Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)

Isolation of industrial strain Saccharomyces cerevisiae with high tolerance to ethanol from Iran's alcohol manufactures

Document Type : Research Paper

Authors

1 University of Maragheh

2 Department of Microbiology, Faculty of Science, University of Maragheh, Maragheh, Iran

Abstract

Reducing fossil fuels, increasing fuel prices and carbon dioxide emissions, and concern about climate change are encouraging factors for biofuels production. Microbial biofuels are liquid and gaseous fuels which produced by microorganisms. Bioethanol is a suitable alternative biofuel for petroleum based fuels. For the industrial and high-scale production of bioethanol, the first step is isolation of suitable yeast strain with high tolerance to ethanol and high-level ethanol production. Hence, the aim of this study was Isolation of industrial strain Saccharomyces cerevisiae with high tolerance to ethanol from Iran's alcohol manufactures. Sampling from several Iran's alcohol manufactures was carried out for the isolation of Saccharomyces cerevisiae with the highest ethanol production and tolerance. Selected yeast strain was examined by morphological, biochemical tests such as sugars fermentation, absorption of nitrogen compounds and carbon compounds, and also molecular test. The selected yeast strain produced 8% ethanol and tolerated 12% ethanol. The morphological, biochemical and molecular tests confirmed that the yeast strain is Saccharomyces cerevisiae, and this strain was named Saccharomyces cerevisiae Sahand 101. The isolated industrial yeast strain with the suitable characteristics in terms of ethanol production and tolerance to ethanol can be used for further studies and increase ethanol production by optimization methods at the level of flask and bioreactor.

Keywords

Main Subjects

جداسازی سویه صنعتی ساکارومایسس سرویزیه با قابلیت تحمل­ بالا به اتانول از

کارخانه­های الکل­سازی ایران

فرشاد درویشی* و نوشین ابوالحسن مقدمی

مراغه، دانشگاه مراغه، دانشکده علوم

تاریخ دریافت: 11/4/97                تاریخ پذیرش: 2/7/97

چکیده

کاهش سوخت­های فسیلی، افزایش قیمت سوخت­ها و انتشار گاز دی اکسید کربن و نگرانی درباره تغییرات آب و هوایی عوامل محرک برای تولید سوخت­های زیستی هستند. سوخت­های زیستی میکروبی، سوخت­های مایع و گازی هستند که توسط میکروارگانیسم­ها تولید می­شوند. بیو­اتانول یک سوخت زیستی جایگزین مناسب برای سوخت­های پایه­ی نفتی است. برای تولید صنعتی و در مقیاس بالای بیواتانول، اولین مرحله جداسازی سویه­های مخمری مناسب با تحمل بالا به اتانول و تولید بالای اتانول است. از این رو هدف این تحقیق، جداسازی سویه صنعتی ساکارومایسس سرویزیه با قابلیت تحمل بالا به اتانول از کارخانه‌های الکل‌سازی ایران بود.نمونه برداری از چند کارخانه­های الکل­سازی برای جداسازی سویه ساکارومایسس سرویزیهبا بیشترین میزان تولید و تحمل به اتانول صورت گرفت. سویه مخمر منتخب توسط آزمایش­های ریخت­شناسی، بیوشیمیایی نظیر تخمیر قندی، جذب ترکیبات نیتروژنی و کربنی و همچنین با روش مولکولی مورد بررسی قرار گرفت. سویه‌ منتخب مخمر 8 درصد اتانول تولید کرد و به 12 درصد اتانول تحمل داشت. آزمایش­های ریخت­شناسی، بیوشیمیایی و مولکولی تایید کردند که سویه مخمر ساکارومایسس سرویزیه است و این سویه مخمر ساکارومایسس سرویزیه سهند 101 نام­گذاری شد.سویه صنعتی مخمر جدا شده با ویژگی‌های مناسب از لحاظ تولید و تحمل به اتانول می‌تواند برای مطالعات بعدی و افزایش تولید با روش‌های بهینه‌سازی سازی در سطح ارلن و بیوراکتور بکار رود.

واژه­های کلیدی: جداسازی، شناسایی، مخمر، سویه صنعتی، بیواتانول.

* نویسنده مسئول، تلفن: 37278900-041 ، پست الکترونیکی:  f.darvishi@ymail.com

مقدمه

 

سوخت­های فسیلی جزء سوخت­های تجدید­نا­پذیر و دارای منابع محدود هستند و به دلیل انتشار گازهای گلخانه­ای می­توانند برای محیط زیست مضر باشند (19). حدود 88 درصد از مصرف انرژی جهانی، سوخت­های فسیلی هستند (24). کم شدن ذخایر سوخت­های فسیلی، نگرانی درباره تغییرات آب و هوایی و افزایش انتشار گازهای گلخانه­ای از جمله دی اکسید کربن از جمله دلایل برای سوق دادن به سمت سوخت­های زیستی می­باشند (24). سوخت­های زیستی، سوخت­های گازی و مایع با منشاء زیستی هستند که از زیست­توده­های آلی تجدید­پذیر مشتق می­شوند. بیو­هیدروژن، بیوگاز، الکل­های زیستی، بیودیزل و روغن­های زیستی از سوخت­های زیستی تجدید­پذیر هستند که تحقیقات جهانی برای تولید این سوخت­ها و کاهش آلودگی زیست محیطی در جریان است (10).

ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ ﺑﻪ ﻓﺮآﻳﻨﺪﻫﺎی ﺗﺨﻤﻴﺮ، ﭘﻴﺶﺗﻴﻤﺎر و ﻫﻴﺪروﻟﻴﺰ، اﻣﻜﺎن ﺗﻮﻟﻴﺪ اﻧﻮاع ﻣﻨﺎﺑﻊ اﻧﺮژی، ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﺑﻴﻮﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ و ﻓﺮآوردهﻫﺎی زﻳﺴﺘﻲ از ﭘﺴﻤﺎﻧﺪﻫﺎی ﻟﻴﮕﻨﻮﺳﻠﻮﻟﺰی ﻛﺸﺎورزی وﺟﻮد دارد. تولید میکروبی اتانول به عنوان سوخت زیستی سریعاً در حال توسعه بوده و کارخانه­های جدید تولید الکل راه اندازی می­شوند تا میزان تولید را افزایش دهند و در این بین محققان نیز راه­هایی را برای افزایش میزان اتانول جستجو می­کنند (2 و 4). یکی از راه­هایی که می­تواند به افزایش میزان تولید اتانول کمک نماید، توسعه سویه­های میکروبی مورد استفاده در تخمیر است (23). میکروارگانیسم­هایی که می­توانند برای تولید اتانول مورد استفاده قرار گیرند شامل قارچ­ها مثل موکور ایندیکوس (Mucor indicus)(14)، باکتری‌ها مثل زیموموناس موبیلیس(21) و مخمرها مانند ساکاروماسیس سرویزیه و کلاورومایسس مارکسیانوس
(Kluyveromyces marxianus) می­باشند (22).

مخمرها در بسیاری از فرآیندهای صنعتی مثل تولید اتانول، زیست توده (مخمر نان و مخمرهای غذایی) و محصولات متابولیکی متنوع استفاده می­شوند. علاوه بر این از مخمرها برای تولید انواع محصولات شامل آنزیم­ها، ویتامین­ها، پلی­ساکاریدها، کارتنوئیدها، الکل­های پلی هیدریک (Polyhydric alcohols)، لیپیدها، گلیکولپیدها، اسید سیتریک، اتانول، دی اکسید­کربن و همچنین ترکیبات سنتز شده با ایجاد DNA نو ترکیب استفاده شده است. برخی از این تولیدات به صورت تجاری تولید می­شوند و برخی از آن­ها دارای اهمیت زیست فناوری هستند. استفاده از مخمرها به زمان­های باستان بر­می­گردد که حدود 7000 سال قبل از میلاد در سومر (Sumeria) تولید شد. همچنین رومیان باستان در 100 سال قبل از میلاد، مخمر را به صورت مایه نان در نانوایی­ها مورد استفاده قرار دادند. شیر نیز به صورت کفیر (Kefyr) توسط سویه­های کلاورومایسس در کشورهای آسیایی تولید شد. الکل­های سوختی و صنعتی معمولاً به وسیله سنتز شیمیایی از نفت به دست می­آید اما در سال 1977، مخمرها 20 درصد از این تولیدات را به خود اختصاص دادند و درسال 1984 مخمرها سهم خود را در تولید اتانول به 87 درصد رساندند. بسیاری از تحقیقات اکولوژیکی و تکنولوژیکی این فرضیه را تأیید کرده­اند که ساکارومایسس سرویزیه گونه­های خاصی از مخمر­ها هستند که تخمیر الکلی آبمیوه­ها را انجام می­دهند (20) و نیز مخمری است که بیشترین استفاده را در تولید اتانول صنعتی دارد (6).

بیشترین تحقیقاتی که تا به امروز مورد توجه قرار گرفته است، جداسازی ارگانیسم‌های تحمل کننده اتانول می‌باشد که دست‌یابی به این پیشرفت به تولید و بازده بیشتر اتانول کمک می‌کند. جهت تولید اتانول در مقیاس بالا و صنعتی، اولین قدم جداسازی سویه‌های مناسب برای تولید اتانول می‌باشد که در این تحقیق سعی بر این بود که سویه‌ی مناسب صنعتی و بومی مخمر ساکارومایسس سرویزیه با تحمل بالا نسبت اتانول با نمونه‌برداری از کارخانه‌های الکل‌سازی ایران جداسازی شود.

مواد و روشها

نمونه برداری: در این تحقیق نمونه­­برداری از سه کارخانه الکل­سازی سهند مراغه در  17 کیلومتری جاده مراغه – تهران، بیدستان قزوین در 10 کیلومتری جاده قزوین- کرج و گلریز میاندوآب در 10 کیلومتری جاده­ی میاندوآب- شاهین­دژ انجام گردید. نمونه­برداری از قسمت­های مختلف کارخانه (پیش کشت و مرحله­ی تخمیر) برای جداسازی سویه مناسب انجام شد.

