Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)

Effects of unfunctional RON1 in mutant plants ron1-1 in response to hormonal-induced stress in Arabidopsis

Document Type : Research Paper

Abstract

Plants are usually exposed by environmental stresses and in this regard they normally change their hormones levels in order to give a sufficient response to those environmental stresses to ensure their survival. Hereby, morphological and molecular charachteristics of ron1-1 mutant including was evaluated and compared with the Ler-0 wild type plants in response to different concentrations of hormone IAA, ABA, ACC in vitro condition. Plant hormone abscisic acid (ABA) is involved in a wide range of plant developmental stages and its levels changes when plants are facing with drought stress and pathogens. Vein pattern, lateral root formation, hairy root, stem, root and apical dominance are to be adjusted by auxin (IAA). Plant hormone ethylene is involved in many physiological processes such as germination, senescence, fruit ripening, leaf fall, creating hairy roots. The Morphological conversion in ACC's treated plants is called triple response. Triple response symptom includes root shortness, root thickness and hypocotyl shortness and exajorated hock. Based on the obtained results, there is a significant difference between primary root length, lateral root number, leaf number and rate of germination in mutant seedlings ron1-1 when compared with the wild type seedlings in response to Different concentrations of ABA, ACC, IAA. Overall, the results here indicate that a considerable increase in sensitivity of ron1-1 and old101 mutant plants to stress-induced conditions has been observed in comparison with the Ler-0 plants.

Keywords

بررسی تأثیر عدم فعالیت آنزیم RON1 در گیاهان موتانت ron1-1 در واکنش به تنش القا شده توسط هورمونها در آرابیدوپسیس 

سارا رویان1، رضا شیرزادیان خرم‌آباد1*، عاطفه صبوری2 و محسن زواره2

1 رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی کشاورزی

2 رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات

تاریخ دریافت: 29/2/94                تاریخ پذیرش: 19/11/94 

چکیده

گیاهان با توجه به نوع تنش میزان بسیاری از هورمونها را تغییر می­دهند. هورمونهای گیاهی اسید آبسیزیک (ABA)، اکسین (IAA) و اتیلن (Ethylene) بر طیف گسترده­ای از فعالیت­های مهم گیاه مؤثر هستند. از آن­جایی که ژن RON1 بر مسیر بیوسنتز یا سیگنالینگ هورمونهای  IAA, ABAو C2H4 مؤثر می­باشد، از این‌رو تأثیر تغییر فعالیت ژن RON1 در گیاهچه‌های ron1-1 بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی در واکنش به غلظتهای مختلف این هورمونها در محیطin vitro  مورد بررسی قرار گرفت. طول ریشه اصلی، تعداد ریشه جانبی، تعداد برگ و میزان جوانه‌زنی در گیاهچه­های جهش­یافته ron1-1 در واکنش به غلظتهای مختلف  ABAدر مقایسه با گیاهچه­های مادری تفاوت معنی­داری نشان دادند. همچنین طول ریشه، طول هیپوکوتیل و تعداد ریشه جانبی در گیاهچه­های جهش­یافته ron1-1 در واکنش به غلظتهای مختلف IAA در مقایسه با گیاهچه­های مادری دارای تفاوت معنی­داری بودند. بررسی رگبرگ‌ها در کوتیلدون‌ها و برگ سوم گیاهچه ها نشان داد که موتانت‌ها دارای شبکه­های رگبرگی ثانویه باز بوده، در حالی­که ژنوتیپ Ler-0 دارای شبکه رگبرگی پیوسته می­باشد. گیاهچه­ها در واکنش به غلظتهای مختلف  ACC(پیش‌ماده اتیلن) نیز از لحاظ طول ریشه، طول هیپوکوتیل و قطر ریشه تفاوت معنی­داری را با گیاهچه­های مادری نشان دادند. بنابراین جهشron1-1 و تغییر میزان فعالیت آنزیم RON1 موجب تغییر خصوصیات گیاهچه­های موتانت در مقایسه با گیاهان مادری گردید. جهش در ژن RON1 باعث تجمع آدنوزین 3 و 5 بیوفسفات (PAP) و احتمالاً اینوزیتول-1و4و5 تری فسفات (IP3) در سلول­های گیاهان موتانت شده که این تجمع باعث توقف فعالیت RON1 و تأثیر بر خصوصیات مرفولوژیکی مرتبط در گیاهچه­های موتانت شده است.

واژه‌های کلیدی: آرابیدوپسیس، ACC، ABA، IAA، تنش هورمونی، RON1/FRY1 

* نویسنده مسئول، تلفن: 33690451-013 ، پست الکترونیکی: R.shirzadian@gmail.com 

مقدمه

 

گیاهان در طول دوره رشد و نمو خود به کرات در برابر تنش­های محیطی قرار می­گیرند (4). با توجه به نوع تنش و محرک محیطی، مجموعه­ خاصی از ترکیبات وهورمونهای گیاهی از قبیل اسید جاسمونیک (Jasmonic acid)، اسید سالسیلیک (Salicylic acid)، اسید آبسیزیک (Abscisic acid)،  اتیلن (Ethylene)  و  اکسین  (Auxin)  در  گیاهان

برای حصول اطمینان از بقای گیاه تولید می­شود (1).

هورمون گیاهی اسید آبسیزیک (ABA) بر طیف گسترده ای از فعالیت­های مهم در رشد و توسعه گیاه از­قبیل خواب بذر، رشد و توسعه­ ریشه و ساقه، تعرق و تحمل به تنش مؤثر می­باشد (6). در گیاه توسعه­ ریشه­ جانبی با افزایش میزان ABA مهار می­شود، این اتفاق بلافاصله بعدازظهور پریموردیای ریشه جانبی و قبل ازفعال شدن مریستم ریشه­جانبی رخ می­دهد (6). تحت شرایط طبیعی رشد، محتوای ABA در گیاهان بسیار کم است. در واکنش به تنش غیر زیستی مقدار ABA در سلول گیاهی افزایش می­یابد (5). ژن RON1/FRY1 (ROTUNDA1/FIERY1) در مسیر پاسخ به تنش­های وابسته به  ABA و غیر وابسته به ABA بعنوان یک تنظیم­کننده منفی عمل می­کند (23). همچنین به عنوان تنظیم کننده­ سیگنالینگ تنش­های غیر زنده عمل می­کند (5) و (شکل 1-الف). پس از تیمار گیاهان موتانت fry1-1 با  ABAنشان داده شد که در گیاهان جهش یافته fry1-1 میزان IP3 (Inositol 1, 4, 5 triphosphate) نسبت به گیاهان تیپ وحشی افزایش یافته­است (23). موتانت­های fry1 دارای حساسیت بیشتری به ABA در پاسخ به تنش القا شده می­باشد (23).

 

 

شکل 1- الف: مدل ارائه شده در مورد نقش فعالیت RON1 در ارتباط با هورمونهای  (2) C2H4 ,(1) IAAو(3) ABA. جهش ron1-1 منجر به اختلال در عملکرد سه هورمون ذکر شده می­شود (14، 17، 20، 21). ب- ساختار ژن RON1 روی کروموزوم شماره 5 آرابیدپسیس تالیانا، محل جهشron1-1  در ژن RON1 و برخی دیگر از موتانت‌های آللیک با ron1-1 نشان داده شده است. جهش  ron1-1در مرز اگزون 5 و اینترون مربوطه رخ‌داده است (5، 17، 23، 24).

