Authors
1 2- Department of Agriculture, Payame Noor University, Iran
2 Department of Biology, Payame Noor University, I.R. Iran
Abstract
Teucrium polium L. is one of the well-known medicinal and aromatic plants. In this study, we have used the SCoT marker to determine genetic variation among 17 genotypes of Teucrium polium collected from Kermanshah province, Iran. All of the SCoT primers showed 48 polymorphic bands. The primers of Sc20, Sc59 and Sc21 showed the highest number of band (6 bands) and Sc15 showed the lowest number of bands (2 bands). The mean polymorphic information content (PIC=0.361), marker index (MI= 1.525), Effective multiplex ratio (EMR= 4.197), polymorphism percentage (98.485%) and Resolving Power (RP=2.837) indices were calculated for all primers. The greatest similarity was between Gilan-gharb2 and Salas2 stations with 0.732 values. The lowest genetic similarity was between Naft-Shahr with Gilan-gharb1 and Gilan-gharb2 stations with 0.1. The cluster analysis group showed that the genotypes were classified into two groups, and the results of the clustering were confirmed by the use of molecular variance analysis (AMOVA) and principal components analysis (PCoA).
Keywords
بررسی تنوع ژنتیکی ژنوتیپهای گونه مریم نخودی (L.Teucrium polium) در غرب ایران با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT
محسن فرشادفر1*، هومن شیروانی1، مصطفی امجدیان1 و عبدالمهدی نوریان2
1 ایران، تهران، دانشگاه پیام نور، گروه کشاورزی
2 ایران، کرمانشاه، دانشگاه پیام نور، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 26/7/1396 تاریخ پذیرش: 19/3/1397
چکیده
مریم نخودی (L. Teucrium polium) از قدیمیترین گیاهان دارویی میباشد که در طب سنتی کاربرد فراوان دارد. جهت تعیین میزان تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپهای مختلف مریم نخودی 17 ژنوتیپ از این گونه با استفاده از 15 آغازگر SCoT مورد بررسی قرار گرفت که 11 آغازگر دارای باندهای قابل امتیازدهی بودند. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 48 باند چند شکل تولید کنند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 17 ژنوتیپ برابر 82/2 بود. آغازگرهای SC20، SC21 و SC59 با 6 باند بیشترین تعداد و آغازگر SC15 با 2 باند کمترین تعداد باند را تکثیر نمود. میانگین درصد چند شکلی (PPB%)، محتوای اطلاعات چند شکلی (PIC)، شاخص نشانگری (MI)، شاخص نسبت چندگانه مؤثر (EMR) و شاخص تفکیک (RP) در بین آغازگرهای مورد بررسی به ترتیب برابر 485/۹۸، 361/۰، 525/۱ و 197/۴ بود. در حالت کلی و بر اساس تمام شاخصها، مناسبترین آغازگرها برای بررسی گونه مریم نخودی، آغازگرهای SC59 و SC11 تعیین شد. بیشترین تشابه را ژنوتیپهای (گیلان غرب2) با (ثلاث2) (732/0) و کمترین تشابه را ژنوتیپ (نفت شهر) با ژنوتیپهای (گیلان غرب1) و (گیلان غرب2) (10/0) داشت. گروهبندی حاصل از تجزیه کلاستر نشان داد که ژنوتیپها در 2 گروه قرار گرفته که نتایج حاصل از گروهبندی با استفاده از تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA) و تجزیه به مؤلفههای اصلی (PCoA) تایید گردید.