محیط‌هایکشتوشرایطکشت مخمرها: نمونه­ها در محیط کشت YGC (مرک) برای جلوگیری از رشد باکتری­ها کشت داده شدند.محیط کشت جامد YGC، که به میزان 40 گرم بر لیتر در آب مقطر حل و بعد از آماده­سازی، محیط در دمای 121 درجه سانتی­گراد به مدت 15 دقیقه استریل گردید. این محیط برای رشد مخمر و عدم رشد باکتری­ها و جداسازی نمونه­ها تهیه شد. محیط کشت YPD محیطی مغذی برای رشد مخمرها و بررسی تولید اتانول توسط مخمر­ها تهیه شد. ترکیبات محیط کشت YPD (Yeast extract peptone dextrose) شامل گلوکز (20 گرم در لیتر)، پپتون (20 گرم در لیتر) عصاره مخمر (10 گرم در لیتر) و تیامین (05/0 گرم در لیتر) می­باشد. برای ساخت محیط جامد 2 درصد آگار (مرک) را به سایر ترکیبات افزوده و در نهایت محیط در دمای 121 درجه سانتی­گراد و به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو استریل ­گردید. ملاس چغندر قند از کارخانه قند میاندوآب خریداری و محیط کشت ملاس چغندر قند با بریکس 18 آماده گردید. درجه بریکس میزان قند محلول می­باشد که یک درجه از بریکس شامل یک گرم از ساکارز (مرک) در 100 گرم محلول است. این میزان توسط بریکس سنج سنجش شد. 2 گرم بر لیتر از سولفات آمونیوم (مرک) و 2 گرم بر لیتر اوره (مرک) نیز برای ساخت این محیط افزوده شد.

بررسی تحمل سویه­های صنعتی مخمر به اتانول: برای بررسی میزان تحمل سویه­های مخمر به اتانول، آنها در محیط کشت YPD جامد دارای 10 تا 12 درصد اتانول کشت داده و رشد یا عدم رشد آن­ها بررسی گردید. رشد سویه­ها در داخل این محیط نشان­دهنده تحملشان به اتانول است. در نتیجه 80 سویه جدا­سازی شده از کارخانه­ها در محیط­های دارای اتانول کشت داده شدند تا بهترین نمونه از میان آن­ها که بیشترین تحمل را به اتانول دارند، انتخاب شوند.

بررسی تولید کمی اتانول توسط مخمر در محیط کشت صنعتی: جهت بررسی کمی میزان اتانول در محیط ملاس، ابتدا سویه مخمر منتخب در محیط YPD جامد به مدت 48 ساعت کشت داده شدند. سپس یک کلنی در محیط 20 میلی لیتری ملاس با بریکس 18 که در ارلن 100 میلی لیتری تهیه شده بودند تلقیح گردید و پس از 24 ساعت از هر یک از نمونه‌ها به میزان یک میلی لیتر مجدداً به ارلن‌های 100 میلی‌لیتری حاوی 20 میلی‌لیتر ملاس با بریکس 18 تلقیح شد. محیط‌های کشت ملاس 20 میلی‌لیتری در ارلن، به مدت 48 ساعت در انکوباتور شیکردار با دور 200 و دمای 29 درجه سانتیگراد قرار داده شد تا در شرایط هوازی رشد کنند، سپس برای ایجاد شرایط‌ بیهوازی، محیط به ظرف‌های دربسته 50 میلی‌لیتری انتقال داده شدند. با قرار دادن سرنگ در روی در ظروف، راهی برای خروج گاز دی اکسید کربن تولید شده توسط مخمر ایجاد گردید. نمونه‌ در دمای 29 درجه سانتیگراد و چرخش 200 دور در دقیقه انکوباتور شیکردار قرار داده شد. برای تعیین میزان تولید اتانول و شمارش تعداد سلول‌های مخمر هر روز نمونه‌برداری انجام گرفت.

شناسایی مخمر از طریق ریخت شناسی: برای ریخت­شناسی کلنی­ها، آن­ها را روی YPD جامد کشت داده و ویژگی­های ظاهری کلنی در پلیت بررسی شد. شکل مخمر تک سلولی نیز در زیر میکروسکوپ نوری با عدسی 40 مشاهده گردید.

بررسی فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مخمر: تخمیر کربوهیدرات‌ها: مخمرها در توانایی تخمیر قندها با هم متفاوتند که این توانایی به وسیله­ی تولید گاز دی اکسید کربن و تجمع آن در داخل لوله­ی دورهام اندازه­گیری می­شود. لوله آزمایش حاوی لوله­های دورهام شامل 2 درصد از محلول قندی (به جز رافینوز که معمولاً 4 درصد است، چون برخی سویه ها فقط یک قسمتی از این مولکول را مصرف می­کنند) استفاده می­شود. قندهای مورد استفاده در این بررسی شامل L-آرابینوز، D-مالتوز، D-رافینوز، لاکتوز، D-مانیتول، D-زایلوز، D-گالاکتوز، سوکروز و D-سلبیوز (همه قندها از محصولات مرک) می­باشند.یک لوله آزمایش حاوی محیط YPD مایع برای سویه­ی منتخب آماده شد و یک کلنی از YPD جامد در آن تلقیح گردید، سپس در داخل انکوباتور به مدت 24 ساعت قرار داده شدند تا رشد کند و به عنوان محیط تلقیح مورد استفاده قرار گیرد. تهیه­ی لوله­های آزمایش حاوی محیط کشت به این صورت انجام شد که ابتدا 2 گرم از قندها (جز رافینوز که 4 گرم می­باشد) به علاوه 1 گرم از عصاره مخمر در 100 میلی­لیتر آب مقطر حل شد سپس لوله­های دورهام کوچک را به صورت برعکس داخل محیط انداخته و در دمای 110 درجه سانتی­گراد به مدت 10 دقیقه استریل کرده تا لوله­های دورهام به پایین بروند و در ته قرار بگیرند. لوله­های حاوی محیط قندی به میزان 1 درصد، از محیط کشت YPD مایع که حاوی سویه کشت داده شده بود، تلقیح شد. لوله­ها در دمای 25 درجه سانتیگراد به مدت 28 روز انکوبه شدند. کدورت محیط و لوله­های دورهام برای تجمع گاز داخل آنها بررسی شدند که نتایج به صورتی که در جدول 1 آمده است، خوانده می­شوند (15).

