Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)

Study of the CuO nanoparticles interaction with human serum albumin using fluorescence technique

Document Type : Research Paper

Abstract

In this study, interaction between human serum albumin and CuO nanoparticle (NP) at different concentrations was studied using fluorescence method under the simulative physiological condition. The results showed the intrinsic fluorescence reduced in the presence of the NP as the manner increase NP concentration in media. According to the results of quenching rate constant (Kq), it deduced that the interaction take place through static mechanism. Thermodynamic parameters including enthalpy and entropy were calculated as -18.06 (KJ mol-1) and 0.0195 (KJ mol-1 K) respectively, which shows the importance of electrostatic interaction in HAS and NP interaction. Affinity of this particle to HAS deduced as the negative sign of free energy (∆G°) that shows the interaction is exergonic process. Evaluation of ANS fluorescence intensity indicated that hydrophobicity of the surface protein increased in the presence of the NP. Based on the results it established, the protein structure chnaged in the presence of NP which may be affected its function.

Keywords

Main Subjects

مطالعه میانکنش نانوذره اکسید مس با آلبومین سرم انسانی با استفاده از تکنیک فلورسانس

علی ریاحی مدوار1* و علیرضا قاسمی نسب2

1کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، گروه بیوتکنولوژی. 

2 کرمان، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، دانشکده علوم و فناوری­های نوین، گروه بیوتکنولوژی

تاریخ دریافت: 31/5/95                تاریخ پذیرش: 21/9/95

چکیده

در این مطالعه، برهمکنش بین آلبومین سرم انسانی (HSA) با غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (CuO) با استفاده از روش طیف سنجی فلورسانس در شرایط شبه فیزیولوژیک بررسی گردید. نتایج نشان داد که در حضور این نانو­ذره، نشر فلورسانس ذاتی پروتئین کاهش می­یابد که با غلظت نانوذره در محیط هماهنگ است. بر اساس نتایج مربوط به ثابت سرعت خاموشی (Kq) چنین استنباط می­شود که مکانیسم برهمکنش از نوع پایا (Static) است. پارامترهای ترمودینامیکی شامل آنتالپی (H°∆) و آنتروپی (S°∆) میانکنش بین نانوذره با HSA به ترتیب 06/18-  (KJ mol-1)و 0195/0 (KJ mol-1 K) محاسبه گردید که نشان دهنده نقش مهم میانکنشهای الکتروستاتیک در این اتصال می­باشد. در این میانکنش، علامت منفی مربوط به تغییرات انرژی آزاد (G°∆) بیانگر انرژی­زا بودن واکنش و تمایل این ذره به اتصال با HSA می­باشد. همچنین افزایش نشر فلورسانس ANS در حضور نانوذره بیانگر افزایش هیدروفوبیسیته سطحی پروتئین می­باشد. بر اساس نتایج به دست آمده چنین استنباط می­شود که ساختار HSA در حضور این نانوذره دچار تغییر شده که می­تواند بر عملکرد آن نیز تأثیر گذارد.

واژه­های کلیدی: آلبومن سرم انسانی، خاموشی، فلورسانس، نانو ذره اکسید مس.

* نویسنده مسئول، تلفن: 03433776611، پست الکترونیکی: riahi.ali@gmail.com

مقدمه

 

علم نانوتکنولوژی به ساختار و عملکرد مواد و ترکیباتی می­پردازد که حداقل یکی از ابعاد عملکردی آنها بین 1 تا 100 نانومتر باشد (4) .استفاده از نانوذرات به دلیل ویژگیهای منحصر به­فرد آنها، که خود ناشی از اندازه و ابعاد آنهاست، به طور روز افزون در حال افزایش است (26). تا­کنون سمیت نانوذرات برای رده­های سلولی پستانداران (7)، خرچنگها (5)، ماهیها (14)، گیاهان (20) و موشها (38) گزارش شده است. مطالعات مختلف حاکی از اثرات مضر و زیانبار ترکیبات نانویی مختلف همچون نانولوله­های کربنی و اکسید تیتانیوم بر روی سلولهای جانوری در محیط آزمایشگاه و همچنین بر اندامهای مختلف بدن جانوران از قبیل ریه ­می­باشد (10 و 20). همچنین، پتانسیل ایجاد خطر توسط نانوذرات برای سلامتی انسان، به دلیل سمیتی که بر سلولهای ریه (34) و سلولهای قرمز خون (28) نشان دادند، را دارا می­باشند.