واژه های کلیدی: مریم نخودی، تنوع ژنتیکی، نشانگرمولکولی، SCoT
* نویسنده مسئول، تلفن: 09183312331 ، پست الکترونیکی: Farshadfarmohsen@yahoo.com
مقدمه
براساس برآوردهای سازمان بهداشت جهانی، بیش از 80 درصد از جمعیت جهان در کشورهای در حال توسعه سلامتی خود را بهطور مستقیم یا غیرمستقیم، مدیون گیاهان دارویی هستند و در کشورهای پیشرفته نیز استفاده از ترکیبات شیمیایی گیاهان دارویی رو به افزایش است (4). به دلیل عوارض فراوان ناشی از استفاده از داروهای شیمیایی مصنوعی، استقبال چشمگیری از داروهای طبیعی با منشاء گیاهی شده است (10). جنس مریم نخودی (Teucrium L.) متعلق به تیره نعناع، شامل بیش از 340 گونه است و در کشور ایران 12 گونه از این جنس رویش دارد که گونههای مختلف آندر طب سنتی به عنوان گیاه دارویی استفاده میشوند. در استان کرمانشاه چهار گونه
(T. polium L., T.oriental L., T.oliverianum Ging. ex Benth, T.parvifolium Schreb ) از این جنس در اکثر مناطق استان (دالاهو، اسلام آبادغرب، گیلانغرب، صحنه، سرپلذهاب و روانسر) رویش دارد (22). از 2000 سال پیش تا کنون، گونههای مختلف L. Teucriumگیاه دارویی شناخته شده و از آن به عنوان ضد تشنج، ضد التهاب، ضد درد، تب بر و التیام دهندگی زخم استفاده میگردد (22). آگاهی دقیق از تنوع ژنتیکی موجود در ژرمپلاسم گیاهی ضمن حفظ ذخائر ژنتیکی گیاهی، قابلیت استفاده از آنها را در برنامههای اصلاحی تعیین میکند. همچنین کسب اطلاع از فاصله ژنتیکی نسبی بین افراد و جمعیتها و روابط خویشاوندی بین آنها، امکان سازماندهی ژرمپلاسم و تهیه جمعیتهای مناسب برای ترسیم نقشه ژنتیکی و مکانیابی ژنها را فراهم میسازد (28). بیشتر بهنژادگران معتقدند که کمبود تنوع ژنتیکی پیشرفتهای اصلاحی را در آینده مختل میکند (20). ارزیابی تنوع ژنتیکی در گیاهان برای برنامههای اصلاحی و حفاظت از ذخایر توارثی، حیاتی بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی در گونه گیاهی برای انتخاب والدین جهت رسیدن به هیبرید مناسب از اهمیت زیادی بر خوردار است (23). تنوع ژنتیکی میتواند به وسیله تخمین فاصله ژنتیکی با استفاده از اطلاعات شجره یا با استفاده از نشانگرهای مولکولی شناسایی شود (25). به منظور تخمین این تنوع انواع مختلفی از سیستمهای نشانگری توسط بهنژادگران گیاهی استفاده میشود که از جمله آنها میتوان به نشانگرهای مورفولوژیکی و مولکولی شامل بیوشیمیایی و DNA اشاره کرد. نشانگرهای DNA امکان شناسایی مستقیم تنوع توالی ژنومی را در بین گیاهان فراهم میکنند که میتواند در تکمیل اطلاعات شجرهنامه مورد استفاده قرار گیرند (24). نشانگر مولکولی SCoT یا کدونهای آغاز هدف واقع شده، روشی است که در آن پرایمرها بر اساس توالیهای آغازگر (ATG) طراحی شده و نواحی بین کدونهای آغازگر طی واکنش زنجیرهای پلیمراز تکثیر میشود و تفاوتها آشکار میشود (9). از نشانگر مولکولی SCoT در بررسی تنوع ژنتیکی گیاهان دارویی مانند جاتروفا (.L Jatropha curcas) و کاکوتی (L. Ziziphora tenuior) استفاده شده است که در مقایسه با نشانگرهای RAPD و ISSR تنوع ببشتری را نشان داده است (13 و 30). هدف از این تحقیق شناسایی تنوع ژنتیکی بین ژنوتیپهای مریم نخودی با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT در راستای بهبود ذخایر ژنتیکی کشور میباشد.
مواد و روشها
در تحقیق انجام شده بذرهای 17 ژنوتیپ از گیاه دارویی مریم نخودی (T. polium L.) پس از شناسایی توسط کارشناسان بخش تحقیقات منابع طبیعی مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی استان کرمانشاه، جمعآوری و پس از ثبت در هرباریوم این مرکز به منظور استخراج DNA در گلدان کشت گردید (جدول 1 و شکل 1).