جذب (Absorption) ترکیبات کربن:لوله­های آزمایش حاوی 5 میلی­لیتر محیط کشت که شامل محیط پایه نیتروژن (سیگما)( YNB) و قند و آب مقطر می­باشد، آماده شد.

جدول 1- روش تفسیر نتایج تخمیر کربوهیدرات­ها توسط مخمرها (11)

  +

مثبت قوی

پر شده از گاز تا 7 روز

L ( Late)

مثبت تأخیری

پر شده از گاز به صورت سریع بعد از 7 روز

S(Slow)

مثبت کم

پر شده از گاز به آرامی بعد از 7 روز

W (Weak)

مثبت ضعیف

پر شدن گاز کمتر از 3/1 لوله دورهام

  _

منفی

عدم پرشدن گاز

V (Variant)

متغیر

برخی سویه ها + و برخی دیگر – هستند

بر این اساس 7/6 گرم از محیط پایه­ی نیتروژن و 5 گرم از قند در100 میلی­لیتر آب تهیه شد و با  فیلتراسیون، استریل گردید. قندها شامل آرابینوز، D-مالتوز، D-رافینوز، لاکتوز، D-مانیتول، D-زایلوز، D-گالاکتوز، سوکروز و D-سلبیوز می­باشند. سپس 5/0 میلی­لیتر از محیط آماده شده را در 5/4 میلی­لیتر آب مقطر مخلوط کردیم. برای لوله­های آزمایش، 1 درصد از محیط کشت YPD حاوی سویه­ی منتخب، تلقیح کرده و در دمای 25 درجه سانتی­گراد به مدت 3 الی 4 هفته انکوبه گردید و لوله­ها هر 48-24 ساعت یک بار بررسی شدند. برای بررسی این لوله­ها از یک کاغذ سفید رنگ که دارای خطوط سیاه با قطر 7/0 میلی­متر می­باشد استفاده شد و با قرار دادن کاغذ در پشت محیط نتایج به صورت زیر گزارش شد.اگر خطوط به طور کامل دیده نشود: 3+؛ خطوط به صورت نامرتب دیده شود : 2+؛ خطوط قابل تشخیص باشند : 1+ ؛ خطوط به طورکامل و جدا از هم دیده شوند نتیجه منفی می­باشد. نتایج به صورت جدول 2 گزارش می­شوند (15).

جدول 2- روش قرائت نتایج حاصل از جذب ترکیبات کربن (11)

مثبت (+)

اگر نتایج 3+ و 2+ در طی یک الی دو هفته به دست ­آید.

مثبت تأخیری (L)

اگر 3+ و 2+ بلافاصله بعد از  هفته مشخص شود.

مثبت ضعیف (W)

اگر 1+ خوانده شود.

منفی (-)

اگر خطوط به طور واضح و مشخص دیده شوند.

جذب ترکیبات نیتروژن: محیط استوک نیتروژنی با غلظت 10 برابر، با حل کردن 7/11 گرم از محیط پایه کربن و با مقادیر 78/0 گرم نیترات پتاسیم و 26/0 گرم نیتریت سدیم در 100 میلی­لیتر آب تهیه شد و سپس توسط فیلتراسیون استریل گردید. محیط نهایی با مخلوط کردن 5/0 میلی لیتر از محیط استوک با 5/4 میلی لیتر آب مقطر استریل آماده شد. نتایج همانند جذب ترکیبات کربن گزارش می­شود (15).

شناسایی مولکولی مخمر و رسم درخت فیلوژنی: برای شناسایی مخمر جداسازی شده، پرایمرهای ITS1 و ITS4 با توالی­هایی که در جدول 3 آمده است برای تکثیر ژن 18S rRNA مخمر استفاده شد. این پرایمرها از شرکت تکاپوزیست تهیه شدند.

 

جدول 3- توالی پرایمرهای برای تعیین توالی و شناسایی مخمر

Tm (ºC)

نوکلئوتید

توالی آغازگر

نام

63

19

5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′

ITS1

1/54

20

5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′

     ITS4

 

از روش (واکنش زنجیره­ای پلیمراز) PCR- کلنی برای تکثیر قطعه مورد نظر استفاده شد. در این روش ابتدا یک کلنی 5-3 میکرولیتر آب مقطر حل گردید و در دستگاه ترمو­سایکلر (Eppendorf AG22331) با سیکل ارائه شده در جدول 4 قرار داده شد تا سلول­ها لیز شوند.

جدول 4- چرخه دمایی برای لیز و آزادسازی ژنوم نمونه

دما (درجه سانتی­گراد)

زمان (ثانیه)

65

30

8

30

65

90

8

60

65

180

97

60

65

60

80

10 دقیقه

سپس واکنش زنجیره­ای پلیمراز در ویالی با حجم 50 میکرولیتر طبق جدول 5 در دستگاه ترموسایکلر انجام شد.

جدول 5- ترکیبات واکنش زنجیره­ای پلیمراز

ترکیب

غلظت

حجم )میکرولیتر(

مستر میکس آنزیم فیوژن

(2X Master Mix Phusion U)

2X

25

ITS1

10 پیکومول

1

ITS4

10 پیکومول

1

محصول کلونینگ

-

1

آب مقطر استریل

-

22

مستر میکس فیوژن از شرکت ترموساینتیفیک فیشر (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) خریداری شده و انجام واکنش از مخلوط حاصل در سیکل دمایی ارائه شده در جدول 6 در دستگاه ترموسایکلر انجام گرفت.