نانوذرات فلزی با سطح ویژه بالا و واکنش‌پذیری سطحی بالا، نه تنها می­تواند به تنهایی توسط تماس فیزیکی معمولی جذب شوند بلکه می­توانند با پروتئینهای زیستی میانکنش دهند و توسط سلولها جذب گردند (32). درک بهتر رابطه متقابل نانوذرات و سلولهای زنده می­تواند منجر به پیشرفت در درک دریافتها، تواناییهای تشخیصی و درمانی جدید از قبیل دارورسانی هدفمند، ژن درمانی و تشخیص سلاحهای بیولوژیک شود (24). سریم اکسید در مقیاس نانو می­تواند با سرم آلبومین گاوی واکنش دهد و توسط سلولهای سرطانی ریه جذب ‌شود (23). اخیراً مطالعات گسترده­ای بر روی میانکنش نانوذرات با پروتئینها انجام شده است (6، 25،29 و 37).

آلبومین سرم انسانی (HSA) پروتئینی کروی با 585 اسید­آمینه، جزء فراوان‌ترین پروتئین موجود در پلاسمای خون است و حدود 80 درصد فشار اسمزی خون را تأمین می­نماید (21). این پروتئین با دارا بودن سه جایگاه اتصال اختصاصی (I، II و III) که هر کدام از آنها دارای دو زیر دُمین A و B می­باشند (8 و 11)، نقش مهمی در انتقال و پخش داروها در خون دارد (8). تحقیقات زیادی بر روی میانکنش بین HSA و مولکولهای دارویی با استفاده از تکنیک فلورسانس انجام شده است (9 و 18). میانکنش بین یک مشتق آکریدین (Acridine) و HSA با استفاده از مطالعات اسپکتروفتومتری فلورسانس در شرایط شبه فیزیولوژیک، نشان داد که این میانکنش از طریق مکانیسم پایا و با استفاده از پیوندهای هیدروژنی و میانکنشهای هیدروفوب انجام می­گیرد (9). اساساً در اتصال لیگاند به پروتئین چهار نوع میانکنش غیر­کوالانسی شامل پیوندهای هیدروژنی، نیروی واندروالسی، میانکنشهای هیدروفوبی و الکتروستاتیک­ می­تواند دخیل باشند. از روی علامت و بزرگی پارامترهای ترمودینامیکی (آنتالپی و آنتروپی) می­توان به نوع نیروی دخیل در میانکنشهای لیگاند- پروتئین در یک واکنش پی­برد. Ross و Subramanian  (27) علامت و اهمیت پارامترهای ترمودینامیکی در ارتباط با انواع مختلف میانکنشهایی که در روند اتصال به پروتئینها ممکن است رخ دهد را مشخص کردند؛ اگر آنتالپی و آنتروپی هر دو بزرگتر از صفر باشند؛ نوع میانکنش هیدروفوب می­باشد. اگر هر دو پارامتر مذکور کوچکتر از صفر باشند میانکنش واندروالسی و پیوند هیدروژنی در اتصال نقش دارند و اگر آنتالپی کوچکتر از صفر و آنتروپی بزرگتر از صفر باشد، میانکنشهای الکتروستاتیک عامل اصلی اتصال می­باشد. مطالعات مختلف بیانگر این است که در اتصال نانوذرات به پروتئینهای مکانیسمها و نیروهای مختلف درگیرند. به عنوان مثال،Roy  و Das (29) نشان دادند که میانکنش بین نانوذرات نقره با سرم آلبومین گاوی از طریق مکانیسم پویا با استفاده از میانکنشهای هیدروفوب و الکتروستاتیک انجام می­شود. در مطالعات انجام شده توسط Zhang و همکاران در سال  2015 مشخص گردید که میانکنش نانوذرات Fe2O3 با پروتئین فیبرینوژن اساساً از طریق پیوند هیدروژنی صورت می­گیرد (37). همچنین مطالعات انجام شده توسط Bhogale و همکاران در سال 2014  نشان داد  که میانکنش بین نانوذرات مس (با اندازه حدود 5/7 نانومتر) با سرم آلبومین گاوی از طریق مکانسیم پایا و با استفاده از میانکنشهای هیدروفوب صورت می­گیرد (6).

در این مطالعه، میانکنش آلبومین سرم انسانی با غلظتهای مختلف نانوذره CuO در شرایط شبه فیزیولوژیک با استفاده از تکنیک فلورسانس مورد آنالیز قرار گرفت.

مواد و روشها

مواد مورد استفاده در این تحقیق شامل سرم آلبومین انسانی (جرم مولکولی 65400 دالتون) و8-Anilinonaphthalene-1-sulfonic acid (ANS) از شرکت سیگما تهیه شدند. نمکهای فسفات شامل K2HPO4 و KH2PO4 از شرکت مرک تهیه شدند. نانوذره اکسید مس (CuO) با درصد خلوص 2/99 درصد، میانگین اندازه 60 نانومتر و مساحت سطح m2g-155 از شرکت NaBond Technology  تهیه گردید.

