Document Type : Research Paper
Authors
Abstract
Cellulases are important industrial enzymes for the most bioconversion processes. In this study, Bacillus aerius isolated and identification as the best thermophilic cellulose degrading bacterium from Gorooh hot spring and was identified as Bacillus aerius AV10 based on 16S rRNA sequence homology and microbial-biochemical tests. Cultivation conditions of cellulase production by Bacillus aerius AV10 in solid-state fermentation (SSF) were investigated. The moisture content, yeast extract, MgSO4 and initial culture pH were identified by Plackett-Burman design (PBD) as the significant factors for endoglucanase, exoglucanase and filter paper (FPA) activities. Response surface Methodology and central composite design by 5-level and 4-factor were used for the optimization of enzyme. The optimal ranges of moisture content, yeast extract, MgSO4 and initial culture pH were 61.4%, 1.65%, 0.29% and 6.2, respectively. Under the optimized conditions, maximum CMCase production was 561.12 U/ml. The optimal pH and temperature of the enzyme for wheat straw hydrolysis were determined to be 7.0 and 60 °C.
Keywords
Main Subjects
بهینه سازی آماری تولید سلولاز به وسیله باسیلوس آرئوس سویه AV10 با روش تخمیر حالت جامد ضایعات سلولزی و تعیین خصوصیت نسبی آن
فاطمه آزادیانخرنجانی1و2، ارسطو بدویی دلفارد1٭ و زهرا کرمی1
1کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
2 کرمان، دانشگاه شهید باهنر کرمان، انجمن پژوهشگران جوان
تاریخ دریافت: 14/12/94 تاریخ پذیرش: 8/8/95
چکیده
سلولازها یکی از مهمترین آنزیمهای صنعتی برای اکثر فرآیندهای تبدیل زیستی هستند. در این مطالعهباسیلوس آرئوس به عنوان بهترین باکتری ترموفیل تجزیهکننده سلولز از چشمه آبگرم گروه در کرمان جداسازی و شناسایی شد. این باکتری بر اساس تستهای میکروبی- بیوشیمیایی و توالییابی ژن rRNA S16 به عنوان باسیلوس آرئوس شناخته شد. شرایط تولید آنزیم سلولاز توسط این باکتری در تخمیر حالت جامد مورد بررسی قرار گرفت. pH، رطوبت، عصارهمخمر و MgSO4 به عنوان عوامل قابل توجه در فعالیت اندوگلوکاناز، اگزوگوکاناز و Fpase به وسیله طراحی پلاکت- برمن مشخص شدند. روش سطح- پاسخ (RSM( و طرح ترکیبی مرکزی ((CCD با 4 عامل و 5 سطح جهت بهینهسازی تولید آنزیم مورد استفاده قرار گرفت که نتایج محدوده بهینه pH، MgSO4، رطوبت و عصارهمخمر را به ترتیب 2/6، 29/0، 4/61، 65/1 درصد نشان داد. در حالت بهینه بیشترین مقدار تولید CMCase،(U/ml) 1203/561 به دست آمد. pH و دمای بهینه آنزیم در هیدرولیز کاه گندم به ترتیب 7 و60 درجه سانتیگراد به دست آمد.
واژه های کلیدی: طرح پلاکت-برمن، ترموفیل، تخمیر حالت جامد، کاه گندم
* نویسنده مسئول، تلفن: 03433222032، پست الکترونیکی: badoei@uk.ac.ir
مقدمه
سلولازها یکی از مهمترین آنزیمهای صنعتی هستند که شامل سه نوع مختلف سلوبیوهیدرولازها (EC:3.2.1.91)، اندوگلوکانازها یا CMCase (EC:3.2.1.4) و بتاگلوکوزیدازها (EC:3.2.1.21) میباشند (22). اندوگلوکانازها به طور تصادفی باندهای β(1-4) را در مولکول سلولز هیدرولیز میکنند. برای اندازهگیری فعالیت این آنزیم از سوبسترای کربوکسیمتیلسلولز استفاده میشود، به همین دلیل به آن CMCase نیز گفته میشود. اگزوسلوبیوهیدرولازها در بیشتر موارد یک واحد سلوبیوز را آزاد میکنند که جهت اندازهگیری آن ازAvicel به عنوان