Document Type : Research Paper
Authors
Department of Biotechnology, Institute of Science and High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran.
Abstract
HMGB4 protein which was identified in 2008 is a member of mammalian non-histone HMGB protein family. All HMGB proteins bind to DNA through two tandem DNA-binding motifs named HMG-box A and HMG-box B. HMGB proteins are known to improve the anticancer properties of platinum-based drugs such as cisplatin by high affinity binding to the platinum-DNA adducts and retarding the process of DNA excision repair. The results from previous studies have revealed in comparison with full-length HMGB1, the full-length HMGB4 binds with higher affinity to platinum-DNA lesions and inhibits the excision repair of the lesions much more efficient. It seems the hypersensitivity of testicular germ cell tumors to cisplatin is originated from strong expression of HMGB4 in this tissue. In the present work, the tertiary structure of human HMGB4 was determined using two methods based on homology modeling (MODELLER software and I-TASSER server). The results show that models created by both methods have good quality and stability. Although I-TASSER model in comparison to the modeller better explain the differences between HMGB1 and HMGB4 binding to the platinated DNA. The results obtained from the work demonstrate that HMGB4 binds to DNA by intercalating of Valine17 and Phenylalanine38 from box A and Leucine101 and Valine120 from box B between base pairs of DNA minor groove. The results also show the C-terminal part of HMGB4 possesses disordered tertiary structure. In general, the results will be helpful to understand the structure-function relationship of the protein and to design new anticancer drugs.
Keywords
Main Subjects
تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی با استفاده از دو روش مبتنی بر همولوژیمدلینگ
صفا لطفی*، مجتبی مرتضوی و علی ریاحی مدوار
کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی
تاریخ دریافت: 29/2/97 تاریخ پذیرش: 17/7/97
چکیده
پروتئین HMGB4 که در سال 2008 شناخته شد از اعضای خانواده پروتئینهای غیرهیستونی HMGB پستانداران است. پروتئینهای HMGB از طریق دو موتیف که بترتیب HMG-box A وHMG-box B نامیده میشوند به DNA اتصال مییابند. پروتئینهای HMGB به DNA تغییر یافته با سیسپلاتین اتصال یافته و مانع دسترسی عوامل ترمیم برشی DNA به این نقاط میشوند. HMGB4 در مقایسه با HMGB1 عضو دیگر این خانواده با میل ترکیبی بالاتری به این نوع DNA اتصال یافته و با قدرت بیشتری ترمیم این نقاط آسیبدیده را مهار مینماید. بنظر میرسد که حساسیت بسیار بالای تومورهای سلولهای زایای بیضه نسبت به سیسپلاتین ناشی از بیان بسیار بالای HMGB4 در بافت بیضه باشد. در این مطالعه ساختار سوم HMGB4 انسانی با استفاده از نرمافزار مدلر و سرور I-TASSER که هردو بر پایه هومولوژی مدلینگ عمل مینمایند تعیین گردید. نتایج نشان میدهد که مدلهای ایجاد شده توسط هردو روش از کیفیت و پایداری مناسبی برخوردار هستند. هرچند مدل I-TASSER در مقایسه با مدلر تفاوت مشاهده شده در ویژگیهای اتصال HMGB1 و HMGB4 به DNA پلاتینه را بهتر توجیه مینماید. بر اساس نتایج حاصل، والین17 و فنیلآلانین38 از HMG-box A و لوسین101 و والین120 از HMG-box B بنیانهایی هستند که با وارد شدن بین جفت بازهای شیار کوچک DNA موجب اتصال پروتئین HMGB4 به DNA میشوند. همچنین نتایج نشان میدهد که بخش انتهای کربوکسیل HMGB4 فاقد ساختار سوم منظم میباشد. نتایج حاصل میتواند به فهم بهتر ارتباط ساختار و عملکرد این پروتئین و همچنین طراحی داروهای جدید ضدسرطان کمک شایانی نماید.