برای اندازه گیری شدت فلورسانس از اسپکتروفلورومتر VarianCary Eclipse ساخت کشور استرالیا استفاده شد.

آماده­سازی مواد: استوک HAS با غلظت 5/0 میلی­مولاردر بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار با 4/7pH= تهیه شد. همچنین استوک یک میکرومولار نانوذره اکسید مس در بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار در 4/7pH= تهیه شد. به منظور تهیه سوسپانسیون یک دست از نانوذره، استوک تهیه شده به مدت پنج دقیقه با فاصله زمانی یک دقیقه استراحت با استفاده از دستگاه سونیکاتور در یخ سونیکت گردید.

اندازه­گیری شدت فلورسانس ذاتی HSA در میانکنش با نانو ذره اکسید مس: جهت مطالعه برهمکنش نانوذره اکسید مس باHSA آزمایش به این صورت انجام شد:

طول موج تحریک : 295 نانومتر، محدوده طول موج نشر: 500-300 نانومتر، سرعت اسکن (Scan Speed):500 نانومتر بر دقیقه وSlit  (پهنای باند نور تابیده شده یا ثبت شده توسط دتکتور): 5 نانومتر.

در سل کوارتز یک سانتیمتری، حجم نهایی 5/2 میلی­لیتر از بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار با pH برابر 4/7، پروتئین با غلظت نهایی میکرومولار و نانوذره با غلظتهای نهایی صفر، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 ، 0/2، 4/2، 8/2، 2/3، 6/3 و 4 نانومولار اضافه شد، پس از 10 دقیقه انکوبه شدن در دمای 298 درجه کلوین طیف فلورسانس ذاتی پروتئین در طول موج تحریک 295 نانومتر ثبت گردید. علاوه بر این، فلورسانس ذاتی پروتئین در دماهای 303 و 310 درجه کلوین در حضور غلظتهای مختلف این نانو ذره اندازه­گیری شد.

بررسی نوع مکانیسم میانکنش (پایایا پویا): جهت بررسی نوع مکانسیم میانکنش نانوذره با پروتئین، نمودار استرن-ولمر مربوط به هر یک از دماها، بر حسب شدت فلورسانس در طول موج 340 نانومتر و غلظت نانوذره (نانومولار) ترسیم گردید. پس از به دست آوردن معادله خط مربوط به نمودار، ثابتهای خاموشی بر اساس معادله 1 محاسبه گردید.

معادله 1

 

در این معادله؛ F0 و F به ترتیب شدتهای فلورسانس پروتئین در عدم حضور و حضور خاموش کننده، kq؛ ثابت سرعت خاموشی پروتئین،KSV؛ ثابت نمودار استرن- ولمر (عکس مولار بر ثانیه)، [Q]؛ غلظت خاموش کننده برحسب مولار می­باشند (13، 18). متوسط نیمه عمر پروتئین بدون خاموش کننده (5 نانوثانیه) (35) می­باشد. برای محاسبه مقدارkq از معادله 2 استفاده شد.

معادله 2          

بر اساس معادله 3 می­توان ثابت اتصال و تعداد جایگاههای اتصال پروتئین برای یک لیگاند را محاسبه نمود.

معادله 3

 

در این معادله F0 و F به ترتیب شدتهای فلورسانس در عدم حضور و حضور خاموش کننده، Ka؛ ثابت اتصال برحسب مولار و n؛ تعداد جایگاههای اتصالی پروتئین برای هر لیگاند می­باشد (16).

تعیین پارامترهای ترمودینامیکی: جهت تعیین نیروهای دخیل در میانکنش پروتئین با نانوذره، پارامترهای ترمودینامیکی شامل آنتالپی و آنتروپی با استفاده از معادله 4 محاسبه شدند.

معادله 4

 

در این معادله؛ K: ثابت استرن ولمر در دماهای مختلف برحسب عکس مولار، DH0: تغییرات آنتالپی استاندارد واکنش بر حسب کالری بر مول بر درجه کلوین، DS0: تغییرات آنتروپی استاندارد واکنش بر حسب (مول.کلوین بر ژول) وR: ثابت گازها (مول.کلوین بر ژول) است (9، 30).

مقدار تغییرات انرژی آزاد گیبس استاندارد (کیلو­کالری بر مول) از معادله 5 محاسبه گردید.

معادله 5                       

اندازه­گیری فلورسانس ANS: فلورسانس ANS در غلظت پروتئینی یک میکرومولار و غلظت 30 میکرومولار ANS در بافر فسفات پتاسیم 50 میلی­مولار با 4/7 pH= در حضور و عدم حضور نانوذره ( 2 نانومولار) با شرایط زیر انجام شد.

طول موج تحریک : 350 نانومتر، محدوده طول موج نشر: 400-600 نانومتر، سرعت اسکن: 500 نانومتر بر دقیقه،Slit  (پهنای باند نور تابیده شده یا ثبت شده توسط دتکتور): 5 نانومتر.

