Document Type : Research Paper
Authors
1 Plant Bilology, Natural Sciences faculty, University of Tabriz, Tabriz, Iran
2 Plant biology, Natural sciences Faculty, University of Tabriz, Tabriz, Iran
3 Department of Biotechnology, Faculty of Agriculture, Azarbijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran
4 Department of Cellular and Developmental Biology of Plants, University of Bielefeld, Bielefeld, Germany
5 Department of Plant Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran
6 Drug Applied Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran
Abstract
In the most organisms, signaling photoreceptors have been made to percept and interpret of environmental signals. They can absorb light through their chromophores, trigger different signaling pathways and result in appropriate responses in the cells. Optogenetics, a new field of science, try to use the photoreceptors as molecular instruments in order to exact control of the cellular events. Determination of the new molecular instruments with special characteristics is one of the ways to develop the optogenetics. For this goal, investigation on the predicted genes ortologous with determined photoreceptors is very useful. Two Cryptochrome/ Photolyase family genes were predicted based on the results of Volvox carteri (the model algae) genome sequencing. The goals of this investigation are as follow: the exact determination and isolation of coding sequences related with these two predicted genes, insertion into the expression vector (pGEX2TK) and determination of the subclude of their open reading frames in the Cryptochrome/Photolyase family. Volvox carteri has been grown up in optimum condition. Then this two coding sequences were amplified by using RT-PCR technique. These coding sequences were inserted in the pGEX2TK by genetic engineering techniques. Produced recombinant vectors were transferred to the Escherichia coli strain Top10 and sequenced after plasmid extraction. In current study, it was found that documented mRNA sequences for these two genes in NCBI are different with our mRNA sequences.
Keywords
Main Subjects
همسانهسازی و بررسی فیلوژنتیکی توالیهای دو ژن متعلق به زیر خانواده کریپتوکروم DASH جلبک Volvox carteri
سعید مهدوی1، جعفر رازقی1*، مقصود پژوهنده2،آرش کیانیان مومنی3، علی موافقی1، مرتضی کوثری نسب4
1ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست شناسی گیاهی
2 ایران، کیلومتر 35 جاده تبریز- آذر شهر، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی
3 آلمان، بیله فلد، دانشگاه بیله فلد، گروه زیست شناسی سلولی و تکوینی گیاهی
4 ایران، تبریز، دانشگاه علوم پزشکی تبریز، مرکز تحقیقات علوم دارویی
تاریخ دریافت: 4/10/96 تاریخ پذیرش: 10/4/97
چکیده
در اکثر موجودات، گیرنده های نوری پیام رسانی به منظور درک و تفسیر علائم محیطی بهوجود آمدهاند. این مولکولها قادرند، نور را توسط کروموفورهای خود جذب کرده، مسیرهای پیام رسانی خاصی را در سلولها به راه انداخته و سبب بروز پاسخ مناسب در سلول شوند. شاخه جدیدی از علم به نام اپتوژنتیک تلاش میکند تا از گیرنده های نوری به عنوان ابزارهای مولکولی جهت کنترل دقیق وقایع سلولی استفاده کند. یکی از راههای توسعه اپتوژنتیک، شناسایی ابزارهای مولکولی جدید دارای خصوصیات ویژه می باشد. بدین منظور تعیین خصوصیات ژنهای پیش گویی شدهای که اورتولوگ گیرنده های نوری شناسایی شده می باشند، بسیار مفید خواهد بود. در پروژه تعیین توالی ژنوم Volvox carteri دو ژن پیشگوییشده متعلق به خانوادهی Cryptochrome/Photolyase شناسایی شد. هدف از این مطالعه، جداسازی توالیهای کدکنندهی این دو ژن، همسانهسازی دو ژن مذکور در داخل وکتور بیانی و تعیین موقعیت قالب خواندن باز آنها در خانواده کریپتوکروم/فتولیاز میباشد. بدین منظور، جلبک V.carteri تحت شرایط بهینه رشد داده شد. سپس با استفاده از تکنیک RT-PCR توالیهای کدکنندهی این دو ژن تکثیر شد. با استفاده از تکنیک مهندسی ژنتیک قطعات تکثیر شده وارد وکتور بیانی pGEX2TK گردید. به منظور همسانهسازی وکتور نوترکیب، پلاسمیدها وارد باکتریEscherichia coliگردیدند و سپس تعیین توالی شدند. نتیجه پژوهش نشان داد که توالیهای ثبتشده در پایگاه دادهای NCBI به عنوان توالی mRNA برای دو ژن کریپتوکروم DASH، با توالی آنها در ولوکس تفاوت هایی را نشان می دهد.