واژههای کلیدی: پروتئین HMGB4، سیسپلاتین، هومولوژی مدلینگ، نرم افزار مدلر، سرور I-TASSER
* نویسنده مسئول، تلفن: ۰۳۴۳۳۷۷۶۶۱۱، پست الکترونیکی: safalotfi@ut.ac.ir
مقدمه
پروتئین های HMG ( (High Mobility Group (HMG) proteins، که اولین بار در سال 1973 شناسایی شدند بزرگترین گروه پروتئین های غیرهیستونی کروماتین را تشکیل میدهند (12). پروتئین های HMGB که فراوان ترین گروه پروتئین های HMG در پستانداران میباشند در تنظیم فعالیتهای متعددی نظیر نسخه برداری، همانندسازی، نوترکیبی V(D)J و ترمیم DNA مشارکت مینمایند (3، 4، 7 و 29). خانواده پروتئینهای HMGB متشکل از پروتئین های HMGB1 (HMG1، آمفوترین)، HMGB2 (HMG2)، HMGB3 و HMGB4 است. پروتئین های HMGB1-3 با وزن مولکولی تقریبا 25 کیلودالتون، از دو دومین اتصال یابنده به DNA به نام HMG box-A (باکس A) و HMG box-B (باکس B) و یک دم اسیدی طویل در انتهای کربوکسیل تشکیل شده اند (25، 26 و 39). پروتئین HMGB4 با وزن تقریبی 22 کیلودالتون که اولین بار در سال 2008 شناخته شد تنها عضو این خانواده است که فاقد دم اسیدی میباشد (6). اولین بار مطالعات انجام گرفته در موش نشان داد که بیان پروتئین HMGB4 در بیضه ها بسیار بالا است، این در حالی است که این پروتئین در اغلب بافت ها بیان نمیشود و یا در معدودی از بافت ها نظیر مغز بمیزان بسیار کمی بیان میگردد (5، 6 و 20).
DNA هدف اصلی داروهای ضدسرطانی حاوی پلاتین (نظیر سیس پلاتین) محسوب می شود (9). این داروها با اتصال به نیتروژن شماره 7 بازهای پورین موجب ایجاد اتصالات متقاطع در ساختار DNA میشوند (15). پروتئین هایHMGB با میل ترکیبی بالایی به این ساختارهای متشکل از DNA-پلاتین اتصال یافته و مانع دسترسی عوامل ترمیم DNAبه این نقاط می شوند و بنابرین اثر ضدسرطانی این داروها را تقویت می نمایند (14، 37). پروتئین HMGB4 در مقایسه با پروتئین HMGB1 با میل ترکیبی بالاتری به این ساختارها اتصال می یابد و همچنین با قدرت بیشتری ترمیم این نقاط آسیب دیده را مهار می نماید. بنظر می رسد که حساسیت بسیار بالای تومورهای سلول های زایای بیضه نسبت به سیسپلاتین ناشی از بیان بسیار بالای این پروتئین در بافت بیضه باشد (19).
بطور کلی پیشبینی ساختار سوم یک پروتئین با استفاده از توالی آمینوسیدی آن یک مسئله علمی اساسی محسوب میشود. از بین انواع روشهای موجود برای تعیین ساختار پروتئینها، هومولوژیمدلینگ بعنوان اولین و سریع ترین روش در نظر گرفته می شود. (31، 34). تا به امروز ساختار سوم HMGB4 در هیچکدام از گونههای پستانداران تعیین نشده است. در این مطالعه، ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی با استفاده از نرم افزار مدلر و سرور I-TASSER تعیین گردیده است. در مجموع نتایج بدست آمده از این تحقیق میتواند به فهم بهتر ارتباط بین ساختار و عملکرد این پروتئین و همچنین طراحی داروهای جدید ضدسرطان کمک نماید.
مواد و روشها
بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی، ابتدا توالی این پروتئین با فرمت FASTA از پایگاه اطلاعاتی UniProt دانلود گردید. UniProt که یک پایگاه اطلاعاتی با کیفیت بسیار بالا است بطور رایگان قابل دسترس می باشد و اطلاعات کاملی را از عملکرد و توالی پروتئینها ارائه می دهد. بسیاری از ورودی های اطلاعاتی این سایت از پروژه های تعیین توالی ژنوم مشتق شده است. این سایت مقادیر بالایی از اطلاعات را در مورد عملکرد زیستی پروتئینها که از نتایج حاصل از تحقیقات علمی بدست آمده اند در اختیار محققین قرار می دهد (30).