شکل 1- محل جمعآوری ژنوتیپهای مورد بررسی
استخراج DNA به روش CTAB تغییر یافته (6) برای هر ژنوتیپ در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشگاه پیام نور مرکز کرمانشاه انجام گرفت. بعد از انتقال ۲۰ تا ۵۰ میلیگرم نمونه خرد شده با ازت مایع به تیوب، ۸۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج (۴ گرم CTAB، ۳۶/۱۶ گرم NaCl، ۱۵/۳ گرم Tris-HCl، ۴۸/۱ گرم EDTA، ۴۰۰ میکرولیتر b-mercaptoetchanol در ۸=pH به حجم 100 میلیلیتر) به تیوبها اضافه شد و به مدت یک ساعت نمونهها در حمام آبی با دمای ۶۵ درجه سانتی گراد قرار داده شدند. سپس به هر نمونه مقدار ۸۰۰ میکرولیتر محلول کلروفرم-ایزوآمیل الکل (24:1) اضافه گردید و به مدت 20 دقیقه خوب به هم زده شد تا محلول داخل تیوپ یکنواخت شود. پس از آن نمونهها را به مدت ۱۰ دقیقه با ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه، سانتریفیوژ و فاز رویی به یک تیوب تمیز منتقل گردید و به هر تیوب مقدار ۶۰۰ میکرولیتر محلول ایزوپروپانول سرد اضافه و به مدت یک ساعت در فریزر در دمای ۲۰- درجه قرارداده شدند. سپس تیوبها به مدت ۱۵ دقیقه با ۱۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ گردید و بعد از آن فاز مایع به آرامی خالی و به هر تیوب مقدار ۶۰۰ میکرولیتر اتانول 80 درصد سرد اضافه و یک سانتریفیوژ کوتاه صورت گرفت و به آرامی فاز مایع خالی شد (این مرحله دو بار تکرار شد) در پایان نیز تیوبها در دمای اتاق قرار گرفتند تا خشک شوند و بعد به هر تیوب میزان ۱۰۰ میکرولیتر آب دو بار تقطیر استریل اضافه گردید. بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده با استفاده از ژل ۸/۰ درصد آگارز و دستگاه اسپکتوفتومتر صورت گرفت. واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) در حجم 20 میکرولیتر (50 نانوگرم DNA الگو، 2 میلی مولار MgCl2، 05/0 میلیمولار از هر dNTP، 2/0 میکرومول آغازگر، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase و بافر واکنش به مقدار x1) انجام شد.
جدول 1- مشخصات ژنوتیپهای مورد استفاده در تحقیق
ارتفاع سطح دریا (متر) |
طول جغرافیایی |
عرض جغرافیایی |
منطقه جمع آوری |
کد ژنوتیپ |
ژنوتیپ |
||||
1750 |
47 |
41 |
51 |
34 |
29 |
64 |
صحنه1 |
Te.p Ksh-Sah1 |
G1 |
600 |
46 |
31 |
00 |
34 |
15 |
60 |
سرپل1 |
Te.p Ksh-Sar1 |
G2 |
550 |
45 |
54 |
32 |
33 |
57 |
18 |
سومار |
Te.p Ksh-Som |
G3 |
1750 |
46 |
51 |
22 |
34 |
31 |
12 |
روانسر1 |
Te.p Ksh-Rav1 |
G4 |
1800 |
46 |
02 |
11 |
34 |
36 |
63 |
سرپل2 |
Te.p Ksh-Sar2 |
G5 |
870 |
46 |
00 |
27 |
34 |
25 |
08 |
سرپل3 |
Te.p Ksh-Sar3 |
G6 |
1450 |
46 |
18 |
21 |
33 |
57 |
58 |
گیلان غرب1 |
Te.p Ksh-Gil1 |
G7 |
1700 |
46 |
10 |
26 |
34 |
11 |
49 |
دالاهو1 |
Te.p Ksh-Dal1 |
G8 |
1700 |
46 |
10 |
26 |
34 |
11 |
49 |
دالاهو2 |
Te.p Ksh-Dal2 |
G9 |
365 |
45 |
36 |
31 |
34 |
21 |
49 |
نفت شهر |
Te.p Ksh-Naf |
G10 |
1570 |
46 |
12 |
70 |
34 |
17 |
67 |
دالاهو3 |
Te.p Ksh-Dal3 |
G11 |
1720 |
47 |
08 |
50 |
34 |
47 |
29 |
صحنه2 |
Te.p Ksh-Sah2 |
G12 |
1200 |
46 |
04 |
95 |
34 |
45 |
36 |
ثلاث1 |
Te.p Ksh-Sal1 |
G13 |
