Document Type : Research Paper
Authors
1 Department of Biology, Khorasan Razavi Science and Research Branch, Islamic Azad University, Neyshabur, Iran
2 2- Cell and Molecular Biotechnology Research Group, Institute of Biotechnology, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran, 3- Department of Biology, Faculty of Science, Ferdowsi University of Mashhad, Mashhad, Iran
3 Department of Biology, Neyshabur Branch, Islamic Azad University, Neyshabur, Iran
Abstract
Reactive oxygen species, which lead to oxidative stress and related diseases via both intra- and extracellular pathways, could be identified and cleaning through some of the bacterial enzymes. Bearing in mind, the assessment of the structure, function and hosting of the antioxidative enzymes while lead to disclose species of bacteria with probiotics capability, provides approaches to designing genetics constructs. In this regard, the nucleotide and protein sequences of the katA, katE, katE*, sodA, sodA*, gshR, gshR1, gshR4, trxB1 and trxR genes were retrieved from databases. Then the structural, functional,topological and physicochemical properties of the protein sequences of related enzymes were investigated. Moreover, their hosting in bacterial microorganisms were explored. The results of this study whilst disclosed the physicochemical properties of these enzymes reveal that KATE, KATA, KATE* and SODA are secretory capacity. Structural monitoring of these enzymes introduced collaborative and pragmatic domains with the ability to remove reactive oxygen species, hydrogen peroxide decomposition and regulation of redox reactions as well as immunomodulatory effects and ammonia removal in some of them.In this regard, examination the binding affinity of these enzymes to oxidant agents revealed high binding affinity of them, in particular KATA, to O2-. Additionally, checking the host of these enzymes revealed the presence of homologous sequences especially sequences like to TRXB1 and TRXR in different species of Weissella, Pediococcus, Leuconostoc, Tetragenococcus, Peptoniphilus and Listeria. Meanwhile, similarity search lead to detection seven encoding sequences with antioxidative capacity in the genomic context of the Pediococcus acidilactici, Lactobacillus pentosus and Lactobacillus plantarum.
Keywords
Main Subjects
بررسی زیستدادهای ویژگیهای ساختاری، عملکردی و دامنه میزبانی آنزیمهای باکتریایی مؤثر در مقاومت به استرسهای اکسیداتیو
نازنین غلامپور فاروجی1، علی اکبرحدادمشهدریزه*2،3 و سمانه دولت آبادی4
1 نیشابور، دانشگاه آزاداسلامی، علوم وتحقیقات خراسان رضوی، گروه زیست شناسی
2 مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، پژوهشکده فناوری زیستی، گروه سلولی ومولکولی
3 مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی
4 نیشابور، دانشگاه آزاداسلامی واحد نیشابور، گروه زیست شناسی
تاریخ دریافت: 8/5/94 تاریخ پذیرش: 3/12/94
چکیده
گونههای اکسیژن فعال که میتوانند از دو مسیر داخل وخارج سلولی منجربه استرسهای اکسیداتیو و بیماریهای ناشی از آن شوند، توسط برخی از آنزیمهای باکتریایی قابل شناسایی و حذف میباشند. لذا پایش ساختاری، عملکردی و آشکارسازی دامنه میزبانی این نوع از آنزیمها، ضمن ارائه راهکارهایی در جهت طراحی سازههای ژنتیکی، معرفی گونههای باکتریایی با قابلیت پروبیوتیکی را به دنبال خواهد داشت. به این منظور توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی ژنهای katA،katE،*katE، sodA،sodA*،gshR، gshR1، gshR4، trxB1 و trxRاز بانکهای اطلاعاتی استحصال و پایش ساختاری، عملکردی، ویژگیهای فیزیکوشیمیایی، توپولوژیکی، و نیز دامنه میزبانی و قرابتیابی آنزیمهای مرتبط صورت پذیرفت. نتایج حاصل از این تحقیق علاوه بر آشکارسازی ویژگیهای فیزیکوشیمیایی، ترشحی بودن آنزیمهای KATE، KATA، KATE* و SODA را آشکار نمود. پایش ساختاری این آنزیمها ضمن معرفی دمینهای عملکردی و مشترک با قابلیت حذف گونههای فعال اکسیژن، تجزیه پراکسید هیدروژن و تنظیم واکنشهای اکسایش کاهش، دمینهایی با قابلیت تحریک پاسخ ایمنی و حذف آمونیاک را در برخی موارد نشان داد. در همین راستا بررسی میل اتصالی آنزیمها به عوامل اکسیدان، میل بالای آنها به ویژه KATA به مولکول - O2را مشخص نمود. همچنین بررسی پراکنش میزبانی این آنزیمها، حضور توالیهای همگون بهویژه شبه توالیهای مشابه باTRXB1 وTRXR با ارزش مناسب در گونههای مختلف از جنسهای باکتریایی غیرمیزبانی شامل Weissella،Pediococcus،Leuconostoc،Tetragenococcus، PeptoniphilusوListeria را مشخص نمود، که در این میان حضور 7 نوع توالی کدگذار با قابلیت احتمالی مقاومت به استرسهای اکسیداتیو در محتوی ژنومی گونههای باکتریایی Pediococcus acidilactici، Lactobacillus pentosus و Lactobacillus plantarum آشکار شد.