سوبسترا استفاده میشود و در آخر سلوبیوز به وسیله بتاگلوکوزیداز به گلوکز تبدیل میشود. همچنین فعالیت هر سه آنزیم به طور همزمان با استفاده از کاغذ صافی اندازهگیری میشود که به این روش FPase میگویند (10، 23 و 30). سلولازها مهمترین آنزیمهای تجاری هستند که در صنعت غذا، نساجی، پالپ و کاغذسازی، تخمیر الکلی، غلات، داروسازی، صنایع آبجوسازی و مالت سازی استفاده میشوند (27). یک مانع مهم در کاربرد سلولازها هزینه بالای تولید آن است که بیشتر از 50 درصد از هزینههای کلی هیدرولیز را شامل میشود و استفاده تجاری از این آنزیمها را محدود میکند (38). تخمیر حالت جامد رشد میکروارگانیسمها روی ذرات جامد در غیاب یا کمبود آب تعریف میشود و برای تولید محصولات مختلف از جمله آنزیمها استفاده میشود (7، 29). محتوای آب در تخمیر حالت جامد بین 80-40 درصد متفاوت است. محتوای آب در تخمیر غوطهوری بیش از 95 درصد است (33). اگرچه معایبی در تخمیر حالت جامد وجود دارد، مانند کشت طولانی و دشوار بودن شناسایی پارامترهای تخمیری، اما تخمیر حالت جامد فرآیندی بسیار جذاب و جایگزین است. چون با استفاده از ضایعات کشاورزی و غذایی به عنوان سوبسترا هزینههای فرآیند پایین می آید (6). بهینهسازی شرایط تخمیر مشکل اصلی در توسعه فرآیند است. برخی از پارامترها که با توجه به تأثیر اقتصادی آنها بر فرآیند باید بهینهسازی شوند شامل شرایط محیط کشت مثل (رطوبت، pH، دما و زمان کشت) و ترکیبات محیط کشت (به ویژه منابع کربنی و نیتروژنی) میباشد. روش بهینهسازی سطح- پاسخ امروزه در دنیا کاربرد فراوانی دارد. این روش در واقع مجموعهای از روشهای تجربی، ریاضی و استنتاج آماری است که به طور فزآیندهای برای بهینهسازی در روند مطالعات فناوری زیستی به کار برده میشود (39). این روش می تواند چند عامل را در چند سطح همزمان با در نظر گرفتن اثرات متقابل آنها بررسی کند و ناحیهای که نتایج در محدوده آن قرار دارند را به شکل یک سطح سهبعدی نشان دهد. در این مطالعه تولید آنزیم سلولاز توسط سویه Bacillus aerius با استفاده از ضایعات کشاورزی در فاز تخمیری حالت جامد مورد مطالعه قرار گرفت و تأثیر سطوح مختلف pH، رطوبت، عصاره مخمر وMgSO4 به عنوان فاکتورهای مؤثر بر روی تولید آنزیم با روش طراحی آزمایش به شیوه سطح-پاسخ مورد آزمایش قرار گرفت.
مواد و روشها
نمونهبرداری و جداسازی باکتریهای مولد سلولاز: در این پژوهش برای جداسازی باکتریهای ترموفیل مولد آنزیم سلولاز از چشمه آبگرم گروه در شهرستان جیرفت در استان کرمان با مختصات جغرافیای 57 درجه و 56 دقیقه طول شرقی و 29 درجه و 5 دقیقه عرض شمالی با دمای 72 درجه سانتیگراد نمونه برداری صورت گرفت. بعد از تهیه محیط کشت حاوی CMC به عنوان منبع کربن از نمونه چشمه آبگرم به محیطهای مایع تلقیح شد و به مدت یک هفته در انکوباتور شیکردار در دمای 50 درجه سانتیگراد و دور rpm150 قرار گرفتند. ترکیبات محیط کشت در یک لیتر آب مقطر به شرح زیر است (16):
MgSO4 0.05 carboxymethylcellulose, 0. 5; yeast extract, 0.05; NaNO3, 0. 1, 1; K2HPO4, 0. 1;
پلیتها در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. به وجود آمدن هاله شفاف در اطراف کلنیها در محیط حاوی CMCآگار نشانگر تولید آنزیم سلولاز است که سبب هیدرولیز کربوکسی متیل سلولز موجود در محیط شده و یک هاله شفاف ایجاد مینماید. برای تشخیص باکتریهای ایجادکننده هاله، پلیتها به مدت 20 دقیقه در حضور معرف کنگورد 5/0 درصد قرار گرفته و پس از آن با NaClیک مولار رنگبری شدند. باکتریهای ایجاد کننده هاله انتخاب و برای خالصسازی به محیطهای جدید منتقل شدند (9).