 

از دیگر هورمونهای مؤثر بر رشد و نمو گیاهان، اکسین، ایندول-3- استیک اسید (IAA) می­باشد (12). ریشه جانبی یا فرعی معمولا‍ً در ناحیه ای بالاتر از ناحیه­ طویل­شدن تارهای­کشنده یافت­می­شود و از گروه­های کوچکی از سلول­های دایره­ محیطیه منشأ می­گیرند. هورمون IAA نقش مهمی در تشکیل و طویل شدن ریشه­جانبی و سازماندهی و ایجاد ساختار نهایی ریشه دارد (15و 8). هورمونهای گیاهی از جمله اکسین نقش مهمی در تعدیل رشد گیاه و همچنین محافظت در برابر تنش­ها دارند (3). الگوی رگبرگ­ها، تشکیل ریشه­جانبی، ریشه مویین، ساقه، ریشه و چیرگی انتهایی فرایندهایی شناخته شده هستند که توسط هورمون IAA تنظیم می­شوند (17). پیام رسانی اکسین توسط گیرنده­های اکسین همانند گروه TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1 (TIR1) , AUXIN SIGNALING F-BOX (AFB)  انجام می­شود، این گیرنده­ها هدف پروتئین­های  AUX/IAAهستند (3). پروتئین­های  TIR1/AFBبه­عنوان گیرنده­های اصلی اکسین عمل می­کند و در بروز ژن وابسته به اکسین نقش دارند. مطالعات انجام شده نشان می­دهد که این امکان وجود دارد که در برخی از گیاهان موتانت­ها مانند fry1-1 و  fry1-4رونوشت برداری ژن­های خانواده TIR1 و یاAFB1 و AFB2 به شدت کاهش یافته باشد. در موتانت های fry1 کاهش حساسیت به اکسین در القای ریشه جانبی بصورت کاهش القا ریشه جانبی دیده می­شود (5). کاهش بیان ژن گزارشگر اکسین DR5-GUS در موتانت­های ron1-1 می‌تواند حاکی از ناتوانی در درک اکسین و غلظت کم اکسین ­باشد (17). در پژوهشی نشان داده شد که جهش ron1-1 موجب تغییر در سطح تعداد زیادی از متابولیت گیاهی از جمله مایواینوزیتول و ایندول-3-استونیتریل بعنوان پیش­ساز اکسین شده­است (17). ژن RON1/FRY1 توسعه ریشه جانبی را از طریق فعالیت آدنوزین 3 و 5 بیوفسفات (PAP) تنظیم می­کند که یک مهار­کننده قوی اگزوریبونوکلئازی  (XRN)است (5). در موتانت­هایی که در سنتز اکسین اختلال دارند اختلاف قابل توجهی در زمینه تشکیل ریشه­جانبی، طول ریشه موئی، طول ساقه و عدم اتصال رگ برگ­ها مشاهده می شوند (16).

اتیلن (C2H4) ازجمله هورمونهای مهم گیاهی محسوب می­شود که در بسیاری از فرایندهای فیزیولوژیکی در گیاهان دخالت دارد (21). اتیلن توسط فرایندهایی مثل زخم، کمبود اکسیژن و سرما در گیاهان تولید می­شود (20) و جوانه زنی بذرها را در حالت خواب و غیر خواب تحریک می­کند (2). در مسیر بیوشیمیایی سنتز اتیلن،ACC  (1-aminocyclopropane 1-carboxylic acid) آخرین پیش ماده محسوب می­شود (21). سنتز این پیش ماده مرحله­ محدود کننده­ متابولیکی تولید اتیلن در بافت گیاهی می­باشد. در مسیر بیوسنتز اتیلن، متیونین تحت تأثیر آنزیم­های SAM (-S  آدنوزین متیونین) و ACC synthase به ACC تبدیل و در مرحله بعد با فعالیت آنزیم ACC oxidase در گیاه به اتیلن تبدیل می شود. تغییرات مورفولوژیکی گیاهان تیمار شده با  ACCرا تغییرات سه­گانه (Triple Response) می­نامند (21). علائم واکنش سه گانه شامل کوتاهی و ضخیم شدن ریشه، کوتاهی هیپوکوتیل وچرخش رأس هیپوکوتیل می­باشد (9). ژن RON1 به نحوی با مسیر بیوسنتز اتیلن در ارتباط است (شکل1-الف). در حضور اتیلن ژن EIN5 (ETHYLENE-INSENSITIVE 5) که یکی اجزای مسیر سیگنالینگ اتیلن می­باشد و محصول این ژن اگزوریبونوکلئازی به نام XRN4 می­باشد و برای بیان ژن­های مرتبط با اتیلن لازم می باشد (9). با فعالیت اگزوریبونوکلئازی خود موجب تخریب EBF1/EBF2 (ETHYLENE BINDING F BOX PROTEIN) شده و در نتیجه علیه فعالیت باز خور منفی EIN3 عمل کرده و در نهایت موجب تجمع EIN3 و سیگنالینگ اتیلن می­شود (9). در صورتی که جهش در ژن RON1 مانع سنتز اگزوریبونوکلئازها می­شود و PAP در سلول تجمع می­یابد و سیگنالینگ اتیلن دچار اختلال می­شود.

ژن RON1/FRY1 شامل 7 اگزون بوده و در انتهای بازوی کوچک کروموزوم شماره 5 آرابیدوپسیس قرار­دارد. جهش ron1-1 در این ژن در مرز اگزون 5 و اینترون 4 رخداده که در آن نوکلئوتید G بهA تغییر یافته است (شکل1-ب) (17). ژن RON1/FRY1 دارای دو فعالیت آنزیمی شامل اینوزیتول پلی فسفات-1-فسفاتاز و 3-2-5 بی فسفات نوکلئوتیداز در سلول­های گیاهی می­باشد. فعالیت آنزیمی اینوزیتول پلی فسفات-1- فسفاتاز باعث تجزیه­ مولکول اینوزیتول-1و4و5 تری فسفات(IP3) می­شود (5). تحت تنش محیطی آنزیم فسفولیپاز C فعال می­شود و موجب افزایش مقدار پیامبر ثانویه IP3 می‌گردد (22) (شکل 1-ب). گیاهان موتانت ron1-1 که دارای یک موتاسیون در ژنRON1/FRY1  هستند نیز دارای تفاوت­های مورفولوژیکی قابل توجهی با ژنوتیپ مادری خود بوده که می­توان به طول گل آذین کوتاه­تر و ایجاد گل آذین­های ثانویه بیشتر و همچنین تأخیر درگلدهی اشاره کرد (17). موتاسیون نقطه­ای ron1-1 منجر به عدم سنتز پروتئین FRY1 شده است. در حالیکه در گیاهان fry1-1  پروتئین fry1-1 در سلول شناسایی و گزارش شده است (5و 17). همانطور که در مورد موتانت های  fry1-1و fry1-4 ملاحظه گردید، به دلیل مالتی فانکشنال بودن ژنRON1/FRY1  و با توجه به اینکه در کدام اگزون ژن جهش رخ دهد واکنش به هورمونها در موتانت های مختلف این ژن می‌تواند متفاوت ­باشد، بنابراین در این پژوهش با­توجه به جهش ویژه ای که در ژنوتیپ موتانت ron1-1 به وجود آمده و به دلیل نقشی که ژنRON1/FRY1  در بیوسنتز هورمونهای اکسین ، اتیلن و اسید آبسیزیک دارد تأثیر تغییر فعالیت ژن RON1 در گیاهچه‌های موتانت ron1-1 بر برخی خصوصیات مورفولوژیکی شامل طول ریشه­اصلی ،تعداد ریشه­جانبی، طول هیپوکوتیل و تعداد برگ در ژنوتیپ موتانت و جدیدron1-1 در واکنش به غلظت­های مختلف هورمونی IAA, ACC و ABA در محیطin vitro  مورد بررسی قرار گرفت و با خصوصیات مشابه در گیاه مادری آرابیدوپسیس تالیانا (Ler-0) مقایسه شد. آزمایش‌هایی که توسط Chen و همکاران (2010) ارائه شده روی یکی از موتانت های ژن FRY1 بنام fry1-4 که حاوی یک قطعه T-DNA (SALK_020882) در والد Col-0 است انجام شده است که در واقع این موتاسیون هم از نظر مکان جهش و هم از نظر زمینه ژنومی با ron1-1 متفاوت است. در مقاله Robles و همکاران (2009) فقط این موتاسیون شناسایی و فقط به بررسی تأثیر این موتاسیون بر بعضی خصوصیات مرفولوژیکی در مقایسه با ژنوتیپ مادری در شرایط نرمال پرداخته شده است. در این مطالعه گیاهچه های موتانت ron1-1 در شرایط هورمونی   IAA, ACCو ABA بررسی شده و تغییرات فنوتیپی ناشی از سطوح مختلف این هورمونها گزارش شده است که در نوع خود یک بررسی جدید محسوب می شود. نتایج این بررسی با توجه به اینکه ron1-1 در زمینه ژنومی گیاه آرابیدوپسیس تالیانا Ler-0 رخ داده است می‌تواند جالب باشد.