650 |
45 |
50 |
08 |
34 |
23 |
01 |
گیلان غرب2 |
Te.p Ksh-Gil2 |
G14 |
1700 |
46 |
33 |
39 |
34 |
21 |
31 |
اسلام آباد |
Te.p Ksh-Esl |
G15 |
1550 |
46 |
43 |
15 |
34 |
47 |
33 |
روانسر2 |
Te.p Ksh-Rav2 |
G16 |
1361 |
46 |
12 |
00 |
34 |
45 |
29 |
ثلاث2 |
Te.p Ksh-Sal2 |
G17 |
چرخه حرارتی شامل یک مرحله واسرشت سازی اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد و به مدت ۵ دقیقه و ۳۵ چرخه حرارتی بود که در هر چرخه نیز، زمان و دمای واسرشتسازی به ترتیب ۳۰ ثانیه و ۹۵ درجه سانتیگراد، زمان اتصال آغازگر ۳۰ ثانیه و دمای آن برای هر آغازگر متفاوت بود (52 تا 60 درجه). همچنین زمان و دمای توسعه رشته نیز به ترتیب ۶۰ ثانیه و ۷۲ درجه سانتیگراد بود. توسعه نهایی به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد انجام شد. در این آزمایش از ژل آگارز 2 درصد با بافر واکنش TBE یک درصد استفاده شد. به منظور تزریق نمونه در ژل، ابتدا میزان ۵ میکرولیتر بافر نمونهگذاری به DNAهای تکثیر شده اضافه و سپس میزان ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه به درون چاهکهای ایجاد شده در ژل آگارز بارگزاری و با ولتاژ ۱۰۰ و میزان ۵/۲ ساعت حرکت صورت گرفت و سپس ژل را جهت رنگآمیزی در محلول اتیدیوم برماید (یک میکروگرم در میکرولیتر) به مدت ۴۵-۳۰ دقیقه قرار داده و از دستگاه Gel Document جهت نمایان شده نوارها استفاده شد.
محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC= Polymorphic information content) از طریق فرمول محاسبه شد، در اینجا p برابر با مجموع نوارهای هر لوکوس برای کلیه ژنوتیپها است (8). همچنین شاخص نشانگری (MI= Marker Index) از رابطه MI= PIC × N×B به دست آمد که N تعداد کل باندها و β نسبت چندشکلی برای هر آغازگر بود (18). شاخص نسبت چندگانه مؤثر (EMR= Effective multiplex ratio) از رابطه EMR= NPB × β که از درصد چندشکلی (β) ضربدر تعداد نوارهای چندشکل (NPB) به دست آمد (11) و قدرت تفکیک (RP= Resolving power) از رابطه RP=∑IB محاسبه گردید. RP=∑IB در رابطه [(IB=1-[2×(0.5-Pi و Pi نسبت افراد دارای نوار است (1). در پایان نیز دادههای حاصل، با استفاده از نرم افزارهای NTSYSpc 2.02e برای محاسبه ماتریس تشابه و آزمون مانتل (21)، DARwin 6 جهت تجزیه کلاستر و تجزیه به مؤلفههای اصلی (16) وGenAlEx 6.2 برای تجزیه واریانس مولکولی (15) مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج
بررسی پلیمورفیسم: تنوعژنتیکی ژنوتیپهای مورد مطالعه با استفاده از 15 آغازگر SCoT مورد بررسی قرار گرفت که تنها 11 آغازگر دارای باندهای قابل امتیاز بودند. آغازگرهای SCoT در مجموع توانستند 48 باند تولید کنند که تنها یک باند همشکل مشاهده شد و سایر باندها چند شکل بودند. میانگین تعداد باند تولید شده توسط هر آغازگر برای 17 ژنوتیپ برابر 82/2 به دست آمد. آغازگرهای SC20،SC21 و SC59با 6 باند بیشترین تعداد و آغازگر SC15 با 2 باند کمترین تعداد باند را تکثیر نمود. ژنوتیپ دالاهو3 بیشترین باند (30 باند) و ژنوتیپهای روانسر1 و دالاهو1 کمترین باند (11 باند) را در بین ژنوتیپهای مورد بررسی داشتند. شکل 2 الگوی باندی 17 ژنوتیپ مورد بررسی با استفاده از آغازگر SC21را نشان میدهد.