شناسایی مولکولی: به منظور شناسایی مولکولی، ابتدا باکتری AV10 در محیط CMC آگار کشت داده شد. پس از رشد باکتریها جهت استخراج DNA ژنومی از روش فنل کلروفرم استفاده شد (24، 31). پس از انجام PCR و مشاهده نتایج بر روی ژل آگارز محصول واکنش PCR برای تعیین توالی و شناسایی مورد استفاده قرار گرفت. توالی DNA با استفاده از توالی یاب DNA توسط شرکت بیونیر (کره جنوبی) تعیین شد. سپس درخت فیلوژنی توالی سویهها با توالی حاصل از جستجو در پایگاه اطلاعاتی بانک ژنی به کمک نرم افزار مگا 4 با روش Neighbour joining رسم شد (36).
شکل 1- درخت فیلوژنی سویه باسیلوس آرئوس AV10 با استفاده از نرم افزار Mega4
تخمیر حالت جامد در تولید سلولاز: از سبوس گندم، سبوس برنج، کاه گندم، یونجه، ضایعات ذرت، به عنوان منبع کربنی (10 درصد) استفاده شد که بعد از جمع آوری به طریق مکانیکی خرد شدند و به محیط کشت اضافه شدند. تخمیر حالت جامد در ارلنهای 250 میلی لیتری انجام شد (5). هر کدام از این ارلنها حاوی 10 گرم سوبسترا بودند که شامل:
10.00 g, (NH4)2SO4 0.30 g, KH2PO4 0.06 g, MgSO4·7H2O 0.03 gسوبسترا میباشد. پس از تلقیح از کشت شبانه باکتری مذکور در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 6 روز گرمخانهگذاری شدند.
استخراجآنزیم: به منظور استخراج آنزیم پس از اتمام مدت زمان موردنظرگرمخانهگذاری، ارلن حاوی سوبسترای تخمیر شده را توزین نموده و پس از کسر عدد به دست آمده از وزن خالی، وزن توده تخمیر شده به دست آمد. برای استخراج نمودن آنزیم 5 برابر وزن توده تخمیر شده به ارلن آب مقطر اضافه کرده و به مدت یک ساعت در دور rpm 130 مخلوط شد .پس از خاتمه این مدت به مدت 15 دقیقه محتوای ارلن را با دور g 10000 سانتریفیوژ نموده و مایع موجود در ظروف سانتریفیوژ برای اندازهگیری میزان فعالیت سلولاز در یخچال نگهداری شد (28).
سنجش آنزیمی: در سنجش آنزیمی اندوگلوکانازها (کربوکسی متیل سلولاز ،(CMCase مخلوط واکنش محتویml 5/0 محلول سوبسترا می باشد که در بافر فسفات سدیم 50 میلی مولار با 7pH آماده شده است وml 5/0 محلول آنزیم که در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شد. بعد از انکوباسیون واکنش با اضافهکردن ml1 محلول دی نیتروسالیسیلیک اسید (DNS) متوقف شد. این نمونهها به مدت 10 دقیقه در حمام آبگرم جوشانده میشوند و سپس در دمای اتاق خنک شدند (26). فعالیت سلولاز کل ((Fpase با روش Ghose تعیین شد (8). فعالیت اگزوگلوکاناز با استفاده از Avicel به عنوان سوبسترا تعیین شد. مخلوط واکنش محتوی ml 5/0 آنزیم وml 5/0 محلول سوبستراست که در بافر سدیم فسفات 50 میلیمولار آماده شد (26). یک واحد فعالیت آنزیمی عبارت است از مقدار آنزیمی که یک میکرومول گلوکز را در یک دقیقه تحت شرایط استاندارد واکنش آزاد مینماید.
بهینه سازی شرایط تولید آنزیم (طرح آزمایش پلاکت برمن): طرح آزمایش پلاکت برمن برای 8 متغیر با استفاده از نرم افزار مینی تب (1و16) انجام شد. این 8 متغیر با توجه به تحقیقات انجام شده در این زمینه شامل رطوبت، pH، MgSO4، KH2PO4، عصاره مخمر، سبوس برنج، کاه گندم، و ضایعات ذرت میباشد (39). هر یک از این عوامل در دو سطح بالا (1+) و پایین (1-) مورد آزمایش قرار گرفتند. در مجموع 12 آزمایش طراحی شد و فعالیت سلولازی اندازهگیری شد که در جدول 1 نشان داده شده است. بر اساس نتایج حاصل از طراحی پلاکت برمن pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر به عنوان متغیر انتخاب شدند.