مواد و روشها

این آزمایش در سال 1393 در آزمایشگاه بیوتکنولوژی دانشکده علوم کشاورزی دانشگاه گیلان انجام شد. برای استریل کردن بذرهای مادری آرابیدوپسیس تالیانا Ler-0 و موتانت ron1-1 (اهدایی از دانشگاه Adelaide Functional Genomics Center استرالیا) از محلول هیپوکلریدسدیم 1% به مدت 10دقیقه استفاده شد، سپس بذرها به مدت ده دقیقه در آب مقطر استریل 3 بار شسته­شو داده­شدند. برای بررسی تأثیر  ABAبر برخی خصوصیات مورفولوژیکی شامل طول ریشه، تعداد ریشه جانبی، تعداد بذرهای جوانه زده و تعداد برگ از ABA (ساخت شرکت SERVA با وزن ملکولی 3/264) استفاده شد. در این بررسی ابتدا بذرهای هر یک از ژنوتیپ­ها در محیط غذایی MS حاوی غلظت­های مختلف ABA (صفر، 5/0، 1، 2 میکرومول) در سه تکرار کشت و به مدت 14 روز در ژرمیناتور نگهداری شدند. برای بررسی تأثیر IAA برخی خصوصیات مورفولوژیکی شامل طول ریشه، تعداد ریشه جانبی، طول هیپوکوتیل ازIAA (ساخت شرکت SIGMA-ALDRICH با وزن مولکولی 2/175) استفاده شد. ابتدا بذرها به مدت چهار روز در محیط کشت MS فاقد هورمون IAA کشت شدند و بعد در روز چهارم گیاهچه های هم­اندازه از هر ژنوتیپ انتخاب و در محیط کشتMS حاوی غلظت­های مختلف هورمون IAA (صفر، 5/0،2و10 میکرومول) درسه تکرار کشت و خصوصیات مورفولوژیکی فوق در روز هشتم اندازه­گیری شدند. برای انجام آزمون تغییرات سه­گانه از ACC (ساخت شرکت SIGMA-ALDRICH با وزن مولکولی 1/101) استفاده شد. بذرها به مدت پنج روز در محیط کشت MS حاوی غلظت­های مختلف هورمون ACC (صفر،1،5و10 میکرومول) در سه تکرار و تاریکی مطلق کشت وخصوصیات مورفولوژیکی مورد نظر شامل طول ریشه و طول هیپوکوتیل ، قطر ریشه در روز پنجم توسط نرم­افزار IMAGE J1, 4, 3, 67 اندازه­گیری شدند. پتری های حاوی بذرها در ژرمیناتور(Growth chamber ساخت کمپانی WEISS TECHNIK آلمان مدل ZPR-2000) در دمای 1±22درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی 75% و شرایط نوری 16ساعت روشنایی و8 ساعت تاریکی قرار­گرفتند. آزمایش­های فوق به صورت فاکتوریل با فاکتور ژنوتیپ (در دوسطح) و فاکتور تنظیم­کننده­های رشد (در سطوح مختلف) در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی با 3 تکرار انجام شد، و در نهایت تجزیه­های آماری بااستفاده از نرم افزار SAS 9.1 انجام و از روش مقایسه میانگین  LSDجهت مقایسه میانگین بهره گرفته شد و نمودار­های مربوط با استفاده از نرم­افزار  EXCEL 2007ترسیم شد. برای بررسی وضعیت رگبرگ ها از روش چن و همکاران (1999) با کمی تغییرات استفاده شد. در این روش ابتدا نمونه­های مادری و موتانت­ها به مدت یک ساعت دراسید استیک و اتانول 95 درصد به نسبت 1:3 فیکس می­شوند. برای حذف رنگدانه­ها از برگ، نمونه­ها به ترتیب در اتانول 70 درصد به مدت30 دقیقه و بعد در اتانول 100 درصد در طول شب نگهداری و سپس در هیدروکسید سدیم10 درصد به مدت یک ساعت در 42 درجه سانتی­گراد قرار گرفتند. در ادامه نمونه های برگی را در محلول رنگی  Safranin-o(Merck) یک درصد به مدت 1-2 دقیقه قرار داده تا نمونه­های برگی رنگ‌آمیزی شوند. سپس برای مشاهده رگبرگ ها ضروری است رنگ از دیگر قسمت ها حذف شود. برای این کار به ترتیب نمونه­ها در اتانول 95%، 70% و بعد در آب قرار می­گیرند. سپس نمونه­ها روی لام و توسط گلیسرول به آرامی باز شده و توسط روغن امولسیون تیپ A (ساخت شرکت Cangille) روی لام فیکس و زیر میکروسکوب تصویربرداری شدند (5).  

نتایج

تجزیه داد­های بدست­آمده از بررسی تأثیر غلظتهای مختلف

 ABAبر تعداد بذرهای ­جوانه­زده نشان می­دهد که ژنوتیپ­ها دارای تفاوت معنی داری در این زمینه می­باشند (جدول 1). به­طوری که میزان جوانه­زنی بذرهای موتانت ron1-1 در مقایسه با بذرهای ژنوتیپ مادری  Ler-0در غلظت­های مختلف ABA از کاهش قابل توجهی برخوردار است (نمودار1- الف). میزان جوانه زنی بذرها در موتانت ron1-1 در شرایط نرمال و پس از 4 روز به 40 درصد رسید، در حالی که ژنوتیپ مادری در شرایط برابر دارای 80 درصد جوانه زنی (2 برابر) بود. با افزایش غلظت ABA به نیم میکرومول در ژنوتیپ مادری درصد جوانه­زنی به 78 درصد ودر ژنوتیپ موتانت به 30 درصد رسید. یعنی با افزایش غلظت ABA ازصفر میکرومول به نیم میکرومول در ژنوتیپron1-1 درصد جوانه­زنی نسبت به شرایط نرمال 25درصد کاهش یافته، در حالی­که این کاهش جوانه‌زنی در ژنوتیپ Ler-0 فقط در حدود 5/2 درصد بود. با افزایش غلظت به1 میکرومول، جوانه­زنی در ژنوتیپ Ler-0 به میزان 37 درصد و در غلظت 2 میکرومول به میزان 62 درصد کاهش یافت. در حالی که در ژنوتیپ ron1-1 این مقدار کاهش برای هر دو غلظت 50 درصد بود. اثر متقابل ژنوتیپ و غلظت­های مختلف ABA بر صفت تعداد بذرهای جوانه­زده غیر معنی دار بود (جدول 1). بیشترین تعداد بذرهای جوانه زده در ژنوتیپ Ler-0 در غلظت صفر میکرومول (شاهد) و کمترین تعداد در بذرهای موتانت ron1-1 در غلظت 2میکرومول ABA مشاهده شد. بنابراین وقوع موتاسیون در ژن RON1 موجب کاهش قابل توجه میزان جوانه زنی در بذرهای موتانت ron1-1 در واکنش به غلظت­های مختلف ABA شده است.

بر اساس نتایج بدست آمده از بررسی صفت طول ریشه اصلی، تعداد ریشه­جانبی و تعداد برگ ژنوتیپ­ها از نظر صفت طول ریشه دارای تفاوت معنی داری باهم می­باشند (جدول 1). طول ریشه اصلی، تعداد ریشه­جانبی و تعداد برگ در گیاهچه­های موتانت ron1-1 در واکنش به غلظت­های مختلف ABA نسبت به گیاهچه­های مادری Ler-0 کاهش معنی داری داشته است (جدول1، نمودار1- ب، ج، د شکل 2).

