نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 عضو علمی گروه فنی ومهندسی وکشاورزی،دانشگاه پیام نور، تهران، ایران
2 گروه ژنتیک و تولید گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه زنجان ، زنجان، ایران
3 عضو هیئت علمی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری ایران،تهران ، ایران
چکیده
خلاصه:
تاکسول یک داروی ضد سرطان بوده و قابل استخراج از درخت سرخدار میباشد. هدف از این مطالعه بررسی اثرات الیسیتورهای متیلجاسمونات و اسیدسالسیلیک بر روی تولید تاکسول در ریشه های مویین ایجاد شده در سرخدار ایرانی بود. برای ایجاد ریشههای موئین در ریزنمونههای سرخدار ازسه نژاد اگروباکتریوم ریزوژنز A4، R1000 و ATCC15834 استفاده شد. نتایج نشان داد که فقط سویه A4 باعث ایجاد ریشه های مویین در ریزنمونه ها شده و بررسیPCR نشان داد ژن ریشه زایی اگروباکتریوم به ریزنمونهها منتقل شده است. در عملیات واکشت ریشههای موئین،از سه غلظت 1، 10 و 100 میکرومول متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک به صورت جداگانه و ترکیبی برای افزایش تولید پاکلی تاکسول مورد استفاده قرار گرفت. آنالیز انجام شده توسط HPLC نشان داد که افزودن الیسیتورها به محیط کشت باعث افزایش میزان تاکسول در ریشه های مویین می شود و بیشترین افزایش با افزودن 100 میکرومول متیل جاسمونات به تنهایی بدست آمد که باعث افزایش 5 برابری میزان تولید پاکلیتاکسول در ریشههای موئین گردیده است.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Increasing taxol production in hairy roots formed in Iranian yew (Taxus baccata.sp.)
نویسندگان [English]
1 Faculty Member Department Agriculture,, Pyame Noor university, Tehran.Iran
2 Department of Genetics and Plant Production, Faculty of Agriculture, Zanjan University, Zanjan, Iran
3 Scientific member of Iran Institute of Genetics, Tehran, Iran
چکیده [English]
Abstract:
Taxol is an anti-cancer drug and can be extracted from the yew tree. The aim of this study was to investigate the effects of Methyl jasmonate and Salicylic acid elicitors on taxol production in hairy roots formed in Iranian yew. Three strains of Agrobacterium rhizogenes A4, R1000 and ATCC15834 were used to create hairy roots in yew explants. The results showed that only A4 strain caused the formation of hairy roots in the explants and PCR analysis showed that the Agrobacterium rooting gene was transferred to the explants. In the operation of growing hairy roots, three concentrations of 1, 10 and 100 µmol of methyl jasmonate and salicylic acid were used separately and in combination to increase paclitaxol production. The analysis performed by HPLC showed that the addition of elicitors to the culture medium increases the amount of taxol in hairy roots, and the greatest increase was obtained by adding 100 micromoles of methyl jasmonate alone, which increased the amount of paclitaxol production in hairy roots by 5 times.
کلیدواژهها [English]
(Taxus baccata.sp)
هوشنگ گوهر چینی1،2*، خدیجه باقری1 و محمد رضا زمانی3
1 ایران، زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه ژنتیک و تولیدات گیاهی
2 ایران، تهران، دانشگاه پیام نور
3 ایران، اصفهان، میمه موسسه آموزش عالی نور دانش
تاریخ دریافت: 22/10/1401 تاریخ پذیرش: 27/01/1402
چکیده
تاکسول یکی از مهمترین داروهای ضد سرطان است که از درخت سرخدار قابل استخراج میباشد. امروزه تولید داروهای گیاهی از طریق ایجاد ریشه های مویین در بسیاری از گیاهان دارویی مورد توجه پژوهشگران است. دراین مقاله اثرات الیسیتورهای متیلجاسمونات و اسیدسالسیلیک بر روی تولید تاکسول در ریشه های مویین ایجاد شده در سرخدار ایرانی بررسی می گردد. نویسندگان برای ایجاد ریشههای موئین در ریزنمونههای سرخدار ازسه نژاد اگروباکتریوم ریزوژنز A4، R1000 و ATCC15834 استفاده کردند. نتایج نشان داد که فقط سویه A4 باعث ایجاد ریشه های مویین در ریزنمونه ها شده و بررسیPCR نشان داد ژن ریشه زایی اگروباکتریوم به ریزنمونهها منتقل شده است. در عملیات واکشت ریشههای مویین، از سه غلظت 1، 10 و 100 میکرومول متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک به صورت جداگانه و ترکیبی برای افزایش تولید پاکلی تاکسول مورد استفاده قرارگرفت. تجزیه و تحلیل انجام شده توسط کرماتوگرافی مایع با عملکرد بالا نشان داد که افزودن الیسیتورها به محیط کشت باعث افزایش میزان پاکلی تاکسول در ریشه های مویین می شود و بیشترین افزایش با افزودن 100 میکرومول متیل جاسمونات به تنهایی بدست آمد که باعث افزایش 5 برابری میزان تولید پاکلیتاکسول در ریشههای مویین گردیده است.