شکل 2- تصویر ژل الکتروفورزی 17 ژنوتیپ مورد بررسی برای آغازگر SC21
نتایج به دست آمده برای آغازگرهای استفاده شده در جدول 2 ارائه شده است. میانگین درصد چند شکلی در بین آغازگرهای مورد بررسی برابر 48/98 بود که درصد چند شکلی برای SC20 (33/83 درصد) و برای سایر آغازگرها میزان چند شکلی برابر 100 درصد بود. میانگین PIC در آغازگرهای مورد بررسی برابر 361/0 بود که بیشترین میزان PIC مربوط به آغازگرهای SC59 (44/0)، SC11 (44/0) و SC36 (42/0) بود که این آغازگرها بهتر از سایر آغازگرها بر اساس شاخص PIC توانست فاصله ژنتیکی ژنوتیپها را مشخص کند. آغازگر SC10 (29/0) با کمترین میزان PIC توانایی خوبی در جداسازی ژنوتیپها نداشت. میانگین شاخص RP برابر 837/2 بود که آغازگرهای SC59 (41/5) و SC11 (71/4) بیشترین میزان و آغازگر SC15 دارای کمترین میزان بود. همچنین میانگین شاخصهای MI و EMR به ترتیب برابر 52/1 و 19/4 بود. بیشترین میزان MI را آغازگرهای SC59و SC11 و کمترین میزان را آغازگرهای SC15و SC10 داشتند. همچنین برای شاخص EMR بیشترین میزان را آغازگرهای SC59 و SC21 و کمترین میزان را آغازگر SC15 داشت.
جدول 2 – درصد چندشکلی، تعداد کل باند، محتوای اطلاعات چندشکلی، شاخص نشانگری، نسبت چندگانه مؤثر و شاخص قدرت تفکیک در آغازگرهای مورد بررسی
بررسی میزان تشابه ژنتیکی بین ژنوتیپها: تشابه ژنتیکی ژنوتیپهای مورد بررسی با استفاده از ضریب تشابه دایس از 10/0 تا 732/0 متغیر بود (جدول 3). بیشترین تشابه را ژنوتیپهای (گیلان غرب2) با (ثلاث2) (732/0) و کمترین تشابه را ژنوتیپ (نفت شهر) با ژنوتیپهای (گیلان غرب1) و (گیلان غرب2) (10/0) داشت. نمودار توزیع فراوانی نشان داد که بیشترین فاصله در بین ژنوتیپها در محدوده 60/0 و کمترین فاصله در 95/0 میباشد (شکل 3).
جدول 3 – ماتریس مشابه ژنوتیپ ها برای پرایمرهای SCoT استفاده شده بر اساس ضریب دایس
شکل3– نمودار توزیع فراوانی فواصل ژنتیکی بین ژنوتیپهای مورد بررسی
تجزیه خوشهای: دندروگرام حاصل از تجزیه خوشهای به روش UPGMA بر اساس ضریب تشابه دایس برای ژنوتیپها در شکل 4 ارائه شده است. همچنان که ملاحظه میگردد ژنوتیپها در 2 گروه قرار گرفتند. گروه اول شامل ژنوتیپهای (روانسر1)، (سرپل2)، (دالاهو1)، (نفت شهر) و (اسلام آباد) بود. میانگین تشابه در این گروه برابر 420/0، که بیشترین تشابه را ژنوتیپ سرپل2 با اسلام آباد و کمترین تشابه را ژنوتیپ نفت شهر با اسلام آباد در این گروه داشتند. در گروه دوم شامل 12 ژنوتیپ (صحنه1)، (سرپل1)، (سومار)، (سرپل3)، (گیلان غرب1)، (دالاهو2)، (دالاهو3)، (صحنه2)، (ثلاث1)، (گیلان غرب2) و (ثلاث2) قرار گرفتند. میانگین تشابه در این گروه برابر 409/0، که بیشترین تشابه را ژنوتیپ (صحنه1) با (سرپل1) و کمترین تشابه را ژنوتیپ (گیلان غرب2) با (ثلاث2) در این گروه داشتند.