برای الکتروفورز محصول PCR از ژل آگارز 1 درصد استفاده شد برای تهیه ژل 2/0 گرم از پودر آگارز (مرک) در داخل 20 میلی لیتر از 0.5X TBE حل شد و بعد از حرارت و انحلال کامل، با کاهش دمای ژل، 1 میکرولیتر از محلول RedSafe (iNtRon biotechnology) جهت مشاهده باندها در مقابل اشعه فراء بنفش به ژل افزوده شد. محصول PCR برای تعیین توالی به شرکت تکاپو زیست فرستاده شد. این توالی از طریق بانک اطلاعاتی NCBI= National Center for Biotechnology Information  و توسط برنامه  blastnبا سایر ژن­های موجود مقایسه شده و توالی­های مشابه یافت شد و برای رسم درخت فیلوژنیکی از نرم افزار MEGA 7 استفاده شد.

شکل 6- چرخه دمایی مورد نیاز برای واکنش زنجیره­ای پلیمراز

مرحله

دما(درجه سانتی­گراد)

زمان

واسرشتگی اولیه

94

5 دقیقه

واسرشتگی

94

1 دقیقه

اتصال

55

1 دقیقه

تکثیر

72

2 دقیقه

رفتن به مرحله

تکرار مرحله 2-4 (30 بار)

-

تکثیر

72

10 دقیقه

توقف واکنش

4

-

نتایج

بررسی رشد نمونه­ها و تعیین تحمل به الکل: 80  نمونه از کارخانه­های تولید اتانول در محیط YGC برای رشد مخمرها و عدم رشد باکتری ها کشت داده شدند که در این مرحله حدود 80 نمونه مخمر خالص­سازی شدند. با کشت این مخمر­ها در محیط YPD دارای 10 الی 12 درصد اتانول، یک سویه از بین 80 سویه برای ادامه تحقیقات انتخاب شد که این سویه­ توانایی تحمل 12 درصد اتانول را داشت (شکل 1).

 

 

شکل 1- کلنی سویه منتخب مخمر بر روی محیط YPD دارای 12 درصد اتانول

تولید کمی اتانول توسط سویه مخمر منتخب در محیط کشت صنعتی: ارلن‌ و ظروف دربسته که به ترتیب در شرایط هوازی و بی‌هوازی برای تولید اتانول به کار رفت در شکل 2 نشان داده شده است. همانطور که در شکل 3 ملاحظه می‌شود سویه‌ منتخب مخمر علاوه بر تحمل 12 درصد اتانول، در روز سوم و در زمان اوج تولید 8 درصد اتانول تولید کرد.

 

 

شکل 2- کشت و تخمیر هوازی (سمت راست) و تخمیر بی‌هوازی (سمت چپ) محیط کشت صنعتی ملاس برای تولید اتانول


شناسایی سویه مخمر منتخب از طریق ریخت­شناسی: کلنی­های سویه منتخب دارای سطح نرم و کرم رنگی بوده و حالت تقریبا لزجی داشته و سلول­های مخمرها در زیر میکروسکوپ به شکل بیضوی مانند مخمر ساکارومایسس سرویزیه بودند.

 

 

شکل 3- منحنی رشد و تولید اتانول سویه منتخب مخمر در محیط کشت صنعتی


بررسی فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی: پس از کشت نمونه­ در محیط­های قندی، پر شدن گاز دی اکسید کربن در داخل لوله­های دورهام هر 24 ساعت یک بار مورد بررسی قرار گرفت. با مقایسه نتایج با کتاب تاکسونومی مخمرها (20)، مشخص گردید که ویژگی­های مخمر منتخب مشابه ویژگی­های مخمر ساکارومایسس سرویزیه می­باشد. نتایج این آزمایش، پس از بررسی کدورت لوله­ها هر 24 ساعت یک بار و مشخص شدن و یا نشدن خطوط کاغذ از داخل محیط، گزارش شد. برای بررسی این لوله­ها از یک کاغذ سفید رنگ که دارای خطوط سیاه با قطر 75/0 میلی­متر می­باشد استفاده شد. نتایج نهایی در مقایسه با کتاب تاکسونومی مخمرها (20) نشان داد که این سویه می­تواند ساکارومایسس سرویزیه باشد.همان‌طور که در جدول 7 مشخص است، این مخمر توانایی تخمیر و استفاده از قند­های گلوکز، آرابینوز، مالتوز، رافینوز، گالاکتوز و سوکروز را دارد.

جدول 7 - نتایج حاصل از تخمیر کربوهیدرات­ها، جذب ترکیبات کربنی و  ترکیبات نیتروژنی توسط سویه مخمر منتخب.

تخمیر کربوهیدرات­ها

+

آرابینوز

+

مالتوز

+

رافینوز

-

لاکتوز

-

مانیتول

-

زایلوز

-

سلبیوز

+

گالاکتوز

+

سوکروز

+

گلوکز

جذب ترکیبات کربنی

+

مالتوز

+

رافینوز

-

لاکتوز

-

مانیتول

-

زایلوز

-

سلبیوز

+

گالاکتوز

+

سوکروز

+

گلوکز

+

آرابینوز

جذب ترکیبات نیتروژنی

-

نیترات پتاسیم

-

نیترات سدیم

-

کلرید آمونیوم

این در حالی است که جذب ترکیبات کربنی برای این قندهای ذکر شده نیز وجود دارد. با توجه به این نتایج مشخص می­شود که ویژگی­های ریخت شناسی؛ فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی سویه منتخب مخمر مشابه به ساکارومایسس سرویزیه می­باشد و می­توان آن را بعنوان سویه مخمر ساکارومایسس سرویزیه در نظر گرفت (جدول 7).