 

 

نتایج 

تغییرات فلورسانس ذاتی  HSAدر حضور غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس: همان طور که در شکل 1 قابل مشاهده است، با افزایش غلظت نانوذره در محیط شدت فلورسانس در طول موج تحریکی 295 نانومتر کاهش یافته است. نتایج به دست آمده از معادله استرن-ولمر در طول موج نشری 340 نانومتر بر حسب غلظتهای مختلف نانوذره نشان می­دهد که میزان خاموش شدگی نشر فلورسانس با غلظت نانوذره تقریباً رابطه خطی داشته و هماهنگ با افزایش غلظت نانو ذره در محیط میزان نشر نیز کاهش می­یابد (شکل 2).

 

 

شکل1- اثر غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (صفر، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 ، 0/2، 4/2، 8/2، 2/3، 6/3 و 4 نانومولار) بر طیف نشری فلورسانس ذاتیHSA در طول موج تحریکی 295 نانومتر (دمای 298 درجه کلوین، بافر فسفات 50 میلی­مولار و 4/7pH=).

 

 

شکل 2- نمودار استرن-ولمر برهمکنش غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (صفر، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 ، 0/2، 4/2، 8/2، 2/3، 6/3 و 4 نانومولار) با HSA (طول موج نشر: 345 نانومتر، بافر پتاسیم فسفات 50 میلی­مولار، 4/7pH= و دمای 298 درجه کلوین).

فلورسانس ذاتی HSA در حضور نانو ذره اکسید مس در دماهای 298، 303 و 310 درجه کلوین: تأثیر دما بر میانکنش پروتئین با نانوذره اکسید مس، با اندازه­گیری شدت فلورسانس ذاتی HSA در طول موج 295 نانومتر مورد بررسی قرار گرفت. همانند آنچه در شکل 1 مشاهده می­گردد، در دماهای بالاتر نیز با افزایش غلظت نانوذره در محیط شدت فلورسانس کاهش یافت. از مقایسه نمودارهای استرن-ولمر به دست آمده درطول موج نشری 340 نانومتر، مشاهده می­گردد که با افزایش دما، میزان کاهش شدت فلورسانس کمتر شده است (شکل 3).

 

 

شکل 3- مقایسه نمودار استرن-ولمر برهمکنش پروتئین HSA با غلظتهای مختلف نانوذره اکسید مس (صفر، 4/0، 8/0، 2/1، 6/1 ، 0/2، 4/2، 8/2، 2/3، 6/3 و 4 نانومولار) در دماهای 280 درجه کلوین (♦)، 303 درجه کلوین (¡) و 310 درجه کلوین (▲).


تعیین نوع میانکنش HSA و نانوذره اکسید مس: ثابت خاموشی استرن-ولمر (Ksv) و ثابت سرعت خاموشی فلورسانس (Kq) از روی معادله خط مربوط به هریک از نمودارهای استرن-ولمر در دماهای مختلف در جدول 1 نشان داده شده است. همان طور که در جدول قابل مشاهده است هر دو ثابت خاموشی و ثابت سرعت با افزایش دما کاهش یافته است.  

 

جدول 1- ثابتهای خاموشی میانکنش HSA با نانوذره اکسید مس

Kq

(1х1017L mol-1 s-1)

Ksv

(1х109 L mol-1)

دما (کلوین)

8/8

4/4

298

8/6

4/3

303

6/4

3/2

310


تعیین پارامترهای ترمودینامیکی در میانکنش HSA و نانوذره اکسید مس: با استفاده از معادله خط به دست آمد از نمودار وانت­هوف (شکل 4)، و بر اساس معادله 4، آنتالپی و آنتروپی میانکنش نانوذره اکسید آهن با HSA محاسبه گردید (جدول 2). همان طور که در جدول قابل مشاهده است علامت H∆ منفی و علامت  S∆ مثبت می­باشد.

از طرف دیگر بر اساس معادله 5، مقدار تغییرات انرژی آزاد برای این میانکنش در دماهای مختلف محاسبه گردید. همان طور که در جدول 2 مشاهده می­گردد علامت این پارامتر منفی بوده و با افزایش دما افزایش یافته است.

 

 

  

شکل 4- نمودار وانت­هوف مربوط به میانکنش نانوذره اکسید مس با آلبومین سوم انسانی.