شکل 4- دندروگرام حاصل از دادههای نشانگر SCoT برای ژنوتیپهای مریم نخودی، اعداد روی شکل نشان دهنده روابط و تشابه ژنتیکی ژنوتیپهای مورد بررسی با یکدیگر میباشد
تجزیه به مؤلفههای اصلی (PCoA= Principal components analysis): بر اساس دادههای حاصل از آغازگرهای مورد بررسی تجزیه به مؤلفههای اصلی برای ژنوتیپها انجام شد، که نتایج نشان داد محور مؤلفههای اول و دوم به ترتیب 55/23 و 20/19 درصد از واریانس موجود را توضیح دادند و در مجموع 75/42 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید. بر اساس مؤلفههای اول و دوم دیاگرام پراکنشی ژنوتیپها رسم گردید (شکل 5)، که این دیاگرام با نتایج تجزیه خوشهای و ماتریس تشابه کاملاً مطابقت داشت و ژنوتیپها به دو گروه تقسیم شدند به نحوی که ژنوتیپهایی که دارای بیشترین تشابه در ماتریس تشابه بودند و در تجزیه خوشهای نیز در کنار یکدیگر قرار گرفته بودند، در تجزیه به مؤلفههای اصلی نیز در کنار یکدیگر قرار گرفتند.
شکل 5- بای پلات ژنوتیپها برای نشانگر SCoT بر اساس محور مؤلفههای اصلی اول و دوم
تجزیه واریانس مولکولی (AMOVA= Molecular variance analysis): تجزیه واریانس مولکولی بر اساس گروهبندی تجزیه خوشهای انجام شد (جدول 4)، که ژنوتیپها در داخل 2 گروه قرار گرفتند بر اساس آماره PhiPT در بین گروهها در سطح 5 درصد اختلاف معنیدار وجود داشت به عبارت دیگر گروهبندی به صورت صحیح انجام گرفته است. نتایج به دست آمده نشان داد که در درون گروهها تنوع بیشتر از بین گروهها میباشد. بر این اساس تنوع در درون گروهها برابر 76 درصد و در بین گروهها تنوع برابر 24 درصد مشاهده گردید.
جدول 4- تجزیه واریانس مولکولی بر اساس نشانگر SCoT
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
مجموع مربعات |
میانگین مربعات |
واریانس برآورد شده |
درصد از واریانس |
PhiPT |
|
S.O.V |
Df |
SS |
MS |
Est. Var. |
Var% |
||
بین گروههای کلاستر |
1 |
219/26 |
219/26 |
562/2 |
24% |
*24/0 |
|
درون گروههای کلاستر |
15 |
017/122 |
134/8 |
134/8 |
76% |
|
|
کل |
16 |
235/148 |
|
696/10 |
100% |
|
|
* اختلاف در سطح 5% معنیدار |
|||||||
بحث و نتیجه گیری
همانطور که در قسمت نتایج نشان داده شد، با استفاده از آغازگرهای SCoT تنوع قابل ملاحظهای در بین ژنوتیپهای مریم نخودی (.T. polium L) وجود داشته و چند شکلی مطلوبی بر اساس مارکر SCoT در بین ژنوتیپها مشاهده شد.Noruzi Gharatape و همکاران (2012) به منظور بررسی ساختار و مقایسه تنوع ژنتیکی 77 فرد از 8 توده مختلف گیاه دارویی مریم نخودی (T. polium L.) از نشانگرهای ISSR استفاده کردند، 18 آغازگر مورد استفاده در آن مطالعه 198 مکان قابل امتیاز تولید نمودند که از این تعداد 184 مکان چند شکل بودند (14). میانگین درصد چند شکلی در بین آغازگرهای مورد بررسی برابر 48/98 بود. براساس نتایج این مطالعه