750 bp

شناسایی مولکولی سویه منتخب: پس از واکنش زنجیره­ای پلیمراز و الکتروفورز محصول حاصل از PCR ، باندی به اندازه 750  جفت باز دیده شد که در شکل 4 نشان داده شده است.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4- ژل الکتروفورز مربوط به تکثیر ژن 18S  ریبوزمی سویه مخمر منتخب. M: لدر ژن 1kb (Thermo Scientific GeneRuler 1 kb DNA Ladder)، 1: باند مربوط به تکثیر ژن 18S  سویه مخمر

مطالعات بیوانفورماتیکی: جهت شناسایی سویه مخمر منتخب قطعه 18S ریبوزمی آن توالی­یابی گردید. سپس توالی بدست آمده در بانک اطلاعات بیوانفورماتیکی NCBI مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. با استفاده از قسمت بلاست در پایگاه مذکور مشخص شد که توالی قطعه 18S سویه هدف با سویه ساکارومایسس سرویزیه بیشترین شباهت را داشت بنابراین نتایج تعیین توالی مشخص نمود که سویه­ی مخمر منتخب ساکارومایسس سرویزیه است که این مخمر ساکارومایسس سرویزیه سهند 101 نامیده شد. در شکل 5 درخت فیلوژنی به وسیله نرم افزار MEGA 7 با روش Neighbour-joining رسم شده است.

 

 

شکل 5- درخت فیلوژنی ارتباط توالی ژن ­18S rRNA سویه مخمر منتخب ساکارومایسس سرویزیه سهند 101 با جنس ساکارومایسس سرویزیه نشان می­دهد. همچنین مخمرهای دیگر به عنوان out group هستند.


بحث

بیو­اتانول یک سوخت سازگار با محیط زیست است. مصرف اتانول سبب کاهش انتشار ترکیبات آلی فرار، مونواکسید­کربن واکسیدهای نیتروژن می­شود. انتشار گاز­های گلخانه­ای و سمیت اتانول کمتر از سوخت­های فسیلی است (12). تولید اتانول توسط کشت­های مخمری یک صنعت بسیار مهم است که درآینده بمنظور تولید سوخت­های الکلی بر اهمیت آن افزوده خواهد شد. تبدیل اتانول به یک سوخت زیستی تجدید­پذیر اقتصادی نیاز به بهینه­سازی میزان تولید اتانول دارد. بنابراین در این تحقیق سعی بر این بود که سویه­ای با تحمل بیشتر به اتانول و تولید مناسب اتانول از کارخانجات الکل سازی جداسازی شود (9).

با توجه به اهمیت تولید بیواتانول از ضایعات لیگنوسلولزی به عنوان سوختی تجدیدپذیر و مقرون به صرفه، افزایش بازده تولید امری ضروری به نظر می‌رسد که می­توان این هدف را با استفاده از بهینه­سازی این منابع و تولید حداکثر میزان اتانول انجام داد.  مطالعات مختلفی بر روی استفاده از منابع ارزان قیمت، تحمل میکروارگانیسم­های مسئول  فرآیند تخمیر و کاهش هزینه تولید بیواتانول صورت گرفته است (1 و 25). از ﺟﻤﻠﻪ دﻻﻳﻞ اﻫﻤﻴﺖ ﻣﺨﻤﺮﻫﺎ در ﺗﻮﻟﻴﺪ اﻳﻦ ﻣﺤﺼﻮﻻت ﻣﻲ­ﺗﻮان ﺑﻪ ﻧﮕﻬﺪاری و ﻛﺸﺖ آﺳﺎن و ﻏﻴﺮ وﻳﺴﻜﻮز، ﻧﻴﺎزﻫﺎی ﻣﺤﻴﻄﻲ و ﻏﺬاﻳﻲ ﺳﺎده، ﺗﺮاﻛﻢ ﺳﻠﻮﻟﻲ ﺑﺎﻻ ، ﻫﺰﻳﻨﻪ ﻛﻢ در ﻣﺤﻴﻂ ﺗﻮﻟﻴﺪ اشاره کرد (3).

با بررسی برخی از تحقیقات می­توان به این نتیجه رسید که عموماً سلول­های مخمری از مونوساکاریدها برای رشد­شان استفاده می­کنند و تعداد کمی از آن­ها به اتانول تبدیل می­شود. دی-­گلوکز بهترین نوع سوبسترا است که هم برای برای رشد سلول­های مخمر و هم برای تولید اتانول استفاده می­شود که قند­های هگزوز شامل گلوکز، گالاکتوز و مانوز توسط بسیاری از میکروارگانیسم­ها تخمیر می­شوند (18).