 

جدول 1- تجزیه واریانس داده­های حاصل از بررسی صفات مختلف گیاهچه­های ژنوتیپ ­Ler-0 و ron1-1 در واکنش به غلظت­های مختلف ABA 

میانگین مربعات

   درجه آزادی منابع تغییرات

                                      جوانه­زنی     طول ریشه اصلی    تعداد ریشه­جانبی   تعداد برگ    

ژنوتیپ                 1                     **  5/6337        ** 75/228         **98/183          ** 92/29    

تیمارABA              3                      **6/1748         ** 63/1745       ** 63/478          ** 27/23

ژنوتیپ* تیمار         3                       n.s9/381            *  11/17        ** 24/61           **  37/2

خطا                     16                        6/141                 70/4              51/1                14/0

کل                      23                       

CV                                               49/10                40/10             59/18               50/7

*: معنی­دار در سطح پنج درصد        **: معنی­دار در سطح یک درصد              n.s:  غیر معنی­دار

 

اثر متقابل ژنوتیپ و غلظت­های مختلف ABA بر صفت طول ریشه، تعداد ریشه­جانبی و تعداد برگ معنی دار بود و مطابق نمودار 1- ب، ج و د این اثرمتقابل برای این صفت و سایر صفات به طور مشابه از نوع تغییر در مقدار بود، از این‌رو نیازی به برش دهی (یعنی بررسی هر یک از ژنوتیپ­ها نسبت به غلظت های مختلف ABA به صورت جداگانه) نبود. درشرایط نرمال طول ریشه اصلی در ژنوتیپ مادری  Ler-0تقریبا دو برابر آن در ژنوتیپ موتانت ron1-1 بود (نمودار 1- ب). در واقع طول ریشه اصلی در هر دو ژنوتیپ موتانت ومادری در غلظت­های مختلف 5/0، 1و 2 میکرومول در مقایسه با حالت شاهد دارای روند کاهشی بودند، این درحالی است که با افزایش غلظت از صفر به 5/0، 1و 2 میکرومول میزان کاهش طول ریشه در گیاهچه­های ron1-1 نسبت به طول ریشه اصلی در گیاهچه­های Ler-0 به نسبت 5/1، 3/1و 5/2 برابر کاهش یافت.

اثر متقابل ژنوتیپ ها در غلظت­های مختلفABA  بر صفت تعداد ریشه جانبی نشان داد که به­ترتیب در غلظت­های0، 5/0و 1 میکرومول تعداد ریشه­جانبی در ژنوتیپ مادری Ler-0 در مقایسه با ژنوتیپ موتانت ron1-1 به نسبت 2، 2 و4 برابر افزایش نشان داد. بیشترین تعداد ریشه جانبی در ژنوتیپ  Ler- 0در غلظت صفر میکرومول (شاهد) مشاهده شد و کمترین تعداد ریشه­جانبی در غلظت 1میکرومولABA در ژنوتیپron1-1 مشاهده شد ودر غلظت 2 میکرومولABA ریشه جانبی در هیچ یک از ژنوتیپ­ها مشاهده نشد (نمودار 1- ج). بنابراین می­توان اینگونه استنباط کرد که وقوع موتاسیون در ژن RON1 موجب کاهش قابل توجه تعداد ریشه­های جانبی در گباهچه­های موتانت ron1-1  شده است.

اثر متقابل ژنوتیپ در غلظت­های مختلفABA  بر صفت تعدادبرگ نشان داد که با افزایش غلظت ABA در هردو ژنوتیپ موتانت و مادری تعداد برگ کاهش یافته­است. بیشترین تعداد برگ در ژنوتیپ  Ler-0در غلظت صفر میکرومول (شاهد) مشاهده شد و کمترین تعداد برگ در غلظت 2میکرومولABA  در ژنوتیپ ron1-1 به ترتیب8 و2 برگ می­باشند. بنابراین وقوع جهش نقطه­ای ron1-1 در ژن RON1 موجب کاهش قابل توجه تعداد برگ در گیاهچه­های موتانت ron1-1 شده است.

بررسی داده­ها نشان می­دهد که ژنوتیپ­ها در واکنش به غلظت­های مختلف  IAAاز نظر صفت طول ریشه دارای تفاوت معنی­داری می­باشند، به نحوی که بیشترین طول ریشه در ژنوتیپ مادری مشاهده می­شود (جدول2). بررسی نتایج تأثیر غلظت­های مختلف  IAAبر طول ریشه در گیاهچه­های مادری و موتانت نشان می دهد که طول ریشه اصلی در ژنوتیپ موتانت ron1-1 نسبت به بذرهای مادری  Ler-0کاهش معنی داری یافته­ است (جدول2، نمودار2- الف، شکل3). به طوری که بیشترین طول ریشه در ژنوتیپ Ler-0 در غلظت صفر میکرومول (شاهد) و کمترین طول ریشه در غلظت 10میکرومول IAA در ژنوتیپ ron1-1 مشاهده شد (نمودار 2). اثرمتقابل ژنوتیپ و غلظت­های مختلف  IAAبر صفت طول ریشه معنی‌دار بوده (جدول2)، به‌طوری‌که در شرایط نرمال طول ریشه اصلی ژنوتیپ Ler-0 در حدود دو برابر ژنوتیپ موتانت ron1-1 می­باشد و همچنین در غلظت­های 5/0، 2و 10 میکرومول به­ترتیب در حدود 3، 5/3و 2 برابر بیشتر از میزان طول ریشه در ژنوتیپ موتانت ron1-1 می­باشد. بنابراین تغییر در فعالیت ژن RON1 موجب کاهش معنی دار طول ریشه اصلی در گیاهچه­های موتانت ron1-1 شده است.

 

    

 

نمودار 1- مقایسه میانگین بررسی داده‌های مربوط به صفات مختلف آرابیدپسیس شامل جوانه‌زنی (الف)، طول ریشه (ب)، تعداد ریشه جانبی (ج) و تعداد برگ (د) در واکنش به غلظت‌های مختلف  ABAدر گیاهچه‌های مادری Ler-0 و موتانت ron1-1. 

جدول 2- تجزیه واریانس داده‌های حاصل از بررسی صفات مختلف گیاهچه­های ژنوتیپ ­Ler-0 و ron1-1 در واکنش به غلظت­های مختلف IAA

میانگین مربعات

     درجه آزادی منابع تغییرات

طول ریشه اصلی     تعداد ریشه جانبی       طول هیپوکوتیل      

ژنوتیپ                   1                       ** 38/98             ** 89/784               ** 82/4

 تیمارIAA              3                      **  24/139            **  86/243               **056/3

ژنوتیپ* تیمار         3                      **  57/92               n.s 32/28                n.s479/0

 خطا                    16                          25/3                     62/18                   18/0

کل                      23

CV                                           51/14                     5/13                    73/11

*: معنی­دار در سطح پنج درصد        **: معنی­دار در سطح یک درصد              n.s:  غیر معنی­دار

 

 

شکل 2- گیاهچه­های مادریLer-0  و موتانت  ron1-1رشد کرده در محیط غذایی MS حاوی غلظت­های مختلف (0، 5/0، 1، 2 میکرومول) ABA. مقیاس در شکلهای فوق 10 میلی­متر می­باشد.

 

 

 

 

 

 

نمودار 2- مقایسه میانگین بررسی داده‌های مربوط به صفات مختلف آرابیدپسیس شامل طول ریشه (الف)، تعداد ریشه جانبی (ب) و طول هیپوکوتیل (ج) در  واکنش به غلظت‌های مختلف  IAAدر گیاهچه‌های مادری Ler-0 و موتانت ron1-1.

 

 

شکل 3- گیاهچه­های مادری Ler-0 و موتانت  ron1-1رشد کرده در محیط غذایی MS حاوی غلظت­های مختلف (0، 5/0، 1، 10 میکرومول) .IAA مقیاس در شکلها 10 میلی­متر می­باشد.