بررسی کلی ساختار HMGB4 با استفاده از سایت PONDR: درگام اول بمنظور پیشبینی ساختار کلی پروتئین HMGB4 و مشخص نمودن مناطقی از پروتئین که دارای ساختار سوم منظمو یا نامنظماست توالی پروتئین به سایت PONDR داده شد و نتایج بدست آمده مورد بررسی قرار گرفت. تنها دادهای که PONDR برای پیش بینی مناطق منظم و نامنظم ساختار پروتئین ها به آن نیاز دارد توالی پروتئین مورد نظر است (35).
تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 با استفاده از دو روش مبتنی بر هومولوژی مدلینگ: هومولوژیمدلینگ بر این واقعیت تکیه دارد که پروتئینهایی که از لحاظ تکاملی به هم مرتبط هستند ساختار مشابهی را نیز دارا میباشند. در این روش، ساختار سوم یک توالی پروتئینی خاص (هدف: Target) از طریق همترازسازیآن با توالی یک یا بیش از یک پروتئین با ساختار مشخص (الگو: Template) پیش بینی میشود. اولین مرحله در هومولوژیمدلینگ تشخیص کلیه ساختارهای پروتئینی مرتبط با توالی هدف می باشد. سپس از بین این ساختارها، الگوهای مناسب انتخاب میشوند. سپس توالی پروتئین هدف با توالی الگو(ها) همترازسازی شده و در نهایت مدلهای سه بعدی از پروتئین موردنظر ساخته می شود. در مرحله آخر مدل های ساخته شده مورد ارزیابی قرار می گیرند (10).
تعیین ساختار سوم HMGB4 با استفاده از نرم افزار مدلر: مدلر یک برنامه کامپیوتری است که ساختار سوم پروتئینها را بر پایه هومولوژی مدلینگ پیش بینی مینماید. برای تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4، نسخه 9.15 نرم افزار مدلر مورد استفاده قرار گرفت. تعیین ساختار سوم پروتئینها با نرمافزار مدلر که از زبان برنامه نویسی پایتون استفاده مینماید شامل چندین مرحله می شود. همه این مراحل ساخت یک فایل پایتون (با پسوند .py) و اجرای آن با استفاده از نرم افزار مدلر را شامل میشود. در ذیل این مراحل بطور خلاصه ذکر شده است: 1- جستجوی پروتئینهایی که توالی آمینواسیدی آن ها به HMGB4 شباهت دارد و ساختار سوم آن ها تعیین شده است. 2- انتخاب یکی از این پروتئین ها بعنوان الگوبرای مدل سازی. 3- همتراز کردن توالی الگو و توالی HMGB4. 4- مدل سازی و انتخاب مناسب ترین مدل از بین مدل های ساخته شده. 5- ارزیابی مدل ساخته شده (10، 11 و 23). بمنظور مشاهده و بررسی مدل های ایجاد شده از نرم افزارهای PyMOL و Swiss PDB Viewer استفاده گردید.
تعیین ساختار سوم HMGB4 با استفاده از سرور I-TASSER : سرور I-TASSER (Iterative Threading ASSEmbly Refinement) یک سرویس اینترنتی است که با استفاده از یک روش سلسله مراتبی ساختار و عملکرد یک پروتئین را پیش بینی می نماید. I-TASSER عنوان سرور شماره یک را برای پیش بینی ساختار پروتئین در آزمایش های CASP7، CASP8، CASP9، CASP10 و CASP11 (CASP: Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction)، به خود اختصاص داده است. این سرور همچنین در آزمایش CASP9 بعنوان بهترین سرور برای پیش بینی عملکرد پروتئین شناخته شده است (21، 36 و 38). بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 با استفاده از سرور I-TASSER توالی این پروتئین به سرور مورد نظر داده شد. I-TASSER، بمنظور انجام فرایند مدلینگ، از متاسرور LOMETS برای جستجوی الگوهای ساختاری در کتابخانه PDB (Protein Data Bank) استفاده می نماید. این متاسرور متشکل از چندین برنامه threading است. این برنامههای threading عبارتند از: 1)MUSTER 2) FFAS-3D 3) SPARKS-X 4) HHSEARCH2 5) HHSEARCH I 6) Neff-PPAS 7) HHSEARCH 8) pGenTHREADER 9) wdPPAS 10)cdPPAS (33). در مجموع پنج مدل برای HMGB4 توسط I-TASSERR ساخته شد که بر اساس C-score بهترین مدل انتخاب گردید. درجه قابل اطمینان بودن یک مدل پروتئینی ایجاد شده توسط I-TASSER به صورت کمی توسط C-score اندازه گیری میشود و بنابراین مدلی با بالاترین میزان C-score بهترین مدل شناخته می شود. مقادیر C-score بین 5- تا 2 متغیر است.
