Identification of allelic variants of melatonin receptor (MTNR1A) in a population of Afshari ewes

Document Type : Research Paper

Authors
Neda Saba 1
Rahimeh Sepehri 2
Taher Harkinezhad 1
1 Department of Animal Science, Faculty of agriculture, University of Zanjan, Zanjan, Iran.
2 Department of Animal Science, Faculty of agriculture, University of Zanjan. Zanjan , Iran.
10.22034/cmr.2023.2337
Abstract
The reproduction of most breeds of sheep, especially the Iranian breeds, is seasonal. The hormone melatonin plays an important role in seasonal reproduction. The purpose of this research was to examine the polymorphism(s) in exon two of the MTNR1A gene in Afshari sheep in two groups of random and non-seasonal samples (35 randomly selected ewes and 44 spring calving ewes). After extracting DNA from blood samples and designing specific primers, the target DNA was amplified by the PCR method. Based on the results of the sequence analysis in some samples, a polymorphism at nucleotide 408 of the amplified fragment was identified (corresponding to the C519C>T polymorphism of the cDNA sequence). Genotype identification of non-sequenced samples was performed by PCR-RFLP. All three genotypes of this SNP: CC, CT and TT with frequencies of 0.78, 0.1 and 0.06, respectively, were observed. The frequency of the C allele (0.835) was higher than that of the mutant allele. However T allele had a higher frequency in the non-seasonal group. In addition, a positive and significant correlation between genotype and seasonal reproduction was observed (r=0.36, p-value=0.0001). Analysis of the odd ratios also showed that the T allele was 19 times more likely to occur in the non-seasonal group than in the random group. In general, it appears that the T allele in this position correlates with non-seasonal reproduction in sheep. If this results can be confirmed in further studies, the mentioned polymorphism can be used in breeding schemes to improve the reproductive status of sheep.

Keywords

Subjects

شناسایی واریانتهای اللی ژن گیرنده ملاتونین((MTNR1A در جمعیتی از میش­های نژاد افشاری

ندا صبا، رحیمه سپهری* و محمدطاهر هرکی نژاد

ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی

تاریخ دریافت: 12/07/1402          تاریخ پذیرش: 06/09/1402

چکیده

در اکثر نژادهای گوسفند به­ویژه نژادهای داخل ایران، تولیدمثل فصلی است. هورمون ملاتونین نقش مهمی در تولید­مثل فصلی دارد در پژوهش حاضر، چند­شکلی(های) موجود در اگزون شماره دو ژن MTNR1A در گوسفند افشاری در دو گروه نمونه­های تصادفی (35 راس) و غیرفصلی (44 راس) بررسی شد. پس از استخراج DNA از نمونه خون دام­ها و طراحی پرایمرهای اختصاصی جهت تکثیر قطعه مورد نظر (بخش انتهایی اینترون یک، کل اگزون شماره دو و بخش ابتدایی اینترون دو)، تکثیر این قطعه با دستگاه PCR انجام و شناسایی چند­شکلی(های) موجود به کمک توالی­یابی تعدادی از نمونه­ها صورت گرفت. توالی­ها در نرم­افزارهای Chromas lite و ClC Main Workbench 5 بررسی شدند. یک چند­شکلی در نوکلئوتید 408 از قطعه تکثیر شده (منطبق بر چندشکلیC519C>T از توالی cDNA) شناسایی شد. با تعیین ژنوتیپ­ محصولات توالی یابی نشده به کمک RFLP، سه ژنوتیپ CC، CT و TT  به ترتیب فراوانی­های 78/0، 1/0، 11/0 شناسایی شدند. براساس نتایج حاصله، در کل داده­ها، فراوانی آلل C وآلل T به­ترتیب، 835/0 و 165/0 بود. ولی در گروهی که آبستنی غیر­فصلی داشتند، آلل T فراوانی بیشتری داشت. همچنین، همبستگی مثبت و معنی­داری بین ژنوتیپ و تولید­مثل غیرفصلی مشاهده شد(r=0.36, p=0.0001) . بررسی نسبت Odds نیز نشان داد که احتمال وجود آلل T در این گروه 19 برابر بیشتر از گروه تصادفی می­باشد. لذا، احتمالا آلل T با غیر­فصلی بودن تولید­مثل این گوسفندان مرتبط است. با توجه به نتایج بدست­آمده و در صورت تأیید نتایج فوق در مطالعات تکمیلی، از چند­شکلی فوق می­توان در جهت بهبود وضعیت تولید­مثلی گوسفند استفاده نمود.

واژه‌های کلیدی: گوسفند افشاری، تولید­مثل غیرفصلی، ملاتونین، اگزون دو، چندشکلی تک­نوکلئوتیدی

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: sepehri_r@znu.ac.ir

مقدمه

 

رفتار دوره­ای حاکم بر طبیعت بر فیزیولوژی موجودات، اثر تعیین کننده­ای دارد. مهمترین دوره زمانی درونی، دوره شبانه­روزی است که بسیاری از فرآیند­ها از جمله ترشح هورمون­ها تحت تأثیر نوسانات طول شبانه­روز قرار می­گیرد. در کنار نوسانات زمانی روز، یک دوره­ی تابع فصل نیز وجود دارد (1). نژادهای گوسفند که در مناطق معتدل زندگی می­کنند تولید­مثل فصلی دارند که توسط دوره­های نوری تنظیم شده است. این صفت در دوره خاصی از سال منجر به زاد و ولد می­شود (10 به نقل از 5). تولید­مثلی فصلی با طول دوره روشنایی روز تنظیم می­شود و هنگامی­که ساعات تاریک در حال افزایش است و با کوتاه شدن طول روز (از تابستان تا زمستان)میش­ها فعالیت تولید­مثلی بیشتری نشان می­دهند (10). یک پیام سلولی شیمیایی برای دوره­های نوری در پستانداران هورمون ملاتونین می­باشد که نقش کلیدی در تولید­مثل فصلی بازی می­کند (2) و این هورمون، بصورت مشخصی در بروز، کنترل و رفتار جنسی گوسفندان اثر گذار است (19).