جدول 1- سطوح متغیرهای مورد آزمایش در طرح پلاکت-برمن
Variables (%) |
Low level (-1) |
High level (+1) |
(A) Wheat straw |
5 |
10 |
(B) Corn stover |
5 |
10 |
(C) Rice bran |
5 |
10 |
(D) KH2PO4 |
0.04 |
0.08 |
(E) Yeast extract |
0.5 |
2.5 |
(F) MgSO4 |
0.1 |
0.04 |
(G) Moisture content |
40 |
80 |
(H) pH |
5 |
7 |
بهینهسازیمتغیرهایانتخابشدهتوسط روشسطح- پاسخ: ارزیابی و بهینه سازی شرایط کشت با استفاده از روش سطح- پاسخ (RSM) صورت گرفت. 4 عامل و 5 سطح مرکزی شامل 30 آزمایش در مورد باسیلوس آرئوس مورد بررسی قرار گرفت. متغیرهای طراحی شده pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر بودند. متغیرها و سطوح آنها در جدول 7 آورده شده است. دادههای به دست آمده در این طرح با استفاده از نرم افزار مینی تب مدل 1/16 مدلسازی شده و شکلهای سهبعدی (منحنیهای سطح-پاسخ) جهت بررسی رابطه میان پاسخ و متغیرهای مستقل رسم شد. جهت تعیین نقطه بهینه از روش بهینهیابی عددی نرمافزار مذکور استفاده گردید. تابع پاسخ (Y) شامل تولید آنزیم با استفاده از مدل چند جمله ای درجه دوم زیر به دست آمد.
11.465+1205.78x1+89.8733x2+358.383x3+585.625x4-242.142x1x1-0.710354x2x2-31.9229x3x3-4622.29x4x4-1.47750x1x2-52.1250x1x3+51x1x4+0.24875x2x3-5.725x2x4
جدول 7- طرح آزمایش و نتایج حاصل از روش سطح- پاسخ
Run |
(X1) yeast extract (%) |
(X2) Moisture content (%) |
(X3) Initial culture pH |
(X4) MgSO4.7H2O (%) |
Endoglucanase activity (U/ml) |
1 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
288.1 |
2 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
417.9 |
3 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
334.8 |
4 |
0 |
0 |
0 |
0 |
547.3 |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
547.3 |
6 |
1 |
1 |
1 |
1 |
363.7 |
7 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
338.3 |
8 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
412.9 |
9 |
-1 |
1 |
-1 |
1 |
334.3 |
10 |
1 |
1 |
-1 |
-1 |
467.2 |
11 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
331.8 |
12 |
0 |
0 |
0 |
0 |
547.3 |
13 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
422.9 |
14 |
0 |
0 |
0 |
0 |
547.3 |
15 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
288.6 |
16 |
-1 |
-1 |
1 |
-1 |
224.9 |
17 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
278.1 |
18 |
1 |
-1 |
-1 |
1 |
412.9 |
19 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
219.9 |
20 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
417.9 |
21 |
0 |
0 |
-2 |
0 |
467.7 |
22 |
0 |
0 |
2 |
0 |
333.3 |
23 |
2 |
0 |
0 |
0 |
338.3 |
24 |
0 |
0 |
0 |
2 |
422.9 |
25 |
0 |
2 |
0 |
0 |
278.6 |
26 |
0 |
0 |
0 |
0 |
547.3 |
27 |
0 |
-2 |
0 |
0 |
209.5 |
28 |
-2 |
0 |
0 |
0 |
233.8 |
29 |
0 |
0 |
-2 |
-2 |
263.7 |
30 |
0 |
0 |
0 |
0 |
547.3 |
اثر pH و دما روی فعالیت و پایداری آنزیم سلولاز: در بررسی فعالیت دمایی آنزیم سلولاز، به 500 میکرولیتر سوبسترا (CMC 1 درصد) که در بافر سدیم فسفات 50 میلیمولار آماده شده است، 500 میکرولیتر آنزیم اضافه شده و در محدوده دمایی 90-30 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه گرماگذاری شدند. در بررسی پایداری دمایی آنزیم سلولاز، 500 میکرولیتر آنزیم را به مدت 30 دقیقه در دماهای مورد بررسی قرار داده وقتی همه لولهها در دمای تعیین شده قرار گرفتند به همه آنها به طور همزمان 500 میکرولیتر سوبسترا افزوده و فعالیت باقیمانده آنزیمی اندازهگیری شد (16). میزان فعالیت و پایداری آنزیم سلولاز در محدوده 12- 3 pH مشابه با آنچه در بالا ذکر شد مورد بررسی قرار گرفت. بافرهای به کار رفته برای تهیه pH مختلف عبارت بودند از استات سدیم:
5، 4) pH جرممولکولی =04/82) سدیم فسفات:6، 7، pH (جرممولکولی= 18/174) تریس باز: 8، 9، 10 pH (جرممولکولی =04/121)
نتایج و بحث
شناسایی مولکولی: بعد از تعیین توالی، برای محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز سویه در مقایسه با سایر ژنهای 16S rRNA، موجود در مرکز ملی بیوتکنولوژی درخت فیلوژنتیکی رسم گردید. رسم درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرم افزارمگا 4 با روش Neighbour joining انجام شد (شکل1). این سویه با جنس و گونه باسیلوس آرئوس همسانی بیش از 98 درصد دارد. در مطالعات پیشین انواع متنوعی از جنسها برای تولید سلولاز از جمله باسیلوس سوبتیلیس (18)، مارینوباکتر (32) و پنی سیلیوم (12) گزارش شد.