واژه های کلیدی: گونههای اکسیژن فعال، استرس اکسیداتیو، سرطان، آنزیمهای ضد اکسیدانی، پروبیوتیک
* نویسندة مسئول، تلفن: 05138803796، پست الکترونیکی: a.haddad@um.ac.ir
مقدمه
گونههای اکسیژن فعال که از جمله علل ایجاد بیماریهای مختلف سرطانی و غیرسرطانی محسوب میشوند، در نتیجه متابولیسم طبیعی سلول (29) و یا مواد شیمیایی زنوبیوتیک بیرونی همچون داروها و هورمونها ایجاد می شوند (15 و 39). در همین راستا کاهش سطح آنتیاکسیدانهای آنزیمی در نتیجه تغییر در بیان ژنهای مرتبط نیز منجربه تولید گونههای اکسیژن فعال میشود (4 و41). بنابراین شناخت مکانیسمهای مولکولی مؤثر در تولید این گونه ترکیبات و یا راهکارهای حذف آنها میتواند ارائه کننده روشهایی مفید در جهت مقابله با بیماریهای مرتبط از جمله سرطانها باشد. این نوع از بیماریها که از برهم خوردن هموستاز سلولی، تکثیر کنترل نشده سلولهای تغییر شکل یافته و گسترش آنها به سایر نقاط بدن حاصل میآید (16) ، عامل شایع مرگ و میر در جهان میباشد (12) ، لذا توسعه روشهای نوین درمانی، تشخیصی و یا پیشگیری از این بیماریها در حال گسترش هستند. در این میان استفاده از باکتریها در پیشگیری و درمان بیماریهای سرطانی، در اشکال مختلف از جمله در درمانهای غذایی مبتنی بر پروبیوتیکها جایگاه ویژهای پیداکرده است (32). پروبیوتیکها، میکروارگانیسمهای باکتریایی و غیرباکتریایی زندهای هستند که در صورت مصرف به میزان کافی (13) ، صرفنظر از مکانیسمهای متعدد و مهم در پیشگیری و درمان بیماریهای مختلف، مقابله با استرس اکسیداتیو و کاهش بار گونههای اکسیژن فعال نقش دارند. در این راستا فعالیت آنتی اکسیدانی باکتریهای پروبیوتیکی چون باکتریهای اسیدلاکتیک ممکن است منجربه پاکسازی گونههای فعال اکسیژن، مهار آنزیم و کاهش فعالیت یا مهار اتواکسیداسیون آسکوربات در روده از طریق خنثی سازی رادیکالهای آزاد شود (2). در چندین گزارش نشان داده شده است که سویههای باکتریهای اسیدلاکتیک خواص آنتیاکسیدانی دارند و گونههای اکسیژن فعال را از طریق مکانیسمهای آنزیمی غیرفعال میکنند (10،20،23). بنابراین این آنزیمها به واسطه حذف گونههای اکسیژن فعال، دارای قابلیت سمزدایی میباشند (8). از این رو، با استفاده از پروبیوتیکهایی با قابلیت جذب گونههای فعال اکسیژن و عوامل ایجادکننده آن از یکسو و نیز بالا بردن قابلیت آنتیاکسیدانی آن مبتنی بر فرآیندهای مهندسی ژنتیک، میتوان پیشگیری بسیاری از بیماریها از جمله بیماریهای سرطانی را توقع داشت. در همین راستا بهبود خواص آنتی اکسیدانی باکتریهای اسید لاکتیک فاقد فعالیتهای کاتالاز و سوپراکسیددیسموتاز، به طور گستردهای با تراریختسازی آنها با هترولوگهای کاتالاز و یا سوپراکسیددیسموتاز صورت پذیرفته است (3). همچنین آنزیمهای پروبیوتیکی دخیل در مقاومت به استرس اکسیداتیو همچون تیوردوکسین ردوکتاز، گلوتاتیون ردوکتاز به منظور تقویت خواص آنتیاکسیداتیو و بهبود استحکام آنها مهندسی شده، و بیان بیش از حد هریک از این ژنها در سویه پروبیوتیکی تراریخت منجر به تقویت تحمل اکسیداتیو آنها شده است (46). بنابراین هدف این تحقیق ضمن پروفایل نمودن آنزیمهای کلیدی مؤثر در مقاومت به استرسهای اکسیداتیو پروبیوتیکهای باکتریایی رایج، پایش ویژگیهای ساختاری، عملکردی و دامنه میزبانی آنها به منظور ارائه دمینهای مؤثر در جهت طراحی سازههای ژنتیکی با قابلیت بالا بردن توان آنتیاکسیدانی سویههای پروبیوتیکی و نیز معرفی گونههای باکتریایی با قابلیت بالا در برابر استرسهای اکسیداتیو، به عنوان سویههای پروبیوتیکی پرتوان، مبتنی بر حضور دمینهای مؤثر در شرایط مجازی میباشد.
مواد و روشها
واکاوی دادهها: با هدف آشکارسازی ژنهای دخیل در مقاومت به استرسهای اکسیداتیو، مکانیسمهای مولکولی مرتبط با فرآیند در برخی سویههای باکتریایی رایج پروبیوتیکی بررسی، و ژنهای کلیدی مرتبط شامل katE، katA، *katE، *sodA، sodA، gshR1، gshR4، gshR، trxB1،trxR انتخاب شدند.
دستیابی به توالیهای نوکلئوتیدی و پروتئینی آنزیمهای انتخابی: توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی ژنهای انتخابی با شمارههای شناسایی 1062016، 3777872، 937481، 3166154، 1114019، 1064211، 1062188، 114796714، 13871092 و شمارههای دستیابی WP_033609335.1، YP_394780.1، NP_391784.2، YP_141130.1، NP_266564.1، YP_004888400.1، YP_004890792.1، ABI79324.1، YP_006751102.1 و WP_021336670.1 به ترتیب از پایگاههای اطلاعات ژنی و پروتئینی NCBI (http: www.ncbi.nlm.nih.gov) استحصال شدند.