با توجه به اینکه اغلب نژاد­های گوسفند دارای تولید­مثل فصلی هستند، این خصوصیت گوسفند در بسیاری از مناطق دنیا منجر به محدود شدن رفتار تولید­مثلی شده و تنها یک بار زایش انجام می­پذیرد (10). در نتیجه، در یک سیستم تولید گوشت، بازده تولید به ازای هر حیوان را می­توان با زیاد کردن عملکرد تولید­مثل از طریق افزایش باروری و چند­­قلوزایی و کاهش طول چرخه­ی تولید­مثل (چند­بارزایی) افزایش داد ( 20،9). از جمله راهکارهایی که جایگزین مناسبی برای حیوانات پلی­استروس (Polyestrous) باشد تا بتوانند بدون در نظر گرفتن دوره سال و یا اجتناب از ترفند هورمون تراپی به فعالیت تولید­مثلی برگردند، شناسایی ژنوتیپ­هایی است که به تولید­مثل فصلی کمتر حساس هستند (2).

بدین منظور، ژن گیرنده ملاتونین (Melatonin receptor 1A=MTNR1A) به طور مکرر در مطالعات پیشین  بعنوان ژن کاندیدا پیشنهاد شده­است و بنظر می­رسد در کنترل دوره­های نوری که در آن غلظت ملاتونین با تغییرات طول روز تحت تأثیر قرار می­گیرد، نقش کلیدی دارد. در مطالعات پیشین متعددی ارتباط آماری چند شکلی های نوکلئوتیدی در این ژن در گونه­های مختلف با تولید­مثل فصلی گزارش شده است. بویژه ساختار و پلی­مورفیسم اگزون شماره دو از این ژن در چند نژاد گوسفند بررسی شده و ژنوتیپ­های خاصی با فعالیت­های تولید­مثلی مرتبط بوده­اند (3،15،16).

در این راستا، مسر (Messer) و همکاران (12) برای اولین بار با استفاده از توالی ژن MTNR1A گوسفند (ثبت شده با کد u14109 در بانک اطلاعاتیNCBI) یک جفت پرایمر جهت تکثیرقطعه 824 جفت­بازی از اگزون شماره دو را طراحی نمودند. دو جهش در نواحی ژنی 606 و 612 شناسایی شد. جهش ناحیه 606 در اثر جابجایی نوکلئوتید T باC  و در جهش ناحیه612 نوکلئوتید A جایگزین باز نوکلئوتیدی G شده بود. در پژوهشی که به منظور بررسی چندشکلی ژن MTNR1A در گوسفندان نژاد قزل انجام شد، داده­های حاصل از فناوری توالی­یابی نمونه­ها، نتایج مسر و همکاران (12) را تأیید کرد (13). نتایج آماری بدست آمده از بررسی ارتباط بین ساختار ژن MTNR1A و فعالیت تولید مثلی در نژاد ساردا، ارتباط معنی داری بین ژنوتیپ Rr و فعالیت تولید­مثلی نشان دادند که به شدت تحت تأثیر دوره نوری قرار می­گیرد (2).

مرادی و همکاران (14) از تعداد 124 رأس میش از نژاد زل و نائینی با استفاده از روش PCR-RFLP یک چند­شکلی تک نوکلئوتیدی در ناحیه 605 جفت بازی اگزون دوم شناسایی کردند. آن­ها پیشنهاد دادند که می­توان از این نتایج در مطالعات همبستگی بین ژنوتیپ و صفات مرتبط به تولید­مثل گوسفند بهره جست. ارتباط بین فصلی بودن تولید­مثل و ژن MTNR1A در گوسفند راسا (Rassa) در پژوهشی مورد بررسی قرار گرفت و 17 چندشکلی در ناحیه پروموتر و 11 چندشکلی در ناحیه اگزون دوم شناسایی شد. همچنین، سه ژنوتیپ برای SNP­های 606 و 612 در نظر گرفته شده بود و نتایج آن­ها نشان داد که آلل جهش یافته T در ارتباط با تولید­مثل غیرفصلی می­باشد (11). در گوسفندان ساردا (Sarda) بمنظور بررسی تأثیر پلی­مورفیسم ژن MTNR1A بر آغاز تولید­مثل و ارزیابی تأثیر سن و نمره وضعیت بدن بر آن، مطالعه­ای انجام شد. داده­ها نشان داد که پلی­مورفیسم ژن MTNR1A بر از سر­گیری تولید­مثل در فصل بهار در این نژاد تأثیر مثبت داشته و علاوه بر این، نشان داده شد که در حیطه­ای که این آزمایش انجام شده نمره وضعیت بدنی و سن تأثیر معنی­داری بر فعالیت­های تولید­مثلی نداشته است (4 و16). بمنظور مطالعه و بررسی پلی­مورفیسم ژن MTNR1A و ارتباط آن با فصلی بودن تولیدمثل، پژوهشی در یک مرکز اصلاح نژاد گوسفندان بومی یونان انجام شد. در این آزمایش، ساختار ژن MTNR1A برای اولین بار در گوسفند بومی یونان آنالیز شد. تجزیه و تحلیل آماری نشان داد که همبستگی مثبت بین ژنوتیپ و فصلی بودن تولید­مثل وجود دارد و ژنوتیپ  C/Cنقش مهمی در فعالیت تولیدمثل خارج فصلی بازی می­کند(7). بررسی پلی­مورفیسم گیرنده ژن ملاتونین (MTNR1A) در جمعیت بز­های کاسانگ (Kacang) و پراناکان اتاوا (Peranakan Ottawa) در منطقه جنوب اندونزی نیز با انتخاب تصادفی 253 رأس بز انجام و برای تعیین ژنوتیپ­ها از روش PCR-RFLP توسط آنزیم RsaI استفاده شد. مشاهده دو آلل R و r در نتایج نشان داد که تنوع ژنتیکی در ژنMTNR1A  بز­های کاسانگ و پراناکان وجود دارد. با توجه به نتایج آزمون هاردی واینبرگ، این جمعیت برای ژن MTNR1A در تعادل بود (6). با توجه به اهمیت مساله­ی  تولید مثل گوسفندان و ارتباط عوامل پیرامونی و هورمونی با این مقوله و در راستای برنامه ریزی کاربردی در این بخش، این تحقیق با هدف شناسایی تنوع آللی در ناحیه ای از ژن گیرنده ملاتونین در گوسفندان افشاری انجام شد (5).