 

ژنوتیپ­ها از نظر صفت تعداد ریشه­جانبی و طول هیپوکوتیل نیز دارای تفاوت معنی­داری در واکنش به غلظت­های مختلف  IAAمی­باشند، به نحوی که بیشترین تعداد ریشه جانبی و طول هیپوکوتیل در ژنوتیپ مادری مشاهده­می­شود (جدول2، نمودار2- ب، ج، شکل 3). تأثیر غلظت­های مختلف  IAAبر تعداد ریشه­جانبی در گیاهچه­های مادری و موتانت نشان می‌دهد که تعداد ریشه جانبی در گیاهچه­های موتانت ron1-1 تحت تأثیر غلظت­های مختلفIAA  نسبت به بذرهای مادری Ler-0 کاهش معنی داری داشته­است (جدول2، نمودار2، شکل 3). در شرایط نرمال تعداد ریشه­جانبی ژنوتیپ Ler-0 بیش­از سه­برابر ژنوتیپ موتانت ron1-1 می­باشد. با افزایش غلظت IAA تعداد ریشه­جانبی در هردو ژنوتیپ موتانت و مادری افزایش می­یابد، اما شدت افزایش تعداد ریشه جانبی در ژنوتیپLer-0  بسیار بیشتر از ژنوتیپ موتانت ron1-1 می­باشد. به­نحوی که تعداد میانگین ریشه­جانبی ژنوتیپ Ler-0 از غلظت صفر تا 10 میکرومول در حدود 27 عدد افزایش یافته، این در حالی­است که در ژنوتیپ موتانت میانگین افزایش 12 عدد می­باشد (جدول1، نمودار2- ب، شکل 3). بنابراین در گیاهچه­های موتانت ومادری با افزایش غلظت  IAAتعداد ریشه جانبی افزایش یافت، بیشترین تعداد ریشه­جانبی در ژنوتیپ Ler-0 در غلظت 10 میکرومولIAA  و کمترین تعداد ریشه جانبی در ژنوتیپ موتانت  ron1-1در غلظت صفر میکرومول (شاهد) مشاهده شد (نمودار2- ب).

تأثیر غلظت­های مختلف IAA بر طول هیپوکوتیل در گیاهچه­های مادری و موتانت نشان می دهد که طول هیپوکوتیل در ژنوتیپ موتانت ron1-1 تحت تأثیر غلظت­های مختلف IAA نسبت به ژنوتیپ مادری  Ler-تفاوت معنی داری را نشان می‌دهد. طول هیپوکوتیل در ژنوتیپ مادری Ler-0 در شرایط نرمال درحدود 5/1 برابر طول هیپوکوتیل ژنوتیپ موتانت ron1-1 می­باشد (جدول2، نمودار2- ج، شکل 3). اثرمتقابل ژنوتیپ در غلظت­های مختلف IAA بر صفت طول هیپوکوتیل معنی دار نبود، به‌طوری‌که بیشترین طول هیپوکوتیل در ژنوتیپ Ler-0 در غلظت 10 میکرومول مشاهده شد و کمترین طول هیپوکوتیل در غلظت صفر میکرومول IAA در ژنوتیپ ron1-1 مشاهده شد ( جدول2، نمودار2- ج، تصویر5). پاسخ گیاهان موتانت به IAA کاهش یافته است و در غلظت­های 5/0، 2و 10 میکرومول تفاوت معنی داری در طول هیپوکوتیل در پاسخ به IAA در موتانت ron1-1 مشاهده نشد. بنابراین تغییر در فعالیت ژن RON1 موجب کاهش معنی دار طول هیپوکوتیل در گیاهچه­های موتانت ron1-1 شده است. 

در آزمایش فوق بررسی وضعیت رگبرگی گیاهچه موتانت ron1-1 در مقایسه با ژنوتیپ مادری در سن 30 روزه­گی نیز مورد بررسی قرار گرفت. بررسی رگبرگ ها در کوتیلدون‌های گیاهچه های  ron1-1 نشان داد که رگبرگ در این گیاهچه ها باز است. در حالی­که در ژنوتیپ Ler-0 هیچ رگبرگ بازی مشاهده نمی­شود. از بررسی برگ­های سوم نیز مشخص شد که گیاهان موتانت  ron1-1دارای شبکه­های رگبرگی ثانویه باز و ساختار رگبرگی ضعیفی می­باشند، درحالی­که درژنوتیپ Ler-0 بیشترین شبکه رگبرگی مشاهده می­شود و این رگبرگ ها دارای بیشترین پیوستگی می­باشد (شکل 4) و با افزایش سن گیاه تفاوت قابل توجهی در زمینه پیوستگی رگبرگ­ها در ژنوتیپ موتانت در مقایسه با پژوهش روبلز و همکاران (2010) که در سن 22 روزه­گی انجام شده بود، مشاهده نشد.

آنالیز داد­های بدست­آمده از بررسی تأثیر غلظت­های مختلف  ACCبر طول ریشه و طول هیپوکوتیل در گیاهچه­های مادری و موتانت نشان می دهد که ژنوتیپ­ها در زمینه صفت طول ریشه و طول هیپوکوتیل دارای تفاوت معنی داری می­باشند (جدول 3). بیشترین طول ریشه و طول هیپوکوتیل در ژنوتیپ مادری و کمترین در ژنوتیپ موتانت مشاهده می­شود. همچنین غلظت­های مختلف ACC نیز دارای تفاوت معنی داری می­باشند. اثرمتقابل ژنوتیپ در غلظت­های مختلفACC بر صفت طول ریشه و طول هیپوکوتیل نیز معنی دار است (جدول 3). بیشترین طول ریشه و طول هیپوکوتیل در ژنوتیپ  Ler-0در غلظت صفر میکرومول (شاهد) مشاهده شد. جالب اینکه طول ریشه و طول هیپوکوتیل درتمام غلظت­ها­ی  ACCدر هر دو ژنوتیپ Ler, ron1-1 به کمترین میزان خود رسید (جدول3، نمودار3- الف و 3- ب). در شرایط نرمال اندازه طول ریشه ژنوتیپ مادری دو برابر و طول هیپوکوتیل ژنوتیپ مادری سه برابر ژنوتیپ موتانت می­باشد (نمودار 3- الف و 3- ب). از این‌رو با افزایش غلظت ACC، ژنوتیپ Ler-0 واکنش بیشتری در مقایسه با ژنوتیپ ron1-1 نشان می­دهد. جالب اینکه با افزایش غلظتACC  تفاوت قابل توجهی در زمینه طول ریشه و طول هیپوکوتیل در گیاهچه­های موتانت  ron1-1 مشاهده نشد. بنابراین تغییر در فعالیت ژن RON1 موجب کاهش معنی دار طول ریشه اصلی و طول هیپوکوتیل در گیاهچه­های موتانتron1-1 نشده است و حتی در گیاهچه­های Ler-0 واکنش این گیاهان بهACC  کاهش یافته است.

 

جدول 3- تجزیه واریانس داد­ه‌های حاصل از بررسی صفات مختلف در گیاهچه­های ژنوتیپ ­Ler-0 و  ron1-1 در واکنش به غلظت­های مختلف ACC

میانگین مربعات

     درجه آزادی منابع تغییرات

طول ریشه    طول هیپوکوتیل        قطر ریشه                                                    

ژنوتیپ                  1                        **  41/6            ** 02/22               ** 007/0

 تیمارACC            4                          ** 05/15            ** 21/9                ** 03/0            

ژنوتیپ* تیمار        4                           ** 01/7           ** 08/4                n.s001/0          

 خطا                   20                            22/0                 11/0                0008/0             

کل                      29                    

CV                                            57/15               51/10                  76/9

*: معنی­دار در سطح پنج درصد        **: معنی­دار در سطح یک درصد              n.s:  غیر معنی­دار

 

شکل 4- بررسی تأثیر جهش­های  ron1-1در ژن RON1 بر وضعیت رگبرگ­های گیاهچه­های 30 روزه آرابیدوپسیس تالیانا، الف: کوتیلدون‌ها ب: برگ سوم. فلش‌ها نشان­دهنده باز بودن شبکه رگبرگی در گیاهچه‌های موتانت است.

 

بنابراین تغییر در فعالیت ژن RON1 موجب کاهش معنی دار طول هیپوکوتیل و طول ریشه در گیاهچه­های موتانت ron1-1 نشده است، همچنین واکنش این گیاهان بهACC  کاهش یافته است.