پایش ویژگیهای ساختاری و عملکردی توالیهای انتخابی : پایش توالیهای نوکلئوتیدی و پروتئینی ژنهای انتخابی از نظر اندازه با استفاده از دادههای موجود در پایگاه اطلاعات ژنی و پروتئینی (http: www.ncbi.nlm.nih.gov)، صورت پذیرفت. در همین راستا آشکارسازی دمینهای عملکردی این توالیها با استفاده از برنامههای تحت شبکهInterProScan 5، Motifscan و پایگاه ConservedDomain به ترتیب با آدرسهای،(http: www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/) ، (http: www.motif scan) و(http: www.ncbi.nlm.nih.gov/ cdd/) به طور جداگانه انجام شد. همچنین ویژگیهای فیزیکوشیمیایی این توالیها با استفاده از برنامه ProtParam موجود در بانک اطلاعاتی ExPASY با آدرس (http: web.expasy.org/protparam) تعیین گردید. جهت تعیین و پیش بینی توپولوژی پروتئینها از برنامه TMHMM با آدرس (http: www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0) استفاده شد.
دستیابی به ساختار 3 بعدی توالیهای پروتئینی: ساختار 3 بعدی توالیهای پروتئینی از پایگاه اطلاعاتی PDB با آدرس (http: www.rcsb.org) استحصال و یا با برنامه تحت شبکهswissmodel با آدرس( http: swissmodel.expasy.org) مدلسازی شدند. در این راستا تنها ساختار 3 بعدی توالی پروتئینی KATE باشماره شناسایی 1JKU از پایگاه اطلاعاتی PDB استحصال و ساختار سایر توالیها مدلسازی شدند.
دستیابی به ساختار 3 بعدی ترکیبات شیمیایی : استحصال ساختار 3 بعدی گونههای اکسیژن فعال با استفاده از پایگاههای اطلاعاتی colby و pubchem به ترتیب با آدرسهای http: www.colby.edu/chemistry/molecules و http: pubchem.ncbi.nlm.nih.gov صورت پذیرفت. تبدیل فرمت SDF مولکولها به PDB با برنامه تحت شبکه SMILES Translator با آدرس http: cactus.nci.nih.gov/ translate انجام شد.
ارزیابی میل اتصالی آنزیمها به گونههای فعال اکسیژن: ارزیابی توان اتصالی آنزیمهای انتخابی به گونههای بسیار واکنش پذیر اکسیژن شامل H2O2 و -O با استفاده از برنامه تحت شبکه PatchDock با آدرسhttp: bioinfo3d.cs.tau.ac.il/PatchDock صورت پذیرفت. نتایج حاصل از این آزمون براساس انرژی واکنش پذیری اتمی (ACE) در بین 20 راه حل اولیه با بیشترین اعتبار مورد بررسی و مطلوبترین آن در ارتباط با هر یک از آنزیمها انتخاب شدند. آشکار سازی صحت اتصال در موقعیت مناسب با استفاده از نسخه 1 برنامه Pymol صورت پذیرفت.
همگونیابی و قرابتیابی توالیها: تعیین پراکنش دامنه میزبانی توالی آنزیمهای انتخابی با استفاده از برنامه تحت شبکه Protein Blast با آدرس http: blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast مبتنی بر ماتریکسهای BLUSUM62، PAM250 و BLUSUM45 انجام شد. نتایج حاصل بر اساس ارزش E، درصد همسانی و همپوشانی ارزیابی و قرابت توالیهای انتخابی همگون با استفاده از نسخه 6 برنامه MEGA6 انجام و خوشه بندی توالیها بر اساس الگوریتم UPGMA صورت پذیرفت.
نتایج
ویژگیهای ساختاری و دامنه میزبانی ژنهای مقاومت به استرسهای اکسیداتیو: نتایج حاصل از واکاوی میکروارگانیسمهای پروبیوتیکی توانا در برابر استرسهای اکسیداتیو منجربه معرفی7 گونه باکتریایی متعلق به جنسهای Lactobacillus، Streptococcus، Bacillus و Lactococcus با قابلیت آنتیاکسیدانی و ویژگیهای ساختاری متفاوت شد (جدول 1). همان طوری که در این جدول نمایش داده شده است، ژنkatE* ضمن آنکه طول بلندتری نسبت به بقیه موارد نشان داده است، بیشترین قابلیت مقاومت به استرس اکسیداتیو را نیز ایجاد میکند.
جدول1- دامنه میزبانی، ویژگیهای ساختاری و قابلیت آنتیاکسیدانی ژنهای مقاومت به استرسهای اکسیداتیو. (علامت + در ستون تأثیریگذاری نتیجه بررسی قابلیت این آنزیمها در فرآیند آنتیاکسیداتیو پس از تراریختسازی آنها در گزارشهای مختلف میباشد، علامت +: نشان دهنده ایجاد تحمل اکسیداتیو کم، ++: متوسط، +++: زیاد، ++++: خیلی زیاد)
ردیف |
نام ژن |
سویه باکتریایی |
طول ژن |
نام آنزیم |
طول آنزیم |
تأثیرگذاری |
1 |
katE |
Lactobacillusplantarum |
1455 |
کاتالاز |
484 |
+ |
2 |
katA |
Lactobacillus sakei |
1500 |
کاتالاز |
479 |
++ |
3 |
katE* |
Bacillus subtilis |
2061 |
کاتالاز |
686 |
++++ |
4 |
sodA* |
Streptococcusthermophilus |
663 |
سوپراکسیددیسموتاز |
220 |
++ |
5 |
sodA |
Lactococcus lactis |
621 |
سوپراکسیددیسموتاز |
206 |
+ |
6 |
gshR1 |
Lactobacillus plantarum |
1332 |
گلوتاتیون ردوکتاز |
443 |
+ |
7 |
gshR4 |
Lactobacillus plantarum |
1335 |
گلوتاتیون ردوکتاز |
444 |
+ |
8 |
gshR |
Lactobacillus sanfranciscensis |
1338 |
گلوتاتیون ردوکتاز |
445 |
+ |
9 |
trxB1 |
Lactobacillus casei |
1047 |
تیوردوکسین ردوکتاز |
348 |
++ |
10 |
trxR |
Lactobacillus plantarum |
939 |
تیوردوکسین ردوکتاز |
312 |
+++ |
ویژگیهای فیزیکوشیمیایی توالی پروتئینی ژنهای مقاوم به استرسهای اکسیداتیو: نتایج حاصل از ارزیابی ویژگیهای فیزیکوشیمیایی توالی پروتئینی ژنهای کلیدی مؤثر در مقاومت به استرسهای اکسیداتیو، مبین وزن مولکولی آنها در محدوده 23 تا 55 کیلودالتون، بار الکتریکی منفی 22 تا منفی 72، pH ایزوالکتریک (pI) 92/4 تا 6/5، هیدروفوبیستی منفی 652/0 تا 010/0، نیمه عمر بیش از 10 ساعت در تمامی موارد و نیز شاخص ناپایداری 91/21 تا 72/33 آنها بود (جدول 2). همان طوری که در این جدول نمایش داده شده است، توالی پروتئین KATE* با بیشترین فعالیت و ضریب تأثیرگذاری، دارای بیشترین بار منفی میباشد، با این وجود تفاوت معنیداری در سایر موارد مشهود نبود. در همین راستا GSHR بیشترین پایداری را نشان داد.