مواد و روشها

انتخاب دام ­ها و تهیه نمونه­های خون: جهت اجرای تحقیق حاضر، از گوسفندان نژاد افشاری استفاده شد. نژاد افشاری، نژادی سنگین وزن است و از پتانسیل مناسبی برای تولید گوشت برخوردار است ( 17). با توجه به بالا بودن میزان دوقلوزایی در این نژاد، می­توان آن را از نژادهای گوشتی گوسفندان ایرانی محسوب نمود ( 18). دام­های مورد استفاده در دو گروه قرار گرفتند. گروه یک در مجموع، 35 رأس میش­ که به طور تصادفی از گله­های مختلف انتخاب شدند و گروه دو در مجموع، 44 رأس میش­ بودند که در فصل غیر تولید­مثل آبستن شده بودند. خون­گیری با کمک ونوجکت خلأ­دار 6 سی­سی حاوی ماده ضد انعقاد EDTA از سیاهرگ وداج انجام شد. نمونه­های خون تا زمان استخراج DNA در فریزر با دمای منهای 20 درجه سانتیگراد نگه‌داری شد.

آزمایشات مولکولی: استخراج DNA از نمونه­های خون به روش فنل-کلروفرم انجام شد. کمیت و کیفیت DNA استخراج شده نیز با استفاده از دستگاه نانودراپ مشخص گردید. بمنظور تکثیر قطعه مورد نظر، آغازگر اختصاصی توسط نرم­افزار آنلاین (http://bioinfo.ut.ee/primer 3-0.4.0/) Primer 3 (v.0.4.0) طراحی شد. آغازگر­های پیشنهاد شده توسط  نرم­افزار تحت آزمون­های Primer Blast، Fast Pcr و Mfold جهت انتخاب بهترین آغازگر که بتواند کاملاً، اختصاصی ناحیه مورد نظر را تکثیر دهد، قرار گرفت و بهترین آغازگر­های پیشرو و پس­رو انتخاب شدند.

مواد لازم برای انجام واکنش PCR عبارت بودند از، بافر واکنش PCR ، کلرید منیزیم، dNTPs و آنزیم تک پلیمراز که همگی به صورت مخلوط در red master mix خریداری شده موجود بودند و آغازگرها و DNA حاصل از نمونه­های استخراج شده، به عنوان الگو در واکنش­های PCR استفاده شد. هر مخلوط واکنش (25 میکرولیتر) شامل 5/12 میکرولیتر از Red Master Mix، 1/0 میکرولیتر از هر آغازگر و 1 میکرولیتر از DNA ژنومیک به ازای هر واکنش استفاده شد. برنامه زمانی مورد استفاده برای اگزون­ شماره دو به صورت: واسرشته سازی اولیه: دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و 30 سیکل شامل؛ 95 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 58 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، و 72 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه بود که در انتها با دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه پایان می یافت.

جهت بررسی وجود SNP­(های) احتمالی موجود در قطعه تکثیر شده از ژن مورد بررسی، از روش ترکیبی توالی­یابی مستقیم و RFLP استفاده شد. بدین صورت که، در ابتدا، تعداد 10 نمونه از محصولات حاصل از تکثیر به­طور تصادفی انتخاب و جهت توالی­یابی به شرکت زیست فناوری کوثر ارسال شد. توالی­های بدست آمده توسط بررسی کروماس (منحنی مربوط به توالی) آنها در نرم­افزار Chromas lite و نیز نرم­افزارClC Main Workbench 5 از نظر وجود چند­شکلی­های تک نوکلئوتیدی مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت. پس از مشاهده چند­شکلی در نمونه­های توالی­یابی­شده تعیین ژنوتیپ­ سایر محصولات توالی یابی نشده به کمک RFLP انجام شد. شناسایی آنزیم محدودکننده مناسب برای تشخیص ژنوتیپ­ها نیز به کمک نرم­افزار ClC Main Workbench 5 انجام شد.