واژه های کلیدی: همسانهسازی، وکتوربیانی، گیرنده های نوری، اپتوژنتیک
* نویسنده مسئول، تلفن: 33392706-041 و 09144033450، پست الکترونیکی: Jafar_razeghi@tabrizu.ac.ir
مقدمه
موجودات فتوسنتزکننده از نور، انرژی و اطلاعات موجود در محیط پیرامون خود را کسب میکنند. در این موجودات سیستمهای نوری فتوسنتز برای کسب انرژی تکامل پیدا کردهاند. درک اطلاعات محیط با استفاده از نور توسط سیستمهای پیامرسانی ویژهای که در این موجودات تکامل یافتهاند، انجام میشود. اولین بخش از این سیستمها، سنسورهای پروتئینی گیرندهی نور میباشد. این مولکولها قادرند، نور را توسط کروموفورهای خود جذب کنند و مسیرهای سیگنالینگ خاصی را براه اندازند که باعث بروز پاسخ مناسب در سلولها میشود. گیرندههای نوری را می توان از جنبههای مختلفی مانند نوع عملکرد، طیف جذبی، نوع کروموفور، محل استقرار درون سلولی، ساختار دمین آپوپروتئینی، ساختار سوم و چهارم و سیگنال خروجی آنها طبقهبندی نمود. برخلاف تنوع عملکردی و ساختاری فراوان، گیرندههای نوری اغلب از دو بخش اصلی تشکیل شدهاند که شامل بخش درککننده نور و بخش انتقالدهنده سیگنال میباشد. در بین موجودات، ریزجلبکهای متحرک، سیستمهای حسگر خود را بمنظور ردیابی مستمر نور، بطور ماهرانهای توسعه دادهاند و از این طریق قادرند اطلاعات مورد نیاز را از محیط پیرامون کسب کرده و فعالیتهای فیزیولوژیکی خود را، با تغییرات محیطی هماهنگ کنند (6،7،8،9). کیانیان مومنی (2014)، گیرنده های نوری جلبکی را بدین طریق دسته بندی نمود:
1. LOV‑containing algal photoreceptors
1.1 Phototropins
1.2 Aureochromes
1.3 Neochromes
2. Cryptochromes
2.1 Plant-like Cryptochromes
2.2 Animal-like Cryptochromes
2.3 DASH- Cryptochromes
3. Phytochromes
4. Rhodopsin‑like photoreceptors
4.1 Channelrhodopsins
4.2 Histidine kinase rhodopsins
بجزء رودوپسینها که گیرندهای نوری غشاءگذر هستند، بقیه گیرندههای نوری بدلیل شفاف بودن غشاهای سلولی در برابر نور، سیتوپلاسمی و محلول در آب میباشند. برخلاف این موارد، کمپلکسهایجمعکننده نور و مراکز واکنش فتوسنتزی بدلیل آنکه باید انرژی نور را به صورت شیبی از انرژی الکتروشیمیایی در دو سمت غشاء تبدیل کنند، کمپلکسهای درون غشایی میباشند. ویژگیهای جذبی گیرندههای نوری، با طیف نوری رسیده به زمین، همبستگی دارد، بطوریکه این گیرندههای نوری بنحوی تکامل یافتهاند که محدودهی نور نزدیک به UV (∼350 nm)، آبی و تا قرمز/قرمز دور (∼750 nm) را جذب میکنند (شکل 1) (6،7).
شکل 1- طیف نور جذب شونده توسط برخی از گیرندههای نوری و ساختار شماتیک نمونهای از هر گروه گیرنده نوری (پایین). تصاویر پروتئینها از سایت PDBe گرفتهشدهاست. عدد دسترسی نمونهی پروتئینی فیتوکروم: 4OUR؛ کریپتوکروم: 2J4D؛ UV-B: 4DNU؛ رودوپسین: 3UG9؛ و LOV: 2Z6C است (7).