واژههای کلیدی: سرخدار ، پاکلی تاکسول، ریشه های مویین، اگروباکتریوم ریزوژنز، الیسیتور
* نویسنده مسئول، تلفن: 02144713092 ، پست الکترونیکی: hgohar129@pnu.ac.ir
مقدمه
گیاهان بخشی ضروری از رژیم غذایی روزمره ما را تشکیل میدهند و ارزش های غذایی آنها دههها به شدت مورد مطالعه قرارگرفته است. گیاهان عالی علاوه بر متابولیتهای اولیه مهم مانند لیپیدها، کربوهیدراتها و اسیدهای آمینه همچنین طیف گستردهای از متابولیتهای ثانویه مانند آلکالوئیدها، آنتوسیانینها، فلاونوئیدها، کینونها، لیگنانها، استروئیدها و ترپنوئیدها را تهیه میکنند که در داروسازی، مواد شیمیایی کشاورزی، طعم دهندهها، عطرها، رنگها، آفتکشهای زیستی و افزودنیهای غذایی استفاده میشوند. متابولیتهای ثانویه گیاهی نقش مهمی در حفظ فرایندهای حیاتی گیاهان ندارند، اما نقش شناخته شدهای در برهم کنش گیاه با محیط آن دارند و به عنوان مواد شیمیایی دفاعی گیاه عمل میکنند (21). گیاهان باید با تهدیدات مستمر محیطی مانند حملات پاتوژن (قارچها، ویروسها، حشرات، نماتدها) و شرایط فیزیکی سخت (خشکسالی، شوری، دما، قرار گرفتن در معرض اشعه ماوراء بنفش) مقابله کنند. گیاهان سیگنالهای تهدید را از طریق گیرندهها و حسگرهای خود تشخیص میدهند و پاسخهای دفاعی را برای تثبیت در برابر این تنش ها فعال میکنند. این پاسخها باعث تجمع متابولیتهای ثانویه میشود (28). بیش از 50 درصد متابولیتهای ثانویه محصولات دارویی است و برای اهداف پزشکی استفاده میشوند (5). حداقل ۱۰۰۰۰۰ متابولیت ثانویه در۵۰۰۰۰ گونه گیاهی درحال حاضر شناخته شده است و هرساله ۴۰۰۰ متابولیت ثانویه جدید کشف میشود (8).پاکلیتاکسل در ابتدا از Taxus brevifolia جدا شد. تاکسانها از نظر بالینی در اوایل دهه 1990 به بازار ایالات متحده معرفی شد.(18و30) تاکسانها، از جمله پاکلی تاکسل و مشتقات آن، با اتصال به لولههای توبولین دپلیمره شدن یا تداخل را در مجموعه توبولین متوقف می کنند (22و12). تاکسل در برابر انواع مختلف سرطان ها، از جمله سرطان تخمدان، پستان، سر و گردن، مثانه و دهانه رحم، ملانوم، سرطان ریه و سارکوم کاپوزی مرتبط با ایدز موثر می باشد. علاوه بر این، آزمایشات بالینی زیادی برای آزمایش اثر پاکلی تاکسل، به تنهایی ودر ترکیب با سایر داروهای شیمی درمانی، در برابر نئوپلاسم های مختلف دیگر در حال انجام است (27). استفاده از پوست داخلی برای تولید تاکسول باعث تخریب گسترده درختان سرخدار می شود بطوریکه یک درخت را باید از یبن برد تا فقط یک دوز داروی تاکسول بدست آید. در نتیجه منابع طبیعی به هیچ وجه پاسخگو نیست، و منابع دارویی دیگری سریعاً باید جایگزین گردد (5) گیاهان دارویی با ارزش بالا همچون تاکسول ازاجزای اصلی معیشت مردم بعضی مناطق روستایی است و این وابستگی به ویژه در مناطق کوهستانی زیاد است. برداشت زودرس، بیش از حد، مداوم، و دانش ناکافی از برداشت پایدار، تهدیدهای دیگری برای گیاهان دارویی است که توسط تغییرات اقلیمی و فرسایش زمین تشدید میشود. داده ها و دانش در مورد توزیع فعلی و بالقوه آینده گیاهان دارویی با ارزش بالا در این مناطق نسبتاً کم است و این باعث تشدید خطر انقراض این گونه های گیاهی پر اهمیت شده است (15). دهه 1930 تا 1960، ریشه های مویین HRs عمدتاً به عنوان نشانه ای از تهاجم پاتوژن در گیاهان باغبانی مورد مطالعه قرارگرفتند (4). تا اینکه دهه 1970 تا 1980 Agrobacterium rhizogenes به عنوان عامل باکتریایی شناسایی شد که از طریق انتقال ژن Ri (القاء کننده ریشه) پلاسمید باکتری، سندرم ریشه مویین HR را القاء می کند (3و 7). این کشف مهم باعث انجام چندین مطالعه شد که به توسعه فناوری کشت ریشههای مویین (HRCs) کمک کرده است. اکنون می دانیم که HRs از محل زخم گیاهچه ها که توسط A. rhizogenes یک باکتری همزیست که در حال حاضر از لحاظ تاکسونومیکی Rhizobium rhizogenes نامیده می شود، ایجاد میگردد (10). حتی زمانی که گیاه با تحریک بیان چندین پروتئین دفاعی برای سرکوب پاتوژن به عفونت باکتریایی پاسخ میدهد،