 

 

جدول 1 - آغازگرهای اختصاصی طراحی شده جهت تکثیر اگزون شماره دو ژن MTNR1A

پرایمر

جهت

توالی (5'→3')

طول قطعه­ی تکثیر شده

TM

 

ناحیه­ی تکثیر

MTNR1A

پیشرو

GCTTGAATACCCAGGAAAGG

1026

58

 

اگزون دوم

پیرو

GCATCTACCAACAGGGAATGA

 

 

 

تجزیه و تحلیل آماری داده­ها

بررسی فراوانی های ژنوتیپی و آللی و وجود تعادل هاردی واینبرگ بکمک نرم­افزار Popgene  (21) انجام شد. از آنجایی­که متغیرهای مورد بررسی در مطالعه حاضر، متغیرهای پیوسته نبوده و طبقه­بندی شده می­باشند؛ لذا، از روش­های آماری ناپارامتری برای آنالیز این داده­ها استفاده شد.  بدین­منظور، از نرم افزار آنلاین Medcalc (https://www.medcalc.net/statisticaltests/odds_ratio.php) برای محاسبه odd ratio (نسبت شانس)و همچنین از روش اسپیرمن (Spearman) برای محاسبه ضریب همبستگی بین دو متغیر استفاده شد.

نتایج و بحث

تکثیر قطعه 1026 جفت بازی شامل کل ناحیه اگزون شماره دو ژن MTNR1A و بخش­هایی از اینترون یک و دو با استفاده از پرایمرهای طراحی شده در این پژوهش با موفقیت انجام شد. برای تعیین موقعیت باندهای حاصل از تکثیر از یک شاخص مولکولی 100جفت بازی (Ladder) استفاده شد (شکل 1). براساس نتایج حاصل از آنالیز محصولات توالی­یابی­شده، مطابقت توالی­ها با توالی رفرنس ثبت­شده (NM_001009725.1) تأیید و یک چند­شکلی در نوکلئوتید 408 از قطعه تکثیر شده (منطبق با نوکلئوتید 326 از اگزون شماره 2) شناسایی شد. در این چند­شکلی نوکلئوتید C با نوکلئوتید T جایگزین شده ­است. صحت قطعه تکثیر شده با استفاده از تعیین توالی محصولات PCR حاصله نیز مورد تأیید قرار گرفت (شکل 2).

برای شناسایی چند­شکلی ذکر شده در نمونه­های توالی­یابی نشده از روش RFLP با استفاده از آنزیم محدود کننده RsaI با جایگاه اتصال و برش GTAC استفاده شد.

بر اساس نتایج ارائه شده در جدول شماره 2، این آنزیم قطعه تکثیر شده را در حالت مرجع در چهار جایگاه برش می­دهد و پنج قطعه­ی 411، 267، 186، 23،139 جفت بازی را تولید می­کند. درحالی­که در نمونه­هایی که در منطقه مورد نظر، آلل T (جهش یافته) را دارند یکی از جایگاه­های برش حذف و در نتیجه چهار قطعه به طول های 411، 290، 186، 139 جفت بازی را تولید می­شوند. اگرچه، قطعه 23 جفت بازی تولیدشده در حالت رفرنس در انتهای ژل قرار گرفته یا خارج شده و قابل تشخیص نخواهد بود. لذا در هر دوحالت هموزیگوت رفرنس (CC) و هموزیگوت جهش یافته (TT) چهارقطعه قابل مشاهده خواهد بود ولی یکی از قطعه­ها در این­دو هموزیگوت متفاوت (267 جفت باز در حالت رفرنس و290 جفت باز در حالت جهش­یافته) خواهد بود. در ژنوتیپ هتروزیگوت، یکی از کروموزوم­ها در محل چندشکلی موردنظر تحت تأثیر برش آنزیمی قرار می­گیرد ولی در کروموزوم دیگر (همتا) برش آنزیمی اتفاق نمی­افتد به همین دلیل هر دو قطعه 290 و 267 جفت بازی مشاهده می­شود.

شکل 1- باندهای حاصل از الکتروفورز محصولات PCR شامل بخش انتهایی اینترون یک، کل اگزون شماره دو و بخش ابتدایی اینترون دو ژن MTNR1A روی ژل آگارز یک و نیم درصد (bp1026(. چاهک اول از سمت چپ مربوط به نشانگر مولکولی DNA (100bp) و بقیه چاهک­ها قطعه تکثیر شده نمونه­های مختلف می­باشند.نتایج تکثیر قطعه 1026 جفت باز از توالی اگزون شماره 2 ژن با استفاده از الکتروفورز محصولات.

 

با بررسی تغییرات نوکلئوتیدی شناسایی شده و ثبت شده در اگزون­های این ژن بخصوص اگزون شماره دو و مطابقت چند­شکلی شناسایی شده در پژوهش حاضر با موارد ثبت شده در پژوهشهای سایر محققین مشخص شد که SNP شناسایی شده در پژوهش حاضر قبلاً، شناسایی و با کد rs406779174 در NCBI ثبت شده است. شماره­ی این SNP در توالی cDNA این ژن (C519C>T) می­باشد. SNP شناسایی شده در پژوهش حاضر، از نوع هم­معنی (Synonymous) می­باشد و در نتیجه منجر به تغییر اسیدآمینه نمی­شود. اگرچه تغییرات هم­معنی در کدون­ها منجر به تغییر اسید­های آمینه پروتئین­های مربوطه نمی­شوند، اما، می­توانند میزان بیان ژن مربوطه را به دلیل موضوع بهینه بودن یا نبودن کدون برای یک موجود زنده بخصوص تحت تأثیر قرار دهند. این موضوع بویژه در بحث انتقال ژن مورد توجه ویژه قرار می­گیرد.