از آنجایکه زنجیرهی پلیپپتیدی سازندهی پروتئینها و زنجیرههای جانبی آمینواسیدها، توان جذب محدودهی نور مرئی را ندارند، بناچار در گیرندههای نوری، اجزای غیرپروتئینی تحت عنوان کروموفور تعبیه شدهاند. کروموفور به صورت کووالانسی و یا غیرکووالانسی به بخش آپوپروتئینی گیرنده نوری متصل میشود (11). طی چند سال گذشته، تعدادی از گیرندههای نوری جلبکی شناسایی و بطور مختصر توصیف شدهاند. برخی از این گیرندههای نوری، نسبت به گیرندههای نوری کلاسیک، ویژگیهای جدیدی را نشان میدهند، بطوریکه درک ما را از مکانیسمهای مولکولی سیستمهای حسگر نور و فرآیندهای سلولی تنظیمشده توسط نور، بهبود میبخشند. با افزایش اطلاعات دربارهی نحوهی عملکرد گیرندههای نوری و مسیرهای سیگنالینگ مرتبط با آنها، محققان توانستهاند، از این Photo-sensitive modules مربوط به گیاهان و جلبکها، ابزارهای مولکولی جهت کنترل دقیق وقایع سلولی ایجاد نمایند. به این زمینه جدید که تحقیقات پایهای مربوط به مسیرهای سیگنالینگ کنترل شونده توسط نور را به تحقیقات کاربردی ارتباط میدهد، اپتوژنتیک گفته میشود. گیرندهای نوری و اجزای موجود در مسیر سیگنالینگ نور، بعنوان ابزارهای بالقوهی این زمینه علمی، مطرح میباشند. بدین ترتیب با افزایش تعداد گیرندههای نوری شناختهشده و تعیین ویژگیهای آنها، محدودیتهای پیش روی این زمینهی علمی نوظهور بیش از پیش برداشته میشود (10). در بین گروههای گیرنده نوری فوق، شاخه کریپتوکرومهای DASH از لحاظ مکانیسم عمل و اثرات فیزیولوژیک، کمتر شناخته شدهاند. همچنین از آنجایی که این پروتئینها از نظر ساختاری حدواسط DNA فتولیازها و کریپتوکرومها هستند، تعیین خصوصیات آنها در موجودات مختلف میتواند راهگشای مسیر تکامل در درون خانوادهی Cryptochrome/Photolyase باشد. بدلیل اهمیت جلبکها به عنوان مدل در بیوتکنولوژی صنعتی و تحقیقات پایهای و همچنین ظهور تکنیکهای تعیینتوالی ژنوم باتوان عملیاتی بالا، ژنوم مربوط به تعدادی از جلبکها، مانند Volvox carteri و Chlamydomonase reinhrdtii تعیین توالی شدهاند. Prochnik و همکاران (2010) ژنوم 138 مگابازی Volvox carteri را تعیین توالی و پروتئینهای کدشونده توسط این ژنوم را پیشگویی کردند که در پایگاه دادهای NCBI قرار داده شده است (12). مطالعه آنها نشان داد که در این جلبک دو ژن DASH-کریپتوکروم متعلق به خانوادهی Cryptochrome/Photolyase کد میشود. با توصیف پروتئینهای این دو جایگاه، شاید تا حدودی ابهامهای مربوط به چگونگی عملکرد این گروه از پروتئینها، نقش آنها در جلبک فوق و توانایی بالقوهی آنها به عنوان ابزارهای اپتوژنتیک مشخص شود. به منظور استحصال مقدار مناسب پروتئین برای پژوهشهای ساختاری و عملکردی آینده نیاز به تهیه سازه بیانی بمنظور تولید آنها در سیستمهای تولید پروتئین است (1،2). در پژوهش حاضر توالی کدکنندهی این دو ژن درون وکتوربیانی pGEX2TK کلون شد و توالی دقیق نوکلئوتیدی آنها مشخص گردید.
مواد و روشها
تهیه جلبک، کشت و نمونه برداری: جلبک Volvox carteri f. nagariensis strains Eve10 (female) توسط دکتر آرش کیانیان اهدا گردید. جلبک در محیط کشت SVM (13) در دمای 28 درجه سانتیگراد و تحت چرخه نوری 8 ساعت تاریکی و 16 ساعت روشنایی مربوط به نور سفید حاصل از لامپ LED با شدت نور تقریبی به طور میانگین 1700 لوکس رشد داده شد. پس از رسیدن کشتها به بیوماس مناسب، نمونه برداری به منظور استخراج RNA انجام شد.