R. rhizogenes مکانیسمهایی را برای استفاده از پروتئینهای دفاعی گیاه با خنثی کردن آنها ایجاد می کند که در نتیجه مسیرهای دفاعی گیاه را از بین میبرد (16و 23) تا به امروز، همه سیستم هایی که برای تولید پروتئین نوترکیب استفاده شدند دارای محدودیت هایی است. به عنوان مثال، ناتوانی در تولید و یا ترشح پروتئینهای پیچیده کاربردی (مانند سیستمهای باکتریایی)، خطر انتقال ویروس و مولکولهای سمی (مانند سیستمهای باکتریایی، سلولهای پستانداران) یا هزینههای تولید بسیار بالا است (مانند سلولهای پستانداران) (2). از اوایل دهه 2000، تولید پروتئینهای درمانی با استفاده از گیاهان تراریخته چندین مزیت عمده را نسبت به سایر سیستمهای بیانی از جمله ایمنی (بدون خطر آلودگی ویروسی تهدید کننده انسان)، هزینه های بالادستی پایین و گلیکوزیلاسیون پیچیده ارائه داد. سوسپانسیونهای سلول گیاهی و HRCs مزایای ذاتی گیاهان و محدودیت تولید را ترکیب میکنند. در مقایسه با سوسپانسیون های سلولی، HRCs چندین مزیت مانند پایداری ژنوتیپی و فنوتیپی و امکان ترشح خارج سلولی پروتئینهای بیان شده (همچنین به عنوان ریزترشح نامیده میشود) ارائه یک روش مناسب برای خالص سازی پروتئینهای هدف در یک محیط که مقدار کمی پروتئین وجود دارد (31). کشتهای ریشه مویین(HRCs) قادر به تولید ترکیبات پیچیده در مقیاس بالا هستند (11و 26). در سال های اخیرا، پژوهشگران و محققان زیادی ریشه های مویین را در گیاهان دارویی برای تولید متابولیت های ثانویه مورد بررسی قرار داده اند (33) فنوتیپ آنها براساس خصوصیات رشد نسبتاً سریع و بدون نیاز به هورمونهای خارجی، نداشتن شاخههای جانبی، از دست دادن زمین گرایی، پایداری بیوشیمیایی و ژنتیکی مشخص میشود (9) ریشههای مویین برای تولید بیشتر متابولیت های ثانویه به دلیل پایداری ژنتیکی بهتر، نسبت به سایر روشهای کشت آزمایشگاهی ارجحیت دارند (17). میزان بیوسنتز متابولیتهای ثانویه در ریشههای تراریخته، مبنای ژنتیکی دارد اما تحت تأثیر عوامل تغذیهای (الیسیتورها) و محیطی نیز قرار میگیرد. ترکیب محیط کشت، رشد و تولید متابولیتهای ثانویه را تحت تأثیر قرار میدهد. مقدار ساکارز، هورمون های رشد بیرونی، منبع نیتروژن و مقادیر نسبی آنها، نور، درجه حرارت و وجود مواد شیمیایی محرک یا باز دارنده، همگی میتوانند رشد، مقدار بیوماس، و تولید متابولیت ثانویه را متأثر سازند (32). براساس منابع بررسی شده ریشههای مویین می تواند منبع جایگزین برای تولید تاکسانها، سلولها و بافتهای گیاهی سرخدار که در آزمایشگاه کشت میشوند هستند (23)، یکی از موارد انتقال ژن در گیاه سرخدار با اگروباکتریوم ریزوژنز توسط پالوت-کارکاسون (1994) انجام شد اما هیچ جزئیاتی در مورد تولید تاکسان و تعیین آن در کشت ریشه های مویین در گونه های تاکسون ثبت نشده است. در پژوهشی دیگر ریشههای مویین Taxus × media واریته Hicksii مورد بررسی قرارگرفت محتوای پاکلی تاکسل تعیین شده در این کشت در یک کیلوگرم ماده خشک 619 میلیگرم بود. آنها اولین نتایج خود را در مورد بهینه سازی تولید پاکلی تاکسل ارائه دادند (6). همچنین در پژوهشی دیگر در کره جنوبی برروی سرخدار گونه Sieb Et Zucc Taxus cuspidata موفق شدند که ریشههای مویین با توان مناسب تولید تاکسول در این گونه ایجاد نمایند. شرایط مطلوب برای بهبود تولید پاکلی تاکسول در سه سویه آگروباکتریوم ریزوژنز R1000)، 15384 و A4 ( برای القاء ریشه مویین