ویژگیهای توپولوژی پروتئینهای آنتیاکسیداتیو: بررسی موقعیت سلولی پروتئینهای مؤثر در مقاومت به استرسهای اکسیداتیو، مبین ترشحی و غشایی بودن آنها بود (جدول 3). همان طوری که در این جدول مشاهده میشود در این میان پروتئینهای KATE ، ،KATA، KATE* و SODA ترشحی بوده و سایر موارد با دارا بودن 1 تا 4 دمین گذرنده از غشاء موقعیت غشایی را نشان دادند.
ارزیابی قابلیت پروتئینهای آنتیاکسیداتیو: بررسی قابلیت پروتئینهای آنتیاکسیداتیو انتخابی در حذف مولکولهای اکسیدان، مبین قابلیت تمامی آنها در اتصال به 2 مولکول اکسیدان H2O2 و-O2 بود، با این وجود همان طوری که در شکل 1 نمایش داده شده است بهطورکلی قابلیت اتصالی این مولکولها با -O2 بیشتر است.
پایش ساختاری و عملکردی ژنهای مقاوم به استرسهای اکسیداتیو : نتایج حاصل از پایش ساختاری و عملکردی توالیهای پروتئینی ژنهای مقاومت به استرسهای اکسیداتیو منجر به آشکارسازی دمینهای عملکردی و جایگاههای فعال مرتبط در موقعیتهای مختلف توالیهای مرتبط شد (جدول4). همان طوری که در این جدول نمایش داده شده است، دمینهای عملکردی ضمن آنکه با مکانیسمهای مختلف منجربه مقاومت در برابر استرسهای اکسیداتیو میشوند، طولی متفاوت نیز دارند. از سویی دیگر بررسی نتایج حاصل از پایش توالیهای پروتئینی KATA، KATE و *KATE ضمن آنکه حضور دمینهای مؤثر در تجزیه H2O2 را در هر یک از آنها آشکار نمود، منجربه معرفی دمینهای تحریک کننده پاسخ ایمنی در آنها و نیز دمینی در موقعیت 686-541 توالی *KATE با قابلیت حذف آمونیاک از گلوتامین شد. بررسی دقیق جایگاههای فعال این پروتئینها دخالت 16 اسیدآمینه در این جایگاه با موقعیت 58-42 در KATA وKATE و موقعیت 83-67 در KATE* را مشخص نمود . آشکار شدن دمین مشترک و عملکردی OxRdtase-FAD/NAD در موقعیتهای مختلف توالیهای پروتئینی GSHR1، GSHR4، GSHR، TRXB1 و TRXR از دیگر نتایج حاصل از پایش ساختاری و عملکردی بود.
جدول 2- برخی از ویژگیهای فیزیکوشیمیایی توالی پروتئینی ژنهای مقاومت به استرسهای اکسیداتیو. ( شاخص آلیفاتیک یک پروتئین به عنوان حجم نسبی زنجیره آلیفاتیک جانبی (آلانین، والین، ایزولوسین، و لوسین) در یک پروتئین میباشد که میتوان آن را به عنوان یک عامل مثبت برای افزایش مقاومت حرارتی پروتئینهای کروی در نظر گرفت)
ردیف |
نام توالی |
وزن ملکولی |
بار الکتریکی |
pI |
هیدرفوبیسیتی |
نیم عمر |
شاخص ناپایداری |
شاخصآلفاتیک |
1 |
KATE |
55003.6 |
-52.0 |
5.37 |
-0.571 |
>10 h |
26.24 |
71.85 |
2 |
KATA |
54320.5 |
-64.0 |
5.21 |
-0.652 |
>10 h |
31.04 |
70.04 |
3 |
KATE* |
40446.4 |
-72.0 |
5.60 |
-0.643 |
>10 h |
33.47 |
61.20 |
4 |
SODA* |
24734.0 |
-34.0 |
5.09 |
-0.260 |
>10 h |
30.03 |
88.86 |
5 |
SODA |
23253.8 |
-32.0 |
5.03 |
-0.446 |
>10 h |
33.72 |
80.58 |
6 |
GSHR1 |
47280.6 |
-30.0 |
5.29 |
0.010 |
>10 h |
21.99 |
95.40 |
7 |
GSHR4 |
48258.5 |
-34.0 |
5.18 |
-0.124 |
>10 h |
30.53 |
94.95 |
8 |
GSHR |
48617.0 |
-44.0 |
4.92 |
-0.196 |
>10 h |
21.91 |
95.06 |
9 |
TRXB1 |
38062.4 |
-22.0 |
6.10 |
-0.252 |
>10 h |
29.30 |
82.10 |
10 |
TRXR |
33504.6 |
-26.0 |
4.93 |
-0.186 |
>10 h |
25.73 |
86.54 |
جدول3- ویژگیهای توپولوژی پروتئینهای آنتیاکسیداتیو.