جدول 1- توالی آغازگرهای استفاده شده برای تکثیر قالب باز خواندن دو ژن VcCryDASH1 و VcCryDASH2
توالی آغازگر |
نام ژن |
AAGGATCCATGGCCGCCGCCGGCTG (آغازگر رفت) |
VcCryDASH1 |
AAGAATTCCTACGCATACCCACCCGAGC (آغازگر برگشت) |
|
AAAGATCTATGGCGATGCCTGGTACGG (آغازگر رفت) |
VcCryDASH2 |
AAGAATTCTTACGTCTGTGCCTTGGCCT (آغازگر برگشت) |
|
کشت باکتریE.coli سویه Top10 (Invitrogen) و انتقال ژن به آن: محیط کشت LB مایع دارای آنتیبیوتیک استرپتومایسین (100 میکروگرم بر میلی لیتر) برای کشت باکتری مورد استفاده قرارگرفت. باکتریها توسط محلول TSS مستعدسازی شدند. سپس 5 مایکرولیتر از محصول واکنش اتصال، برای تراریختی باکتری با بکارگیری روش شوک حرارتی TSS، استفاده شد (4). بمنظور انتخاب باکتریهای تراریختشدهی دارای وکتور نوترکیب، از محیط کشت LB جامد حاوی آنتیبیوتیک آمپیسیلین (50 میکروگرم بر میلی لیتر) و انجام PCR-Colony استفاده شد.
استخراج پلاسمید از باکتریهای دارای قطعهی کدکنندهی ژنها، انجام هضم آنزیمی روی پلاسمیدهای نوترکیب و تعیینتوالی: باکتریهای دارای پلاسمید نوترکیب در LB مایع دارای آنتیبیوتیک انتخابگر، کشت داده شدند. استخراج پلاسمید با استفاده از کیت استخراجAccuPrep® Plasmid Mini Extraction Kit (BIONEER, Korea) مطابق دستورالعمل شرکت سازنده انجام شد. بمنظور تایید بیشتر بر روند مهندسیسازه، پلاسمیدهای استخراجشده تحت واکنش هضم آنزیمی قرار گرفتند. پس از تایید حضور قطعات در وکتور، نمونهها برای تعیینتوالی به شرکت توپازژن (ایران) ارسال شد.
بازیابی توالیهای پروتئینی مربوط به خانوادهی ژنی Cryptochrome/DNA photolyase و ترسیم درخت تکاملی: با استفاده از سرور BLASTp (3) توالیهای دو ژن VcCryDASH1 و VcCryDASH2 در مقابل پایگاههای دادهای Uniprot (www.uniprot.org) و PDB (www.rcsb.org) مورد جستجو قرار گرفت. توالیهای پروتئینی توصیف شدهی مربوط به خانوادهی Cryptochrome/DNA photolyase در موجودات مختلف بازیابی شدند و توسط نرمافزار تحتوب Clustal Omega (15) همردیفسازی توالیها انجام شد. همردیفسازی با استفاده از نرم افزار BioEdit V7.0.9 (5) بهینه شد. در نهایت با استفاده از نرم افزار MEGA5 (16) توسط روشهای Maximum likelihood و Neighbor-Joining (14) درخت فیلوژنیک ترسیم شد.
نتایج و بحث
با توجه به بررسیهای in silico انجام شده، برای CDS ژنهای VcCryDASH1 و VcCryDASH2 بترتیب دو توالی (توالی 3078bp ثبتشده در NCBI با شماره دسترسی XM_002953647 و توالی 1710bp حاصل از بررسی EST) و یک توالی نوکلئوتیدی (توالی 2217bp ثبتشده در NCBI با شماره دسترسی XM_002955358) وجود دارد. دو توالی مربوط به ژن VcCryDASH1 در بخش بزرگی در ناحیهی 5' یکسان هستند و تفاوت در توالی نوکلئوتیدی3' است (نتایج حاصل از این بررسی نشان داده نشده است). بدین ترتیب برای ژن فوق یک آغازگر رفت و دو آغازگر برگشت طراحی شد. توسط آنزیم پلیمراز دارای قابلیت تصحیحکنندگی، PCR انجام شد. برای ژن VcCryDASH1 و VcCryDASH2 از دمای اتصال 58 °C استفاده شد. شکل 2 تصویر ژل الکتروفورز محصولات PCR برای تکثیر قطعات کدکنندهی دو ژن فوق می باشد. همانطور که مشخص است در مورد ژن VcCryDASH1 طول قطعهی ایجادشده با طول قطعهی حاصل از بررسی EST همخوانی بیشتری دارد.