در این گونه مقایسه شد. در مجموع با روش های متفاوت آلودگی از طریق فرایندهای متداول واکشت یک دوره 10 ماهه، زمان لازم بود که یک لینه ریشه مویین پایدار و دارای رشد سریع برای تولید بوجود آید. این ریشه های مویین تولید شده سطح بالایی ازپاکلی تاکسول را در پاسخ به الیسیتور متیل جاسمونات (MJ)، نشان دادن که میتواند به عنوان یک منبع جایگزین برای تولید پایدار پاکلی تاکسول استفاده شود (33). کشت های بدست آمده از تلقیح آگروباکتریوم ریزوژنز بر روی ریزنمونههای جوان درترکیب با بیوراکتورها یک تکنیک قدرتمند اقتصادی است که از نظر محیطی برای تولید متابولیت های ثانویه ایمن است (14)، در گذشته، بازدهی کمی برای کشت ریشه های مویین با رویکردهای مرسوم گزارش شده است، اما با استفاده از فنولیکها مانند استوسیرینگون (25) و فراصوت با فرکانس پایین تحت یک محیط کنترل شده راندمان تبدیل را میتوان افزایش داد و بنابراین از این فرایند در تولید کشتهای ریشه مویین در برخی از نهاندانگان استفاده شد (29)، در پژوهشی دیگر تلاش برای توسعه کشت ریشه مویین در یک گیاه از بازدانگان بنام سرخدارTaxus baccata sub sp. wallichiana که چندان به آسانی قابل کشت نیست با کمک فراصوت برای تولید زیست توده بیشتر در نتیجه افزایش تولید متابولیت ثانویه تاکسول صورت گرفت (20). در این مقاله با توجه به بررسی های انجام شده در سرخدار ایرانی هنوز کاری در زمینه ایجاد ریشه های مویین و تولید داروی ارزشمند تاکسول از طریق این ریشه ها صورت نگرفته است برای اولین بار در سرخدار ایرانی اقدام به ایجاد ریشه ها مویین و بررسی اثرات الیستورها بر آنها و مقدار تولید تاکسول در این ریشه ها شد.
مواد و روشها
تهیه بذور و استریل نمودن: بذور سرخدار مورد استفاده این پژوهش از جنگلهای شمال کشور ایران از طریق موسسه جنگلها و مراتع کشور تهیه شد. ابتدا بذور را شستشو دادیم و سپس تیمار یک دقیقهای با اتیل الکل ۷۰ درصد (v/v) و سپس تیمار ۲۰ دقیقهای با هیپو کلرید سدیم 5/1درصد (w/v) اعمال نمودیم سپس با آب مقطر استریل در زیر لامینار جریان هوای آرام سه بار شسته شد و سپس بر روی محیطهای کشت MS کاشته شدند تا گیاهان تازه بدست آوریم.
تلقیح باکتری: پس از تهیه گیاهان تازه از باکتری Agrobacterium rhizogenes سویههای A4 ، R1000و ATCC15834 برای تلقیح نمونهها استفاده شد. سویههای باکتری در محیط کشتYEP (yeast extract peptone) که شامل عصاره گوشت۵۰۰۰، عصاره مخمر۱۰۰۰، پپتون۵۰۰۰، سولفات منیزیم ۴۹۰0، ساکارز۵۰۰۰، آگار ( زمانیکه محلول جامد بکار رفت) ۲۰۰۰۰، میلیگرم در لیتر (mgl-1) کشت شدند از آب مقطر دوبار استریل برای آماده سازی محیط استفاده شد و pH با استفاده از سود 1/0 نرمال یا اسید کلریدریک 1/0 نرمال روی ۷ تنظیم شد. اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتیگراد و فشار 1/1 کیلوگرم بر سانتی مترمربع به مدت ۱۵ دقیقه انجام شد. باکتریها را در محیط مایع YEP برای ۲۴ ساعت روی شیکر قرار دادیم محتوای پلیت را با سرعت ۲۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ نمودیم و کشت را با 2/0 =O.D. در 260 نانومتر پس از حل کردن انتخاب نمودیم اکنون باکتریها برای تلقیح آگروباکتریوم بر روی ریزنمونه های سرخدار آماده بودند.
شکل 1- القای ریشه مویین به گیاهچه هایA ) T. baccata L.(: نهال 3 ماه حاصل از کشت جنین. (B): تلقیح برگ ها توسط )A. rhizogenes (C: تلقیح، نهال ها توسط A. rhizogenes (D): ریشه مویین تازه تشکیل شده بعد از سه ماه در گیاهچه ها(E): ریشه مویین ایجاد شده در برگ ها بعد از سه تا چهار ماه بعد از عفونت A. rhizogenes. (F): ریشه های مویین جداشده برای تجزیه و تحلیل کرماتوگرافی مایع با عملکرد بالا HPLC.