 

شکل 2 - بررسی توالی محصولات PCR: ردیف فوقانی که با فاصله بیشتری از سه ردیف بعدی قرار گرفته، توالی مرجع و توالی­های بعدی توالی نمونه­های تکثیر شده هستند که به ترتیب ژنوتیپ CC، ژنوتیپ CT و توالی ردیف آخر ژنوتیپ TT را نشان می­دهند. خط­های قرمز عمودی چندشکلی مشاهده شده در توالی نوکلئوتیدی نمونه­ها را نشان می دهد

 

 

 

جدول 2-جزئیات تعیین ژنوتیپ چند­شکلی شناسایی شده در اگزون شماره دو ژن MTNR1A به­روش RFLP

نام ژن

روش

تعیین ژنوتیپ

چندشکلی

شناسایی شده

آنزیم

محدود کننده

قطعات حاصل از هضم

MTNR1A

 

PCR-RFLP

(C408T)

از قطعه تکثیر شده

RsaI

CC (411، 267 ،186، 139، 23جفت بازی)

CT (411، 290، 267، 186، 139 جفت بازی)

TT (411، 290، 186، 139 جفت بازی)

 

شکل 3- باند­های حاصل از الکتروفورز محصولات هضم آنزیمی با آنزیم RSaI  بر روی ژل آگارز دو و نیم درصد. در هر دو شکل، اولین ستون از سمت چپ مربوط به نشانگر مولکولی bp100 و باقی ستون­­ها، باندهای مربوط به تعدادی از نمونه­های مورد بررسی را نشان می­دهد. شکل چپ: ستون­های 9و 5، 2 ژنوتیپ TT و ستون­های 10 و8، 7، 6، 4، 3 ژنوتیپ CC را نشان می­دهد. شکل راست: ستون دوم محصول PCR (شاهد منفی)، ستون­های 4و3 ژنوتیپ TT ، ستون­6 ژنوتیپ CT و ستون­های 10 و9، 8، 7 ژنوتیپ CC را نشان می­دهند.

 

 

جدول 3، فراوانی ژنوتیپی و آللی این SNP را در کل داده­ها و همچنین به تفکیک گروه نشان می­دهد. براساس نتایج حاصل از آنالیز داده­ها با نرم­افزار POPGENE (21)، ژنوتیپ TT تنها در گوسفندان گروه 2 (گروه آبستن شده در فصل غیرتولید­مثلی گوسفند) با فراوانی نسبی 21/0مشاهده شد و در دام­های گروه یک هیچ مشاهده­ای برای این ژنوتیپ نبود. فراوانی نسبی ژنوتیپ CC برای هر دو گروه و کل داده­ها بیشتر از سایر ژنوتیپ­ها بود؛ اگرچه فراوانی نسبی این ژنوتیپ در گروه دوم کمتر از گروه اول (68/0 در مقابل 91/0) بود. فراوانی نسبی ژنوتیپ  هتروزیگوت نیز در گروه دوم بیشتر از گروه اول (11/0 در مقابل 08/0) بود. بررسی فراوانی آللی در دو گروه مورد مطالعه نشان داد که در گروهی که آبستنی غیر­فصلی داشتند، آلل T فراوانی بیشتری داشت.

آلل­های گروه یک یعنی میش­هایی که به صورت تصادفی از چند گله مختلف انتخاب شده بودند، در حالت تعادل هاردی ـ ­واینبرگ قرار داشتند در حالیکه، گروه دو، در اینجا غیر فصلی، در شرایط عدم تعادل قرار داشت. دلیل این موضوع می­تواند انتخاب تعداد محدودی از دام­ها (که تولید­مثل غیر فصلی داشتند) به عبارتی عامل انتخاب و اندازه نمونه باشد. در مطالعه حاضر، فراوانی آلل مرجع (C) بیشتر از آلل جهش یافته T می­باشد. فراوانی این دو آلل در نژاد­های مختلف گوسفند دنیا متفاوت است.

 

 

جدول 3- فراوانی ژنوتیپی و آللی و بررسی وجود تعادل هاردی-واینبرگ در SNP شناسایی شده

  Pمقدار

کای اسکوئر

فراوانی آللی

فراوانی ژنوتیپی

گروه

نوع

چندشکلی

موقعیت

چندشکلی

نام ژن

T

C

TT

CT

CC

829/0

461/0

04/0

96/0

0

0

08/0

(3)

91/0

(32)

یک

هم­معنی

)Synonymous(

 

 

 

 

C519C>T

MTNR1A

0000/0

95/22

26/0

74/0

21/0

(9)

11/0

(5)

68/0

(30)

دو

000/0

85/32

165/0

835/0

11/0

(9)

1/0

(8)

78/0

(62)

کل

 

 