1 |
2 |
M |
شکل 2- الکتروفورز ژل آگارز قطعات تکثیر شده با PCR. ستون 1: حاوی باند مربوط به VcCryd1؛ ستون 2: حاوی باند مربوط به VcCryd2.
پس از تکثیر قطعات کدکننده و تخلیص از ژل، واکنش هضم آنزیمی بر روی آنها و همچنین وکتور بیانی pGEX2TK انجام شد. پس از تخلیص قطعات و وکتور برشیافته از ژل، واکنش اتصال اجرا گردید. تراریختی باکتریE.coli سویهی Top10 با استفاده از روش شوک حرارتی TSS انجام شد. همسانههای مشاهدهشده در سطح محیط انتخابی توسط روش کلنیPCR (شکل 3)، استخراج پلاسمید و همچنین هضم آنزیمی پلاسمید استخراجشده مورد بررسی قرار گرفتند (شکل 4 و 5). سپس تعیین توالی قطعات مذکور انجام شد. انجام BLAST (BLASTn و BLASTp) نشان داد که این دو توالی نوکلئوتیدی متعلق به جلبکVolvox carteriهستند (جدول 2).
نتایج حاصل از تعیینتوالی با استفاده از نرمافزارهای تحتوب به توالی آمینواسیدی متناظر با آن تبدیل شدند (شکل6 و 7).
M |
P |
P |
P |
N |
N |
N |
N |
N |
الف |
P |
P |
P |
P |
M |
P |
P |
N |
N |
N |
N |
N |
N |
ب |
شکل 3- ژل الکتروفورز محصولات واکنش کلنی PCR برای ژن VcCryDASH1 (الف) و VcCryDASH2 (ب). M : مارکر P: مشخص کنندهی همسانههای مثبت؛ N: مشخصکنندهی همسانههای منفی.
pGEX2TK::Vcryd1 |
pGEX2TK |
VcCryd1 |
pGEX2TK |
1 |
M |
3 |
2 |
2 |
1 |
شکل 4- ژل الکتروفورز استخراج پلاسمید نوترکیب pGEX2TK::Vcryd1 و برش آنزیمی آن. ستون 1: پلاسمید نوترکیب pGEX2TK::Vcryd1 که توسط یک آنزیم برشی هضم شده است؛ ستون 2: پلاسمید pGEX2TK که توسط یک آنزیم برشی هضم شده است؛ ستون 3: پلاسمید نوترکیب pGEX2TK::Vcryd1 که توسط دو آنزیم برشی هضم شده و قطعهی وارد شده از آن خارج شده است؛ M: مارکر.
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
M |
شکل 5- ژل الکتروفورز استخراج پلاسمید نوترکیب pGEX2TK::Vcryd2 و برش آنزیمی آن. ستونهای 1، 2 و 4: برش pGEX::VcCryd2با استفاده از آنزیم EcoRI؛ ستون 3: برش pGEX2TK با استفاده از آنزیم EcoRI؛ ستونهای 5 و 6: به ترتیب مربوط به استخراج پلاسمید از کلون های حاوی pGEX::VcCryd2 و pGEX2TK.
شکل 6- توالی نوکلئوتیدی استنباط شده از تعیین توالی VcCryDASH1 و توالی آمینواسیدی متناظر با آنها.
شکل 7- توالی نوکلئوتیدی استنباط شده از تعیین توالی VcCryDASH2 و توالی آمینواسیدی متناظر با آنها.
جدول 2- نتیجه حاصل از BLASTn برای VcCryDASH1(بالا) و VcCryDASH2 (پایین).
Accesion |
Ident |
E value |
Query cover |
Total score |
Max score |
Organism name |
|
99% |
0.0 |
99% |
5256 |
2571 |
Volvox carteri f. nagariensis |
98% |
0.0 |
39% |
1137 |
876 |
Volvox carteri f. nagariensis |
|
82% |
0.0 |
48% |
676 |
676 |
Chlamydomonas reinhardtii |
Accesion |
Ident |
E value |
Query cover |
Total score |
Max score |
Organism name |
99% |
0.0 |
88% |
3853 |
2778 |
Volvox carteri f. nagariensis |
از تعیین ساختمان اولیهی این دو پروتئین، دمینهای عملکردی این دو قالب باز خواندن با استفاده از سرورهای Pfam، CD-NCBI، Motif Scan، InterPro Scan و ProDom تعیین شدند، که تصویر شماتیک مربوط به آنها در شکل 8 آورده شده است.