با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT درصد چندشکلی بالایی مشاهده گردید، این نتایج با مطالعات دیگری که با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT بر روی نخود (Cicer. Sp)، انبه (.Mangifera indica L) و رمی (Boehmeria nivea L. Gaudich) انجام گردیده مطابقت داشت (2، 12 و 19). محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC)، یکی از شاخصهای مهم جهت مقایسه نشانگرهای مختلف، از نظر قدرت تمایز آنها به شمار میرود. مقادیر بالای این معیار، دلالت بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه نشانگری داشته که در تفکیک و تمایز افراد نقش به سزایی دارد. بنابراین، نشانگرهایی با محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) بالا برای تمایز ژنوتیپهای خویشاوندی نزدیک مفید هستند (27). این شاخص از صفر تا نیم در نشانگرهای غالب متغیر است و هرچه این عدد بزرگتر باشد بیانگر بالا بودن قابلیت پرایمر یا مارکر مورد استفاده در غربال نمودن ژنوتیپهاست. بهترین شاخص برای انتخاب پرایمر مناسب، شاخص قدرت تفکیک (RP) میباشد، زیرا هم از تعداد افراد دارای باند و هم تعداد آلل تاثیر پذیری دارد (1). در حالت کلی و بر اساس کلیه شاخصهای مورد بررسی در این مطالعه مناسبترین آغازگرها برای بررسی گونه مریم نخودی (T. polium L.)، آغازگرهای SC59 و SC11 تعیین شد، که پیشنهاد میگردد برای آنالیز مجموعه ژرم پلاسم دیگر ژنوتیپهای این گونه در تحقیقات بعدی استفاده گردند. Esfandiary و همکاران (2017) در بررسی تنوع ژنتیکی برخی از اکوتیپهای مختلف مریم نخودی (T. polium L.) با استفاده از نشانگر ISSR بر اساس شاخصهای درصد چندشکلی، قدرت تفکیک (RP) و محتوی اطلاعات چند شکلی (PIC) آغازگرهای برتر را جهت آنالیز ژرمپلاسم این گونه معرفی نمودند (7).
میانگین تشابه بین ژنوتیپها در این مطالعه برابر 420/0 بود که پایین بودن تشابه ژنتیکی یاد شده نشاندهنده تنوعژنتیکی خوب و قابل قبولی در بین ژنوتیپهای مریم نخودی (T. polium L.) بر اساس آغازگرهای مورد بررسی میباشد. که این موضوع میتواند به سبب طول بلند آغازگرهای SCoT و تکثیر انتخابیتر باشد. هیبریداسیون بین ژنوتیپها با فاصله ژنتیکی زیاد میتواند یک روش مناسب برای برنامههای اصلاحی در این گیاه دارویی باشد. از آنجایی که نشانگر مولکولی SCoT تنوع را براساس مناطق ژنی نشان میدهد (تکثیر نواحی با کدون آغاز)، استفاده از نتایج این تحقیق برای تلاقی نمونههای با فواصل زیاد ژنتیکی در جهت هتروزیس به منظور اصلاح و افزایش ترکیبات میتواند بسیار مؤثر باشد. با توجه به تنوع ژنتیکی بالای درون ژنوتیپهای مریم نخودی
(T. polium L.) غرب کشور، حفاظت در محل رویشگاه نمونهها برای حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه و و ایجاد بانک ژرم پلاسم و استفاده از روشهای تکثیر مناسب این گیاه توصیه میشود.