ملاس به دلیل میزان قند بیشتر آن به عنوان سوبسترا برای تخمیر استفاده می­شود. بنابراین می تواند نیاز کربن مخمر ساکارومایسسسسرویزیه را طی متابولیسم آن فراهم کند. در نتیجه استفاده از ملاس به عنوان نسل اول بیواتانول مناسب شناخته می­شود که در این تحقیق نیز از این منبع کربن استفاده شده است. در مطالعه جایوس و همکاران میزان غلظت قند احیا­کننده در طی 36 ساعت انکوباسیون کاهش شدید داشته است که این میزان تا 72 ساعت به آرامی کاهش می­یابد (17). با در نظرگرفتن این موارد بریکس 21 مورد آزمایش در این تحقیق بعد از 72 ساعت به بریکس 14 رسیده است که نشان از استفاده مخمرها از قندهای موجود در منبع کربن یعنی ملاس چغندر است. افزایش درصد اتانول توسط این سویه از مخمر نقش بسزایی در کاهش آلودگی­های محیطی کارخانجات تولیدی دارد که این آلودگی­ها ناشی از درصد پایین اتانول علی رغم استفاده بیش اندازه از ملاس در کارخانجات می­باشد. 

علاوه بر منبع کربن، منابع نیتروژن نقش بسزایی در رشد مخمر و تولید اتانول دارد. بنابراین در بسیاری از محیط­های صنعتی منبع نیتروژن شامل مواد مختلفی مثل پپتیدها و اسید ­آمینه­های آزاد است. در چنین محیط­هایی تشکیل گلیسرول نقش اساسی در تنظیم اسمزی سلولی دارد (7). منبع نیتروژن نمی­تواند فرآیند جذب قند توسط ساکارومایسسسرویزیه را افزایش دهد اما منبع نیتروژن مناسب می­تواند تشکیل محصولات جانبی را کمتر و بازده اتانول را افزایش دهد. وقتی­ که اوره به عنوان منبع نیتروژن است، جریان متابولیسم کربن با زمانی که منبع نیتروژن آمونیوم می­باشد متفاوت است یعنی میزان بازده اتانول با اوره بیشتر می­شود. چرا که از یک طرف متابولیسم اوره NADH تولید می­کند و در نتیجه گلیسرول کمتری شکل می­گیرد و از طرف دیگر در طول تخمیر الکلی اوره می­تواند به عنوان فیلتر مولکولی با اتصال به پروتئین­ها عمل کرده و از تخریب پروتئین­ها به هنگام تولید الکل جلوگیری کند (16). استفاده از آزمایشات بیوشیمیایی و همچنین روش شناسایی مولکولی راهی رایج برای شناسایی میکروارگانیسم­هایی است که ارزش صنعتی دارند. بدویی دلفارد و همکاران از آزمایشات بیوشیمیایی و روش شناسایی مولکولی برای شناسایی باسیلوس مولد آنزیم آسپارازیناز استفاده کرده است (5). در نتیجه استفاده از روش­های شناسایی مختلف برای دست­یابی به سویه صنعتی مناسب جهت تولید هر چه بیشتر سوخت­های پاک و زیستی برای حفظ محیط زیست نیازی مبرم و ضروری می­باشد.

همچنین برای مقایسه سویه­های مختلف در تحمل به اتانول، مطالعه­ای توسط هیراساوا و همکاران صورت گرفته است که براساس آن، کشت دو سویه حاصل از کارخانه شراب­سازی و آزمایشگاهی در غلظت­های 8-5 درصد از اتانول انجام گردید. با توجه به نتایج مشخص شد که با افزودن 7-5 درصد از اتانول به محیط کشت، میزان رشد مخمر حاصل از کارخانه بیشتر از سویه آزمایشگاهی می­باشد و این تفاوت در غلظت 5 درصد بارزتر است که نشان­دهنده­ی تحمل بیشتر این سویه به اتانول می­باشد، ولی رشد هر دو سویه در غلظت 8 درصد به شدت کاهش می­یابد (13). از طرفی، در مطالعه­ی براون و همکاران، ممانعت از رشد مخمر با افزایش غلظت اتانول از 8-4 درصد مشاهده شد که رشد مخمر ساکارومایسس سرویزیه با سویه­ی مشخص در حضور 12 درصد از اتانول به طور کامل متوقف گردید (8 و 11). با توجه به این گزارشات سویه جداسازی شده در این پژوهش، به دلیل تحمل میزان بیشتری از اتانول یعنی 12 درصد می تواند کارایی بهتر و موثرتری در صنعت داشته باشد.

سویه‌ صنعتی ساکارومایسس سرویزیه سهند 101 جداسازی شده در این تحقیق 8 درصد اتانول تولید کرد و به 12 درصد اتانول تحمل داشت. این سویه صنعتی مخمر با ویژگی‌های مناسب از لحاظ تولید و تحمل به اتانول می‌تواند برای مطالعات بعدی و افزایش تولید با روش‌های بهینه‌سازی سازی در سطح ارلن و بیوراکتور بکار رود.

سپاسگزاری

از حمایت های مادی و معنوی معاونت آموزشی و پژوهشی دانشگاه مراغه و همچنین مدیریت­های محترم کارخانجات الکل­سازی سهند مراغه، بیدستان قزوین و گلریز میاندوآب تشکر و قدردانی می‌گردد.

  1. 1. سیمین م، توفیقی آ، آرش اسدی راد م، 1396، تولید بیواتانول توسط ساکارومایسس سرویزیه بومی تثبیت شده در حامل ترکیبی آلژینات-کیتوزان در شرایط تنش فورفورال، دنیای میکروب ها، 2، 122-114.

    2. زاهد ا، صالحی جوزانی غ، خداییان ف، 1394، بهینه سازی منبع ازت و میزان اکسیژن محلول برایتولید همزمان اتانول و زایلیتول در کشت همزمان دو مخمر ساکارومایسس سرویزیه و کاندیدا تروپیکالیس، پژوهشهای سلولی و مولکولی، 28، 249- 238.