 

 

جدول 2- پارامترهای ترمودینامیکی میانکنش نانوذره اکسید مس با آلبومین سوم انسانی

∆S

)kJ mol-1 K)

∆H

)kJ mol-1)

G∆

)kJ mol-1)

(کلوین) دما

 

0195/0

 

06/18-

87/23-

298

96/23-

303

1/24-

310


تعیین ثابت اتصال و جایگاههای اتصال نانوذره بر روی HSA: مقادیر Ka و n برای برهمکنش نانوذره اکسید مس به پروتئین سرم آلبومین انسانی در جدول 3 نشان داده شده است. همان طور که در جدول مشاهده می گردد با افزایش دما ثابت اتصال و همچنین  n افزایش می­یابد (به استثنای n در دمای 310 درجه کلوین که نسبت به دمای 303 درجه کاهش نشان می­دهد).

 

جدول 3 -ثابت اتصال و تعداد جایگاه برای نانوذره اکسید مس با HSA

n

Ka

(1х109 M-1)

(کلوین) دما

442/0

63/9

298

794/0

18/21

303

720/0

98/27

310


فلورسانس ANS در حضور و عدم حضور نانو ذره اکسید مس: همان طور که در شکل 5 مشاهده می­گردد شدت فلورسانس ANS در حضور پروتئین HAS  نسبت به ANS به تنهایی افزایش یافته است. همین طور، نشر این فلوروفور در حضورپروتئین میانکنش داده با نانوذره نسبت به پروتئین تنها  بیشتر شده است.

 

 

شکل 5- فلورسانس ANS به تنهایی، در حضور HSA و در حضور HSA ترکیب شده با نانوذره اکسید مس.

 

بحث

اگرچه نانوفناوری دارای مزایا و پتانسیل­های زیادی است اما سمیت ناشی از باقیمانده­های نانو ذرات یک نگرانی بزرگ است (22). آلبومین فراوان­ترین پروتئین در پلاسما است که نقشهای فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی مختلفی دارد. این پروتئین نقش مهمی در انتقال و پخش داروهای موجود در خون دارد (8). نظر به اینکه، غیر از داروها، مولکولهای دیگر نیز امکان اتصال به این پروتئین را دارند، مطالعه اتصال مولکولهای کوچک به این پروتئین اهمیت زیادی دارد (9). تولید و استفاده بیش از حد نانوذرات منجر به راه­یابی این ذرات به اکوسیستمهای مختلف می­شود و این در حالی است که از سرنوشت این ذرات ­پس از ورود به اکوسیستم اطلاعات کامل و جامعی در دست نیست (22). مطالعات انجام شده توسط امجدی و همکاران نشان داد که نانواکسید مس علاوه بر مهار رشد باکتری اشریشیاکلی باعث تغییر توالی DNA آن در برخی نقاط می­شود (1).

تکنیک فلورسانس به دلیل حساسیت و دقت یک ابزار قدرتمند جهت مطالعه برهمکنش مولکولهای کوچک با پروتئینها به حساب می­آید (33). در ساختار HSA یک مولکول تریپتوفان در موقعیت 214 وجود دارد که فلورسانس ذاتی آن به لیگاندهای پیوند شدة مجاور حساس است (15).

همان طور که در نتایج مشاهده می­گردد با افزایش غلظت نانو­ذره در محیط، شدت فلورسانس ذاتی پروتئین HSA  (در طول موج 295 ناتومتر) در دمای 298 درجه کلوین کاهش یافته است (شکل 1). کاهش نشر فلورسانس ذاتی این پروتئین (مربوط به تریپتوفان) در حضور نانوذرات طلا نیز گزارش شده است (31). از نمودار استرن-ولمر مربوط به طیف فلورسانس ذاتی پروتئین چنین استنباط می­شود که بین خاموشی فلورسانس با غلظت نانوذره تقریباً رابطه خطی وجود دارد. همچنین رابطه مشابهی بین میزان خاموشی و غلظت نانوذره در دماهای بالاتر (303 و 310 درجه کلوین) نیز مشاهده گردید.

نتایج منتشر شده توسط Huang و همکاران در سال 2015 نشان داد که خاموشی فلورسانس HSA توسط کوانتوم دات CdTe:Zn2+ تابعی از غلظت بوده و با افزایش غلظت کوانتم دات میزان نشر فلورسانس ذاتی تریپتوفان کاهش می­یابد (16). این مشاهدات با نتایج به دست آمده در این تحقیق مطابقت دارد. بر اساس نمودار استرن-ولمر مربوط به خاموشی فلورسانس در دماهای مختلف (شکل 3) چنین مشاهده می­شود که با افزایش دما شیب نمودار مربوطه کاهش می­یابد. به عبارت دیگر، با افزایش دما، میزان خاموشی فلورسانس ذاتی مربوط به تریپتوفان در حضور غلظتهای مختلف نانوذره به صورت تابعی از غلظت نانو ذره کاهش می­یابد.