آنالیز داده‌­های بدست­آمده از بررسی تأثیر غلظتهای مختلف ACC بر قطر ریشه در گیاهچه­های مادری و موتانت نشان می‌دهد که ژنوتیپ­ها در صفت قطر ریشه دارای تفاوت معنی داری می­باشند، بیشترین قطر ریشه در ژنوتیپ مادری و کمترین قطر ریشه در ژنوتیپ موتانت مشاهده می­شود. همچنین غلظتهای مختلف ACC نیز دارای تفاوت معنی داری می­باشند. آنالیز داده‌­های بدست­آمده نشان می دهد که اثرمتقابل ژنوتیپ در غلظت­های مختلف  ACCبر صفت قطر ریشه معنی دار نبوده است. لازم به ذکر است که با افزایش غلظت ACC از صفر به 20 میکرومول قطر ریشه در هر دو ژنوتیپ موتانت و مادری 7 برابر شده است. بیشترین قطر ریشه در ژنوتیپ Ler-0 در غلظت 20 میکرومول مشاهده شد و کمترین قطر ریشه در غلظت ­صفر میکرومول در ژنوتیپ ron1-1 مشاهده شد (جدول3، نمودار3- ج). آزمون تغییرات سه­گانه با هدف سنجش و بررسی سالم بودن مسیر سیگنالینگ اتیلن در  موتانت  ron1-1انجام شد. هورمون خارجی پیش ساز اتیلن تأثیری بر واکنش موتانت ron1-1 نداشته و به نظر می­رسد سیگنالینگ اتیلن در گیاه موتانت ron1-1 مختل شده است.

بحث

گیاهان موتانت ron1-1 دارای یک موتاسیون جدید در ژن FRY1 در والدLer-0  بوده که از دیگر موتانت های گزارش شده در این ژن متمایز می‌باشند. با تغییر والد بخش زیادی از محتوای ژنومی تغییر می‌کند و وجود فاکتورهایی مانند مدیفایرها در ژنوم (Genome Modifiers) می‌تواند تأثیر موتاسیون بر خصوصیات گیاه میزبان را تغییر دهد. این عوامل می‌توانند اثرات حتی یک موتاسیون مشابه را در والدین مختلف به نحو قابل توجهی تغییر دهند (18). در این پژوهش یک موتاسیون مشابه در 2 والد مختلف Ler-0 و Col-0 بدلیل عوامل تغییر دهنده فوق منجر به بروز فنوتیپ های مختلفی در شرایط آزمایش مشابه شد. در گزارش دیگری عوامل تغییر دهنده فوق شناسایی شدند (11). ژن FRY1 دارای عملکردهای متعددی بوده و موتاسیونهای مختلفی در آن در زمینه های ژنومی متفاوت تا کنون شناسایی شده است که با توجه به اینکه موتاسیون در کدام اگزون این ژن و در چه زمینه ژنتیکی رخ داده شاهد واکنش های مختلفی در گزارش‌های علمی (5) بوده ایم. از آنجائیکه ژن RON1/FRY1 دارای فعالیت هایی در ارتباط با بیوستز، سیگنالینگ و انتقال سه هورمون اتیلن، اسید آبسیزیک و اکسین می‌باشد، از این‌رو بررسی گیاهچه های ron1-1که دارای یک موتاسیون منحصر بفرد در مرز اگزون و اینترون شماره 2 و در والد   Ler-0است ضروریست. این موتاسیون نقطه­ای منجر به از عدم تولید پروتئین RON1 در گیاهچه های موتانت شده است.  

 

 

 

 

نمودار 3- مقایسه میانگین بررسی داده‌های مربوط به صفات مختلف آرابیدپسیس شامل طول ریشه (الف)، طول هیپوکوتیل (ب) و قطر ریشه (ج) در در واکنش به غلظت‌های مختلف  ACCدر گیاهچه‌های مادری Ler-0 و موتانت ron1-1.


وقوع موتاسیون در ژن RON1 موجب کاهش قابل توجه میزان جوانه زنی در بذرهای موتانت ron1-1 در واکنش به غلظت­های مختلف ABA شد. کاهش قابل توجه میزان جوانه زنی فوق در بذرهای موتانت ron1-1 و همچنین کاهش تعداد ریشه جانبی با افزایش غلظت ABA در گیاهچه­های موتانت و مادری می­تواند به این دلیل باشد که در حضور ABA میزان جوانه زنی کاهش و توسعه­ ریشه­ جانبی مهار می­شود، این اتفاق بلافاصله بعد از ظهور پریموردیای ریشه جانبی و قبل از فعال شدن مریستم ریشه جانبی رخ می­دهد (4). بنابراین با افزایش غلظت ABA میزان مهار ریشه ­جانبی نیز افزایش خواهد ­یافت. جهش در ژن FRY1/RON1 باعث تجمع PAP در سلول­های گیاهان موتانت شده است، که این تجمع باعث کاهش عملکرد ژن fry1 شده و می‌تواند موجب کاهش تعداد ریشه جانبی، طول ریشه اصلی و طول هیپوکوتیل شود (5). اختلال در بیان ژن FRY1/RON1 در گیاهچه­های موتانتron1-1 در عدم حضور ABA موجب کاهش تعداد ریشه­جانبی شده که این روند با افزایش غلظت­های ABA تشدید می­شود. موتانت­هایی که بر سنتز اکسین تأثیر می­گذارند تأثیر قابل توجه­ای بر خصوصیات گیاهچه­ها در زمینه تشکیل ریشه جانبی، طول ریشه موئی، طول ساقه و کاهش تعداد برگ نشان می­دهند (17). از جمله دلایل کاهش طول ریشه درموتانت­های fry1 می‌تواند به دلیل افزایش خاموشی برخی ژنها مثل NAC1 باشد. این ژن واسطه رشد ریشه بوده و در پایین دست TIR1 قرار دارد (5). ژن FRY1/RON1 توسعه ریشه جانبی را از طریق فعالیت بر آدنوزین′3 و′5 بیوفسفات (PAP) تنظیم می­کند که یک مهار­کننده قوی اگزوریبونوکلئازی (XRN) است (5). بیشترین میزان طول ریشه در ژنوتیپ مادری و کمترین طول ریشه در ژنوتیپ ron1-1 مشاهده شد. ژن FRY1/RON1، که روی شکل­گیری ساختار ریشه و همچنین شرایط تنش نقش دارد (5و 17) در ژنوتیپ موتانت ron1-1 حاوی یک موتاسیون نقطه­ای می­باشد. از این‌رو می­توان نتیجه گرفت که ژنوتیپ ron1-1 دارای طول ریشه، تعداد برگ و تعداد ریشه­جانبی کمتری نسبت به ژنوتیپ مادری خود می­باشد. بنابراین به نظر می­رسد جهش ron1-1 با اختلالی که در عملکرد ژن FRY1/RON1 ایجاد می­کند، باعث تجمع IP3 در بذرهای موتانت در حال جوانه­زنی شده و بذرهای موتانت با تولید ABA به تجمع IP3 پاسخ می­دهند و این امر منجر به کاهش و تأخیر در جوانه­زنی بذرهای موتانت نسبت به بذرهای مادری می­باشد. از آن­جایی­که گیاهان موتانت بدلیل جهشی که در ژن FRY1/RON1 دارند دارای مقدار بیشتری ABA درون سلولی در شرایط نرمال در مقایسه با ژنوتیپ­های مادری هستند. احتمالا مقدارABA  در شرایط تنش در ژنوتیپ موتانت افزایش می یابد (23). یکی از عملکرد­های ژنFRY1/RON1  در سیگنالینگ ABA می­باشد و به دلیل اینکه برخی از موتانت­ های دیگر این ژن مانند  fry1-1در سیگنالینگ و درک ABA اختلال دارند، بنابراین به نظر می رسد احتمالأ موتانت ron1-1 نیز در سیگنالینگ ABA دارای اختلال است. به همین دلیل در غلظت های مختلف این هورمون علاوه بر جوانه زنی برخی دیگر از خصوصیات مورفولوژیکی نیز بررسی شد تا اثر این هورمون در برخی دیگراز صفات مورفولوژیکی نیز بررسی شود.