    3. امینی ل، صعودی م، نصر ش، 1394، جداسازی مخمرها از شالیزارهای برنج و بررسی کیفی آنزیمهای کاتابولیک برون ریز در دو مخمر از جنس پسودوزیما، پژوهشهای زیست­شناسی سلولی و مولکولی، 28، 34-23.

     

    1. Antoni D, Zverlov VVSchwarz WH. 2007. Biofuels from microbes. Appl Microbiol Biotechnol. 77(1): 23-35.
    2. Badoei-Dalfard A, Karami Z, Ramezani-pour N. 2016. Isolation, molecular identification and production investigation of Bacillus-producing L-Asparaginase from Jiroft microflora. J Microbial world. 9(3):247-256.
    3. Benjaphokee S, Hasegawa D, Yokota D, Asvarak T, Auesukaree C, Sugiyama M, Kaneko Y, Boonchird C, Harashima S. 2012. Highly efficient bioethanol production by a Saccharomyces cerevisiae strain with multiple stress tolerance to high temperature, acid and ethanol. New Biotechnol. 29(3): 86-379.
    4. Blomberg A, Adler L. 1992. Physiology of Osmotolerance in Fungi. In: Rose AH. Advances in microbial physiology. Academic Press. 33: 145-212.
    5. Brown S W, Oliver S G, Harrison D, Righelato R. 1981. Ethanol inhibition of yeast growth and fermentation: differences in the magnitude and complexity of the effect. J Appl Microbiol Biotechnol. 11: 151-155.
    6. Casey GP, Ingledew WM. 1986. Ethanol tolerance in yeasts. Crit Rev Microbiol. 13(3): 80-219.
    7. Chandra R, Takeuchi H, Hasegawa T. 2012.Methane production from lignocellulosic agricultural crop wastes: A review in context to second generation of biofuel production. Renew Sust Energ Rev. 16(3): 76-1462.
    8. D’Amore T, Panchal C, Russell I, Stewart G. 1990. A study of ethanol tolerance in yeast. Crit Rev Biotechnol. 9(4): 287-304.
    9. Hahn-Hägerdal B, Galbe M, Gorwa-Grauslund MF, Lidén G, Zacchi G. 2006. Bio-ethanol–the fuel of tomorrow from the residues of today. Trends Biotechnol. 24(12): 56-549.
    10. Hirasawa T, Yoshikawa K, Nakakura Y, Nagahisa K, Furusawa C, Katakura Y, Shimizu H, Shioya S. 2007. Identification of target genes conferring ethanol stress tolerance to Saccharomyces cerevisiae based on DNA microarray data analysis. J Biotechnol. 131: 34–44.
    11. Karimi K, Emtiazi G, Taherzadeh MJ. 2006. Production of ethanol and mycelial biomass from rice straw hemicellulose hydrolyzate by Mucor indicus. Process Biochem. 41(3): 8-653.
    12. Kurtzman CP, Fell JW. 1998. The yeast: a taxonomic study. 4th ed. Netherlands. Elsevier press.
    13. Lopes DH, Sola-Penna M. 2001. Urea increases tolerance of yeast inorganic pyrophosphatase activity to ethanol: the other side of urea interaction with proteins. Arch. Biochem Biophys. 394(1): 6-61.
    14. Mayzuhroh A, Arindhani S, Caroenchai C. 2016. Studies on bioethanol production of commercial baker's and alcohol yeast under aerated culture using sugarcane molasses as the media. Agric. Agric Sci Procedia. 9: 9-493.
    15. Mosier N, Wyman C, Dale B, Elander R, Lee YY, Holtzapple M, Ladisch M. 2005. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresour Technol. 96(6): 86-673.
    16. Pokhrel CP, Yadav RK, Ohga S. 2008. Agricultural waste residues as potential sources of bioethanol. Sci World J. 6(6): 19-23.
    17. Robert V. 2011. Methods for isolation, phenotypic characterization and maintenance of yeasts. In: Kurtzman C, Fell JW. The yeasts, a taxonomic study. 5th ed. Elsevier: 87-110.
    18. Rogers PL, Jeon YJ, Lee KJ, Lawford HG. 2007. Zymomonas mobilis for fuel ethanol and higher value products. Adv Biochem Engin Biotechnol. 108: 263-288.
    19. Sansonetti S, Hobley TJ, Calabrò V, Villadsen J, Sin G. 2011. A biochemically structured model for ethanol fermentation by Kluyveromyces marxianus: A batch fermentation and kinetic study. Bioresour. Technol. 102(16): 20-7513.
    20. Stanley D, Fraser S, Chambers PJ, Rogers P, Stanley GA. 2010. Generation and characterisation of stable ethanol-tolerant mutants of Saccharomyces cerevisiae. J Ind Microbiol Biotechnol. 37(2): 49-139.
    21. Sudhakar MP, Merlyn R, Arunkumar K, Perumal K. 2016. Characterization, pretreatment and saccharification of spent seaweed biomass for bioethanol production using baker's yeast. Biomass Bioenerg. 90: 148-154.
    22. Tofighi A, Azin M, Mazaheri Assadi M, Assadi-rad MHA, Nejadsattari T, Fallahian MR.  2010. Inhibitory effect of high concentrations of furfural on industrial strain of Saccharomyces cerevisiae. Int J Environ Res. 4(1): 137-142.
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 31, Issue 4
January 2019
Pages 500-510
  • Receive Date: 02 July 2018
  • Revise Date: 05 August 2018
  • Accept Date: 24 September 2018