پارامترهای مربوط به ثابت خاموشی شامل Ksv و Kq که از معادله خط مربوط به هر یک از نمودارهای استرن-ولمر در دماهای مختلف به دست آمد نشان داد که با افزایش دما از 298 درجه کلوین به 310 درجه کلوین این پارامترها کاهش می­یابند (جدول 1). نتایج مشابهی در اتصال کوانتوم دات CdTe:Zn2+  به HSA  توسط Huang و همکاران گزارش شد. آنها کاهش این پارامترها را به مکانسیم پایا میانکنش بین کوانتوم دات و HSA مرتبط دانستند (16). از طرف دیگر، با توجه به اینکه ثابت سرعت خاموشی (Kq) در تمامی دماها از ثابت سرعت (maximum diffusion rate constant) یا Kq مربوط به این مولکول زیستی (2.0×1010L mol-1 s-1) بیشتر است پیشنهاد می­شود که خاموشی فلورسانس HSA از طریق مکانسیم پایا انجام می­شود (9، 12، 16 و 18). علامت منفی مربوط به مقدار انرژی آزاد شده (G∆) و علامت مثبت تغییرات آنتروپی (DS) در میانکنش HSA با این نانوذره، بیانگر خود به خودی بودن واکنش می­باشد (16).

بر اساس ثابت مربوط به نموارهای استرن-ولمر در دماهای مختلف (9)، پارامتر­های ترمودینامیکی از روی معادله خط مربوط به نمودار وانت­هوف  محاسبه شدند (جدول 2). همان طور که در جدول نشان داده شده است، آنتالپی کوچکتر از صفر و آنتروپی بزرگتر از صفر می­باشد، بنابراین نتیجه­گیری می­شود که میانکنشهای الکتروستاتیک عامل اصلی اتصال نانوذره با پروتئین می­باشند (27). این نتایج با نتایج منتشر شده توسط Huang و همکاران در سال 2015  مطابقت دارد. آنها نشان دادند که اتصال این پروتئین با کوانتوم دات CdTe:Zn2+ از طریق میانکنشهای الکتروستاتیک صورت می­گیرد (16). در حالی که مطالعات Rabbani  و همکاران نشان داد که میانکنش اتصال نانوذرات اکسید مس با آنزیم بتا گالاکتوزیداز از طریق پیوند هیدروژنی و نیروهای واندروالس انجام می شود (25). به نظر می­رسد که نوع مکانسیم اتصال و نیروهای دخیل در اتصال تابعی از اندازه، غلظت و همچنین ماهیت نانوذره در محیط باشد.

مطالعات انجام شده توسط ایرانفر و همکاران نشان داند که با تغییر اندازه نانوذره نقره در محیط رفتارهای متفاوتی رخ می­دهد، به طوری که با افزایش اندازه نانوذره نقره در حضور Ciprofloxacin، ثابت سرعت خاموشی و همچنین ثابت معادله استرن-ولمر افزایش می­یابد. آنها نتیجه گرفتند که نانوذرات با ابعاد مختلف عملکردهای متفاوتی در محلول­ پروتئینی دارد که می­تواند با لایه­های مختلف آبپوشی اطراف آنها مرتبط باشد (17).

ANS یک فلوروفور هیدروفوب است که پس از اتصال به محیطهای هیدروفوب نشر آن افزایش می­یابد (3 و 34). همان طور که در نتایج نشان داده شده است نشر این فلوروفور پس از اتصال به پروتئین متصل شده به نانوذره نسبت به پروتئین میانکنش نداده افزایش یافته است. این مشاهدات با نتایج منتشر شده توسط Sen و همکاران مغایرت دارد. آنها مشاهده کردند طیف نشری فلورسانس ANS در پروتئین متصل شده به نانوذرات طلا نسبت به پروتئین متصل نشده به نانوذره کمتر است (31). افزایش نشر فلورسانس این فلوروفور، نشان دهنده این واقعیت است که میزان هیدروفوبیسیته سطحی پروتئین در اثر میانکنش با این ذره افزایش یافته است که با نتایج به دست آمده از طیف فلورسانس ذاتی در حضور غلظتهای مختلف نانوذره همخوانی دارد. تغییر ساختار HSA پس از اتصال به نانوذرات طلا توسط Sen و همکاران در سال 2011 گزارش شده است. آنها مشاهده کردند که در حضور نانوذرات طلا میزان آلفا هلیکس ساختار پروتئین HAS کاهش می­یابد (31). از طرف دیگر، مطالعات انجام شده توسط شارقی و همکاران نشان داد که نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن بر پایداری آنزیم پپسین تأثیر ندارد (2).

در مجموع این مشاهدات بیانگر تغییر ساختار پروتئین پس از اتصال به نانوذره اکسید مس می­باشد که می­تواند عملکرد آن را تحت تأثیر قرار دهد.  لذا مهم است که جنبه­های محیطی، سلامتی و ایمنی در مراحل ابتدایی استفاده از نانومواد درنظر گرفته شود (5).