B |
A |
شکل 8- دمینهای پیشگویی شده در پروتئینهای VcCryDASH1 (A) و VcCryDASH2 (B). دمین قرمز رنگ: DNA Photolyase Domain؛ دمین آبی رنگ: FAD Binding Domain.
همانطور که انتظار میرفت، این دو پروتئین دارای دمینهایی هستند که در تمام اعضاء خانوادهی پروتئینی Cryptochrome/Photolyase وجود دارند. بدین ترتیب مشخصشد که این دو پروتئین در این خانواده قرار میگیرند. بمنظور تعیین موقعیت این دو پروتئین در این خانواده، با استفاده از توالی آمینواسیدی آنها و توالیهای آمینواسیدی مربوط به اعضاء خانوادهی Cryptochrome/Photolyase در موجودات مختلف، که از پایگاههای دادهای Uniprot و NCBI بدست آمده بودند، توسط نرمافزار Mega 5 درخت فیلوژنتیک رسم شد (شکل 9). همانطور که در درخت مذکور مشخص است این دو پروتئین در شاخه مربوط به کریپتوکرومهای DASH قرار میگیرند و قالب باز خواندن آنها هم همانطور که انتظار میرفت در گروه کریپتوکرومهای DASH قرار میگیرند.
با مقایسهی توالی نوکلئوتیدی کدکنندهی بدست آمده از توالییابی و توالی ژنی موجود در NCBI، محل دقیق اگزونها برای هر دو ژن VcCryDASH1 و VcCryDASH2 مشخص شد. مقایسه بین اگزونهای پیشگویی شده (ثبتشده در NCBI) و تعیینشده در این پژوهش نشان داد که در ژن VcCryDASH1 به جای 20 اگزون (که در NCBI ثبت شده است)، فقط 11 اگزون وجود دارد. اگزونهای 1 تا 8 آنها دارای موقعیت یکسان میباشند اما موقعیت اگزونهای 9، 10 و 11 در آنها تفاوت دارد.
شکل 9- درخت تکاملی ترسیم شده توسط توالیهای پروتئینی اعضاء خانوادهی Cryptochrome/Photolyase توسط روش Maximum liklehood. مربع سبز رنگ موقعیت کلاد Animal-like Cryptochromes، مربع قرمز رنگ کلاد DASH Cryptochromes و مربع آبی رنگ موقعیت کلاد Plant-like Cryptochromes را نشان میدهند. پیکانها محل دو ژن مورد مطالعه را نشان میدهند.
همچنین بقیهی اگزونهای موجود در ژن ثبتشده در NCBI تکرار مربوط به اگزونهای 4 تا 11 آن میباشند. اگزون شمارهی 20 در ژن ثبتشده در NCBI منحصربفرد است و هیچ همتایی در توالیکدکنندهی VcCryDASH1 حاصل از توالییابی انجامشده در این پژوهش ندارد. توالی VcCryDASH2 ثبتشده در NCBI دارای 13 اگزون می باشد در حالی که توالی حاصل از این پژوهش فقط 12 اگزون دارد. مقایسه بین موقعیت اگزونها VcCryDASH2 مربوط به توالیکدکنندهی حاصل از این پژوهش با توالی ژن ثبتشده در NCBI نشان داد که اگزون 1 تا 7 کاملا مشابه است و فقط در اگزون 6 حاصل از توالییابی، کدون GAA (مربوط به اسیدآمینهی گلوتامات) در 5' اگزون وارد نمیشود. تفاوت اصلی در این دو توالی بین اگزونهای 8 تا 11 میباشد (شکل 10). با توجه به بررسیهای بیوانفورماتیکی