نتایج
در مرحله اول بمنظور پیش بینی ساختار کلی پروتئین HMGB4 و تعیین مناطقی از پروتئین که دارای ساختار سوم منظم و یا نامنظم است توالی پروتئین HMGB4 به سرور PONDR داده شد و نتایج مورد بررسی قرار گرفت. نواحی فاقد ساختار مشخص (دارای ساختار نامنظم) می تواند کل یک پروتئین و یا بخش هایی از پروتئین را شامل شود. در واقع این نواحی که اساسا یا بطور نسبی و یا بطور کامل فولد نشده اند فاقد یک ساختار سوم مشخص می باشند. تحقیقات نشان می دهد که این نواحی در فعالیتهای متعددی نظیر تشخیص DNA، تنظیم میل ترکیبی و یا ویژگی اتصال و کنترل طول عمر پروتئین ها نقش دارند. اگر چه این نواحی، در وضعیت های طبیعی فاقد ساختار سوم مشخص هستند اما ممکن است در نتیجه اتصال به مولکولهای دیگر انتقال از حالت نامنظم به منظم را طی نمایند (35). نتایج بدست آمده از این بخش در شکل 1 نمایش داده شده است. همانطور که بخوبی در شکل مشخص است محور X شماره آمینواسیدها و محور Y، PONDR Score را مشخص مینماید. بخش هایی از پروتئین که دارای PONDR Score بالای 5/0 است نشان دهنده مناطقی است که فاقد ساختار منظم است.
شکل 1- پیش بینی بخش هایی از پروتئین HMGB4 که فاقد ساختار سوم مشخص است با استفاده از سرور PONDR
همانطور که در بخش مواد و روش ها اشاره شد بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی، ابتدا توالی این پروتئین از پایگاه اطلاعاتی UniProt دریافت شد و سپس طی چند مرحله با استفاده از نرم افزار مدلر (نسخه 9.15) ساختار این پروتئین تعیین گردید. در اولین مرحله پروتئین هایی که توالی آمینواسیدی آن ها به HMGB4 شباهت دارد و فایل PDB آنها موجود است جستجو شدند. نتایج در شکل 2 نمایش داده شده است. ستون یک کد PDB و نوع زنجیره (A، B و ....)، ستون پنج تعداد بنیانهای آمینواسیدی هر PDB، ستون هفت درصد تشابه توالی HMGB4 و توالی PDB مورد نظر که بوسیله طول همترازسازی یکدست شده است، ستون هشت مقادیر E-value همترازسازی را نمایش میدهد. تمام PDBهایی که E-value همترازسازی برابر با صفر دارند در شکل با بیضی های قرمز مشخص شدهاند. با توجه به نتایج بدست آمده 2yrq بهترین الگویی است که میتوان از آن در مدلسازی پروتئین HMGB4 استفاده نمود. زیرا درصد تشابه آن با HMGB4، 17/44% و E-value همترازسازی آن برابر صفر است. 2yrq درواقع باکس A و B پروتئین HMGB1 انسانی (بنیانهای 166-1) است که از طریق روش NMR تعیین ساختار شده است (28) اگرچه 2rtu و 1j3x درصد تشابه توالی بالاتری نسبت به 2yrq دارند و E-value همترازسازی آن ها نیز صفر است ولی تعداد بنیان های آمینواسیدی آن ها نسبت به 2yrq بسیار کمتر است. زیرا 2rtu تنها باکس A پروتئین HMGB1 انسانی (32) و 1j3x دومین N-ترمینال HMGB2 گراز وحشی (16) را شامل میشود. پس با توجه به اینکه 2yrq هر دو باکس A و B را در بر میگیرد الگوی کاملا مناسبی برای مدلسازی HMGB4 محسوب میشود.