تشکر و قدردانی 

این تحقیق با حمایت مالی پژوهشگاه علوم و تکنولوژی پیشرفته و علوم محیطی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته با قررداد شماره  4031/1 انجام شده است. بنابراین مجری و همکاران مراتب سپاس و قدردانی خود را از آن دانشگاه محترم اعلام می­دارند.

1- امجدی، ف.، گلستانی ایمانی، ب. و کریمی، ف.1394. بررسی اثر نانوذرات اکسید مس روی ژنوم باکتری اشریشیاکلی با استفاده از نشانگرهای مولکولی RAPD  . مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران).  (4) 28، 487-475.
2- شارقی، ب، شهدادنژاد، ک. و محمدی، ه. 1394. مطالعه پایداری ساختاری آنزیم پپسین در حضور نانوذرات اکسیدروی و اکسیدآهن. مجله پژوهشهای سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران).  (3) 28، 351-344.
 
3- Andrade, J.D. Hlady, V. Feng, L. and Tingey, K. 1996. Protein at interfaces: principles, problems, andpotential. In: Brash JL, Wojciechowski PW, editors. Interfacial phenomena and bioproducts. New York: Marcel Dicker.19–55.
4- Ball, P. 2002. Natural strategies for the molecular engineer. Nanotechnology, 13: 15-28.
5- Baun, A. Hartmann, N.B. Grieger, K. and Kusk, K.O. 2008. Ecotoxicity of engineered nanoparticles to aquatic invertebrates: a brief review and recommendations for future toxicity testing. Ecotoxicology. 17(5): 387-95.
6- Bhogale, A. Patel, N. Mariam, J. Dongre, P.M. Miotello, A. Kothari, D.C. 2014. Comprehensive studies on the interaction of copper nanoparticles with bovine serum albumin using various spectroscopies.Colloids Surf B Biointerfaces. 113: 276-84.
7- Brunner, T.J. Wick, P. Manser, P.Spohn, P. Grass, R.N. Limbach, L.K. Bruinink, A. and Stark, W.J.2006. In vitro cytotoxicity of oxide nanoparticles: comparison to asbestos, silica, and the effect ofparticle solubility. Environmental science & technology. 40(14): 4374-4378.
8- Carter, D. C. and Ho, J.X. 1994. Structure of serum albumin. Advances in Protein Chemistry. 45: 153−203.
9- Chen, L. Wu, M. Lin, X. and Xie, Z. 2011. Study on the interaction between human serum albumin and a novel bioactive acridine derivative using optical spectroscopy. Luminescence. 26: 172-177.
10- Corredor, E. Testillano, P.S. Coronado, M.J. Gonzalez-Melendi, P. Fernandez-Pacheco, R. Marquina, C. Ibarra, M.R. Fuente, J.M. Rubiales, D. Perez-de-Luque, A. and Risueno, M.C. 2009. Nanoparticle penetration and transport in living pumpkin plants: in situsubcellular identification. BMC Plant Biology. 9: 1-11.
11- Curry, S. Brich, P. and  Frank, N.P. 1999. Fatty acid binding to human serum albumin: new insights from crystal-lographic studies.BiochimicaetBiophysicaActa. 14: 41−131.
12- Eftink, M.R. 1991. Fluorescence quenching reactions: probing biological macro-molecular structures. In: Dewey TG, editor. Biophysical and biochemical aspects of fluorescence spectroscopy. New York: Plenum.
13- Gelamo, E.L. Silva, C.H.T.P. Imasato, H. and Tabak, M. 2002. Interaction of bovine (BSA) and human (HSA) serum albumins with ionic surfactants: spectroscopy and modeling. BiochimicaetBiophysicaActa. 1594: 84–99.
14- Griffitt, R.J. Weil, R. Hyndman, K.A. and et al. 2007. Exposure to copper nanoparticles causes gill injury and acute lethality in zebrafish (Danio rerio). Environmental science & technology. 41(23): 8178-8186.
15- He, X.M. and Carter, D.C. 1992. Atomic structure and chemistry of human serum albumin. Nature. 358: 209–15.
16- Huang, S., Qiu, H., Liu, Y., Huang,  C., Sheng, J., Wei Su, W. and Xiao, Q. 2015. Molecular interaction investigation between three CdTe:Zn2+ quantum dots and human serum albumin: A comparative study. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 136: 955–962.
17- Hu, Y. Liu, Y. Wang, J. Xiao, X. Qu, S. 2004. Study of the interaction between monoammoniumglycyrrhizinate and bovine serum albumin. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis .  36: 915–19.
18- Iranfar, H.  Rajabi, O.  Salari, R. and Chamani, J. 2012. Probing the Interaction of Human Serum Albumin with Ciprofloxacin in the Presence of Silver Nanoparticles of Three Sizes: Multispectroscopic and ζ Potential Investigation. The Journal of Physical chemistry B. 116, 1951−1964.