روشهای مختلفی را برای القاء میتوانیم بکار بگیریم، که ما از دو روش استفاده نمودیم که شامل روش عفونت مستقیم، که در آن ریزنمونه های زخمی توسط یک اسکلپر آغشته به آگروباکتریوم ریزوژنز آلوده شد و روش واکشت مایع که در آن نهال زخمی بار دیگر همراه با آگروباکتریوم ریزوژنز به مدت 24 ساعت در یک محیط مایع واکشت شدند. بعد از تلقیح ریز نمونه ها به صورت تازه به محیط کشت MS (عناصر ماکرو نصف مقدار اصلی بکار رفتن) حاوی5/0 گرم در لیتر آنتی بیوتیک سفوتاکسیم برای حذف باکتری های اضافی باقیمانده روی بافت هاانتقال یافتند و هر هفته محیط کشت آنها تازه شد و سفوتاکسیم اضافه شد تا زمانی که نشانهای از رشد آگروباکتریوم در آنها مشاهده نشد. پس از آن، گیاهچهها دوباره به مدت 3 هفته در محیط کشت تازه WPM که فاقد سفوتاکسیم و تنظیم کنندههای رشد گیاهی واکشت شدند. کشتها در یک محیط تاریک برای 3 هفته اول نگهداری شدند، و سپس شرایط به چرخه نوری 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی در 25 درجه سانتیگراد تغییر یافت. دوباره واکشتها ادامه مییابد این فرایند را سه ماه ادامه دادیم تا لاینهای مختلف ریشه مویین پایدار ایجاد گردند (شکل 1).
آزمایشPCR برای تأیید ماهیت تراریختی: برای تأیید صحت انتقال ژن های ریشه زایی Rol B باکتری آگروباکتریوم ریزوژنز در ریشه های مویین بدست آمده باید وجود ژن ریشهزایی با تجزیه و تحلیل PCR در ریشه های مویین تائید می شد. ابتدا DNA از ریشه گیاه و ریشه مویین با استفاده ازکیت جداسازی DNA تهیه شده از شرکت آزما ژن استخراج شد. DNA ریشه گیاه به عنوان شاهد منفی که داری ژن Rol B نمیباشد و DNA ریشه مویین به عنوان نمونه آزمایشی که در صورت مشابهت باندی با شاهد منفی میتواند دلیل بر عدم انتقال ژن باشد و همچنین DNA پلاسمید باکتری بوسیله کیت جداسازی
DNA پلاسمید جدا شده بود و بعنوان شاهد مثبت بکار گرفته شد. بعد از جداسازیDNA های مربوطه اقدام به طراحی پرایمرهای اختصاصی ژن Rol B شد. آغازگرها از شرکت سیناژن ایران تهیه شد. پرایمر فوروارد قطعه 500 جفت بازی ژن RolBدارای توالی '3 ATCCAACTCACATCACAATGG--'5 و پرایمر معکوس این ژن دارای توالی ' TTCTAAATCAGGTTCCTCCG -3-'5 بود و برای ارزیابی از نشانگر یک کیلوبایتی استفاده شد Mix PCR در هر لوله با حجم 25 میکرولیتر 100 میلی مول پرایمر، 50 نانوگرم در میلیلیتر DNA و 1 واحد Taq پلیمراز تهیه شد. و 35 سیکل انجام شد (94 درجه سانتیگراد برای 45 ثانیه، 58 درجه سانتیگراد برای 45 ثانیه، و 72 درجه سانتیگراد برای 45 ثانیه)، محصولات تکثیر شده با الکتروفورز بر روی ژل آگارز8/0درصد مشاهده شد (شکل2). بعد از مشاهده ریشه های مویین اولیه در زمان واکشت آنها در محیط WPM در قالب یک طرح کاملاً تصادفی با 10 تیمار (جدول 1) که شامل سه سطح متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک 10،1و30 میکرو مول بصورت جداگانه و ترکیب با هم و بدون الیسیتور در سه تکرار بر افزایش تاکسول مورد بررسی قرارگرفت.
جدول1- تیمارهای بکار رفته برای بررسی اثر متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک بر افزایش میزان پاکلی تاکسل در ریشه هایی مویین سرخدار (Taxus baccata.sp)
شماره تیمار |
متیل جاسموناتMµ |
اسید سالسیلیک µM |
1 |
1 |
- |
2 |
10 |
- |
3 |
100 |
- |
4 |
- |
1 |
5 |
- |
10 |
6 |
- |
100 |
7 |
1 |
1 |
8 |
10 |
10 |
9 |
100 |
100 |
10 |
- |
- |
شکل2- تأیید انتقال ژن های ریشه زایی از آگروباکتریوم ریزوژنز به ریشه های مویین بدست آمده توسط PCR. M مارکر هزار جفت باز DNA است NP DNA ریشه گیاه بدون تلقیح است P.DNA پلاسمید باکتری است. 1، 2، 3 DNA نمونه های ریشه مویین که بطور تصادفی انتخاب شدند
الیسیتورها بعد از تهیه محیط کشت و اتوکلاو آنها در زیر لامینار بعد از عبور از فیلتر به محیط های کشت اضافه شد. بعد از ثبت نتایج توسط نرم افزار اکسل و spss تجزیه واریانس داده ها انجام شد تا اختلاف واقعی بین تیمارها مشخص گردد و برای کم کردن اشتباه نوع اول و دوم و بالا بردن درصد صحت از مقایسه میانگینها در سطح یک درصد استفاده شد.