در این تحقیق برای مشخص کردن بهترین شاخص تشابه و تشخیص بهترین الگوریتم برای ترسیم مناسبترین دندروگرام برای گزارش نتایج، شاخصهای تشابه شامل دایس و جاکارد با روشهای اتصال میانگین (UPGMA) و اتصال مجاور (NJ) محاسبه و بر اساس ضرایب کوفنتیک حاصل از آزمون مانتل مقایسه شدند. با توجه به نتایج به دست آمده الگوریتم UPGMA و شاخص دایس در آزمون مانتل ضریب کوفنتیک بالاتری نشان داد (91 درصد). همچنان که ملاحظه میگردد ژنوتیپها در 2 گروه قرار گرفتند. Pesaraklu و همکاران (2012) در بررسی تنوع ژنتیکی برخی از جمعیتهای مریم نخودی (T. polium L.) ایران با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD تنوع مطلوبی را در بین جمعیتهای مورد بررسی مشاهده و گزارش نمودند که این نشانگر کارآیی بالایی در تفکیک کردن جمعیتها از یکدیگر دارد به صورتی که تنوع ژنتیکی با تنوع جغرافیایی تا حدودی تطبیق داشت (17). همچنین Boussaid و همکاران (2010) نیز با استفاده از نشانگر مولکولی RAPD تنوع ژنتیکی و ساختار جمعیت گیاه مریم نخودی (T. polium L.) را در کشور تونس مورد بررسی قرار داده و تنوع ژنتیکی بالایی درون جمعیت این گیاه به دست آوردند (3).
از تجزیه به مؤلفههای اصلی به عنوان روشی مکمل برای تجزیه خوشهای که منجر به استفاده بهینه و استخراج حداکثر اطلاعات از دادههای مولکولی میشود استفاده میگردد. در مجموع 75/42 درصد از واریانس با این دو محور بیان گردید، این موضوع به نوبه خود مـیتــواند نشان دهنـده پراکــنش گستــرده آغــازگــرهای مختـلف بـــر روی ســطح ژنــوم و همه کروموزومهای مریم نخودی (T. polium L.) باشد. میزان توجیه مؤلفه اول و دوم در این تحقیق با نتایج Zamani و همکارن (2010) مطابقت داشت (30). در بررسی Tabtib (2014) بر روی 8 جمعیت گونه Teucrium polium با استفاده از نشانگر مولکولی ISSR تنوع بالایی بر اساس آغازگرهای مورد بررسی مشاهده و از تجزیه کلاستر و تجزیه به مؤلفههای اصلی برای گروه بندی جمعیتها استفاده شد (26).
همچنین از کاربردهای تجزیه واریانس مولکولی میتوان در تعیین تفاوت ژنتیکی بین جمعیتها و تعیین حد مطلوب خوشه در تجزیه خوشهای اشاره کرد، به این صورت که در هر گروه در نقطه برش دندروگرام به عنوان یک جمعیت و جمعیتهای درون آن به عنوان افراد جمعیت در نظر گرفته میشود و برای هر نقطه برش یک تجزیه واریانس انجام گیرد. نقطهای که بیشترین تمایز بین گروهها به وجود آید، به عنوان نقطه مناسب برش دندروگرام انتخاب خواهد شد. نتایج به دست آمده نشان داد که در درون گروهها تنوع بیشتر از بین گروهها میباشد. بر این اساس تنوع در درون گروهها برابر 76 درصد و در بین گروهها تنوع برابر 24 درصد مشاهده گردید. در مطالعه Tabtib (2014) بر روی 8 جمعیت مریم نخودی (T. polium L.) نتایج تجزیه واریانس مولکولی نشان داد که تنوع در درون جمعیتها بیشتر از بین جمعیتها میباشد، به صورتی که تنوع در درون جمعیتها برابر 77 درصد و در بین جمعیتها برابر 23 درصد گزارش گردید (26). در بررسی Zamani و همکاران (2016) بر روی کاکوتی (Ziziphora tenuior L.) با استفاده از نشانگر مولکولی SCoT تنوع بین جمعیتها 11 درصد و درون جمعیتها 89 درصد گزارش گردید (29).
سپاسگزاری
این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه پیام نور انجام شده است. که از این بابت از مسئولان مربوطه تشکر و قدردانی میشـود. در ضمن کلیه حقوق مادی و معنوی آن متعلق به دانشگاه پیـام نـور میباشد.