تعیین بهترین منبع کربن در تولید آنزیم: همانطور که در جدول 2 دیده میشود، از بین ضایعات کشاورزی مورد مطالعه محیط حاوی کاه گندم بیشترین تولید آنزیم را نشان داد که در مرحله بعدی به عنوان سوبسترا مورد استفاده قرار گرفت. با توجه کشت انبوه گندم در کشور و فراوانی این محصول فرعی کشاورزی در کشور، استفاده از آن به عنوان یک سوبسترا ارزان و در دسترس برای تولید آنزیم سلولاز بسیار قابلتوجه میباشد. لی و همکاران دریافتند که سبوس برنج بهترین منبع کربن برای رشد سلول و تولید سلولاز به وسیله باسیلوس سوبتیلیس A-5 است (20). جو و همکاران، مایند و همکاران گزارش کردند که پوسته برنج و سبوس برنج بهترین زیستتوده کشاورزی برای تولید CMCase به وسیله باسیلوس آمیلولیکوفاسیئنسDL3 (13) و باسیلوس sp (25) است.
جدول 2- اثر منابع کربنی در تولید آنزیم
Substrate |
Activity (%) |
Dry cell mass (mg.ml-1) |
Alfalfa straw |
57 ± 0.9 |
66 |
Corn stover |
79 ± 0.8 |
80 |
Wheat straw |
100 ± 1.2 |
34 |
Rice bran |
80 ± 1.2 |
37 |
Wheat bran |
53 ± 1.1 |
34 |
طرح آزمایش پلاکت برمن: بر اساس دادههای موجود در جدول 3 تنوع گستردهای در فعالیت آنزیم سلولاز در 12 آزمایش طراحی شده وجود دارد. این متغیرها اهمیت بهینهسازی پارامترهای تخمیری برای رسیدن به تولید بالاتر را نشان میدهند. همانطور که در جدول 4، 5 و 6 مشاهده میکنید این فاکتورها شامل pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر میباشند که با P values کمتر از 05/0 اثرات مثبت قابل توجهی بر فعالیت هر سه نوع سلولاز نشان میدهند. بهینهسازی ترکیبات محیط کشت (سبوس برنج، عصاره مخمر، سولفات منیزیم و پتاسیم فسفات) با استفاده از پلاکت برمن و طرح ترکیبی مرکزی از باسیلوس کربنیفیلوس CAS1 گزارش شده است (1). بازده CMCase تولید شده در این مطالعه بسیار بیشتر از CMCase تولید شده به وسیله سایر باکتریهاست. گزارشهای قبلی نشان دادهاند که رطوبت و دما اثر قابل توجهی روی فعالیت آنزیم تریکودرمارسیATCC 26921 و آسپرژیلوس اوریزا ATCC 12892 داشته است (4). علاوه بر این رطوبت و دما به عنوان پارامتر مؤثر به وسیله تریکودرما رسی MCG77گزارش شده است (19).