شکل 2- نتایج حاصل از جستجوی پروتئین هایی با ساختار سوم مشخص که درصد تشابه توالی بالایی با پروتئین HMGB4 دارند با استفاده از نرم افزار مدلر. مواردی که با بیضی های قرمز مشخص شده اند همگی دارای E-value همترازسازی برابر با صفر می باشند. اما بدلایلی که در متن ذکر شده است 2yrq بعنوان الگو برای مدلسازی HMGB4 در نظر گرفته شد.
در مرحله بعد توالی 2yrq و HMGB4 با استفاده از روش align2d همترازسازی شدند. این روش همترازسازی که توسط نرمافزار مدلر استفاده می شود بر پایه یک الگوریتم برنامه نویسی پویا بنیان نهاده شده است و با روشهای همترازسازی توالی-توالی متداول تفاوت دارد زیرا align2d بمنظور ایجاد همترازسازی، اطلاعات ساختاری از الگو را نیز مد نظر قرار میدهد (10). پس از اجرای همترازسازی، مدلسازی انجام گرفت. در مجموع پنج مدل ساخته شد که بر اساس مقادیر DOPE و GA341 بهترین مدل انتخاب گردید. در واقع مدلی که کمترین میزان DOPE و بیشترین میزان GA341 را داشته باشد بهترین مدل محسوب می شود. مقادیر GA341 بین صفر تا یک متغیر است. با توجه به اینکه مقادیر GA341 پنج مدل بسیار به یکدیگر نزدیک بود و DOPE نسبت به GA341 فاکتور قابل اطمینان تری برای تعیین مدل مناسب محسوب می شود مدل دو با کمترین میزان DOPE (-13290.73340) بعنوان بهترین مدل در نظر گرفته شد.
شکل 3-الف بهترین مدل ایجاد شده توسط نرم افزار مدلر (مدل دو) را که از طریق نرم افزار PyMOLمشاهده شده است نمایش می دهد. اگرچه 2yrq الگوی مناسبی برای مدلسازی HMGB4 محسوب می شود اما بیش از 20 اسیدآمینه انتهایی HMGB4 معادلی در 2yrq ندارند و در نتیجه مدلر این بخش انتهایی را بدون استفاده از الگو می سازد. البته با توجه به نتایج بدست آمده از سرور PONDR (شکل 1) بخش انتهایی پروتئین HMGB4 فاقد ساختار سوم مشخص است.
بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 با استفاده از سرور I-TASSER، توالی این پروتئین به فرمت FASTA از پایگاه اطلاعاتی UniProt دریافت شد و در اختیار سرور مورد نظر قرار گرفت. از بین پنج مدل ساخته شده توسط I-TASSER، مدل یک با بیشترین میزان C-score (76/0-) بعنوان بهترین مدل در نظر گرفته شد. شکل 3-ب مدل یک را که با استفاده از نرم افزار PyMOL مشاهده شده است نمایش می دهد.
شکل 3- بهترین مدل ساخته شده از پروتئین HMGB4 توسط نرم افزار مدلر (الف) و سرور I-TASSER (ب) که با استفاده از نرم افزار PyMOL مشاهده شده است.
همانطور که در بخش مواد و روشها اشاره شد فرایند مدلینگ توسط I-TASSER با جستجوی الگوهای ساختاری در کتابخانه PDB توسط LOMETS آغاز میشود. سرور I-TASSER در مجموع از دو ساختار PDB بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 استفاده نمود (داده ها نمایش داده نشده است). یکی از این ساختارها که توسط هشت برنامه threading سرور LOMETS بعنوان بهترین الگو معرفی شد زنجیره A 2yrq (2yrqA) است که در واقع ساختار محلول باکس A و B پروتئین HMGB1 انسانی (بنیان های 166-1) می باشد (28) و توسط برنامه مدلر نیز بعنوان الگو انتخاب گردید. همچنین زنجیرهA 3tq6 (3tq6A) که ساختار کریستال فاکتور نسخه برداری A میتوکندریایی (TFAM) انسانی است (22) توسط دو برنامه threading بعنوان الگو انتخاب شد. همانطور که قبلا اشاره گردید هرچند 2yrq الگوی بسیار خوبی برای مدلسازی HMGB4 محسوب میشود اما بیش از 20 اسیدآمینه انتهایی HMGB4 معادلی در 2yrq ندارند و بنابراین برای ایجاد یک مدل که تمام طول HMGB4 را پوشش دهد نمیتوان فقط از 2yrq بعنوان الگو استفاده نمود. بنابراین سرور I-TASSER بمنظور ایجاد این نوع مدل، 2yrq و 3tq6 را بطور همزمان بعنوان الگوی مدلسازی مورد استفاده قرار داد.
