناسایی جدید و تأیید نهایی گونه‌های همتافت anisactis H. و pastinacifolium H. و همچنین گونه‌های خواهری rechingeri H. و H. persicum است. علاوه بر این باتوجه به رویش برخی از گونه ها در رویشگاههای مشترک مثلا گونه‌های H. sphondylium و H. persicum در نروژ و همچنین گونه‌‌های H. antaciaticum و H. persicum در مناطقی از ایران احتمال وجود دورگه‌سازی طبیعی بین‌گونه‌ای وجود خواهد داشت که نیاز به مطالعات بیشتر ریختی و مولکولی برای تأیید و یا رد این پدیده خواهد بود.

تشکر و قدردانی

از بنیاد علم ایران (صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران کشور) به خاطر حمایت از انجام بخشی از پژوهش (با شماره طرح 92038838) تشکر می‌گردد.