آنالیز ریشه های بدست آمده از طریقHPLC : برای آنالیز ریشه مویین و مشخص نمودن حضور تاکسول در این ریشهها اقدام به آنالیز آنها از طریقHPLC نمودیم. جهت استخراج تاکسان ابتدا نمونه های جدا شده را ۲۴ ساعت در فریز درایر قراردادیم تا خشک شوند. بعد از پودر نمودن آنها سپس در ترکیب متانول آب به نسبت ١:٩ قرارگرفتند و ۱۶ ساعت شیک گردیدند. پس از عبور از کاغذ صافی و فیلترشدن ٤٠ میلیلیتر دیکلرومتان روی محلول بدست آمده افزوده شد با استفاده از قیف جداکننده فاز دیکلرومتان از فاز آبی جدا شد و در روتاری تبخیر شد و عصاره خشک باقیمانده در یک میلیلیتر استونیتریل حل شد. برای آنالیز نمونه ها از دستگاه کروماتوگرافی مایع (HPLC) کنوئر آلمان(Knauer,) نشانگر (Knauer –uv k2501 227nm) ستون) C18 (4.6cm * 25cm* 5µmاستفاده شد. سرعت جریان یک میلیلیتر بر دقیقه، دما ٢٥ درجه سلسیوس و مقدار نمونه تزریق شده ٢٠ ماکرولیتر بود. پیکها در طول موج ٢٣٠ نانومتر نمایان شدند که شناسایی آنها با مقایسه زمان خروج پیک با استانداردهای تاکسان ها صورت پذیرفت در نهایت براساس سطح زیر پیک نمونه و تطابق آن منحنی تنظیم مقدار غلظت تاکسول در محلول اندازه گیری شد. لازم به ذکر است که استاندار ها بر اساس منابع انتخاب شدند (6و 20)
نتایج و بحث
برای بالا بردن احتمال انتقال ژن ریشه زایی توسط اگروباکتریوم و همچنین به علت اینکه دانه های سرخدار به سختی جوانه میزنند از کشت جنین برای تولید نهال استفاده شد تا بتوانیم نهال های جوان بدست آوریم. سپس قطعاتی از برگهای این نهالها به اندازه ۱ سانتیمتر مربع و همچنین هیپوکوتیل نهال های جوان با دو روش ذکر شده با سویههایA4 ، R1000و ATCC15834 آلوده شدند. از میان این سه سویه فقط سویه A4 به طور موفقیت آمیز در ریزنمونه ها در هر دو روش بکار گرفته شده ایجاد ریشه های مویین نمود. اما دو سویه دیگر از باکتری که در این پژوهش استفاده شد هیچگونه ریشه ای ایجاد ننمودند و لذا در ادامه کار مورد بررسی قرارنگرفتند. براساس این نتایج مشخص گردید که ممکن است بعضی از سویه های آگروباکتریوم ریزوژنز برای تبدیل و القاء ریشه های مویین در سرخدار موفقیت آمیز باشند و برخی سویه ها قادر به این کار نیستند پس در قدم اول باید سویه ای مناسب باتوجه به گونه سرخدار بکار بگیریم در مطالعات قبلی انجام شده، از سویه آگروباکتریوم ریزوژنز LBA9402، برای ترانسفورماسیون گیاهچه های سرخدار برای ایجاد ریشه های مویین درTaxus * media var. Hicksiii استفاده شد (9). در مطالعه ای دیگر برای ایجاد ریشه های مویین در Taxus cuspidata از سه سویه اگروباکتریوم ATCC 15834، R1000 و A4 استفاده شد و فقط دوسویه ATCC 15834، R1000 ایجاد ریشه های مویین نمودند این ریشه ها با ریشه های طبیعی T. cuspidataاز نظر تعداد ریشههای نابجا و شکل متفاوت بودند. حتی در فقدان IBA، به عنوان هورمون اکسین، رشد میکنند، و حاوی بسیاری از شاخه های جانبی میشوند. در این پژوهش تقریباً در 26درصد از نهال ها ریشه های مویین ایجاد شدند. بااین حال، بیشتر ریشه های مویین جدید بدست آمده از این ترانسفورماسیون به عنوان ریشه کامل نمی توانند رشد کنند (33). علت رشد نکردن مناسب ریشههای مویین شاید این باشد که زمانیکه ژن rol انتقال مییابد ممکن است ژن تکمیل کننده این مسیر تکاملی را خاموش کند (24). بسته به جایگاه ورود T-DNA به ژنوم گیاه میزبان، توان ریشه های موئین در تولید متابولیت ثانویه متفاوت است. مشخص شده است ریشه های مویین از نظر ژنتیکی پایدار بوده واکشت آنها آسان میباشد. با این وجود، ریشه های مویین هتروژن هستند و به نظر میرسد که به منظور دستیابی به لاینهایی از ریشههای مویین که دارای تولید بالایی باشند لازم است که عمل انتخاب چند بار انجام شود (13). سه نمونه از ریشههای مویین از میان نمونههای بدست آمده انتخاب شد اقدام به تجزیه و تحلیل PCR از آنها نمودیم. پس از الکتروفورز DNAهای استخراج شده تایید شد که باندهای مشابهی را در DNA ریشه مویین نمونه مانند DNA پلاسمید باکتری که بعنوان کنترل مثبت بکاربرده بودیم در برابر قطعه Rol B نشان داد در حالیکه این باند در DNA ریشه گیاه بعنوان کنترل منفی (بدون آلودگی آگروباکتریوم) وجود ندارد.این باندههای مشاهده شده ترانسفورماسیون ر یشههای مویین و انتقال ژن ریشهزایی را تأیید میکرد (شکل2). ریشههای مویین پس از اعتبارسنجی PCR به مدت سه ماه برای رشد بیشتر به محیط کشت WPM منتقل شدند. محتوای پاکلی تاکسل در ریشههای مویین سه ماه که حاوی مقادیر مختلف متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک بودند مورد بررسی و مقایسه قرار گرفتند که پس از تجزیه واریانس و مقایسه میانگین ها از طریق آزمون چند دامنه دانکن نتایج زیر بدست آمد (جدول 2و شکل 3).