نتایج بدست آمده نشان می­دهد با افزایش غلظت IAA تعداد ریشه جانبی در گیاهچه های مادری به نحوقابل توجهی افزایش یافته است. در حالی که این افزایش در گیاهچه های موتانت قابل توجه نیست. تفاوت فوق در میزان افزایش تعداد ریشه های جانبی بین گیاهچه های مادری و موتانت می‌تواند به این دلیل باشد که از آنجائیکه FRY1/RON1 توسعه ریشه جانبی را از طریق فعالیت بر آدنوزین 3 و 5 بیوفسفات (PAP) که یک مهارکننده قوی اگزوریبونوکلئازی (XRN) است، تنظیم می­کند (5). از این‌رو جهش در این ژن می­تواند منجر به نقص در توسعه ریشه­ جانبی شود. اینگونه استنباط می شود که موتانت ron1-1 نیز مانند موتانت­هایی که بر سنتز اکسین تأثیر می­گذارند، تأثیر قابل توجهی برتشکیل ریشه جانبی، طول ریشه موئی و طول هیپوکوتیل دارند (17). یکی از علل نقص ریشه­جانبی در موتانت­هایfry1  افزایش خاموشی ژن NAC1 در انواع خاصی از سلول­ها می­باشد. این ژن واسطه رشد ریشه­جانبی می­باشد وپایین دست ژن TIR1 قرار دارد و توسط miRNA164 سرکوب می­شود و رشد ریشه جانبی را کاهش می­دهد (5). جهش در ژن RON1 درگیاهچه­های موتانت در عدم حضور IAA موجب کاهش تعداد ریشه­جانبی شده که این روند باافزایش غلظت­های IAA تاحدودی تغییر یافته و افزایش تعداد ریشه جانبی را نشان می­دهد. از آنجایی­که فعالیت ژن FRY1/RON1 بر میزان اکسین تولید شده در گیاه مؤثر است، جهش در این ژن موجب کاهش سطوح بیان برخی از پیش ساز­های اکسین ازجمله ایندول-3- استو نیتریل می­شود (17). ازاین­رو به نظر می­رسد موتاسیون  ron1-1می­تواند برمیزان بیان ژن­های مرتبط مؤثر بوده ومیزان تولید هورمون اکسین و IAA را تغییر دهد. گیاهان موتانت  fry1در ژن FRY1/RON1 دارای موتاسیون می باشند، بیان این ژن در شرایط تنش در گیاهان نرمال زیاد می­شود تا گیاه از طریق محصولات این ژن به شرایط تنش (افزایش غلظت هورمون ) پاسخ دهد، اما در شرایط تنش عملکرد این ژن دچار اختلال شده وگیاهان موتانت قادر نخواهند بود مانند گیاهان مادری به تنش پاسخ دهند (3). آنزیم PAP یک محصول از ژن FRY1 می­باشد که یک مهارکننده قوی آنزیم­های ساخت RNA می­باشد. مطالعات انجام شده در موتانت fry1-1 نشان می­دهد که کاهش تولید ریشه جانبی به دلیل از دست رفتن فعالیت PAP در موتانت­های های ژن FRY1/RON1 می­باشد. موتانت­های  FRY1/RON1ویژگی موتانت­های مقاوم به اکسین را مثل کاهش رشد، کوتاه شدن هیپوکوتیل و کاهش چشمگیر رشد ریشه­جانبی نشان می­دهد (5). لازم به ذکر است که اکسین (IAA) در غلظت­های بالاتر از 8- 10 مولار بر طویل شدن ریشه­های اولیه اثر بازدارندگی دارد، ولی تشکیل ریشه جانبی به وسیله­ مقادیر زیاد اکسین تحریک می­شوند (1). افزایش تعداد ریشه­جانبی در گیاهان موتانتron1-1 بدلیل جهش در ژن RON1 بسیار کمتر می­باشد. بنابراین جهشron1-1 موجب تغییر در تعداد ریشه جانبی و طول ریشه اصلی و طول هیپوکوتیل در گیاهچه های موتانت می­شود (17). به دلیل اینکه موتانتron1-1  در سنتز برخی از پیش ساز های اکسین اختلال دارد، بنابراین به نظر می رسد احتمالاً در درک هورمون IAA نیز دچار اختلال باشد. از این رو این گیاهان موتانت تحت تیمار غلظت­های مختلف هورمون IAA بررسی شدند تا میزان درک این هورمون در ژنوتیپ موتانت در مقایسه با ژنوتیپ مادری مقایسه گردد. نتایج نشان دادند که مقدار افزایش طول هیپوکوتیل و تعداد ریشه در این موتانت با افزایش غلظت IAA نسبت به ژنوتیپ مادری بسیار کمتر می‌باشد.

در آزمایش بررسی وضعیت رگبرگ گیاهچه های موتانت ron1-1 در مقایسه با ژنوتیپ مادری مشاهده شد که رگبرگ ها در گیاهچه موتانت ron1-1 باز است، در حالی­که در ژنوتیپ Ler-0 هیچ رگبرگ بازی مشاهده نمی­شود. از بررسی برگ­های سوم مشخص شد که گیاهان موتانت  ron1-1دارای شبکه­های رگبرگی ثانویه باز و ساختار رگبرگی ضعیفی می­باشند (شکل 4)، و با افزایش سن گیاه تفاوت قابل توجهی در زمینه پیوستگی رگبرگ­ها در ژنوتیپ موتانت در مقایسه با پژوهش روبلز و همکاران (2010) که در سن 22 روزه­گی انجام شده بود، مشاهده نشد. بنابراین می­ توان نتیجه گرفت که چون ژن RON1/FRY1 کد کننده آنزیم اینوزیتول پلی فسفات1- فسفاتاز و ′3′(2)و′5- بیس فسفات نوکلئوتیداز می­باشد، و تعیین‌کننده الگوی قرار گیری رگبرگ­ها نیز می­باشد. جهش ron1-1/fry1 و جهش­هایی که بر سنتز اکسین تأثیر می­گذارند، در الگوی قرار گرفتن رگبرگ اختلال و تغییر ایجاد می­کنند (17). ژن RON1 بر سنتز اکسین مؤثر است، موتانت­های ron1-1 در سطح بیان 38 متابولیت ازجمله مایواینوزیتول و ایندول3- استونیتریل (پیش ساز اکسین) دارای اختلال می­باشند (7و 17). بنابراین برخی از موتانت­های این ژن (مانند ron1-1)، به دلیل اختلال در بیان ژن RON1/FRY1 که مؤثر بر سنتز پیش ساز­های اکسین و بیان ژن­های پایین دست از جمله CVP2(COTYLEDON VASCULAR PATTERN5) که مؤثر بر شکل گیری رگبرگ می­باشند، دچار اختلال می­باشد. بنابراین شبکه رگبرگی باز در برخی از موتانت­های ron1-1 مشاهده می­گردد.

با توجه به نتایج بدست­آمده در این پژوهش، با افزایش غلظتACC  تغییرات چندانی در کاهش طول ریشه و هیپوکوتیل ژنوتیپ موتانت ron1-1 مشاهده نمی­شود، از این‌رو شاهد کاهش پاسخ اتیلن در این ژنوتیپ می­باشیم. لازم به ذکر است که با افزایش غلظتACC  در گیاهان موتانت  ron1-1بر خلاف ژنوتیپ مادری پیچیدگی رأسی را مشاهده نمی­کنیم که احتمالاً ناشی از عدم درک اتیلن می­باشد. مطابق نمودار 3- الف و 3- ب ژنوتیپ ron1-1 از نظر دو صفت ذکر شده دارای تفاوت معنی­داری با ژنوتیپ مادری می­باشد. ازآنجایی که ژنوتیپ مادری  Ler-0ازمسیر بیوسنتز، درک و سیگنالینگ اتیلن نرمالی برخورداراست، بنابراین ژنوتیپ ron1-1 بدلیل داشتن تفاوت معنی­دار از لحاظ صفات بررسی شده در مقایسه با ژنوتیپ مادری احتمالاً دچار اختلال در مسیر بیوسنتز، درک و سیگنالینگ اتیلن می­باشد. بنابراین براساس بررسی­های انجام شده جهش  ron1-1درگیاهچه­های موتانت ron1-1 عامل اصلی تفاوت معنی­دار با گیاهچه­های مادری Ler-0 در دو صفت طول هیپوکوتیل و طول ریشه است. شواهد نشان می دهد که مسیرهای سیگنالینگ اکسین و اتیلن در هم تنیده است. در واقع، بسیاری از موتانت ­های اکسین، مانندaux1, axr1, axr2, axr3,eir, wei1 دارای پاسخ­های متفاوتی به اتیلن هستند (5). بنابراین کاهش القا و تولیدIAA  در موتانت ron1-1 می­تواند با اختلال در پاسخ به اتیلن در این گیاه موتانت در ارتباط باشد. از وظایف ژن FRY1/RON1 می توان به تجزیه­ PAP به Amp و Pi اشاره کرد، که این امر منجر به بیان ژن­های  XRN2, XRN3, XRN4 در گیاه شده و طی این روند ما شاهد ساختار ریشه مناسب، مقاومت به خشکی، ساختار مناسب برگ، احساس و سیگنالینگ هورمون، الگوی تشکیل رگبرگ، حساسیت به نور و... می­باشیم. اما در صورت بروز جهش در ژن،PAP بدلیل عدم تجزیه توسط ژنron1/fry1 در سلول تجمع می­یابد و منجر به عدم بیان ژن­های XRN2, XRN3, XRN4 شده وساختار ریشه، مقاومت به خشکی، احساس و سیگنالینگ هورمون، الگوی تشکیل رگبرگ، حساسیت به نور غیر نرمالی را از خود بروز می­دهد (10). از ژن­هایی که در مسیر درک اتیلن مؤثر می باشند می­توان به  XRN4اشاره کرد. ازآن­جایی که در گیاهان موتانت  ron1/fry1بیان این ژن دچار اختلال شده می توان درک پایین اتیلن توسط گیاهان موتانت را به عدم بیان XRN4 در گیاهان موتانت مرتبط دانست.XRN4  به عنوان جزء جدایی ناپذیر در سیگنالینگ اتیلن می­باشد. تخریب RNA توسط  XRN4به عنوان یکی فرایند­های پس از رونویسی می­باشد که در درک این هورمون گیاهی مؤثر می‌باشد (16).