ردیف |
نام توالی |
نوع پروتئین |
موقعیت و تعداد دمین های گذرنده از غشاء |
|||
1 |
KATE |
ترشحی |
- |
- |
- |
- |
2 |
KATA |
ترشحی |
- |
- |
- |
- |
3 |
KATE* |
ترشحی |
- |
- |
- |
- |
4 |
SODA* |
غشایی |
42-13 |
159-128 |
- |
- |
5 |
SODA |
ترشحی |
- |
- |
- |
- |
6 |
GSHR1 |
غشایی |
35-2 |
147-127 |
197-164 |
|
7 |
GSHR4 |
غشایی |
51-5 |
204-160 |
353-320 |
443-423 |
8 |
GSHR |
غشایی |
43-4 |
- |
- |
- |
9 |
TRXB1 |
غشایی |
76-5 |
122-94 |
286-253 |
339-314 |
10 |
TRXR |
غشایی |
59-2 |
310-281 |
- |
- |
جدول4- ویژگیهای ساختاری و عملکردی توالی پروتئینی ژنهای مقاومت به استرس اکسیداتیو.
ردیف |
نام توالی |
نام دمین/ موتیف |
موقعیت |
عملکرد |
1 |
KATA |
Catalase_core |
388-6 |
H2O2 تجزیه |
Catalase_immune_responsive |
472-409 |
تحریک پاسخ ایمنی |
||
Catalase_AS |
58-42 |
جایگاه فعال |
||
2 |
KATE |
Catalase_core |
389-6 |
H2O2 تجزیه |
Catalase_immune_responsive |
475-415 |
تحریک پاسخ ایمنی |
||
Catalase_AS |
58-42 |
جایگاه فعال |
||
3 |
KATE* |
Catalase_core |
419-10 |
H2O2 تجزیه |
Catalase_immune_responsive |
511-443 |
تحریک پاسخ ایمنی |
||
Catalase_AS |
83-67 |
جایگاه فعال |
||
Class_I_gatase-like |
686-541 |
حذف آمونیاک از گلوتامین |
||
4 |
SODA* |
Mn/Fe-SOD |
219-17 |
تبدیل رادیکالهای سوپراکسید به O2 |
5 |
SODA |
Mn/Fe_SOD |
205-1 |
تبدیل رادیکالهای سوپراکسید به O2 |
6 |
GSHR1 |
OxRdtase-FAD/NAD |
301-6 |
حذف رادیکالهای سوپراکسید |
7 |
GSHR4 |
OxRdtase-FAD/NAD |
304-8 |
حذف رادیکالهای سوپراکسید |
8 |
GSHR |
OxRdtase-FAD/NAD |
304-9 |
حذف رادیکالهای سوپراکسید |
9 |
TRXB1 |
OxRdtase-FAD/NAD |
312-37 |
حذف رادیکالهای سوپراکسید |
OxRdtase-AS |
184-164 |
جایگاه فعال |
||
10 |
TRXR |
OxRdtase-FAD/NAD |
279-6 |
حذف رادیکالهای سوپراکسید |
OxRdtase-AS |
153-133 |
جایگاه فعال |
آشکارسازی قرابت توالی پروتئینی ژنهای مقاوم به استرسهای اکسیداتیو: نتایج حاصل از قرابتیابی توالی پروتئینی ژنهای مؤثر در مقاومت به استرسهای اکسیداتیو همان طوریکه انتظار میرفت، منجر به قرارگیری آنها در 4 خوشه مستقل متعلق به کاتالاز، سوپراکسیددیسموتاز، گلوتاتیون ردوکتاز و تیوردوکسین ردوکتاز شد (شکل 2). همان طوری که در این شکل مشاهده میشود این قرابتیابی نزدیکی پروتئینهای گلوتاتیون ردوکتاز و تیوردوکسین ردوکتاز را آشکار نمود.
پراکنش میزبانی توالیهای پروتئینی شبه گلوتاتیون ردوکتاز و تیوردوکسین ردوکتاز: واکاوی باکتریهای واجد توالی پروتئینی همگون با گلوتاتیون ردوکتاز و تیوردوکسینردوکتاز، منجربه آشکارسازی 1500 توالی مشابه با همسانی، همپوشانی و ارزش E مناسب در گونههای مختلف از جنس میزبانی و غیرمیزبانی دور و نزدیک شد، که در این میان 105 سویه باکتریایی حائز اهمیت بودند. با این وجود حضور توالیهای پروتئینی شبه گلوتاتیون ردوکتاز در گونههای مختلف از 3 جنس باکتریایی Weissella، Pediococcusو Leuconostoc و توالیهای شبه تیوردوکسین ردوکتاز در گونههای مختلف 2 جنس باکتریایی Pediococcus و Tetragenococcus از ارزش بالایی برخوردارند که قرابت آنها در شکل 3 آورده شده است. همان طوری که در این شکل نمایش داده شده است، در این میان گونه باکتریایی Pediococcus claussenii دارای توالی پروتئینی با شماره دستیابی WP_014271906.1 با قرابت نزدیک به توالی پروتئینی GSHR وGSHR4 میباشد، و نزدیکی توالی پروتئینی با شماره WP_046871913.1 متعلق به گونه Pediococcus damnosus به TRXB1 و TRXR مشهود است.