پس از اعتبارسنجی PCR به مدت سه ماه برای رشد بیشتر به محیط کشت WPM منتقل شدند. محتوای پاکلی تاکسل در ریشههای مویین سه ماه که حاوی مقادیر مختلف متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک بودند مورد بررسی و مقایسه قرارگرفتند که پس از تجزیه واریانس و مقایسه میانگین ها از طریق آزمون چند دامنه دانکن نتایج زیر بدست آمد (جدول 2و شکل 3)
جدول2- تجزیه واریانس اثر تیمار مقادیر مختلف متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک بر میزان تاکسول در ریشه های مویین
منبع تغییر |
درجه آزادی |
میانگین مربعات (MS) |
تیمار |
9 |
**09/6228 |
خطا |
20 |
02/4 |
ضریب تغییرات cv |
|
30/5 |
** : معنی دار در سطح احتمال 1درصد
مطابق نتایج جدول 2 بکارگیری الیسیتور متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک بر میزن تاکسول موثر بوده و در سطح 1 درصد معنی دار گردیده است و این نشان دهنده تأثیر مثبت و موثر این الیسیتورها بر افزایش تاکسول در ریشه های مویین است. اثر سودمند در مطالعات مختلف بکار گیری پیش سازها و الیسیتورها بر پاکلی تاکسل و تجمع تاکسان های مرتبط در کشت سلولی سرخدار به خوبی مستند شده است به نظر می رسد امیدوارکننده باشد (19) در مطالعات انجام شده ژونگ مشخص نمود که بکارگیری پیش سازها و الیسیتورها به طور موثر تولید تاکسان ها و تجمع آنها را در هر دو کشت کالوس و سوسپانسیون سلولی گونه های تاکسوس تحریک می کند (35)، کاتارزینا سیکلوسکا و همکاران نیز در بررسی خود اثرات ال-فنیل آلانین (PHE) و p-آمینو بنزوئیک اسید (PAB) را به تنهایی یا در ترکیب با متیل جاسمونات بر رشد ریشه مویین و تولید تاکسان بررسی نمودند و مشخص گردید بیشترین افزایش زیست توده خشکی پس از 4 هفته کشت ریشه های مویین در حضورترکیبات پیش ساز در مقایسه با شاهد مشاهده شد. با این حال، ترکیب 100 میکرومولار فنیل آلانین با 100 میکرومول متیل جاسمونات، بیشترین (تقریباً 28 برابر) افزایش تولید پاکلی تاکسل را به همراه داشت (27)، کاربرد اسید سالسیلیک بر افزایش ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی در سوسپانسیون سلولی گیاه دارویی اسطوخودوس نشان داد که 12میلی گرم در لیتر از آن به مدت 72 ساعت باعث افزایش ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی به ترتیب تا 5/3 و 3 برابر می شود (1). همچنین در بررسی متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک بر گیاه دارویی شنبلیله مشخص شد که بیان ژن های کلیدی مسیر بیوسنتزی دیوسژنین تغییر می یاید و بخصوص متیل جاسمونات باعث افزایش تولید دیوسژنین می شود (2) البته نیاز به بررسی بیشتر است، که زمان بکارگیری الیسیتورها بر افزایش تولید تاکسول موثر است یا خیر؟ با بررسی بکارگیری در سنین مختلف ریشه های مویین و زمان باقی ماندن الیسیتور در محیط کشت می توان به آنها دست یافت. سپس برای مشخص شدن اینکه کدام الیسیتور بیشترین تأثیر را نسبت به شاهد و سایر تیمارها داشته است بررسی میانگین ها توسط آزمون چند دامنه ای دانکن انجام شد (شکل 3).