19- Lakowicz, J.R. 1999. Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edn. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers. 368.
20- Lee, W.M. An, Y.J. Yoon, H. and Kweon, H.S. 2008. Toxicity and bioavailability of copper nanoparticles to the terrestrial plants mung bean (Phaseolusradiatus) and wheat (Triticumaestivum): Plant agar test for water-insoluble nanoparticles. Environmental Toxicology and Chemistry. 27(9): 1915-1921.
21- Li, Y. He, W.Y. Liu, H. Yao, X. and Hu, Z. 2007. Daidzein interaction with human serum albumin studied using optical spectroscopy and molecular modeling methods. Journal of Molecular Structure. 83: 144−150.
22- Monica, R.C. and Cremonini, R. (2009) Nanoparticles and higher plants. Caryologia. 62(2): 161-165.
23- Patil, S. Sandberg, A. Heckert, E. Self, W.  and Seal S. 2007.Protein adsorption and cellular uptake of cerium oxide nanoparticles as a function of zeta potential. Biomaterials. 28:4600-4607.
24- Pinto-Alphandary, H. Andremont, A. and Couvreur, P. 2000. Targeted delivery of antibiotics using liposomes and nanoparticles, research and applications. International journal of antimicrobial agents.13: 155-168.
25- Rabbani, G.  Khan, M.J. Ahmad, A. YusofMaskat, M.  and Khan, R.H. 2014. Effect of copper oxide nanoparticles on the conformation and activity of β-galactosidase. Colloids Surf B Biointerfaces. 123: 96-105.
26- Roco, M.C. 1999. Nanoparticles and nanotechnology. Journal of Nanopaticle Research 1: 1-6.
27- Ross, P.D. and Subramanian, S. 1981. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability. Biochemistry. 20(11): 3096-102.
28- Rothen-Rutishauser, B.M. Schurch, S. Haenni, B. and et al. 2006. Interaction of fine particles and nanoparticles with red blood cells visualized with advanced microscopic techniques. Environmental science & technology. 40(14): 4353-4359.
29- Roy, S. Das, T.K. 2014. Spectroscopic studies of interaction between biologically synthesized silver nanoparticles and bovine serum albumin. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 14(7): 4899-4905.
30- Sanei, H. Asoodeh, A. Hamedakbari-Tusi, S. and Chamani, J. 2011. Multi-spectroscopic Investigations of Aspirin and Colchicine Interactions with Human Hemoglobin:Binary and Ternary Systems. Journal of Solution Chemistry. 40: 1905–1931.
31- Sen, T., Mandal, S., Haldar, S., Chattopadhyay, K. and Amitava Patra, A. 2011. Interaction of Gold Nanoparticle with Human Serum Albumin (HSA) Protein Using Surface Energy Transfer. J. Phys. Chem. C.115: 24037–24044
32- Wang, B.X. Li C.H. and Peng X.F. 2005. Adsorption of nanoparticles on bubble surface in nano-particle suspension. China Particuology. 3: 208-212.
33- Wei, Y. Li, J. Dong, C. Shuang, S. Liu, D. and Huie, C.W. 2006. Investigation of the association behaviors between biliverdin and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy. Talanta. 70 (2): 377–382.
34- Worle-Knirsch, J.M. Kern, K. Schleh, C. and et al. 2007. Nanoparticulate vanadium oxide potentiated vanadium toxicity in human lung cells. Environmental science & technology. 41(1): 331-6.
35- Xie, M. Long, M. Liu, Y. Qin,  C. and Wang, Y. 2006. Characterization of the interaction between human serum albumin and morin. BiochimicaetBiophysicaActa. 1760:1184–91.
36- Yousefi-Nejad, M. Hosseinkhani, S. Khajeh, K. Ranjbar, B. 2006. Expression, purification and immobilization of firefly luciferase on alkyl-substituted Sepharose 4B.Enzyme and Microbial Technology. 40: 740–746.
37- Zhang, H. Wu, P. Zhu, Z. and Wang, Y. 2015. Interaction of γ-Fe2O3 nanoparticles with fibrinogen.SpectrochimicaActa Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy.151: 40–47.
38- Zhu, M.T. Feng, W.Y. Wang, Y. and et al. 2009. Particokinetics and extrapulmonary translocation of intratracheally instilled ferric oxide nanoparticles in rats and the potential health risk assessment. Toxicological sciences: an official journal of the Society of Toxicology. 107(2): 342-51.
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 30, Issue 4
February 2018
Pages 339-348
  • Receive Date: 21 August 2016
  • Revise Date: 26 November 2016
  • Accept Date: 11 December 2016