پراکنش میزبانی توالیهای پروتئینی شبه کاتالاز و سوپراکسیددیسموتاز: واکاوی باکتریهای واجد توالی پروتئینی شبه کاتالاز و سوپراکسیددیسموتاز نیز منجربه آشکارسازی 1500 توالی مشابه با همسانی، همپوشانی و ارزش E مناسب در گونههایی از جنس میزبانی و غیرمیزبانی دور و نزدیک شد. بررسی دقیق این نتایج مبین حضور توالی شبه پروتئینی KATA و KATE، KATE*، *SODA و SODA به ترتیب در گونههای مختلف از7،3،3و 8 جنس باکتریایی شد. بررسی قرابت توالیهای آشکار شده نزدیکی توالیهای پروتئینی با شمارههای دستیابی WP_005917332.1، WP_007475878.1، CON88561.1، WP_026681693.1، WP_036754612.1 و WP_0192443313.1 از جنسهای مختلف باکتریایی به توالیهای پروتئینی آنزیمهای کاتالاز و سوپراکسیددیسموتاز را نشان داد (شکل 4).
فراوانی و پراکنش توالیها و شبه توالیهای پروتئینی مقاومت در برابر استرسهای اکسیداتیو: بررسی حضور توالیها و شبه توالیهای پروتئینی مقاومت در برابر استرسهای اکسیداتیو در گونههای باکتریایی پایش شده، ضمن آنکه مبین حضور توالیهای TRXB1وTRXR به ترتیب در 22 و 19 گونه باکتریایی با ارزش مناسب بود، حضور 1 تا 7 نوع از این توالیها را در باکتریهای ردیابی شده آشکار نمود (جدول5). همان طوری که در این جدول نمایش داده شده است، در محتوی ژنومی گونه باکتریایی Lactobacillus acidophilus تنها 1 توالی، در حالی که در ژنوم گونههای Pediococcus acidilactici، Lactobacillus pentosus وLactobacillus plantarum حضور 7 توالی کدگذار احتمالی مرتبط با مقاومت به استرسهای اکسیداتیو آشکار شد.
جدول5- فراوانی و پراکنش توالیهای مقاومت به استرس اکسیداتیو در سویههای باکتریایی(حضور و یا عدم حضور توالی پروتئینی با علامت + و -، حضور توالیهای پروتئینی با همسانی و یا همپوشانی کمتر یا مساوی70 درصد با علامت*+و بیشتر از 70 درصد با علامت**+نمایش داده شده است)
TRXB1 |
TRXR |
GSHR4 |
GSHR1 |
GSHR |
SODA* |
SODA |
KATE* |
katE |
KATA |
نام باکتری |
ردیف |
**+ |
**+ |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus fabifermentans |
1 |
**+ |
**+ |
**+ |
**+ |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
Lactobacillus plantarum 2025 |
2 |
*+ |
- |
*+ |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus sanfranciscensis |
3 |
**+ |
**+ |
**+ |
**+ |
*+ |
- |
- |
- |
**+ |
*+ |
Lactobacillus plantarum |
4 |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
Lactobacillus paraplantarum |
5 |
**+ |
**+ |
**+ |
**+ |
*+ |
- |
- |
- |
**+ |
*+ |
Lactobacillus pentosus |
8 |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus salivarius |
6 |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus acidophilus |
7 |
- |
- |
**+ |
*+ |
*+ |
- |
- |
- |
**+ |
- |
Lactobacillus versmoldensis |
8 |
- |
**+ |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus farciminis |
9 |
**+ |
**+ |
**+ |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Pediococcus claussenii |
10 |
**+ |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Pediococcus damnosus |
11 |
**+ |
**+ |
*+ |
- |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
Pediococcus pentosaceus |
12 |
**+ |
**+ |
*+ |
*+ |
*+ |
- |
- |
- |
**+ |
**+ |
Pediococcus acidilactici |
13 |
**+ |
**+ |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
**+ |
Lactobacillus casei |
14 |
**+ |
**+ |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus paracasei |
15 |
- |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
- |
**+ |
**+ |
Lactobacillus fructivorans |
16 |
- |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus florum |
17 |
**+ |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
18 |
|
**+ |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
**+ |
Lactobacillus sakei |
19 |
**+ |
**+ |
- |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus malefermentans |
20 |
**+ |
**+ |
- |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus oryzae |
21 |
**+ |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
**+ |
Lactobacillus curvatus |
22 |
**+ |
**+ |
*+ |
*+ |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus brevis |
23 |
**+ |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus saerimneri |
24 |
**+ |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Lactobacillus suebicus |
25 |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
**+ |
- |
- |
Streptococcus pneumoniae |
26 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
Salinibacillus aidingensis |
35 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
*+ |
*+ |
Bacillus subtilis |
27 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
*+ |
- |
Bacillus tequilensis |
28 |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
Streptococcus thermophilus |
29 |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
Streptococcus vestibularis |
30 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
Lactococcus lactis |
31 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
Lactococcus garvieae |
32 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
Lactococcus raffinolactis |
33 |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
*+ |
- |
*+ |
*+ |
Enterococcus faecalis |
34 |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
*+ |
- |
*+ |
*+ |
Enterococcus faecium |