انجام شده مشخص شد که اگزونهای 1 تا 3 در توالی ژن مربوط به VcCryDASH1 منحصربفرد بوده در حالی که اگزونهای 4 تا 11 دارای دو نسخهی تقریبا مشابه (در برخی از اگزونها دو نسخه از اگزون کاملا یکسان بوده اما در برخی دیگر از آنها حذفشدگی یا اضافهشدگی و یا تغییر، مشاهده میشود) میباشد. به عنوان مثال اگزون شمارهی 4 با اگزون شمارهی 12 و یا اگزون 5 با اگزون 13 مشابه می باشد. با بررسی بیوانفورماتیکی بر روی اورتولوگ این ژن در کلامیدوموناس مشاهده شد که این ارگانیسم دارای یک ژن 11 اگزونی میباشد (این بررسیها در مقاله نشانداده نشده است). از آنجائیکه ولوکس و کلامیدوموناس دارای مسیر تکاملی یکسانی بودهاند وبنظر میرسد که کلامیدوموناس نیای ولوکس باشد، میتوان این احتمال را مطرح کرد که وجود اگزونهای 12 تا 19 ناشی از وقوع دوبرابرشدگی اگزونی در ولوکس میباشد. همچنین وقوع جهشهای مختلف را میتوان دلیل عدم تشابه کامل بین اگزونهای مشابه در نظر گرفت. شاید وقوع این رخداد درمسیر تکامل آینده و قدرت بقاء ولوکس تاثیر گذار باشد، به گونهای که در طول تکامل اگزونهای حاصل از دوبرابرشدگی عملگر شده و باعث ایجاد پروتئین جدید با قابلیت اصلاحشده و یا حتی کاملا متفاوت از پروتئین اولیه گردد.
تشکر و قدردانی
این پروژه با حمایت مالی مرکز مطالعات و همکاری های علمی بین المللی انجام شده است و از این طریق از مسوولین مربوطه تشکر و قدردانی می شود.
اگزون 9 |
اگزون 8 |
اگزون 8 |
NCBId2 1141 CGAAGAGCGCTACAGCGCCTTCAGGAGCTGGTCGGGTTGGACTACAGCCAGCTACTGCCG
Vcd2 1141 CGAAGAGCGCTACAGCGCCTTCAGGAGCTGGTCGGGTTGGACTACAGCCAGCTACTGCCG
NCBId2 1201 CCAGTAGAGCCCGAAGGGCCACCGGCGCCACACGACCCGCGTACGGCATTTCCCTTCCAC
Vcd2 1201 CCAGTAGAGCCC---GGGCCACCGGCGCCACACGACCCGCGTACGGCATTTCCCTTCCAC
NCBId2 1261 GCCGGCTACAGCAGCGCCGTACGCCGCCTGCGGTACTACGTTTGGGGCCACCCGGAAGGG
Vcd2 1258 GCCGGCTACAGCAGCGCCGTACGCCGCCTGCGGTACTACGTTTGGGGCCACCCGGAAGGG
NCBId2 1321 GCTCCCCCGGAGCTGCCAAGCGACCCACGGGACGGCGCCGGATCCAGCTCCCAGCCGCAT
Vcd2 1318 GCTCCCCCGGAGCTGCCAAGCGACCCACGGGACGGCGCCGGATCCAGCTCCCAGCCGCAT
NCBId2 1381 GGGGCCCCCGTGAGCTCTCCACCCTCGTTGCTGTATTTCACCAACACCCGGGCGCAGGCG
Vcd2 1378 GGGGCCCCCGTGAGCTCTCCACCCTCGTTGCTGTATTTCACCAACACCCGGGCGCAGGCG
NCBId2 1441 GTTGGTGTGGACAGCAGCACTAAGTTGTCGCCCTTCGTGGCGCTGGGCTGCATCACGTCG
Vcd2 1438 GTTGGTGTGGACAGCAGCACTAAGTTGTCGCCCTTCGTGGCGCTGGGCTGCATCACGTCG
NCBId2 1501 CGCCAAATACATGAGGAGCTGTCGACCACACCA----CCGCTTCC-CGGGTCCTGTTTTG
Vcd2 1498 CGCCAAATACATGAGGAGGTGGAGCAGGTACGAGCAGCTGCTACTGCGGCTGCTGCT---