همانطور که قبلا در بخش مقدمه اشاره شد پروتئینهای HMGB از طریق HMG-boxهای A و B به DNA متصل می شوند. هر دومین HMG-box که تقریبا دارای 75 اسید آمینه است از سه آلفا هلیکس که بفرم L و با زاویه تقریبی 80 درجه فولد شده اند تشکیل شده است. در شکل 3 بخوبی مشخص است که ساختار پروتئین HMGB4 نیز از دو HMG-box A و B تشکیل شده است. در واقع نحوه اتصال پروتئینهای HMGB به DNA بگونه ای است که بنیانهای آمینواسیدی حجیم هیدروفوب قرار گرفته در سطح مقعر HMG-boxهای A و B بین جفت بازهای شیار کوچک DNA قرار میگیرند. در پروتئینHMGB1 ، آلانین 17 و فنیل آلانین 38 از باکس A و فنیل آلانین 103 و ایزولوسین 122 از باکس B این مسئولیت را بر عهده دارند (27). بررسی همترازسازیهای انجام شده توسط نرم افزار مدلر و سرور I-TASSER، بنیانهای معادل این بنیان ها را در HMGB4 مشخص مینماید (همترازسازیها نمایش داده نشده است). والین 17 و فنیلآلانین 38 از باکس A و لوسین 101 و والین 120 از باکس B بنیان های حجیم هیدروفوبی هستند که در اتصال پروتئین HMGB4 به DNA نقش دارند. همانطور که مشخص است از این چهار اسیدآمینه فقط یکی از آنها (فنیل آلانین 38) در هر دو پروتئین HMGB4 و HMGB1 حفظ شده است (19). شکل 4 موقعیت قرارگیری این بنیان های حجیم هیدروفوب را در پروتئینهای HMGB1 (2yrq) و HMGB4 (مدل های ایجاد شده توسط مدلر و I-TASSER) نشان میدهد.
شکل 4-مقایسه ساختار پروتئین HMGB1 ((2yrqA (الف) با مدل های ایجاد شده از ساختار پروتئین HMGB4 توسط نرمافزار مدلر (ب) و سرور I-TASSER (ج). بنیان های حجیم هیدروفوب از HMG-box A و HMG-box B که با وارد شدن به درون شیار کوچک DNA موجب اتصال این پروتئینها به DNA می شوند به فرم کروی مشخص گردیده اند.
بحث
تعیین ساختار سوم پروتئین ها با استفاده از روش های آزمایشگاهی همیشه بهترین گزینه بشمار نمی رود. زیرا علاوه بر آنکه این روش ها نیازمند صرف زمان و هزینه بالا هستند برای برخی از پروتئین ها قابل اجرا نمی باشند. امروزه روش های مبتنی بر هومولوژی مدلینگ بدلیل آنکه سریعتر و کم هزینهتر از روش های آزمایشگاهی هستند از اهمیت بسیار بالایی برای تعیین ساختار پروتئینها برخوردار می باشند (31). همچنین پیشرفتهای علمی بدست آمده در این زمینه منجر به افزایش روزافزون قابلیت اطمینان و دقت این روش ها شده است. تعیین ساختار سوم پروتئین ها از بسیاری از جهات حائز اهمیت فراوان است (34). بسیاری از ترکیباتی که امروزه بعنوان دارو برای درمان بیماری ها مورد استفاده قرار می گیرند در واقع عملکرد خود را از طریق میانکنش با یک پروتئین خاص انجام می دهند. بمنظور طراحی این نوع داروها ابتدا باید ساختار سوم پروتئین مورد نظر وجود داشته باشد. در ضمن با توجه به اینکه بین ساختار و عملکرد یک پروتئین رابطه تنگاتنگی وجود دارد تعیین ساختار سوم یک پروتئین به فهم بهتر عملکرد آن پروتئین کمک شایانی مینماید (2، 10و 31).