 بنابر نتایج بدست آمده از این پژوهش، جهش در ژن FRY1/RON1 منجر به اختلال در درک و پاسخ به تنش ایجاد شده توسط سه هورمون IAA , ABA , ACC در گیاهچه­های موتانت شده است و این موتانت در پاسخ به هورمونها کاملاً متفاوت از ژنوتیپ مادری بوده و مسیر سیگنالینگ ABA,  IAAآن به شدت تضعیف شده و سیگنالینگ اتیلن آن به طور کامل از کار افتاده و گیاهچه ها­ی 5 روزه  قادر به درک اتیلن نیستند.

1- تایز، ل. زایگر، الف. (1388). فیزیولوژی گیاهی. ترجمه کافی، م. زند، الف. کامکار، ب. عباسی، ف و مهدوی دامغانی، ع. انتشارات جهاد دانشگاهی مشهد.
2- عموآقایی، ریحانه. 1392 . تأثیر برخی هورمونها و ترکیبات ازته روی ظرفیت، سرعت و هماهنگی جوانه زنی بذر های قیچ تحت تنش شوری. مجله پژوهش های گیاهی . جلد26. شماره 4. صفحه 466
3- نجفی، فرزانه. محمدی، ف. 1394 تأثیر ایندول استیک اسید بر میزان رشد، پروتئین، فعالیت آنزی مهای کاتالاز و پراکسیداز در تحت تنش آلومینیوم کلراید (Merr (L)Glycine max) گیاه سویا. مجله پژوهش های گیاهی.  جلد28. شماره 1. صفحه 187
 
4- Boyer, J.S. (1982) Plant productivity and environment. Science. 218: 443–448.  
5- Chen, H. and  Xing, L. (2010) The bifunctional abiotic stress signaling regulator and endogenous RNA silencing suppressor FIERY1 is required for lateral root formation. Plant Cell Environment. 33: 2180-90.
6- De Smet, I., Signora, L. Beeckman, T. Inze, D. Foyer, C.H. and Zhang, H. (2003) An abscisic acid- sensitive checkpoint in lateral root development of Arabidopsis. The Plant Journal. 33:543-555.
7- Francine, M. C. and Nelson, T. (2004(. COTYLEDON VASCULAR PATTERN2–Mediated Inositol (1,4,5) Triphosphate Signal Transduction Is Essential for Closed Venation Patterns of Arabidopsis Foliar Organs. The Plant Cell. 16:1263–1275
8- Fukaki, H. and Tasaka, M. (2009) Hormone interactions during lateral root formation. Plant Molecula Biology. 69: 437–449.
9- Guzman, P. and Ecker, J. R. (1990) Exploiting the Triple Response of Arabídopsís To ldentify Ethylene-Related Mutants. The Plant Cell. 2: 513-523.
10- Hirsch, J., J. Misson, P. A. Crisp, P. David, V. Bayle, G. M. Estavillo, H. Javot, S. Chiarenza, A. C.  Mallory, and A. Maizel. (2011) A novel fry1 allele reveals the existence of a mutant phenotype unrelated to 5′- > 3′ exoribonuclease (XRN) activities in Arabidopsis thaliana roots. PloS one (6)2: 1672.
11- Jibran, R., Hunter, D. A. and Dijkwel, P.P.(2013). Hormonal regulation of leaf senescence through integration of developmental and stress signals. Plant Molecular Biology 82, 547–561.
12- Levitt, J. (1980) Responses of Plants to Environmental Stresses. Academic Press.
13- Ljung, K., Bhalerao, R. P. and Sandberg, G. (2001) Sites and homeostatic control of auxin biosynthesis in Arabidopsis during vegetative growth. Plant journal.  29: 325–332.
14- Mahajan, S., and N. Tuteja. (2005) Cold, salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysics. 444:139-158.
15- Overvoorde, P., Fukaki, H. and Beeckman, T. (2010) Auxin Control of Root Development. Cold spring harb perspect biology, 2:1537.
16- Potuschak T., Vansiri, A. Binder, B.M., Lechner, E., Vierstra, R.D. and Genschik, P. (2006) The exoribonuclease XRN4 is a component of the ethylene response pathway in Arabidopsis. The Plant Cell. 18: 3047–3057.
17- Robles, P., Fleury, D. Candela, H. Cnops, G., Alonso Peral, M. M. and Anami, S. (2010) The RON1/FRY1/SAL1 gene is required for leaf morphogenesis and venation patterning in Arabidopsis. Plant Physiology. 152:1357-72.
18- Shirzadian-Khorramabad R, Jing H. C, Everts G. E, Schippers J. H. M, Hille J, Dijkwel, P. P. (2010) A mutation in the cytosolic O-acetylserine (thiol) lyase induces a genome-dependent early leaf death phenotype in Arabidopsis. BMC Plant Biology10:80.
19- Stepanova, A., Ecker, J. (2000) Ethylene signaling. From mutants to molecules. Current Opinion in Plant Biology. 3: 353-360.
20- Speed, C.J., Little, P. J., Hayman, J.A. and Mitchell, C.A. (1996) Underexpression of the 43 kDa inositol polyphosphate 5-phosphataseis associated with cellular transformation. EMBO Journal. 15: 4852–4861.
21- Wang, K., Li, H. and Ecker, J. (2002) Ethylene Biosynthesis and Signaling Networks. Plant cell. 14(Supl1): S131-S151.
22- Wilson, P. B., Estavillo, G. M. Field, K. J. Pornsiriwong, W. Carroll, A. J. Howell, K. A. Woo, N. S.  Lake, J. A. Smith, S. M. Harvey Millar, A. von Caemmerer S. and B. J. Pogson. (2009). The nucleotidase/phosphatase SAL1 is a negative regulator of drought tolerance in Arabidopsis. Plant Journal. 58 :299-317.
23- Xiong, L., Lee, B. H., Ishitani, M., Lee H., Zhang C., Zhu, J.K. )2001( FIERY1 encoding an inositol polyphosphate 1-phosphatase is a negative regulator of abscisic acid and stress signaling in Arabidopsis. Genes Development. 15: 1971-1984.
24- Xiong, L., Schumaker, K. S., and Zhu, J. K. (2002) Cell signaling during cold, drought, and salt stress. The Plant Cell. 14 (suppl 1):S165-S183.
25- Zakarias, L. and Reid, M.S. (1990) Role of growth regulators in the senescence of Arabidopsis thaliana leaves. Physiologia Plantarum. 80:549-554.
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 29, Issue 4 - Serial Number 4
May 2017
Pages 382-398
  • Receive Date: 19 May 2015
  • Revise Date: 20 November 2015
  • Accept Date: 08 February 2016