جدول 3- طرح آزمایش پلاکت-برمن برای 8 متغیر و نتایج فعالیت سلولازها در تخمیر حالت جامد
Run |
A |
B |
C |
D |
E |
F |
G |
H |
Endoglucanase activity (U/ml) |
FPA (U/ml) |
Exoglucanase activity (U/ml) |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
126.4 |
51.7 |
76.6 |
2 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
49.8 |
5.0 |
24.9 |
3 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
101.5 |
26.9 |
51.7 |
4 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
204.0 |
124.4 |
149.3 |
5 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
223.9 |
120.0 |
149.3 |
6 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
194.0 |
119.4 |
144.3 |
7 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
104.5 |
29.9 |
54.7 |
8 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
-1 |
84.6 |
10.0 |
34.8 |
9 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
139.3 |
114.4 |
139.3 |
10 |
1 |
-1 |
-1 |
-1 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
117.9 |
43.3 |
68.2 |
11 |
1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
217.9 |
143.3 |
168.2 |
12 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
1 |
-1 |
1 |
-1 |
84.6 |
14.4 |
39.3 |
جدول 4- طرح آزمایش پلاکت-برمن برای فعالیت اندوگلوکاناز
Term |
Effect |
Coef |
SE Coef |
T |
P |
Constant |
|
137.35 |
3.084 |
44.54 |
0.000 |
(A) W.S |
-16.17 |
-8.08 |
3.084 |
-2.62 |
0.079 |
(B) C.S |
-5.72 |
-2.86 |
3.084 |
-0.93 |
0.422 |
(C) R.B |
-5.72 |
-2.86 |
3.084 |
-0.93 |
0.422 |
(D) KH2PO4 |
29.44 |
14.72 |
3.084 |
4.77 |
0.017 |
(E) Yeast extract |
51.16 |
25.58 |
3.084 |
8.30 |
0.004 |
(F) MgSO4 |
46.85 |
23.42 |
3.084 |
7.6 |
0.005 |
(G) Moisture content |
-50.00 |
-25 |
3.084 |
-8.11 |
0.004 |
(H) pH |
62.94 |
31.47 |
3.084 |
10.21 |
0.002 |
جدول 5- طرح آزمایش پلاکت-برمن برای فعالیت اگزوگلوکاناز
Term |
Effect |
Coef |
SE Coef |
T |
P |
Constant |
|
66.88 |
5.513 |
12.13 |
0.001 |
(A) W.S |
-14.69 |
-7.35 |
5.513 |
-1.33 |
0.275 |
(B) C.S |
-12.34 |
-6.7 |
5.513 |
-1.12 |
0.345 |
(C) R.B |
12.5 |
6.25 |
5.513 |
1.13 |
0.339 |
(D) KH2PO4 |
11.21 |
5.61 |
5.513 |
1.02 |
0.384 |
(E) Yeast extract |
51.18 |
25.59 |
5.513 |
4.64 |
0.019 |
(F) MgSO4 |
36.88 |
18.44 |
5.513 |
3.34 |
0.044 |
(G) Moisture content |
-40.23 |
-20.12 |
5.513 |
-3.65 |
0.036 |
(H) pH |
59.80 |
29.90 |
5.513 |
5.42 |
0.012 |
جدول 6- طرح آزمایش پلاکت-برمن در تعیین فعالیت Fpase
Term |
Effect |
Coef |
SE Coef |
T |
P |
Constant |
|
91.71 |
5.307 |
17.28 |
0.000 |
(A) W.S |
-16.25 |
-8.13 |
5.307 |
-1.53 |
0.223 |
(B) C.S |
-12.44 |
-6.22 |
5.307 |
-1.17 |
0.326 |
(C) R.B |
10.95 |
5.47 |
5.307 |
1.03 |
0.378 |
(D) KH2PO4 |
12.77 |
6.38 |
5.307 |
1.2 |
0.315 |
(E) Yeast extract |
52.74 |
26.37 |
5.307 |
4.97 |
0.016 |
(F) MgSO4 |
36.98 |
18.49 |
5.307 |
3.48 |
0.04 |
(G) Moisture content |
-40.13 |
-20.07 |
5.307 |
-3.78 |
0.032 |
(H) pH |
61.36 |
30.68 |
5.307 |
5.78 |
0.01 |
بهینهسازیمتغیرهایانتخابشدهتوسطروشسطح- پاسخ: بر اساس نتایج حاصل از طراحی پلاکت برمن (جدول های 2، 3، 4 و 5) pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر به عنوان متغیرهای تأثیرگذار در فعالیت آنزیم انتخاب شدند. روش سطح- پاسخ برای بهینهسازی متغیرهای انتخاب شده انجام شد. شرایط بهینه برای تولید آنزیم با استفاده از pH، رطوبت، عصاره مخمر و MgSO4 بر روی پارامتر تولید آنزیم با استفاده از تکنیک بهینهسازی عددی نرم افزار مینیتب انجام شد. در حالت بهینه بیشترین مقدار تولید آنزیم 1203/561 به دست آمد. مقادیر متغیرهای مستقل در شرایط بهینه تولید آنزیم برای رطوبت، عصاره مخمر و MgSO4 و pH به ترتیب 4141/61، 6515/1، 2980/0 و 2929/6 (unit/ml) به دست آمد.