پروتئین HMGB4 که در سال 2008 شناسایی شد از اعضای خانواده پروتئین های HMGB است (6). این خانواده که علاوه بر HMGB4 از سه عضو دیگر به نام های HMGB1، HMGB2 و HMGB3 تشکیل شده است فراوان ترین گروه پروتئین های غیرهیستونی HMG را تشکیل می دهد (26). پروتئین HMGB4 بر خلاف سایر اعضای این خانواده که همگی بعنوان فعال کننده های نسخه برداری عمل می نمایند یک مهارکننده توانمند فرایند نسخه برداری محسوب می شود (6). تا به امروز ساختار سوم پروتئین HMGB4 در هیچکدام از گونه های پستانداران تعیین نشده است. در مطالعه حاضر بمنظور تعیین ساختار سوم پروتئین HMGB4 انسانی از دو روش که هر دو بر پایه هومولوژی مدلینگ بنا شده اند استفاده گردید. در یکی از این روش ها نرمافزار مدلر برای تعیین ساختار سوم این پروتئین مورد استفاده قرار گرفت و در روش دیگر از سرورI-TASSER برای مدلسازی استفاده شد.
همانطور که بخوبی در مدلهای ایجاد شده توسط نرم افزار مدلر (شکل 3-الف) و سرور I-TASSER (شکل 3-ب) مشخص است پروتئین HMGB4 همانند سایر اعضای خانواده پروتئین های HMGB دارای دو دومین HMG-box A و B برای اتصال به DNA میباشد. این پروتئین ها بمنظور اتصال به DNA، بنیان های حجیم هیدروفوب قرار گرفته در سطح مقعر این دو دومین را بین جفت بازهای شیار کوچک DNA وارد می نمایند (1 و26). در شکل 4 موقعیت قرارگیری این بنیانهای حجیم هیدروفوب در پروتئین های HMGB1 و HMGB4 مشخص شده است. از بین این چهار بنیان تنها فنیلآلانین 38 در هر دو پروتئین حفظ شده است. همانطور که در بخش مقدمه اشاره شد پروتئین های HMGB با اتصال به DNA پلاتینه حاصل از میانکنش داروهای ضدسرطان پلاتینه نظیر سیسپلاتین با DNA مانع دسترسی سیستم ترمیم DNA به این نقاط و در نتیجه موجب تقویت اثر ضدسرطانی این نوع داروها میشوند. تحقیقات نشان میدهد که فنیلآلانین 38 که در HMGB4 موش نیز وجود دارد نقش بسیار مهمی در اتصال پروتئین های HMGB به DNA پلاتینه ایفا می نماید (13، 17، 19 و 24). بررسی نحوه قرارگیری این بنیان در مدل های ایجاد شده توسط مدلر و I-TASSER و مقایسه آن با فنیل آلانین 38 پروتئین HMGB1 (2yrq) اطلاعات جالبی را ارائه می دهد (شکل 5). در این شکل دو پروتئین HMGB4 و HMGB1 با استفاده از گزینه "iterative magic fit" نرم افزار Swiss PDB Viewer بر روی یکدیگر منطبق شده اند و موقعیت فنیل آلانین 38 در این دو پروتئین مقایسه شده است. در مدل ایجاد شده توسط I-TASSER زنجیره جانبی این بنیان نسبت به بنیان معادلش در HMGB1 بنحو متفاوتی جهت گیری می نماید در حالی که در مدل مربوط به مدلر این جهت گیری متفاوت مشاهده نمی شود. نتایج حاصل از تحقیقات In vitro نشان می دهد که میل ترکیبی HMGB4 و HMGB1 برای اتصال به DNA پلاتینه و همچنین توانایی آنها برای ممانعت از ترمیم این نقاط توسط سیستم ترمیم DNA تفاوت معنیداری را نشان میدهد (19). با توجه به اینکه فنیل آلانین 38 نقش بسیار مهمی را در فرایند اتصال این دو پروتئین به DAN پلاتینه ایفا می نماید بنظر میرسد که مدل ساخته شده توسط I-TASSER در مقایسه با مدلر این اختلاف را بنحو بسیار خوبی توجیه می نماید. همچنین مطالعات انجام گرفته در زمینه مقایسه کیفیت مدل های پروتئینی ساخته شده توسط چندین روش متفاوت مبتنی بر هومولوژی مدلینگ نشان می دهد که سرور I-TASSER در بین این روش ها بهترین عملکرد را دارد که نتایج بدست آمده در این مطالعه با نتایج مربوط به این تحقیق مطابقت دارد (8).