35 |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Weissella thailandensis |
36 |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Leuconostoc citreum |
37 |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Leuconostoc mesenteroides |
38 |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Leuconostoc fallax |
39 |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
|
- |
- |
- |
Leuconostoc lactis |
40 |
**+ |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
- |
Tetragenococcus halophilus |
41 |
*+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Tetragenococcus muriaticus |
42 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
Listeria fleischmannii |
43 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
Bifidobacterium asteroides |
44 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
Bifidobacterium sp. 7101 |
45 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
Bifidobacterium actinocoloniiforme |
46 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
Bifidobacterium bombi |
47 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
Weissella confusa |
48 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
Weissella hellenica |
49 |
- |
- |
- |
- |
- |
**+ |
- |
- |
- |
- |
Peptoniphilus lacrimalis |
50 |
|
|
|
|
|
**+ |
|
|
|
|
Bacillus megaterium |
51 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
- |
Veillonella ratti |
52 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
- |
Bacillus massilioanorexius |
53 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
- |
Trichuris trichiura |
54 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
- |
Vagococcus lutrae |
55 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
*+ |
- |
- |
- |
Carnobacterium divergens |
56 |
بحث و نتیجهگیری : شیوع بالای بیماریهای سرطانی و مرگ و میر ناشی از آن، منجربه ارائه راهکارهایی متنوع در جهت پیشگیری، تشخیص و درمان این نوع از بیماریها شده است (17) .در این میان توجه به فراوانی 90 تا 95 درصد عوامل سرطانزا در محیط زیست انسان، فرصتی مناسب در جهت پیشگیری از این بیماریها را فراهم میآورد (22) ، به طوری که اصلاح عوامل تغذیهای و الگوی مصرف مواد غذایی به تنهایی قابلیت پیشگیری از 30 درصد تا 40 درصد از موارد ابتلاء سرطان را دارا میباشد (24). در این راستا استفاده از پروبیوتیکها و جایگزینی باکتریهای مفید از طریق مکملهای غذایی جایگاه ممتازی در جهت پیشگیری از انواع سرطان بهویژه سرطانهای دستگاه گوارش پیدا نموده (27 و 35) ، که این مهم مستلزم شناخت ویژگیهای آنزیمی پروبیوتیکها در پیشگیری از سرطان میباشد. در این میان حذف عوامل اکسیدان از جمله گونههای اکسیژن فعال یکی از قابلیتهای اساسی سویههای پروبیوتیکی مبتنی بر حضور آنزیمهای آنتیاکسیداتیو باکتریایی در پیشگیری از بیماریهای التهابی و سرطانهای دستگاه گوارش میباشند (9، 30، 31، 37، 42 و 47) . بنابراین شناخت دقیق و پایش ویژگیهای ساختاری و عملکردی این آنزیمها ضمن آنکه میتواند راهکاری در جهت تقویت قابلیت آنتیاکسیدانی سویههای پروبیوتیکی موجود را فراهم آورد، منجربه توسعه سویههای پروبیوتیکی نوین مبتنی بر پایش دامنه میزبانی این آنزیمها خواهد شد، که در این تحقیق در دستور کار قرار گرفته است. بهطورکلی پایش مکانیسمهای مولکولی مقاومت در برابر استرسهای اکسیداتیو از 7 گونهباکتریایی شاخص پروبیوتیکی آشکارسازی 10 ژن کلیدی katE، katA، *katE، *sodA، sodA، gshR1، gshR4، gshR، trxB1، trxR با قابلیت آنتیاکسیدانی و ویژگیهای ساختاری متفاوت را باعث شد (جدول 1). نتایج حاصل از بررسی ویژگیهای ساختاری، فیزیکوشیمیایی و توپولوژیکی محصول پروتئینی این ژنها (جداول 1، 2 و 3)، منجربه معرفی KATE* با بیشترین طول، بارمنفی و ترشحی بودن انواع کاتالازها شد (جدول 3)، که ممکن است قابلیت آنتیاکسیدانی بالای KATE* را (جدول 1) با توجه به وابستگی حلالیت پروتئین با بار منفی و میل اتصالی بالا به عوامل اکسیدان (18) توجیهپذیر نماید. در این رابطه میتوان به قابلیت بیان خارج سلولی KatE* درlactis Lactococcus و مقاومت 800 برابری آن به استرسهای اکسیداتیو اشاره نمود (31). در ادامه پایش ویژگیهای ساختاری و عملکردی توالیهای پروتئینی این ژنها منجر به آشکارسازی پروفایلی از دمینهای عملکردی با قابلیتهای متفاوت بهویژه توانایی حذف گونههای اکسیژن فعال شد (جدول4).در این راستا در ساختار پروتئینی کاتالازها علاوه بر دمین مؤثر در حذف گونههای فعال اکسیژن (جدول 4)، دمینی با قابلیت تعدیل پاسخ ایمنی آشکار شد، که در سایر تحقیقات بر حضور این دمین و تحریک سلولهای T توسط کاتالازها تأکید شده است (14). بنابراین کاتالازهای مورد بررسی این تحقیق با عملکرد دوگانه حذف گونههای اکسیژن فعال و القای پاسخ ایمنی، محصولی کارآمد در پیشگیری از بیماریهای سرطانی محسوب شده که میتوانند در توسعه پروبیوتیکها مورد استفاده قرار گیرند. از سویی دیگر در این پروفایل دمینی با نام Mn/Fe_SOD در آنزیمهای سوپراکسیددیسموتاز آشکار شد، که قابلیت حذف گونههای اکسیژن فعال توسط آن در پروکاریوتها، قارچها، جلبکهای سبزآبی و میتوکندری نیز گزارش شده است (40). در ادامه پایش مولکولی آنزیمهای گلوتاتیونردوکتاز و تیوردوکسین ردوکتاز منجربه آشکارسازی دمین عملکردی OxRdtase-FAD/NAD در هر 2 این آنزیمها شد، که این مهم ضمن اشاره بر نقش آنتیاکسیدانی آنها میتواند دلالت بر جد مشترک آنها داشته باشد، که قرابت یابی این آنزیمها مؤید این نکته نیز شد (شکل 1).
شکل1- مقایسه ارزش انرژی تماس اتمی پروتئینهای آنتیاکسیداتیو با H2O2و O2- بر اساس ACE.