بهینهسازیسطوحپاسخچندگانه: یکی از اهداف عمده تحقیقات سلولازی کاهش هزینههای تولید آنزیم به وسیله بهینهسازی پارامترهای فرآیند است. این روش یک روش ریاضی طراحی آزمایشها، ساخت مدلها، تعیین تأثیر چندین عامل و جستجوی شرایط بهینه برای پاسخهای مورد نیاز است .بر طبق مطالعات پیشین، بهینهسازی ترکیبات محیط کشت برای محاسبه اثر بر همکنش گزیلوز، عصاره گوشت، سدیم کلراید، pH و دما در تولید سلولاز به وسیله باسیلوسVITRKHB مورد مطالعه قرار گرفته است (34). نمودارهای سه بعدی پاسخ وقتی دو تا از متغیرها در سطح مرکزی ثابت و دو تای دیگر تغییر میکند در شکل 2 نشان داده شده است.
شکل 2- اثر دما و pH بر فعالیت و پایداری آنزیم سلولاز |
این نمودارها نشان میدهند که pH، رطوبت، MgSO4 و عصاره مخمر تولید آنزیم را تحت تأثیر قرار میدهند. نمودارهای سه بعدی حاصله در این آزمایش از نوع نمودارهای حداکثر است و میتواند میزان حداکثر پاسخ را در محدوده انتخابی نشان دهد.
رابطه متغیرها در تولید آنزیم: در شکل 2-الف نمودار سه بعدی مرتبط به دو عامل MgSO4 و رطوبت نشان داده شده است. با افزایش محتوای رطوبت تا 60 درصد و MgSO4 تا 29/0 میزان تولید CMCase افزایش مییابد. در تحقیقی که توسط لطیفیان ارائه شده است، نتایج نشان میدهد که بیشترین فعالیت سلولاز عمدتاً در بیشترین سطح محتوای رطوبتی (70 درصد) میباشد (19) که این نتایج بسیار به نتایج گزارش شده توسط سلولازهای قارچی شباهت دارد (11، 14 و 28). در شکل 2-ب نمودار سه بعدی مربوط به دو عامل عصاره مخمر و MgSO4 نشان داده شده است. با افزایش میزان عصاره مخمر و MgSO4 میزان تولید CMCase در نقطه مرکزی به حداکثر میزان خود میرسد. در شکل 2-ج نمودار سه بعدی مربوط به دو عامل pH و رطوبت نشان داده شده است. با افزایش میزان رطوبت تا 60 درصد و تأثیر گذاری کمتر pH میزان تولید CMCase در نقطه مرکزی افزایش قابل توجهی نشان داده است. سانی و همکاران با استفاده از کاه برنج به عنوان سوبسترا و محتوای رطوبتی 75 درصد به بیشترین میزان تولید اندوگلوکاناز (2/240) با استفاده از قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس رسیدند (35). در شکل 2-د نمودار سه بعدی مربوط به دو عامل pH و MgSO4 نشان داده شده است با کاهش میزان pH و افزایش غلظت MgSO4 میزان تولید CMCaseدر نقطه مرکزی به حداکثر مقدار خود میرسد. در تحقیقی که توسط کانگ و همکارانش با استفاده از کاه برنج به عنوان سوبستر ارائه شد، بیشترین میزان تولید CMCase (129 درصد) عمدتاً در محتوای رطوبتی 65 درصد و 7 pH مشاهده شد (15). ضریب تعیین کلی 98/97 نشان میدهد که مدل رگرسیونی واکنش را به خوبی توصیف میکند و میتواند تغییرات کلی را در درون محدوده مقادیر مورد مطالعه توضیح دهد. هر چه قدر این مقدار به یک نزدیکتر باشد، مدل بهتر پاسخ را پیشبینی میکند. مقایسه تولید آنزیم سلولاز در شرایط بهینه شده با بالاترین میزان تولید شده (1203/561) نشان میدهد که با بهینه سازی به روش سطح- پاسخ میزان تولید آنزیم 2/8 افزایش مییابد.