شکل 5- مقایسه نحوه جهتگیری زنجیره جانبی بنیان فنیلآلانین 38 در پروتئین HMGB1 ((2yrqA و مدل های ایجاد شده از پروتئین HMGB4 توسط سرور I-TASSER (الف) و نرم افزار مدلر (ب).
نرم افزار مدلر 2yrq را بعنوان الگو برای مدلسازی مورد استفاده قرار داد. همانطور که در بخش نتایج اشاره شد بیش از 20 اسیدآمینه انتهایی پروتئین HMGB4 معادلی در 2yrq ندارند. این بدین معناست که برای ساخت مدلی سه بعدی از این بخش از پروتئین HMGB4 الگویی وجود ندارد. بررسی کلی ساختار سوم پروتئین HMGB4 با استفاده از نرم افزار PONDR (شکل 1) نشان میدهد که این بخش از پروتئین HMGB4 به احتمال زیاد فاقد ساختار سوم مشخص و منظم می باشد. البته این احتمال وجود دارد که بهنگام اتصال این پروتئین به DNA و یا پروتئینهای دیگر، این بخش ساختار سوم منظمی را ایجاد نماید. بمنظور ایجاد ساختار سوم پروتئین HMGB4 با استفاده از نرم افزار مدلر بخش انتهایی HMGB4 در همترازسازی لحاظ گردید، در نتیجه نرم افزار مدلر این بخش از پروتئین را بدون الگو ایجاد نمود.
سرور I-TASSER بمنظور ایجاد مدلی که تمام طول پروتئین HMGB4 را پوشش دهد علاوه بر 2yrq از 3tq6 نیز بعنوان الگو استفاده نمود. 3tq6A در واقع ساختار کریستال فاکتور نسخه برداری A میتوکندریایی (TFAM) انسانی است (22). TFAM حاوی دو HMG-box است و نقش بسیار مهمی در بسته بندی، بقا و همچنین نسخه برداری DNA میتوکندریایی دارد (18). بررسی بهترین مدل ایجاد شده توسط I-TASSER (شکل 3-ب) نیز نشان میدهد که این بخش از پروتئین HMGB4 در کل فاقد ساختار منظم سوم می باشد، هرچند بخش بسیار کوچکی از آن دارای ساختار مارپیچ آلفا است. در مجموع اطلاعات بدست آمده از این مطالعه می تواند به طراحی داروهای ضدسرطان جدید و فهم ارتباط بین عملکرد و ساختار پروتئین HMGB4 کمک فراوانی نماید.
تقدیر و تشکر
این مقاله مستخرج از طرح شماره 2421/94/ص/7 دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان
میباشد که بدینوسیله نویسندگان لازم میدانند از دانشگاه مذکور تقدیر و تشکر نمایند.
1. امان زاده، ا. و محبت کار، ح. 1394. بررسی نقش HMGB1 در بیماری Cerebral Ischemia و مقایسه داروهای طراحی شده برای مسیر سیگنالی آن. مجله پژوهش های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). (1)28، 22-9.
2. کیان مهر، ا.س. و مهدی زاده دهوسطی، ر. 1393. مطالعه فیلوژنتیکی باکتری سودوموناس پوتیدا تولید کننده پرولین دهیدروژناز و آنالیز بیوانفورماتیکی آنزیم جداسازی شده. مجله پژوهش های سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران). (2)27، 295-285.