NCBId2 1556 GAACCCTTGTAAGCTCCCCCTTCGCCCTGGCGGGGGTCAACCCTGCATGGGTC-------
Vcd2 1555 --ACTGCTGCATGCAGAGC---CACACTGGCAGATACTGCAGCAGCAGGAGCAGGAGCAG
NCBId2 1609 -------------TGTATCCGCGCGCGGTG---CACGTGCAGGTGG--------------
Vcd2 1610 GAGAAATAGCCCGTGCAGCGGCGGGTGGTGGGCAGCGTGGGGCCGGCGCTACTGCCAACC
NCBId2 1639 --------------------------AGCAGTAGCTCAGTACCAGCCCCCGCCGAGTGTG
Vcd2 1670 CCGGCCCGGCCTCCCCTCCCCCCGGCGGCAGTAGCTCAGTACCAGCCCCCGCCGAGTGTG
اگزون 10 |
NCBId2 1673 ATTGGCTGGCCATGCACCTGTGCATCCGGGACTTCTTCATCTTCACGACGCTCAAGGAGG
اگزون 9 |
Vcd2 1730 ATTGGCTGGCCATGCACCTGTGCATCCGGGACTTCTTCATCTTCACGACGCTCAAGGAGG
NCBId2 1733 GTGATGCCGTACTGGACGAACGGGGCATTATGGGTCTCCCCGTCAGCTGGCGGAACGACA
Vcd2 1790 GTGATGCCGTACTGGACGAACGGGGCATTATGGGTCTCCCCGTCAGCTGGCGGAACGACA
NCBId2 1793 TGGAGACATTCACTCGGTGGGCCCAGGGCCGCACGGGTCTCCCCTTCGTGGACGCCAACA
Vcd2 1850 TGGAGACATTCACTCGGTGGGCCCAGGGCCGCACGGGTCTCCCCTTCGTGGACGCCAACA
NCBId2 1853 TGCGGGAGCTGGCGGTCACCGGCTGGATGAGCAACCGGGGCCGACAGAACGTGGCTAGCT
Vcd2 1910 TGCGGGAGCTGGCGGTCACCGGCTGGATGAGCAACCGGGGCCGACAGAACGTGGCTAGCT
NCBId2 1913 TGCTGACCAAGGACCTGGGGGTAGACTGGAGATGGGGTGCGGAGCTGTTTGAGAGCTTGT
Vcd2 1970 TGCTGACCAAGGACCTGGGGGTAGACTGGAGATGGGGTGCGGAGCTGTTTGAGAGCTTGT
NCBId2 1973 TGGTGGATTGCGATGTGGCGGTTAACTATTGCAACTGGAATTACTTTGCTGGTATCGGGA
Vcd2 2030 TGGTGGATTGCGATGTGGCGGTTAACTATTGCAACTGGAATTACTTTGCTGGTATCGGGA
NCBId2 2033 ACGACCCACGCAATCGCCATTTCAAGACCGTGACT-------------------------
Vcd2 2090 ACGACCCACGCAATCGCCATTTCAAGACCGTGACTCAGGGCATGAAGTACGACGAGGATG
اگزون 13 |
اگزون 12 |
NCBId2 2068 -----------------------------------------------------------C
Vcd2 2150 CCGCGCTCGCCGCTACATGGCTGCCCGAGCTGGCCGCTCTACCGCCCGCTCCCCGCCACC
اگزون 11 |
اگزون 11 |
اگزون 10 |
اگزون 12 |
NCBId2 2069 AGCCCTGGGCCATGACGGCGGAGGAAGCTGAGCAGTACAGCTTTGTACTGGGCCGCGATT
Vcd2 2210 AGCCCTGGGCCATGACGGCGGAGGAAGCTGAGCAGTACAGCTTTGTACTGGGCCGCGATT
NCBId2 2129 ACCCTTTTCCTTTGGTCGACCCGGCTAACCATGTCGGCCAGCTGACGGGCACGGGGAAGC
Vcd2 2270 ACCCTTTTCCTTTGGTCGACCCGGCTAACCATGTCGGCCAGCTGACGGGCACGGGGAAGC
NCBId2 2189 GCAGGAACAAGGCCAAGGCACAGACGTAA
Vcd2 2330 GCAGGAACAAGGCCAAGGCACAGACGTAA
شکل 10- مقایسهی توالی کدکنندهی VcCryDASH2 ثبتشده در NCBI (NCBId2) و تعیینشده در این پژوهش (Vcd2). فلشهای نمایش دادهشده در بالای همردیفی مربوط به موقعیت اگزون در توالی NCBId2 و در پایین آن مربوط به توالی Vcd2 میباشد.