علاوه بر پایش ویژگیهای ساختاری و عملکردی آنزیمهای انتخابی، قابلیت آنتیاکسیدانی آنها با تعیین میل اتصالی این آنزیمها به گونههای فعال اکسیژن صورت پذیرفت، که حاکی از میل بالای این آنزیمها به ویژه KATA به مولکول -O2 بود (شکل 2)، با این وجود در سایر گزارشها به نقش کاتالازها برای تجزیه H2O2 تأکید بیشتری شده است (43 و 44). از سوی دیگر پایش دامنه میزبانی آنزیمهای انتخابی منجربه آشکارسازی حضور توالیهای پروتئینی شبه گلوتاتیونردوکتاز و تیوردوکسین ردوکتاز در جنسهای غیرمیزبانی Weissella،Pediococcus،Leuconostoc وTetragenococcus شد، که در این میان قرابت شبه توالی مستقر در دو گونهTetragenococcus halophilus و Tetragenococcus muriaticus با TRXB1 و TRXR مشهود بود (شکل3 ). بنابراین حضور T. halophilus در طول تخمیر انواع غذاهایی تخمیری و شور (38) ، میتواند ناشی از حضور توالی شبه تیوردوکسینردوکتاز در این باکتری باشد که کمتر مورد توجه قرار گرفته است. از سوی دیگر آشکار شدن حضور شبه توالی گلوتاتیونردوکتاز درجنس باکتریایی Leuconostoc ضمن آنکه میتواند مبین مقاومت به استرس اکسیداتیو این باکتری باشد، کاربری گسترده آن در طیف گستردهای از محصولات لبنی تخمیری (26) را نیز توجیهپذیر میسازد.
شکل 2- قرابت توالی پروتئینی ژنهای مقاومت به استرسهای اکسیداتیو مشتق از گونههای مختلف باکتریایی پروبیوتیکی .
شکل3- قرابت توالیهای پروتئینی ژنهای مقاوم به استرسهای اکسیداتیو به توالیهای پروتئینی GSHR1،GSHR4،GSHR، TRXB1، TRXR(▲: پروتئین همگونیابی شده)
در همین راستا اخیراً قابلیت پروبیوتیکی گونه mesenteroides Leuconostoc این جنس تحت شرایط شوری و دمای پایین گزارش شده است (45). بنابراین براساس کاربرد این باکتری در شرایط استرس شوری، دمای پایین، و داشتن ویژگی مقاوم به اسید و بهویژه دارا بودن مقاومت احتمالی به استرس اکسیداتیو این گونه میتواند کاندید مناسب پروبیوتیکی باشد که تا کنون مورد توجه قرار نگرفته است. از سوی دیگر قرابت نزدیک شبه توالی پروتئینی قابل اشتقاق از Pediococcus damnosus با گلوتاتیون ردوکتاز و تیوردوکسین ردوکتاز (شکل3)، ضمن کاربری گسترده این باکتری در صنایع تخمیری (6 و 33) قابلیت مقاومت این گونه در برابر استرسهای اکسیداتیو را نیز توجیه پذیر میسازد. علاوه بر این پایش دامنه میزبانی کاتالازها، منجربه آشکارسازی قرابت نزدیک KATE* با پروتئینی با نام سودوکاتالاز در گونه باکتریایی Streptococcus pneumonia شد (شکل 4) که قابلیت بیماریزایی آن قبلاً مشخص شده است (21). همچنین همگونیابی توالیهای شبه KATA و KATE قرابت نزدیک آنها با شبهتوالیهایی در گونههایی از جنس باکتریایی Listeria را آشکار نمود (شکل 4) که در این میان گونه Listeria fleischmannii با توانایی منحصر به فرد تخمیرD-مانیتول و D-گزیلوز (7) میتواند کاندید مناسب پروبیوتیکی با خواص آنتی اکسیداتیو باشد.
شکل4- قرابت توالیهای پروتئینی ژنهای مقاوم به استرسهای اکسیداتیو به توالیهای پروتئینیKATA،KATE، *KATE، SODA و*SODA(▲: پروتئین همگون یابی شده).
از سوی دیگر وجود توالی شبه KATE با قرابت نزدیک در گونه باکتریایی Pediococcus acidilactici (شکل 4)، میتواند کاربردی بودن این باکتری را نشان دهد، در همین ارتباط قابلیت مقاومت به استرسهای دمایی، صفراوی، اسیدی،pH ، فشار اسمزی و توانایی تولید پپتیدهای ضد میکروبی توسط این باکتری آن را به عنوان باکتری کاربردی در صنایع غذایی و پروبیوتیکی مطرح نموده است (5، 25 و 28). در ادامه پایش توالیهای آنتیاکسیدانی منجربه آشکارسازی 7 توالی شبه آنزیمی مقاومت به استرسهای اکسیداتیو در محتوی ژنومی این باکتری شد (جدول 5)، که کارآمدی بالای این باکتری در مقاومت به استرسهای متفاوت را ممکن است توجیه پذیر نماید. ادامه پایشهای میزبانی منجربه آشکارسازی اهمیت آنزیمهای TRXB1 و TRXR نسبت به سایر آنزیمهای مورد بررسی در این تحقیق در نتیجه دامنه گسترده میزبانی آنها شد، بهطوریکه شبه توالی این آنزیمها به ترتیب در 22 و 19 گونه باکتریایی با قابلیت آنتیاکسیداتیو مطرح (1، 11، 34 و 36)، واکاوی شد (جدول 5). همچنین آشکار سازی حضور 7 توالی شبه آنزیمی در محتوی ژنومی گونههای Lactobacillus pentosus وLactobacillus plantarum افزون بر Pediococcus acidilactici از نتایج این تحقیق بود، که این موضوع میتواند هم راستا با قابلیت آنتی اکسیدانی بالای Lactobacillus plantarum باشد، بهطوریکه بر اساس گزارشها در طول دوره رشد، این باکتری آنتیاکسیدانهایی معادل با تقریباً mg100 ویتامین C تولید میکند (19). به طورکلی نتایج حاصل از این تحقیق ضمن آشکارسازی دمینهای عملکردی در آنزیمهای آنتیاکسیداتیو، منجربه معرفی گونههای باکتریایی با قابلیت آنتیاکسیدانی بالا مبتنی بر حضور توالیهای شبه آنزیمی در محتوی ژنومی آنها و نیز تأکیدی بر قابلیتهای نقش برخی از باکتری مبتنی بر حضور این نوع از توالیها شد که تا کنون به آن پرداخته نشده بود.