اثر pH و دما روی فعالیت و پایداری آنزیم سلولاز: همانطور که در شکل 3- الف نشان داده شده است بهینه فعالیت و پایداری آنزیمی در دمای 60 درجه سانتیگراد، برای هیدرولیز کاه گندم مشاهده شد. به طوری که از دمای 30 تا 60 درجه سانتیگراد روند افزایش فعالیت آنزیم مشاهده شد. آنزیم سلولاز در دمای 70 درجه سانتیگراد 40 درصد کاهش فعالیت داشت. روند کاهش فعالیت آنزیم در دماهای بالاتر ادامه داشت به طوری که در دمای 80 درجه سانتی گراد 46 درصد فعالیت بهینه آنزیمی مشاهده شد. این دمای بهینه بیشتر از CMCase تولید شده به وسیله باسیلوس sp بود (37) و مشابه سلولاز تولید شده به وسیله باسیلوس مگاتریوم بود (17). در مطالعهای بر روی سلولاز خالصسازی شده از باسیلوس پومیلوسEB3 (3) وباسیلوس L1(21) ماکزیمم فعالیت آنزیم در دمای 60 درجه سانتیگراد مشاهده شد. همانطور که در شکل 3-ب نشان داده شده است بیشترین فعالیت و پایداری آنزیم در 7pH مشاهده شد در 9 pH فعالیت آنزیم به میزان قابل توجهی کاهش یافت و در بازه 12-9 تقریبا 30 درصد از فعالیت بهینه آنزیم مشاهده شد. این pH بهینه پایینتر از CMCase گزارش شده از باسیلوس هالودورانس است (2). در بررسی سلولاز جدا شده از باکتری باسیلوس پومیلوسEB3 مشخص شد که فعالیت بهینه آنزیم در 6 pH بوده است (3) و در باسیلوس آمیلولیکوفاسیئنس DL3 در 7 pH مشاهده شد (11).
ب |
ج |
د |
ج |
الف |
شکل 3-الف( نمودار سه بعدی اثر متقابل محتوای رطوبتی و غلظتهای مختلف MgSO4بر میزان تولید CMCase. شکل 3-ب( نمودار سه بعدی اثر متقابل عصاره مخمر و MgSO4 بر میزان تولید CMCaseشکل 3-ج( نمودار سه بعدی اثر متقابل MgSO4 و pH بر میزان تولید CMCase شکل 3- د نمودار سه بعدی اثر متقابل محتوای رطوبت و pH بر میزان تولید CMCase. در شرایطی که دو متغیر در نقطه مرکزی ثابت نگه داشته شدند
د |
نتیجهگیری کلی
استفاده از ضایعات کشاورزی برای تولید آنزیم سلولاز در فاز تخمیری حالت جامد امروزه توجه زیادی را به خود جلب کرده است که نشان میدهد این مواد حاوی ترکیبات با ارزشی است و میتواند به تولید مواد با ارزش افزوده بیانجامد. در طی این تحقیق یک سویه بومی که دارای فعالیت سلولازی مناسب میباشد از چشمه آبگرم جداسازی گردیده و بعد از تعیین توالی ژن rRNA S16 باسیلوس آرئوسAV10 نامگذاری گردید. نتایج حاصل از این تحقیق بیانگر کارآیی مفید روش سطح-پاسخ در بهینهسازی شرایط تولید آنزیم سلولاز گرما دوست میباشد. از میان شرایطی که برای تولید آنزیم اعمال شد pH (2/6 درصد)، MgSO4(29/0 درصد)، رطوبت (4/61 درصد) و عصاره مخمر (65/1 درصد) نسبت به سایر فاکتورها تأثیر زیادی بر تولید آنزیم داشته به طوریکه میزان تولید تا 2/8 برابر افزایش پیدا کرد. سوبسترای مورد استفاده در این مطالعه کاه گندم میباشد که با توجه به هزینه بالای تولید آنزیم اقتصادی بودن فرآیند تولید را توجیه میکند.
جدول 8- نتایج جدول آنالیز واریانس ((ANOVA مدل سطح-پاسخ معادله درجه دوم
Source |
df |
SS |
MS |
F |
P |
Model |
14 |
344764 |
246226 |
48/04 |
0.000 |
Linear |
4 |
69693 |
17423 |
33/99 |
0.000 |
Square |
4 |
238979 |
59745 |
116/56 |
0.000 |
Intraction |
6 |
36092 |
6015 |
11/74 |
0.000 |
Residual error |
14 |
7176 |
513 |
- |
- |
Lack of fit |
10 |
7176 |
718 |
- |
- |
Pure error |
4 |
0 |
0 |
- |
- |
TOTAL |
29 |
355445 |
45 |
- |
- |
جدول 9- نتایج جدول آنالیز واریانس ((ANOVA مدل سطح-پاسخ معادله درجه دوم
|
Response |
Optimal |
High |
Low |
Variables |
561.1203 |
CMCase maximum |
1.6515 |
2.5 |
0.5 |
Yeast extract |
|
|
61.4141 |
80 |
40 |
Moisture |
|
|
6.2929 |
9 |
5 |
pH |
|
|
0.2980 |
0.5 |
0.1 |
MgSO4 |