شکل3- نمودار مقایسه میانگین تیمارها با مقادیر مختلف متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک توسط آزمون چند دامنه ای دانکن در سطح 1 درصد
حروف مشترک نشان دهنده نداشتن اختلاف معنی دار بین دو تیمار است
مطابق نمودار مقایسه میانگین تیمار ها تمام تیمارها با شاهد (بدون الیسیتور) در میزان تاکسول اختلاف معنی دار داشتند و این نشان می دهد که بکارگیری الیستورها تأثیرمثبت در تولید تاکسول در ریشه های مویین دارد و بیشترین تأثیر در تیمار شماره 3 هنگامی که 100 میکرومول متیل جاسمونات بکار گرفته شد میزان تاکسول بیش از 5 برابر افزایش یافت و این نتیجه می تواند افق روشنی برای تولید تجاری این گیاه دارویی با ارزش باشد در تیمار 6 که 100 میکرومول اسید سالسیلیک به تنهایی بکار برده شد نیز اختلاف معنی داری در میزان تاکسول با شاهد نشان داد اما این تیمار در جایگاه دوم مقدار تاکسول بعد از آنالیز HPLCدر این بررسی نشان داد و کمتر از تیمار 3 بود به همین علت در این بررسی نتیجه گیری شد که تأثیر متیل جاسمونات بر افزایش تاکسول ریشه های مویین سرخدار ایرانی بیشتر است اما در تیمار 9 که متیل جاسمونات و اسید سالسیلیک بصورت ترکیبی و هر را به مقدار 100 میکرو مول بکار گرفته شد باعث افزایش تاکسول شد اما میزان آن پایین تر از دو تیمار 3 و 6 بود که می تواند اثر تداخلی این دو الیسیتور باشد یا اینکه بالا بودن مقدار الیسیتورهای بکارگرفته شده باشد زیرا در این تیمار 200 میکرومول الیسیتور بکار رفته است و احتمال اینکه پیشنهاد دوم درست تر باشد بیشتر است زیرا وقتی این تیمار با سایر تیمارها مقایسه شد مشخص گردید که این تیمار میزان تاکسول را نسبت سایر تیمارهایی که بصورت ترکیبی اما با مقدار کمتر الیسیتور بکار گرفته شده افزایش تاکسول بیشتری را بوجود آورده است در بررسی سایر تیمارها مشاهده شد که اختلاف افزایش تاکسول در تیمارهایی با میزان الیسیتور یکسان متیل جاسمونات و اسیدسالسیلیک مانند تیمار های 1و4 تیمارهای 2و5 و تیمارهای 7و8 اختلافاً معنی داری بین انها مشاهده نشد، اما با شاهد دارای اختلاف معنی داری بودند بطور کلی بکارگیری پس از بررسی گرافهای حاصل از آنالیزکروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا HPLC (شکل 4)نشان داد الیستورها در افزایش تاکسول در ریشه ای مویین موثر است اما تعینن دقیق مقدار الیسیتور و نوع الیسیتور و سن گیاه و زمان در معرض قرار گرفتن الیسیتور بر میزان این افزایش می تواند موثر باشد.
شکل 4- کروماتوگرافهای تجزیه و تحلیل کرماتوگرافی مایع با عملکرد بالاHPLC شکل A: استاندارد تاکسول شکل B: شاهد شکل :C تیمار 6 شکل D:تیمار 3
بررسی سایر منابع نیز این موضوع را تائید می نماید (19، 27و 35).
در پایان نتیجه گیری شد که سویه مناسب آگروباکتریوم ریزوژنز مناسب برای ایجاد ریشه های مویین در ریزنمونه های سرخدار ایرانی سویه A4 می باشد و برای نگهداری و توسعه این ریشه ها از محیط کشت1/2 MS وWPM می توان استفاده نمود و برای افزایش محتوی تاکسول و اقزایش تولید تاکسول استخراجی از این ریشه های مویین بدست آمده می توان با بکار گیری الیسیتور متیل جاسمونات به میزان 100 میکرومول میزان تاکسول را 6 برابر افزایش داد البته لازم به یاد آوری است در این پژوهش ما فقط از سه سویهA4 ، R1000و ATCC15834 استفاده نمودیم که پیشنهاد می گردد از سویه های دیگر این باکتری نیز استفاده شود و اثر آنها در ایجاد ریشههای مویین مورد بررسی ومطالعه قرارگیرد و اثرات الیسیتورهای دیگر نیز مورد بررسی قرارگیرد.
سپاسگزاری
در پایان جا دارد که از ریاست دانشگاه پیام نور مرکز تهران شرق سرکار خانم دکتر نصری و مسئول آزمایشگاه سرکار خانم مظفری و کارشناس آزمایشگاه سرکار خانم بدری برای همکاری و مساعدت در اجرای این پروژه با بنده کمال تشکر و قدردانی را داشته باشم.