بررسی بخشی از اگزون دو توسط کارکانگیو و همکاران (2)، بر روی نژاد ساردا با روش PCR-RFLP و به­کمک آنزیم برشی RsaI انجام و دو ژنوتیپ  با فراوانی 96 درصد و 4 درصد شناسایی شد. آنها  فراوانی دو آلل شناسایی شده را در این نژاد به ترتیب 98/0 و 02/0 برآورد نمودند که بسیار نزدیک به نتایج پژوهش حاضر در گروه یک است. در این پژوهش، نیز ژنوتیپ سوم (ژنوتیپ جهش­یافته) مشاهده نشد (همانند نمونه­های گروه یک پژوهش حاضر). در مطالعه­ی مشابه دیگری از همین محققان ( 3) روی همین ژن، پس از هضم قطعه تکثیر شده با آنزیم MnlІ، فراوانی آللی برای آلل +، (جایگزین شدن نوکلئوتید A به جای G) 78/0 و برای آلل-، 22/0 می­باشد. فراوانی ژنوتیپ­ها نیز 68، 5/20 و 5/11 درصد بترتیب برای ژنوتیپ­های + +، - + و - - به دست آمد. همچنین هضم با آنزیم RsaІ فراوانی آللی 66/0 برای آلل C (آلل رفرنس) و 34/0 برای آلل T (آلل جهش یافته) را نشان داد. فراوانی برای ژنوتیپ­های CC، CT و TT به ترتیب5/53، 26 و 5/20 بدست آمد. آنها گزارش نمودند که هر دوی این چند­شکلی­ها فاقد تعادل هاردی-­واینبرگ می­باشند. چند­شکلی دوم گزارش شده در پژوهش مذکور با پژوهش حاضر مطابقت دارد.

مورا و همکاران (13 و 14)  دو چند­شکلی تک نوکلئوتیدی را در ناحیه 606 و 612 قطعه تکثیر شده از اگزون دوی نژاد ساردا شناسایی کردند. در پژوهش آنها نیز فراوانی آلل رفرنس (C) بیشتر از آلل جهش یافته بود نتایج این گزارش نیز با نتایج ما همخوانی دارد.

برای اولین بار جیانتسیس و همکاران (7) اگزون شماره دوی گوسفندان بومی یونان را به منظور بررسی ارتباط تولید­مثل فصلی با ژن MTNR1A مورد بررسی قرار دادند و در ناحیه 606 و 612 دو چند­شکلی شناسایی کردند. در هر دو گروه مورد بررسی در این پژوهش نیز فراوانی ژنوتیپ CC و آلل C بیشتر بود. مارتینز و همکاران (11) ارتباط بین فصلی بودن باروری و ساختار ژن MTNR1A را در گوسفند نژاد راسا آرگونسا بررسی کردند. جهش­های خاموش که در ارتباط با تولید­مثل فصلی در سایر نژاد­ها گزارش شده بود در نژاد راسا نیز مشاهده شد. آلل جهش یافته T در نوکلئوتید 606 اگزون دو در ارتباط با چرخه آبستنی میش­های راسا بود. در این پژوهش سه ژنوتیپ برای اسنیپ­های 606 و 612 در نظر گرفته شد و نتایج نشان داد که آلل جهش یافته T در ارتباط با تولید­مثل فصلی بوده و باعث افزایش چرخه فحلی در دام­های دارای ژنوتیپ TT شد. نتایج حاصل از  مطالعه حاضر در مورد شناسایی چندشکلی، با چندشکلی گزارش شده در مطالعات قبل در جایگاه 606 اگزون شماره دو مطابقت دارد که با رنگ قرمز در شکل 4 نشان داده شده است.

 

 

شکل 4- نمای شماتیک از ژن MTNR1A گوسفند، که جعبه­ها اگزون ­را نمایش می­دهند (توالی­های کد­کننده و غیر کد­کننده به ترتیب سیاه و خاکستری نشان داده شده است). پلی­مورفیسم شناسایی شده در پژوهش حاضر با فلش قرمز رنگ نشان داده شده است. موقعیت پلی­مورفیسم با توجه به توالی GenBank AY525665 و u14109 نشان داده شده است. برای SNPهای اگزون دو موقعیت اسیدآمینه و تغییر آن در پرانتز نشان داده شده است.

 

در کنسرسیوم بین­المللی ژنوم گوسفند (International Sheep Genome Consortium(ISGC)) نتایج پژوهش­هایی که بر روی نژاد­های مختلف در این باره انجام شده ثبت گردیده است. در برخی از نژاد­ها فقط آلل C، برخی فقط آلل T و در برخی نیز هر دو آلل وجود داشته­است. (https://asia.ensembl.org/Ovis_aries/Variation/Population). فراوانی آللی که در این مطالعات گزارش شده است به­دلیل کوچک بودن اندازه نمونه، قابل اعتماد کامل نیست. برای نمونه در اطلاعات این کنسرسیوم، برای گوسفند افشاری نیز تنها ژنوتیپ CC ثبت شده است (براساس ژنوتایپینگ 2 نمونه). در حالی­که در مطالعه حاضر آلل T با فراوانی نسبتاً مناسبی مشاهده شد. البته در این مطالعه به دلیل اینکه از گله هایی که از کار تلاقی با ترکیب ژنتیکی چند­قلوزا به دور بوده­اند نمونه برداری نشد بنابراین دقیقاً نمی­توان گفت که فراوانی آللی T در نژاد افشاری در چه وضعیتی است. اما به هرحال هدف اولیه این پژوهش شناسایی آلل­هایی در این ژن بود که با غیر­فصلی بودن مرتبط باشد و منشأ آلل در ابتدا اهمیت چندانی نداشت. مطالعات تکمیلی می­تواند به روشن­تر شدن موضوع کمک نماید.

در خصوص ارتباط گروه های تولیدمثلی مورد بررسی با آللهای شناسایی شده  در پژوهش حاضر، تجزیه و تحلیل آماری بر اساس نسبت شانس (Odds ratio) نشان داد که فراوانی الل T در دو گروه دام­های انتخاب شده به صورت تصادفی و گروه غیر­فصلی معنی­دار است. با بررسی وضعیت نسبت شانس آلل T  در دو حالت فرضی غالب و مغلوب و با فرض اینکه آلل T سبب غیرفصلی بودن تولیدمثل شود، در حالت مغلوب بودن این آلل، احتمال وجود الل T در گروه غیر فصلی 19 برابر بیشتر از گروه تصادفی است (P-value = 0.04) و در حالت غالب بودن این آلل، احتمال آلل T در گروه غیرفصلی 5 برابر بیشتر از گروه تصادفی است (P = 0.019). لذا بنظر می­رسد آلل T با غیر­فصلی بودن تولید­مثل این گوسفندان مرتبط باشد. همانطور که در منابع مختلف اشاره شده است، موضوع فصلی بودن تولیدمثل در اغلب نژادهای گوسفند باعث می­شود در فصول غیر تولید مثلی بهره­وری گله کاهش پیدا کند. در این خصوص دام­هایی که وضعیت غیرفصلی بودن تولیدمثل را دارند از ارزش ویژه­ای برخوردار هستند. تحقیق حاضر هم از لحاظ نوع ارتباط با صفت تولید مثل و هم به نوعی از نظر فراوانی آللی با برخی از  پژوهش­های انجام شده به ویژه حاتمی و همکاران (8) و جیانتسیس و همکاران (7) همخوانی دارد. همانند پژوهش­های کارکانگیو و همکاران (2) و مارتینز و همکاران (11) پژوهش حاضر نیز نشان می­دهد که در گوسفند افشاری احتمالاً چندشکلی یافت شده با غیر فصلی بودن تولید مثل میتواند در ارتباط باشد.

بر اساس نتایج حاصل از آنالیز همبستگی اسپیرمن نیز، بین گروه تولیدمثلی و ژنوتیپ همبستگی مثبت و معنی داری (0001/0=p-value ، 365/0=r) مشاهده شد؛ بطوری­که با تغییر گروه تولیدمثلی از تصادفی به غیرفصلی، فراوانی ژنوتیپ TT بیشتر ­شد. همین ارتباط در مورد آلل­های شناسایی شده نیز مشاهده شد ( 012/0=p-value ، 281/0=r).

صفات مرتبط با تولید مثل دام از پیچیدگی­های خاصی برخوردار است. گاهی با وجود تمام انتخاب­های که برای تولید دام­های پرتولید انجام می­گیرد، پاسخ چندانی بدست نمی­آید؛ در حالیکه در مواردی هم ممکن ­است یک ژن بزرگ­اثر (مانند FecB ) تحول بزرگی را ایجاد نماید. با توجه به نتایج بدست­آمده و در صورتی که مطالعات تکمیلی نتایج فوق را دوباره تائید نمایند، از چند­شکلی ذکر شده می­توان در کار­های اصلاح نژادی در جهت بهبود وضعیت تولید­مثلی در گوسفند استفاده نمود. اما بهر حال لازم است که تحقیق در سطح وسیع­تری، بویژه در گله­های گوسفند افشاری که در سال­های اخیر تحت پوشش ورود ژن FecB نبوده اند انجام و براساس آن استنتاج بهتری صورت پذیرد.

سپاسگزاری

بدینوسیله از کارشناس محترم آزمایشگاه ژنتیک مولکولی گروه علوم دامی دانشگاه زنجان، سرکار خانم مهندس سیامکی، که نهایت همکاری را در اجرای این پژوهش داشتند تقدیر و تشکر بعمل می آید.

1-      Bubenik, G. A. 2008. Thirty four years since the discovery. Journal of physiology and pharmacology 59.2: 33-51.
2-      Carcangiu, V., M.C. Mura, G.M. Vacca, M. Pazzola, M.L. Dettori, S.Luridiana and P.P. Bini. 2009a. Polymorphism of the melatonin receptor MT1 gene and its relationship with seasonal reproductive activity in the Sarda sheep breed. Animal Reproduction Science. 116(1-2):65-72.
3-      Carcangiu, V., G.M. Vacca, M.C. Mura, M.L. Dettori, M. Pazzola, S. Luridiana and P. P. Bini. 2009b. Relationship between MTNR1A melatonin receptor gene polymorphism and seasonal reproduction in different goat breeds. Animal Reproduction Science. 110(1-2):71-78.
4-      Carcangiu, V., S. Luridiana, G. M. Vacca, C. Daga and M. C. Mura. 2011. A polymorphism at the melatonin receptor 1A (MTNR1A) gene in Sarda ewes affects fertility after AI in the spring. Reproduction, Fertility and Development. 23(2): 376-380.
5-      Chemineau, P., Daveau, A., Pelletier, J., Malpaux, B., Karsch, F. J., & Viguié, C. (2003). Changes in the 5-HT2Areceptor system in the pre-mammillary hypothalamus of the ewe are related to regulation of LH pulsatile secretion by an endogenous circannual rhythm. BMC neuroscience, 4(1), 1-14.
6-      Dagong, M. I. A., R. R. S. R. A. Bugiwati and N. PurnomoBugiwati. 2019. Melatonin receptor 1A (MTNR1A) gene polymorphisms in the local goat population in South Sulawesi region of Indonesia. The 1st Biennial Conference on Tropical Biodiversity In IOP Conference Series: Earth and Environmental Science.270(1): 012009. Makassar, Indonesia.
7-      Giantsis, I. A., G. P. Laliotis, O. Stoupa and M. Avdi. 2016. Polymorphism of the melatonin receptor 1A (MNTR1A) gene and association with seasonality of reproductive activity in a local Greek sheep breed. Journal of Biological Research-Thessaloniki, 23(1): 9.
8-      Hatami, M., G. Rahimi_ Mianji and A. Farhadi. 2014. Association of melatonin receptor 1A gene polymorphisms with production and reproduction traits in Zandi sheep. Iranian Journal Of Applied Animal Science. 4(1): 75-78.
9-      Hernandez, X., L. Bodin, D. Chesneau, D. Guillaume, P. Chemineau, B. Malpaux and M. Migaud. 2005. Relationship between MT1 melatonin receptor gene polymorphism and seasonal physiological responses in Ile-de-France ewes. Reproduction Nutrition Development, 45(2): 151-162.
10-   Luridiana, S., M. C. Mura, C. Daga, M. L. Diaz, P. P. Bini, G. Cosso and V. Carcangiu, 2015. The relationship between melatonin receptor 1A gene (MTNR1A) polymorphism and reproductive performance in Sarda breed sheep. Livestock Science, 171, 78-83.
11-   Martínez-Royo, A., B. Lahoz, J. L. Alabart, J. Folchand J. H. Calvo. 2012. Characterisation of the melatonin receptor 1A (MTNR1A) gene in the Rasa Aragonesa sheep breed: association with reproductive seasonality. Animal reproduction science, 133(3-4): 169-175.
12-   Messer, L., L. Wang, C. Tuggle, M. Yerle, P. Chardon, D. Pomp, J. Womack, W. Barendse, A. Crawford, D. Notter and M. Rothschild. 1997. Mapping of the melatonin receptor la (MTNR1A ) gene in pigs, sheep, and cattle. Mammalian Genome 8(5):368-370.
13-   Mirabzadeh Ardakani. A., A. Nejati-Javaremi, M. Sadeghi and N. Zare-Shahneh. 2010. Detection of Genetic Polymorphism in Melatonin Receptor 1 (Locus MTNR1A) gene in Ghezel sheep by PCR-RFLP. The 4th Congress on Animal Science. pp:3419-3422. Karadj. Iran.(In Persian)
14-   Moradi N., GH. Rahimi_Miyaneji, H. Deldar and M.B. Kaamjoo. 2012. Detection of Genetic Polymorphism in Melatonin Receptor 1 (Locus MTNR1A) gene in Zel and Naeini sheep. The 7th Biotechnology Conference of the Islamic Republic.Tehran. Iran. (In Persian) https://civilica.com/doc/376052.
15-   Mura, M. C., S. Luridiana, G. M. Vacca, P. P. Bini and V. Carcangiu, 2010. Effect of genotype at the MTNR1A locus and melatonin treatment on first conception in Sarda ewe lambs. Theriogenology. 74(9): 1579-1586.
16-   Mura, M. C., S. Luridiana, S. Bodano, C. Daga, G. Cosso, M. L. Diaz and V. Carcangiu. 2014. Influence of melatonin receptor 1A gene polymorphisms on seasonal reproduction in Sarda ewes with different body condition scores and ages. Animal reproduction science. 149(3-4): 173-177.
17-   Salmani V., Harkinezhad T. and Salimi D. 2018. .Evaluation of the Association of Polymorphism in FTO Gene with Carcass Traits and Blood Parameters in Afshari× Booroola Merino cross lambs. Cellular and Mulecular Research (Iranian Journal of Biology). 31(1): 46-57. (In Persian)
18-   Sepehri R., Harkinezhad T., Alijani S., Shoja Ghias J. and Raafat S.A. 2018. Single Nucleotide Polymorphism in part of GH Gene and Its Association with Carcass Traits in Afshari and Afshari-Booroola Merino sheep. Cellular and Mulecular Research (Iranian Journal of Biology).  31(2): 222-232. (In Persian)
19-   Song, Y., H. Wu, X. Wang, A. Haire, X. Zhang, J. Zhang and A. Wusiman. 2019. Melatonin improves the efficiency of super-ovulation and timed artificial insemination in sheep. PeerJ. 7, e6750.
20-   Vatankhah, M., M. Moradi-Shahrbabak, A. Nejati-Javaremi, S. R. Miraei-Ashttiani and R. Vaez-Torshizi. 2004. A review of sheep breeding in Iran.591-597pp. Proceeding of the 1st congress of animal& aquatic science. Tehran. Iran. (In Persian)
21-   Yeh, F., Yang, R., Boyle, T., Ye, Z. and Mao, J.X., 1997. Pop Gene, the user-friendly computer freeware for the analysis of genetic variation among and within populations using co-dominant and dominant markers. Molecular Biology and Biotechnology Center. University of Alberta.
Cellular and Molecular Research (Iranian Journal of Biology)
Volume 37, Issue 3
Autumn 2024
Pages 238-253

  • Receive Date 04 October 2023
  • Revise Date 13 November 2023
  • Accept Date 27 November 2023